JP2016516201A - 神経保護性ｐｋｃ活性化因子を特定する方法 - Google Patents

神経保護性ｐｋｃ活性化因子を特定する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、神経保護性ＰＫＣ活性化因子を特定する方法であって、候補ＰＫＣ活性化因子を分析して、それら候補が、非腫瘍形成性である、非毒性である、脳への接触容易性がある、αおよびε特異性を有する、最小限のε−イソ酵素下向き調節をもたらす、シナプス形成性である、抗アポトーシス性であるかどうかを判定することを含む、方法を対象とする。ここで開示する方法は、候補ＰＫＣ活性化因子を分析して、それら候補が、ＡＳＰＤに対して神経保護性である、ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性から保護する、正常動物モデルにおいて学習および記憶を向上させる、下流のシナプス形成性生化学事象を誘導する、Ａβ分解酵素を活性化する、ＧＳＫ−３βを阻害する、かつ／またはα−セクレターゼを活性化するかどうかを判定することをさらに含んでもよい。

Description

本出願は、その内容の全体が参照により援用される、２０１３年３月１５日出願の米国仮出願第６１／７９１，７５８号に対して、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に従って優先権の権益を主張する。
ＰＫＣは、非受容体型セリンスレオニンプロテインキナーゼの最大の遺伝子ファミリーの１つである。ＰＫＣが８０年代初期に発見され、ホルボールエステルの主要な受容体であると確認されて以来、数多くの生理学的なシグナル伝達機序が、この酵素によって引き起こされるとされている。Ｋｉｋｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）、第２５７巻、１３３４１〜１３３４８頁；Ａｓｈｅｎｄｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８３）、第４３巻：４３３３〜４３３７。ＰＫＣへの関心は、カルシウム、ならびにその生成が成長および分化因子の作用によるリン脂質代謝回転と共役するエフェクターである、ジアシルグリセロール（およびホルボールエステル模倣物）によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化しうる、その独特な能力に端を発する。ＰＫＣの活性化には、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／または１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ホスファチジル−Ｌ−セリン、ＰＳ）が異なる結合部位において結合することが必要である。ＰＫＣの直接の活性化に代わる手法は、たとえば、ホスホリパーゼ、たとえばホスホリパーゼＣγを活性化する、Ｓｅｒ／ＴｈｒキナーゼであるＡｋｔを、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を経由して刺激する、または内因性の活性化因子であるＤＡＧのレベルを増大させることによる、間接的なＰＫＣ活性化によるものである。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２００９）第３４巻、１３６〜１４５頁。たとえば、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤は、内因性リガンドであるジアシルグリセロールのレベルを高め、それによって、ＰＫＣの活性化を引き起こしうる。Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ（２００２）、第１３巻、７２５〜７３３頁。ホルボールエステルは、腫瘍促進活性を有するので、最終的な創薬に適する化合物ではない。ｌｂａｒｒｅｔａら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ（１９９９）、第１０巻、１０３５〜１０４０頁。
ＰＫＣ遺伝子ファミリーは、１１の遺伝子からなり、これらの遺伝子は、４つの亜群：（１）古典的ＰＫＣα、β１、β２（β１およびβ２は、同じ遺伝子の選択的スプライシングによる形態である）、およびγ、（２）新規ＰＫＣδ、ε、η、およびθ、（３）非定型ＰＫＣζおよびι／λ、ならびｂに（４）ＰＫＣμに分けられる。ＰＫＣμは、新規ＰＫＣイソ型に似ているが、推定上の膜貫通ドメインを有する点が異なる。Ｂｌｏｂｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．（１９９４）、第１３巻、４１１〜４３１頁；Ｈｕｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９３）第２９１巻、３２９〜３４３頁；Ｋｉｋｋａｗａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）、第５８巻、３１〜４４頁。古典的ＰＫＣイソ型のα、β１、β２、およびγは、Ｃａ2+、リン脂質、およびジアシルグリセロールに依存的であるのに対し、他のイソ型は、リン脂質、ジアシルグリセロールによって活性化されるが、Ｃａ2+に依存的でなく、活性化因子が必要でない場合もある。すべてのイソ型が、５つの可変領域（ＶＩ〜Ｖ５）を含み、α、β、およびγイソ型は、高度に保存されている４つの（Ｃ１〜Ｃ４）構造ドメインを含んでいる。ＰＫＣα、β、およびγを除くすべてのイソ型は、Ｃ２ドメインをもたず、ι／λおよびηイソ型は、ジアシルグリセロールが結合する、Ｃ１におけるシステインに富んだ亜鉛フィンガードメインも、２つのうち９つ欠如している。Ｃ１ドメインは、すべてのイソ型の間で高度に保存され、また基質結合部位をブロックして不活性な立体構造の酵素を生成することにより自己調節的な機能の役に立つ、偽基質配列も含んでいる。Ｈｏｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）、第２３８巻、１７２６〜１７２８頁。
多様なＰＫＣイソ型は、こうした構造上の特色のために、生理学的刺激に応答したシグナル伝達ならびに悪性形質転換および分化において、高度に特殊化された役割を有すると考えられる。Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８９）、第１０巻、１８９２〜１９０３頁； Ｇｌａｚｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ、１７１〜１９８頁、ｌ．Ｆ．Ｋｕｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９９４。ＰＫＣモジュレーターについての論述に関しては、たとえば、それぞれがその全体で参照によりここに援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１４１（ＷＯ９７／４３２６８）号ならびに米国特許第５，６５２，２３２号、６，０８０，７８４号、５，８９１，９０６号、５，９６２，４９８号、５，９５５，５０１号、５，８９１，８７０号、および５，９６２，５０４号を参照されたい。
ＰＫＣの活性化は、学習および記憶を向上させることが示されている。たとえば、それぞれがその全体で参照によりここに援用される、Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００７）第１０４巻、１９５７１〜１９５７８頁；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００７１０１（ＷＯ２００３／０７５８５０）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０８２０（ＷＯ２００４／００４６４１）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８５２２（ＷＯ２００６／０３１３３７）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９１１０（ＷＯ２００７／０１６２０２）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２４５４（ＷＯ２００８／０１３５７３）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１７５５（ＷＯ２００８／１００４４９）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６１５８（ＷＯ２００８／１４３８８０）号、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１９２７（ＷＯ２０１０／０１４５８５）号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３１５号、ならびに米国出願第１２／０６８，７３２号、１０／１６７，４９１号（現在は米国特許第６，８２５，２２９号）、１２／８５１，２２２号、１１／８０２，７２３号、１２／０６８，７４２号、および１２／５１０，６８１号を参照されたい。ＰＫＣ活性化因子は、短期間（約１４分）の全身低酸素と組み合わせた２血管閉塞によって全脳虚血を誘発してから２４時間以上経過後に投与することで、卒中によって誘発された記憶および学習障害の治療に使用されている。Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００８）第１０５巻、１３６２０〜１３６２５頁；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００９）第１０６巻、１４６７６〜１４６８０頁。
ＰＫＣ活性化因子
ＰＫＣ活性化因子としては、たとえば、大環状ラクトン、ブリオログ（bryolog）、イソプレノイド、ダフナン型ジテルペン、二環式トリテルペノイド、ナプタレンスルホンアミド、８−［２−（２−ペンチルシクロプロピル）メチル］−シクロプロパンオクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、成長因子、成長因子活性化因子、一価不飽和脂肪酸、および多価不飽和脂肪酸が挙げられる。
さらに、たとえば、大環状ラクトンとしては、限定はしないが、ブリオスタチン、たとえば、ブリオスタチン１、ブリオスタチン２、ブリオスタチン３、ブリオスタチン４、ブリオスタチン５、ブリオスタチン６、ブリオスタチン７、ブリオスタチン８、ブリオスタチン９、ブリオスタチン１０、ブリオスタチン１１、ブリオスタチン１２、ブリオスタチン１３、ブリオスタチン１４、ブリオスタチン１５、ブリオスタチン１６、ブリオスタチン１７、およびブリオスタチン１８、またはネリスタチン（neristatin）、たとえば、ネリスタチン１が挙げられる。
ブリオログ（ブリオスタチンの類似体）は、当業界で知られている。たとえば、すべて、その全体が参照によりここに援用される、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）、第１巻、１〜１１頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）、第９５巻、６６２４〜６６２９頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）、第１２４巻、１３６４８〜１３６４９頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．（２００６）、第８巻、５２９９〜５３０２頁を参照されたい。ブリオログは、たとえば、米国特許第６，６２４，１８９号および７，２５６，２８６号にも記載されている。ブリオログの非限定的な例としては、Ａ環およびＢ環ブリオログが挙げられる。
その全体が参照によりここに援用される、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）、第３４巻、３９１６〜３９２０頁に記載されているとおり、ファルネシルチオトリアゾールなどのイソプレノイドも、本開示に適するＰＫＣ活性化因子である。別の例は、その全体が参照によりここに援用される、Ｆｕｊｉｋｉら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８７）、第４９巻、２２３〜２６４頁；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８２）、第１０４巻、１１５９〜４１６６頁に記載のものなどの、テレオシジンと同類の非ホルボールプロテインキナーゼＣ活性化因子である、オクチルインドラクタムＶである。
ジテルペンの非限定的な例としては、グニジマクリン（gnidimacrin）およびインゲノールが挙げられ、トリテルペノイドの例としては、イリパリダール（iripallidal）が挙げられる。Ｎ−（ｎ−ヘプチル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミド（ＳＣ−１０）およびＮ−（６−フェニルヘキシル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミドを始めとするナプタレンスルホンアミドは、参照によりここに援用される、Ｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）、第２５巻、４１７９〜４１８４頁に記載されているような、別のクラスのＰＫＣ活性化因子の仲間である。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、たとえば、６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）や［３−［２−［４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）も、ＰＫＣを間接的に活性化することにより、本開示におけるＰＫＣ活性化因子として適するといえる。
様々な成長因子、たとえば、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）やインスリン成長因子が、ＰＫＣ経路を通して機能しており、ここで開示する方法に適する。さらに、成長因子、たとえば、ＮＧＦやＢＤＮＦの合成および／または活性化を刺激する、４−メチルカテコール誘導体、たとえば、４−メチルカテコール酢酸（ＭＣＢＡ）を含めるがこれらに限定はしない、成長因子活性化因子が、ここに含まれる。
多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）、たとえば、アラキドン酸や２−ヒドロキシ−９−ｃｉｓ−オクタデセン酸（すなわち、ｍｉｎｅｒｖａｌ）、およびＰＵＦＡ誘導体、たとえば、ＣＰＡＡ（シクロプロパン化アラキドン酸）、ＤＣＰＬＡ（すなわち、リノール酸誘導体）、ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル（すなわち、アラキドン酸誘導体）、ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル（すなわち、ドコサヘキサエン酸誘導体）、ＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル（すなわち、エイコサペンタエン酸誘導体）、ならびにシクロプロパン化ルーメン酸、シクロプロパン化α−エレオステアリン酸、シクロプロパン化カタルプ酸、およびシクロプロパン化プニカ酸（punicic acid）から選択されるω−５およびω−７ ＰＵＦＡ誘導体は、ここで開示する候補ＰＫＣ活性化因子の非限定的な例である。
別のクラスのＰＫＣ賦活脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸（「ＭＵＦＡ」）誘導体、たとえば、シクロプロパン化オレイン酸、シクロプロパン化エライジン酸（以下で示す）、およびエポキシ化化合物、たとえば、ｔｒａｎｓ−９，１０−エポキシステアリン酸である。
加えて、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪アルコール、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪酸エステルが、候補ＰＫＣ活性化因子化合物の非限定的な例として挙げられる。
プロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）の最適な活性化は、正常および罹病状態において認知に影響を及ぼす多くの分子機構において役割を果たす。そのため、神経保護性ＰＫＣ活性化因子であると考えてよい潜在的な化合物を、詳細なパラメータを試験する種々のアッセイを使用してスクリーニングして、たとえば、アルツハイマー病の治療における最終的な創薬に適する化合物を見出すことが求められている。本開示の方法は、こうした要求を満たし、たとえば、アルツハイマー病および他の神経変性疾患の臨床処置を大いに改善することに加え、予防的に、認知力強化の向上をもたらす。
ここでは、細胞を神経変性から保護し、かつ／またはＣＮＳ障害、たとえば、アルツハイマー病を治療することのできる神経保護性ＰＫＣ活性化因子を特定する方法が提供される。ここで開示する方法は、潜在的な化合物を分析して、化合物が、細胞を神経変性から保護し、かつ／またはＣＮＳ障害、たとえば、アルツハイマー病を治療するのに必要となる、ある特定の属性を含むかどうかを判定することを包含する。
したがって、本開示は、アルツハイマー病の治療において有用な神経保護性ＰＫＣ活性化因子を特定する方法を対象とする。開示する方法は、ＰＫＣ活性化因子化合物候補を、ここでは次のように称する、列挙される判断基準：（１）非腫瘍形成性、（２）非毒性、（３）脳接触容易性、（４）ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε活性、（５）最小限のＰＫＣ−ε下向き調節、（６）シナプス形成性、（７）抗アポトーシス、（８）ＡＳＰＤからの神経保護、（９）ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性からの保護、（１０）正常動物モデルにおける学習および記憶の強化、（１１）下流のシナプス形成性生化学的事象の誘導、（１２）Ａβ分解酵素の活性の増大、（１３）ｔａｕのＧＳＫ３Ｂリン酸化の阻害、および（１４）α−セクレターゼの活性化に従ってスクリーニングする。
ここで開示する方法によれば、候補ＰＫＣ活性化因子は、脳接触容易性、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε活性を示すこと、最小限のＰＫＣ−ε下向き調節、シナプス形成性、および抗アポトーシスの潜在的可能性という５項目の判断基準を使用して査定する。さらに、候補ＰＫＣ活性化因子は、治療上有用となるために、非腫瘍形成性および非毒性となりうる能力を含む。したがって、候補ＰＫＣは、神経保護性ＰＫＣ活性化因子として適格であるために、最低でも、列挙した判断基準の少なくとも７項目を含む。
別の態様では、開示する方法は、上で定めた７項目の判断基準を満たす候補ＰＫＣ活性化因子を含むが、神経保護性ＰＫＣ活性化因子として適格であるために、少なくとも１項目の他の追加判断基準を満たす、たとえば、列挙した判断基準の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、または１４項目を満たす候補ＰＫＣ活性化因子をさらに含んでもよい。少なくとも一態様では、開示する方法は、脳接触が容易であり、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε活性を示し、ＰＫＣ−ε下向き調節が最小限であり、シナプス形成性を誘導し、抗アポトーシスの潜在的可能性を有し、非腫瘍形成性であり、非毒性であり、また少なくとも１項目の他の判断基準として、たとえば、ＡＳＰＤから保護する、またはｉｎ ｖｉｖｏ神経変性から保護する、候補ＰＫＣ活性化因子を含む。
図１は、ブリオスタチンの単回静脈内注射後のマウスにおける血漿レベルを示す。 図２は、脳中ブリオスタチンレベルと血漿中ブリオスタチンの、ＰＫＣ下向き調節の差異を示す。 図３は、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫＣ−εの脳接触容易性を示す。 図４は、ブリオスタチン投与から３０分後のＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε移行の用量依存性を示す。 図５は、ブリオスタチン投与から１２０分後のＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε移行の用量依存性を示す。 図６は、ＤＨＡ−ＣＰ６、ＤＣＰＬＡおよびＤＣＰＬＡメチルエステルによる種々のＰＫＣイソ酵素の活性化を示す。 （続き） 図７は、ＤＣＰＬＡメチルエステルまたはブリオスタチンのいずれかで処理したヒト一次ニューロンにおいて、ＰＫＣ−ε活性化により、シナプス形成が誘発されることを示す。 図８は、ＤＣＰＬＡメチルエステルまたはブリオスタチンのいずれかで処理したヒト一次ニューロンにおいて、ＰＫＣ−ε活性化により、神経突起の枝分かれおよび接続が誘発されることを示す。 図９は、ＤＣＰＬＡメチルエステルまたはブリオスタチンのいずれかで処理したＨＣＮ−２細胞において、ＰＫＣ−ε活性化により、シナプス形成が誘発されることを示す。 図１０は、ＤＣＰＬＡメチルエステルまたはブリオスタチンのいずれかで処理したヒト一次ニューロンがアポトーシスを予防することを示す。 図１１（Ａ〜Ｃ）は、ＣＡ１海馬野におけるニューロンにおいて、ブリオスタチンおよびＤＣＰＬＡメチルエステルがアポトーシス細胞死を予防することを示す。 （続き） （続き） 図１２は、ＰＫＣ活性化を介したＥＣＥによるｉｎ ｖｉｖｏでのＡβ分解の流れ図を示す。 図１３（Ａ〜Ｂ）は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞および培養ニューロンにおける、ブリオスタチン、ＤＣＰＬＡ、ＤＨＡ−ＣＰ６、ＥＰＡ−ＣＰ５、およびＡＡ−ＣＰ４によるＥＣＥ活性の結果を示す。 （続き） 図１４は、ブリオスタチンで処理した一次海馬ニューロンが、Ａβによって低下したＮＴＦ ｍＲＮＡ発現を元の状態に戻すことを示す。 （続き） （続き） 図１５は、ＤＣＰＬＡで処理した一次海馬ニューロンが、Ａβによって低下したＮＴＦ ｍＲＮＡ発現を元の状態に戻すことを示す。 図１６は、ＤＣＰＬＡメチルエステルで処理した一次海馬ニューロンが、Ａβによって低下したＮＴＦ ｍＲＮＡ発現を元の状態に戻すことを示す。 図１７は、ブリオスタチンで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、Ａβによって阻害されたネプリライシンタンパク質の膜局在化を元の状態に戻すことを示す。 図１８は、ブリオスタチンで処理したＳＨ−ｈＮＥＰ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ネプリライシン活性化によるＡβペプチド分解を誘発することを示す。 図１９（Ａ〜Ｊ）は、５ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスにおいて、ブリオスタチンが、海馬ＣＡ１野におけるシナプス後樹状突起スパインおよびシナプスの減少を防ぐことを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２０（Ａ〜Ｉ）は、５ヶ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて、ＤＣＰＬＡによって、海馬ＣＡ１野におけるシナプス減少が予防されることを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２１（Ａ〜Ｆ）は、５ヶ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて、ブリオスタチンおよびＤＣＰＬＡによって、学習および記憶障害ならびにアミロイド斑形成が予防されることを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２２（Ａ〜Ｇ）は、脳虚血が誘発された後、ブリオスタチンによって、学習経験および記憶が奪回されることを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２３（Ａ〜Ｇ）は、脳虚血が誘発された後、ブリオスタチンによって、学習経験および記憶は奪回されるが、感覚運動能力は奪回されないことを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２４（Ａ〜Ｅ）は、長期間のブリオスタチン１によって、背側海馬ＣＡ１野における錐体細胞、神経栄養活性、およびシナプス強度が、虚血によって誘発された損傷から救済されることを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２５（Ａ〜Ｂ）は、ラットにおける外傷性脳損傷の処置におけるブリオスタチン投与の用量依存性を示す。 （続き） 図２６（Ａ〜Ｆ）は、脆弱Ｘ（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ）トランスジェニックマウスにおいて、ブリオスタチンがシナプスの数を回復させることを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２７（Ａ〜Ｄ）は、ブリオスタチンが、水迷路訓練後の健康なラットにおいてキノコ型スパイン形成を強化することを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） 図２８（Ａ〜Ｈ）は、ブリオスタチンが、水迷路訓練後の健康なラットにおいて、個々のＣＡ１錐体ニューロン内で、記憶に特異的なキノコ型スパイン形成を強化することを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図２９（Ａ〜Ｆ）は、活性化したＰＫＣが、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＮＴ−３転写物に安定性をもたらすことを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図３０（Ａ〜Ｈ）は、活性化したＰＫＣによって、ＨｕＤタンパク質のターゲットＮＴＦ ｍＲＮＡへの結合が強化され、ＮＴＦタンパク質発現が増加することを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図３１（Ａ〜Ｅ）は、ブリオスタチンが、水迷路訓練後の健康なラットにおいて、ＰＫＣ−α依存的なｍＲＮＡ安定化タンパク質ＥＬＡＶまたはＨｕの持続した活性化を誘発し、樹状突起スパイン形成およびシナプス前濃縮を増加させることを示す。 （続き） （続き） （続き） （続き） 図３２（Ａ〜Ｂ）は、ブリオスタチンが、脳ニューロンにおけるネプリライシン活性を増大させることを示す。 （続き） 図３３（Ａ〜Ｂ）は、ブリオスタチンが、脳ニューロンにおいて、ネプリライシン膜局在化を強化し、ネプリライシン活性を増大させることを示す。 （続き） 図３４は、ブリオスタチン、ＤＣＰＬＡ、およびＤＨＡ−ＣＰ６が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ＥＣＥを活性化することを示す。 図３５は、ブリオスタチンが、脆弱Ｘマウスの海馬において、ＧＳＫ−３βのリン酸化を増加させることを示す。 図３６（Ａ〜Ｂ）は、ブリオスタチン、ベンゾラクタム、およびスタウロプソリン（stauropsorin）間の、ヒト線維芽細胞におけるＡＰＰ−α分泌の較差を示す。 （続き）
説明
ここで開示する方法を使用して、細胞を神経変性から保護し、かつ／またはＣＮＳ障害、たとえば、アルツハイマー病を治療することのできる神経保護性ＰＫＣ活性化因子が特定される。認知症の最も一般的な形であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、最近の記憶の喪失から始まり、細胞外のアミロイド斑と細胞内の神経原線維濃縮体という、脳における２つの主要な病理学的徴候と関連付けられている。これらは、通常、シナプスの有意な減少と関連する。アミロイド斑は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ経路によって切断されて生じる、Ａβペプチドオリゴマーの凝集によって形成されるが、αセクレターゼは、非毒性でシナプス形成性の可溶性ＡＰＰ−αを生じる。蓄積された所見からは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）イソ酵素αおよびεが、α−セクレターゼを媒介とするＡＰＰ切断を直接（Ｓｌａｃｋら、１９９３；Ｋｉｎｏｕｃｈｉら、１９９５；Ｊｏｌｌｙ−ＴｏｒｎｅｔｔａおよびＷｏｌｆ ２０００；Ｙｅｏｎら、２００１；Ｌａｎｎｉら、２００４）、かつ／または細胞外シグナルによって調節されるキナーゼ（ＥＲＫｌ／２）のリン酸化を介して間接的に（Ｄｅｖａｒｉら、２００６、Ａｌｋｏｎら、２００７）に活性化されることが示唆される。
多くの所見は、ＰＫＣシグナル伝達経路が、ＡＤの神経変性性病態生理における事象、たとえば、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）を媒介とするＡβ分解を調節することも示唆している（Ｎｅｌｓｏｎら、２００９）。ＡＤ−トランスジェニックマウスにおいてＰＫＣ−εをｉｎ ｖｉｖｏで過剰発現させることにより、アミロイド斑が減少している（Ｃｈｏｉら、２００６）。
他の研究は、ＡＤに特有の病理学的異常を、血液、皮膚線維芽細胞、および眼組織を含めた、脳以外の組織において見出すことができる証拠を提供している（Ｇｕｒｒｅｉｒｏら、２００７、Ｒａｙら、２００７）。ＡＤの皮膚線維芽細胞では、たとえば、特有のＫ+チャネル（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９３；１９９４）、ＰＫＣイソ酵素（Ｇｏｖｏｎｉら、１９９３、Ｆａｖｉｔら、１９９８）、Ｃａ+シグナル伝達（Ｉｔｏら、１９９４）、ＭＡＰキナーゼＥｒｋ１／２リン酸化（Ｚｈａｏら、２００２；ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００６）、およびＰＰ２Ａ（Ｚｈａｏら、２００３）の欠陥が見出されている。
家族性ＡＤ患者については、皮膚線維芽細胞がＡβ分泌の増強を示したが（Ｃｉｔｒｏｎら、１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９９４）、正常なヒト線維芽細胞では、Ａβ1-40によって、特有のＫ＋チャネルのＡＤ特異的な減少が誘発された（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９３；１９９４）。たとえば、剖検によって確認され、内部制御された、皮膚線維芽細胞中のリン酸化されたＥｒｋ１／２末梢バイオマーカーは、有望な感度および特異性を有することが示されている（ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００６；２０１０）。さらに他の研究は、ＡＤ患者の特定の脳領域におけるＰＫＣの欠陥を示唆している（Ｍａｓｌｉａｈら、１９９１）。
最後に、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的活性化因子は、異なる２系統のＡＤマウスを、ＡＤに特徴的な病理学的および認知的異常のすべてから防御しうることも示されている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１）。こうした所見と一致して、ＰＫＣ−αおよび−εは、ＡＤトランスジェニックマウスにおいて有意に減少しており、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的活性化因子での処置によって、正常レベルに回復したことがわかっている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１）。
上述のとおり、アルツハイマー病の病理は、数多くのバイオマーカーの存在によって認めることのできる神経障害の単なる一例である。神経障害、たとえば、アルツハイマー病の治療にとっての創薬の利益は、ＰＫＣ活性化因子が、治療する神経障害の病理に与える効果、たとえば、ＰＫＣ活性化因子が、高められたＡβ分泌にどのように影響を及ぼすのか、ならびにそれがＡＤ患者に与える全体的な効果を理解することである。したがって、ここで開示する方法は、詳細なパラメータを試験する種々のアッセイを使用しながら潜在的な神経保護性ＰＫＣ活性化因子を分析して、たとえば、アルツハイマー病の治療における最終的な創薬に適する化合物を見出すものである。
定義
本明細書で使用するとき、「上向き調節する」または「上向き調節」とは、作用因子、たとえば、ＰＫＣタンパク質または転写物の量または活性を、限定はしないが、転写、翻訳の増加、および／または転写物もしくはタンパク質産物の安定性の向上を始めとする、いずれかの機序によって、ベースライン状態を基準として増大させることを意味する。
本明細書で使用するとき、「下向き調節する」または「下向き調節」とは、作用因子、たとえば、ＰＫＣタンパク質または転写物の量または活性を、限定はしないが、転写、翻訳の減少、および／または転写物もしくはタンパク質産物の安定性の低下を始めとする、いずれかの機序によって、ベースライン状態を基準として低下させることを意味する。
「神経変性」とは、ニューロンの死を含めて、ニューロンの構造または機能の進行性の喪失を指す。
「シナプス」は、ニューロン間、またはニューロンと他のタイプの細胞間の機能的な接続である。シナプスは、一般に、軸索を樹状突起に接続するだけでなく、軸索を細胞体に、軸索を軸索に、また樹状突起を樹状突起にも接続する。
本明細書で使用するとき、「シナプス形成」とは、シナプスの形成、すなわち、シナプス前ニューロンにおける神経伝達物質放出部位と、シナプス後ニューロンにおける受容野の形成を含む過程を指す。シナプス前終末、またはシナプスボタンは、シナプス前細胞の軸索の端にある終端の球状部であり、シナプス小胞と呼ばれる、膜を境界とする小さな球体に封入された神経伝達物質を収容する。シナプス後ニューロンの樹状突起は、シナプス後肥厚部（ＰＳＤ）と呼ばれるタンパク質のネットワークに接続している、神経伝達物質受容体を収容する。ＰＳＤ中のタンパク質は、神経伝達物質受容体の固定および輸送、ならびにこうした受容体の活性の変調に関与する。受容体およびＰＳＤは、多くの場合、樹状突起スパインと呼ばれる、主たる受容突起軸から特化した突出部に見出される。
用語「治療上有用なＰＫＣ活性化因子」とは、測定可能な治療応答をもたらす候補ＰＫＣ活性化因子化合物を指す。治療応答は、症状および代理臨床マーカーの改善を含めて、使用者（たとえば、臨床医）によって、療法に対する有効な応答であると認識される、どんな応答でもよい。したがって、治療応答は、一般に、疾患または状態、たとえばＡＤの１つ以上の症状の寛解または抑制となる。測定可能な治療応答には、治療薬による、症状もしくは疾患の予防、または発症の遅延、または別な形での緩和を発見することも含める。
本開示の目的では、「神経疾患」とは、ＡＰＰのβ−アミロイド生成性プロセシングと関連付けられる、いずれかの中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）疾患を指す。このＡＰＰプロセシングは、限定はしないが、ニューロンの減少、ニューロンの変性、ニューロンの脱髄、グリオーシス（すなわち、アストログリオーシス）、または異所性タンパク質もしくは毒素（たとえば、Ａβ）のニューロンもしくは神経外への蓄積を始めとする、ニューロンまたはグリア細胞の欠陥を結果として生じることがある。一例となる神経疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である。別の例となる神経疾患は、脳アミロイド血管障害とも呼ばれる、コンゴーレッド親和性血管障害（ＣＡＡ）である。
判断基準
以下のサブセクションで、ＰＫＣ化合物候補が、神経変性から保護し、かつ／またはＣＮＳ障害を治療することにおいて、治療上有用なＰＫＣ活性化因子として適格であるかどうかの判定に使用する判断基準を定める。
本開示の少なくとも一態様によれば、候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、最低でも、脳接触容易性、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε活性を示すこと、ＰＫＣ−εの最小限の下向き調節、シナプス形成性、抗アポトーシスの潜在的可能性、非腫瘍形成性、および非毒性から選択される、列挙した判断基準の７項目を含む。他の態様では、たとえば、神経保護性ＰＫＣ活性化因子として適格となるのに、列挙した判断基準の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、または１４項目を満たさなければならない。たとえば、候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、上で列挙した７項目の判断基準を含み、ＡＳＰＤからの保護、ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性からの保護、正常動物モデルにおける学習および記憶の向上、下流のシナプス形成性生化学事象の誘導、Ａβ分解酵素の活性化、ＧＳＫ３βの阻害、ならびにα−セクレターゼの活性化から選択される、少なくとも１項目の追加判断基準をさらに含む。
非腫瘍形成性
ＣＮＳ障害における治療に有用となる候補ＰＫＣ活性化因子は、非腫瘍形成性である。したがって、本開示によれば、候補ＰＫＣ活性化因子は、非腫瘍形成性である。これは、候補ＰＫＣ活性化因子を腫瘍形成性について評価または査定するとき、非腫瘍形成性となることを意味する。
いくつかのＰＫＣ活性化因子が特定されているが、一部のＰＫＣ活性化因子、たとえば、ホルボールエステルは、腫瘍促進活性を有するため、最終的な創薬に適する化合物でない（Ｉｂａｒｒｅｔａら（１９９９）、Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｐｏｒｔ １０（５＆６）：１０３５〜４０）。ブリオスタチンは、ホルボールエステルと異なり、腫瘍成長を促進せず（臨床試験で証明されている）、ホルボールエステルの腫瘍促進活性を打ち消す（試験で証明されていない）。（Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｅ Ｌｏｗ−Ｇｒａｄｅ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｖａｒｔｅｒａｓｉａｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第６巻、８２５〜２８頁（２０００））。
非腫瘍形成性活性化因子は、ホルボールエステルなどの腫瘍形成性活性化因子とは異なり、ＨＬ−６０細胞のマクロファージ様分化を誘発しない。たとえば、ブリオスタチンは、ホルボールエステルによって誘発される、ＨＬ−６０細胞の分化をブロックすることが示されており、４８時間内に適用すれば、さらなる分化を、用量依存的に停止させる（Ｋｒａｆｔら（１９８６）、ＰＮＡＳ ８３（５）：１３３４〜１３３８）。ブリオスタチンは、ホルボールエステルに対する分化応答を元に戻し、ホルボールエステルによる細胞付着の誘発をブロックすることも示されている（Ｄｅｌｌ’Ａｑｕｉｌａら（１９８７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（２２）：６００６〜６００９）。構造の違いが、種々のＰＫＣ活性化因子によって示される腫瘍促進に差が出る理由ともいえる（Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，ＡＰら（１９９７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：１３１６〜１３２６）。
ＰＵＦＡも、ＰＫＣを活性化し、低濃度から中程度の濃度で、がんに対する強力な防御を有することが知られている（Ｃｒｅｍｏｎｅｚｚｉら（２００４）、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ．４２（１２）：１９９９〜２００７；Ｓｉｌｖａら（１９９５）、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、５３（４）：２７３〜２７７；Ｓｉｌｖａら（２０００）、Ｅｘｐ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．５２（１）：１１〜６）。
非腫瘍形成性を実証するための一試験が、ＡＭＥＳ試験である。ＡＭＥＳ試験は、化学化合物の潜在的な突然変異誘発性についての迅速なスクリーニングである。陽性の試験は、化学化合物が突然変異誘発性であり、したがって、がんは多くの場合突然変異と結び付けられることから、発癌物質として作用する場合があることを示唆する。既知の全発癌物質の５０％〜７０％が、ＡＭＥＳ試験において陽性と判定される。
これに応じて、少なくとも一態様では、たとえば、統計学的に有意な陰性のＡＭＥＳ試験結果を出した候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、ＣＮＳ障害の治療において治療上有用であるかどうかを判定するために、残りの判断基準の分析を続けてよいことが示唆される。逆に、候補ＰＫＣ活性化因子化合物が陽性のＡＭＥＳ試験結果を出した場合、その候補は、ここで開示する方法に治療上有用であるとみなされない。
非毒性
ＣＮＳ障害における治療に有用となる、潜在的なＰＫＣ活性化因子化合物は、非毒性である。したがって、本開示によれば、候補ＰＫＣ活性化因子は、非毒性である。
非毒性は、一定用量のＰＫＣ活性化因子を投与し、特定のバイオマーカーのレベルの変化を対象サンプルと比較することにより測定できる。たとえば、タンパク質、リンパ球、無機質、トリグリセリドなどのバイオマーカーの内部レベルの変化は、毒性を示唆することがあり、したがって、ＣＮＳ障害の治療に相応しい治療選択肢でない。
これに応じて、少なくとも一態様では、たとえば、有効用量の候補ＰＫＣ活性化因子化合物を投与した後、バイオマーカーの正常な細胞レベルに統計学的有意差を生じたＰＫＣ活性化因子は、その候補ＰＫＣ活性化因子が毒性であり、したがって、ＣＮＳ障害の治療に治療上有用でないことが示唆される。
脳接触容易性
神経変性からの保護およびＣＮＳ障害の治療において有用なＰＫＣ活性化因子として適格となるために、ＰＫＣ活性化因子は、脳に接触する。したがって、候補ＰＫＣ活性化因子は、ここで開示する方法に従って脳に接触可能となりうる能力を含む。
ＰＫＣ活性化因子が脳に接触したかどうかを測定する一手段は、ＰＫＣ活性化因子を投与した後、血漿中と脳中のＰＫＣ活性化因子を測定することによるものである。ＰＫＣ活性化因子の投与後に、かなりのレベルのＰＫＣ活性化因子が脳に存在する場合、その活性化因子は、脳接触容易である。たとえば、候補ＰＫＣ活性化因子化合物を投与してから一定期間、たとえば、２０分〜８０分の範囲の期間、たとえば、３０分〜６０分間経過後、ＰＫＣ活性化因子が依然として脳に存在する場合、その候補化合物は、脳接触容易性を有するとみなされる。
脳接触容易性の別の尺度は、ＰＫＣ−εの活性化および移行の増加である。すなわち、脳におけるＰＫＣ−ε移行を対象と比べた％計算値は、治療上有用なＰＫＣ活性化因子を特定するための別のバイオマーカーである。
ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε特異性
ここで開示する方法によれば、候補ＰＫＣ活性化因子は、神経変性に対して、またＣＮＳ障害の治療において、保護性となる能力を含む。
ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的活性化因子は、異なる２系統のアルツハイマー病マウスを、ＡＤに特徴的な病理学的および認知的異常のすべてから防御しうることが示されている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１）。こうした所見と一致して、ＰＫＣ−αおよび−εは、ＡＤトランスジェニックマウスでは有意に減少することが判明しており、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的活性化因子での処置によって正常レベルに回復した（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１）。
一まとめにして、これらおよび他の以前の研究は、１）ＡＤが、症状としての結果が脳機能に限定された、全身性の病理学的発現を有し、２）シナプスの減少、Ａβおよびアミロイド斑の生成、ならびに神経原線維濃縮体における、ＧＳＫ−３βを媒介とするｔａｕの過剰リン酸化を始めとする、ＡＤ病理の主要な側面の調節において、ＰＫＣイソ酵素、特にαおよびεが肝要な役割を果たすという、２つの重要な含みをもつ。
ＰＫＣ活性化因子化合物によるＰＫＣ−εの活性化は、治療上有用なＰＫＣ活性化因子を、ここでの方法に従って特定するためのもう一つのマーカーである。たとえば、細胞中のＰＫＣ−ε活性レベルの測定は、たとえば、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡによって求めることができる。少なくとも一態様では、ＰＫＣ活性化因子は、ＰＫＣ−εを±１５％および／または３０％ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−δ活性で活性化する、たとえば、ＰＫＣ−εを±１５％ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−δ活性で活性化すれば、有用な活性化因子として適格である。
最小限の下向き調節
ＣＮＳ障害の治療における治療的ＰＫＣ活性化因子として適格となるために、ＰＫＣ活性化因子は、ＰＫＣの下向き調節を最小限にしか誘導しない。
シナプス形成性
シナプス形成性を誘導するＰＫＣ活性化因子は、神経変性の予防およびＣＮＳ障害の治療において治療上有用である。したがって、ここで開示する方法によれば、治療上有用な活性化因子として特定されるためには、候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、シナプス形成性を誘導する。
記憶は、情報処理に関係した脳構造においてシナプス修飾が持続する結果であると考えられる。シナプスは、遺伝子発現およびタンパク質翻訳の変化、キナーゼ活性の変更、またはシグナル伝達カスケードの修正のいずれが事象に関与していようと、記憶関連事象がその機能発現を果たすために通る最終目標にある肝要な部位であると考えられる。Ｃａ２＋／カルモジュリンＩＩキナーゼ、ＰＫＣ、カレキシチン（calexcitin）、学習と関連する２２ｋＤａのＣａ２＋結合性タンパク質、およびＩＩ型リアノジン受容体を始めとする、いくつかのタンパク質は、連想記憶との関連が示唆されている。具体的には、ＰＫＣ−ε活性化因子は、ラット空間迷路学習において、学習および記憶、ならびに構造上特異的なシナプス変化を強化することが示されている（ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００７）。大環状ラクトンの投与によるＰＫＣの変調も、シナプス修飾に影響を及ぼす機序をもたらすと考えられている。
ＰＫＣ−εの活性化によって、神経突起の枝分かれおよび接続の増加、ＰＳＤ−９５とシナプトフィジンの斑点状の共局在化の増加、ならびにシナプスの数を含めて、神経突起／シナプス成長が誘発される。こうした要素は、ウエスタンブロット分析によって分析し、顕微鏡法によって可視化することができる。上で列挙した要素のいずれかにおいて統計学的に有意な増加を示す候補ＰＫＣ活性化因子は、好結果である。
抗アポトーシス
アポトーシスを抑制するＰＫＣ活性化因子は、神経変性の予防およびＣＮＳ障害の治療において治療上有用である。したがって、ここで開示する方法によれば、候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、アポトーシスを抑制して、治療上有用な活性化因子となる。
ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−θは、カスパーゼアポトーシス経路の構成要素であるため、多くの場合、アポトーシス促進性の機能を有するとみなされる。一方、ＰＫＣ−εは、反対の役割をもつ。すなわち、その活性化によって、増殖および細胞生存が促進され、アポトーシスが抑制される。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００９、３４（３）：１３６〜１４５を参照されたい。ＰＫＣεの活性化はまた、卒中後またはアルツハイマー病において、シナプス形成を誘発し、またはアポトーシスを予防しうる。たとえば、ＰＫＣ−εの活性化により、神経毒性アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）によって誘発されるアポトーシスが防御される。したがって、アポトーシスの抑制は、ＣＮＳ障害、たとえば、卒中やアルツハイマー病の治療において治療上有用である。
アポトーシスの抑制における候補ＰＫＣ活性化因子の潜在的可能性を明らかにするためには、細胞を候補ＰＫＣ活性化因子化合物で処理し、次いで、たとえば、ウエスタンブロット分析によって分析し、顕微鏡法によって可視化して、アポトーシス細胞のレベルを検出することができる。たとえば、アポトーシス細胞のレベルの統計学的に有意な減少を示す候補ＰＫＣ活性化因子は、好結果である。
ＡＳＰＤからの神経保護
ＡＳＰＤから保護するＰＫＣ活性化因子は、神経変性の予防およびＣＮＳ障害の治療において治療上有用である。したがって、ここで開示する方法によれば、候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、ＡＳＰＤからの保護にもなりうる。
アミロイド斑は、アルツハイマー病の徴候の１つである。アミロイド斑は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ経路によって切断されて生じるＡβペプチドオリゴマー（ＡＳＰＤ）の凝集によって形成される。多くの所見から、ＰＫＣシグナル伝達経路は、ＡＤの神経変性性病態生理の重要な事象、たとえば、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）を媒介とするＡβ分解を調節することが示唆される（Ｎｅｌｓｏｎら、２００９）。
ＰＫＣシグナル伝達経路は、ＡＤの神経変性性病態生理の重要な事象、たとえば、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）を媒介とするＡβ分解を調節する（Ｎｅｌｓｏｎら、２００９）。異なる形態の毒性Ａβオリゴマーが、Ａβを分解するＥＣＥの調節を担う、細胞中のＰＫＣ−εレベルに影響を及ぼすことが考えられる。こうしたタンパク質は、Ａβ除去において重要な役割を果たす。したがって、妥当な仮説は、β−，γ−セクレターゼ活性が高めであるためにＡβが異常に蓄積すると、ＰＫＣ−εが減少し、次いで、ＰＫＣ−εがフィードバックループに関与して、さらなるＡβ上昇を引き起こすというものである。
ＡＳＰＤレベルが増大すると、神経栄養因子細胞（ＮＴＦ）、たとえば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ−３）、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）が減少し、ネプリライシンタンパク質の膜局在化が阻害される。ＰＫＣ活性化因子は、考えられるところでは、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子α変換酵素）、Ａβ分解酵素、たとえばＥＣＥ、インスリン分解酵素、もしくはネプリライシンを活性化する、またはシナプス形成を刺激することにより、ＡＳＰＤからの神経保護を実現することが報告されている。
本開示の少なくとも一態様によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、ニューロンにおいて、ＥＣＥを活性化し、ＡＳＰＤによって減少したＮＴＦ ｍＲＮＡ発現を元に戻し、かつ／またはＡβオリゴマーによって阻害されたネプリライシンタンパク質の膜局在化を元に戻す。たとえば、上で列挙した要素のいずれかにおける統計学的に有意な増進をもたらす候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、ここで開示する方法によれば好結果である。
ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性からの保護
神経保護性ＰＫＣ活性化因子の特徴は、ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性から保護するという特徴である。種々の神経疾患または障害、たとえば、アルツハイマー病、卒中、外傷性脳損傷、および知能障害は、神経変性を招くことがある。したがって、候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、ここで開示する方法に従って、ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性から保護するものでもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏ 神経変性から保護するための一方法は、錐体細胞を救済するなど、ニューロンの減少を防ぎ、海馬ＣＡ１野におけるシナプスの減少、たとえば、シナプス後樹状突起スパイン、たとえばスピノフィリン、およびシナプス前小胞、たとえばシナプトフィジンの減少を防ぐことによるものである。たとえば、ブリオスタチン１での虚血／低酸素後処置により、虚血によって誘発された、シナプス形成、神経栄養活性、ならびに空間学習および記憶の障害が、有効に救済された。ＳｕｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００８、１０５（３６）：１３６２０〜１３６２５５。この効果には、シナプスタンパク質スピノフィリンおよびシナプトフィジンのレベルの増大、ならびにシナプス形態の構造変化が伴った。ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６。
樹状突起スパインの代謝回転は、学習および記憶との関連が示唆されている。詳細には、長期記憶は、一部、新たな樹状突起スパインの成長および既存のスパインの拡大によってもたらされる。学習によって、キノコ型スパインの形成が増進されるが、キノコ型スパインは、長期連想記憶のための構造上の保存部位、および記憶に特異的なシナプス形成のための部位となることが知られている。高速のスパイン代謝回転は、学習能力の向上と関連付けられており、スパインの持続性は、記憶の安定化と関連付けられている。
樹状突起スパイン密度の変化は、シナプス強度を増大させる、記憶および学習によって誘発されるシナプス構造の変化に影響を及ぼす。たとえば、長期記憶は、一部、特定の神経経路を補強する、新たな樹状突起スパインの成長を媒介とする。２つのニューロン間の接続を強化することにより、シナプス前細胞のシナプス後細胞活性化能が高められる。シナプスに放出される神経伝達物質の量の変化、およびこうした神経伝達物質に細胞がどれだけ有効に応答したかの変化を含めて、他のいくつかの機序も、学習および記憶によって誘発されるシナプス構造の変化に関与する（Ｇａｉａｒｓａら、２００２）。記憶は、脳において、相互に接続したシナプスのネットワークによって生じるので、このような変化が、学習および記憶の神経科学的な土台となる。
樹状突起スパイン形態の変化も、加齢に伴うシナプス減少と関連付けられる。アカゲザルの前頭皮質のある特定の野における、興奮性（非対称）と抑制性（対称）の両方のシナプスの密度は、５才から３０才までに３０％低下した。Ｐｅｔｅｒｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００８、１５２（４）：９７０〜８１。これは、認知障害と相関した。同様のシナプス減少は、アルツハイマー病患者の剖検において観察されており、認知機能低下と最も顕著な病理学的相関がある。
ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性から保護する別の方法は、ニューロトロフィン産生を活性化することによるものである。ニューロトロフィン、詳細には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）は、損傷したニューロンおよびシナプスの修復および再成長を開始する、鍵となる成長因子である。一部のＰＫＣイソ酵素、詳細にはＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αが活性化されると、大抵は、ニューロトロフィンの産生が上向き調節されることにより、神経傷害から保護されることが示されている。Ｗｅｉｎｒｅｂら、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４、１８：１４７１〜１４７３。ＰＫＣ活性化因子は、チロシンヒドロキシラーゼの発現を誘発し、ニューロンの生存および神経突起の伸長を誘導することも報告されている。ＤｕおよびＩａｃｏｖｉｔｔｉ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９７、６８：５６４〜６９；ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６；Ｌａｌｌｅｍｅｎｄら、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．、２００５、１１８：４５１１〜２５。
本開示の少なくとも一態様によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、たとえば、タンパク質マーカーであるスピノフィリンまたはシナプトフィジンのレベルの測定による、樹状突起スパイン密度の低下を後退させ、たとえば、当業界で既知の測定技術の使用による、錐体細胞、キノコ型スパイン形状の樹状突起スパイン、およびシナプスの減少を予防する。別の態様によれば、候補ＰＫＣ活性化因子を用いたｉｎ ｖｉｖｏ研究を使用して、たとえば、四分円試験または記憶保持テストにおける成績を評価して、候補物によって学習および記憶障害が予防されたかどうかを見極めることにより、候補物の有効性を判定することができる。候補ＰＫＣ活性化因子化合物によって、スピノフィリンもしくはシナプトフィジン、または錐体細胞、樹状突起スパイン、およびシナプスの統計学的に有意な増加が生じるとき、好結果が認められる。
正常動物モデルにおける学習および記憶の向上
本開示によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、正常な（すなわち、健康な）動物モデルにおいて学習および記憶を向上させる。上の段落で論述したとおり、キノコ型スパインの形成によって、長期連想記憶のための構造上の保存部位、および記憶に特異的なシナプス形成のための部位が設けられることが知られている。したがって、キノコ型スパイン密度は、正常な対象において学習および記憶を向上させるＰＫＣ活性化因子を特定するための別のマーカーとして使用することができ、したがって、ここでの方法による治療上有用なＰＫＣ活性化因子の特定に使用することができる。たとえば、健康なラット細胞におけるキノコ型スパイン密度の測定は、当業界で知られている技術によって決定することができる。少なくとも一態様では、たとえば、キノコ型樹状突起スパインおよびシナプスの数または密度の統計学的に有意な増大を生じる候補ＰＫＣ活性化因子は、好結果である。
下流のシナプス形成性生化学事象の誘導
上で論述したとおり、ＰＫＣは、ニューロトロフィン産生、たとえば、ニューロトロフィン、詳細には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を活性化する。ＰＫＣ活性化因子は、細胞が分泌するアミロイド形成性でない可溶性ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）の相対的な量も増加させる。たとえば、ＰＫＣがブリオスタチンによって活性化されると、ヒト線維芽細胞からアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断して非毒性断片であるｓＡＰＰを生じる、α−セクレターゼが活性化されることが示されている（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら（２００４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：１１１４１〜１１１４６）。
本開示によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、下流のシナプス形成性生化学事象、たとえば、成長因子、たとえばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＩＧＦ、ならびにタンパク質、たとえば、ＧＡＰ４３、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３） ｓＡＰＰα、ＥＬＡＶ（ＥＬＡＶタンパク質は、一般に、遺伝子発現の転写後調節に関与する）の誘導を誘発するものでもよい。
神経栄養因子のタンパク質ＭＲＮＡの存在をマーカーとして使用して、ここでの方法による治療上有用なＰＫＣ活性化因子を特定してもよい。すなわち、たとえば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＩＧＦ、ＧＡＰ４３、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ｓＡＰＰα、およびＥＬＡＶのレベルを統計学的に有意に増大させる候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、好結果である。
Ａβ分解酵素の活性の増大
β−アミロイド（「Ａβ」）は、β−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）のタンパク質切断によって生じる、４ｋＤａのペプチドである。Ａβのオリゴマーは、最も毒性であるとみなされるが、原線維Ａβは、多くが不活性である。単量体Ａβは、正常な患者において見出され、その機能はまだ突き止められていない。
ＰＫＣ活性化因子が、Ａβのレベルを低下させ、ＡＤトランスジェニックマウスの生存を延長しうることは知られている。Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７１８４〜７１８８を参照されたい。ＰＫＣ−εは、Ａβ産生を抑制することにおいて、最も有効であることが示されている。Ｚｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１、２８５：９９７〜１００６を参照されたい。したがって、イソ型に特異的なＰＫＣ活性化因子は、潜在的な抗ＡＤ薬物として非常に望ましい。
本開示によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、Ａβ分解酵素、たとえば、ＥＣＥやネプリライシンの活性を増大させるものでもよい。たとえば、ネプリライシンおよびＥＣＥの活性を統計学的に有意に増大させる候補ＰＫＣ活性化因子化合物は、好結果を示唆する。
ｔａｕのＧＳＫ３βリン酸化の阻害
ＰＫＣイソ酵素、特にαおよびεは、神経原線維濃縮体における、ＧＳＫ−３βを媒介とするｔａｕの過剰リン酸化の調節において肝要な役割を果たし、したがって、アルツハイマー病病理および脆弱Ｘの主要な側面である、Ａβがもたらす神経毒性から、ニューロンを保護する。すなわち、ＧＳＫ−３βは、過剰リン酸化されたｔａｕタンパク質の産生における鍵酵素であり、Ｓｅｒ−９残基のリン酸化によって、ＧＳＫ−３βは阻害され、ＰＫＣによるＧＳＫ−３βのＳｅｒ−９におけるリン酸化を増加させれば、ＰＫＣ活性化因子の保護効果を高めることもできる。したがって、ｔａｕタンパク質のＧＳＫ３βによるリン酸化を阻害するＰＫＣ活性化因子は、薬物療法に望ましい特徴である。
したがって、本開示によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、ｔａｕタンパク質のＧＳＫ−３βによるリン酸化を阻害するものでもよい。遊離のＧＳＫ−３βタンパク質およびリン酸化されたＧＳＫ−３βタンパク質は、リン酸化されたＧＳＫ−３βの増加を測定するマーカーとして使用することができる。たとえば、リン酸化されたＧＳＫ−３βを統計学的に有意に増加させる候補ＰＫＣ活性化因子は、好結果である。
α−セクレターゼの活性化
ＰＫＣ活性化の結果として、ａ−セクレターゼが強化または支持され、アミロイド形成性でない経路が生じる。したがって、ＰＫＣ活性化は、α−セクレターゼ経路を活性化して、有害でないｓＡＰＰを産生するための魅力的な手法である。
したがって、本開示によれば、治療上有用なＰＫＣ活性化因子は、α−セクレターゼ経路を活性化するものでもよい。ｓＡＰＰ−αタンパク質のレベルは、活性化したα−セクレターゼを測定するマーカーとして使用することができる。たとえば、ｓＡＰＰ−αタンパク質のレベルを統計学的に有意に増大させる候補ＰＫＣ活性化因子は、好結果を示唆する。
ここで提供するある特定の態様は、以下の例によって例示することができるが、例は、ここで提供する開示のすべてを一切限定するものでない。
［実施例］
非腫瘍形成性−ＰＫＣ活性化因子のＡＭＥＳ試験
プロトコール：
以下の表１〜４に示す、ブリオスタチン、シクロプロパン化アラキドン酸、ＤＣＰＬＡ、およびＤＨＡＣＰ６についてのＡＭＥＳ試験では、統計学的に有意な陽性反応は得られなかった。試験結果からは、ブリオスタチン、シクロプロパン化アラキドン酸、ＤＣＰＬＡ、およびＤＨＡＣＰ６が、突然変異誘発性でなく、したがって発癌性でないことが示唆される。
非毒性−内部毒性研究
プロトコール
ＰＫＣ活性化因子（ブリオスタチン、シクロプロパン化アラキドン酸、ＤＣＰＬＡ、およびＤＨＡＣＰ６）を治療用量の１０倍で投与してから２４時間後に、種々の生化学マーカーを測定する内部試験を実施した。結果を以下で表５〜７に示す。結果からは、ブリオスタチン、シクロプロパン化アラキドン酸、ＤＣＰＬＡ、およびＤＨＡＣＰ６は、生化学マーカーのレベルにおいて、正常レベルと比べた統計学的有意差を示しておらず、したがって、非毒性ＰＫＣ活性化因子として適格であることが示唆される。
脳接触容易性
ブリオスタチンの単回静脈内注射
プロトコール：
ブリオスタチンの測定値を、高用量のブリオスタチン（１１４μｇ／ｍ２）の投与後の異なる時点で分析した。以下の図１の中段の曲線で示すとおり、ブリオスタチンは、脳において、血漿中と比べて極めて長い半減期を有する。血漿／脳比は、３０を超えることもある。加えて、図２に示すとおり、脳ブリオスタチンは、血漿ブリオスタチンと比べると、ＰＫＣ下向き調節が弱い。
ブリオスタチンによるマウス脳におけるＰＫＣ−ε活性化
プロトコール：Ｃ５７ＢＬ／６Ｍ雄マウス（１５〜２０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、非強化環境において、ケージあたり３匹のマウスとして、７〜８日間順応させた。ブリオスタチン（Ｔｏｃｒｉｓ）をＤＭＳＯに溶解させ、０．９％食塩水中に希釈し、１０および１５μｇ／ｍ２の用量で尾静脈に注射した。一定期間経過後、マウスをＣＯ２で麻酔し、脳をドライアイスで凍結させた。血液は、１ｍＭのＥＤＴＡ ＰＢＳ溶液０．２ｍｌと混合し、１００ｇで３０分間遠心分離し、血漿をドライアイスで凍結させた。一部の実験では、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ試薬を製造者が推奨する手順を使用しながら使用して、血液リンパ球画分を集めた。動物に関する手順はすべて、組織であるＩＡＣＵＣによって承認されている。
ＰＫＣ−εの活性化および移行は、細胞質ゾルと粒状画分への細胞成分分画後にウエスタンブロット法によって測定した。ホモジネートを１００，０００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞質ゾル画分と粒状画分を４〜２０％のＴｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース上にブロットし、イソ酵素特異的抗体で探索した。ＧＥ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔにおいて１６ビット／画素でブロットを撮影し、Ｉｍａｌ Ｕｎｉｘ（登録商標）ソフトウェアを使用して垂直ストリップデンシトメトリーによって解析した。
ブリオスタチンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの尾静脈に、１０および１５μｇ／ｍ２（３．５０および５．２５μｇ／ｋｇに相当する）で注射し、ウエスタンブロットを使用して脳ＰＫＣ−ε濃度を測定した。脳ＰＫＣ−ε活性化は、ブリオスタチンレベルが上昇し続けたとしても、二相性であり、０．５時間で頂点に達し、静止レベルに向かってゆっくりと下降した。これは、以前に確立されたＰＫＣの短期間の活性化と一致する。開始値を下回る下向き調節は認められなかった。０．５時間のブリオスタチン濃度は、０．０２９ｎＭであった。結果を以下の図３に示す。
ＰＫＣαおよびＰＫＣε移行のブリオスタチンによる活性化の用量依存性研究の結果を、以下で図４（投与から３０分後に測定）および図５（投与から１２０分後に測定）に示す。ブリオスタチンが脳ＰＫＣ移行（酵素による活性化の指標）に与える効果も、二相性であり、５〜１０μｇ／ｍ２の用量で最大の効果が認められた。ブリオスタチンによってαイソ型とεイソ型が等しく活性化される、精製されたＰＫＣイソ酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ測定とは対照的に、マウス脳では、ＰＫＣ−εによってのみ、移行が認められた。
ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−ε特異性
プロトコール：精製されたＰＫＣ−α、βＩＩ、γ、δ、またはε（９ｎｇ）を、次のＰＫＣ活性化因子：（Ａ）ＤＨＡ−ＣＰ６、（Ｂ）ＥＰＡ−ＣＰ５、（Ｃ）ＡＡ−ＣＰ４、（Ｄ）ＤＣＰ−ＬＡ、（Ｅ）「他のシクロプロパン化およびエポキシ化脂肪酸、アルコール、およびメチルエステル」と共に室温で５分間プレインキュベートした後、実験手順において記載のとおりにＰＫＣ活性を測定した。結果を以下で図６に示す。図６に示すとおり、ＤＨＡ−ＣＰ６−メチルエステル、ＤＣＰ−ＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−メチルエステルは、ＰＫＣ−ε特異性を示す（±１５％ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−δ）。
シナプス形成性
プロトコール：ヒト一次ニューロンを、ＤＣＰＬＡ−メチルエステル（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）のいずれかで処理した。図７に示すとおり、ＤＣＰＬＡ−メチルエステルまたはブリオスタチン１のいずれかで３０日間処理した細胞は、ＰＳＤ−９５とシナプトフィジンの斑点状の共局在化染色の増加を示し、シナプスの数の増加が示唆された（右側の図で、典型的なシナプスを例示する）。図８に示すとおり、ＤＣＰＬＡ−メチルエステルまたはブリオスタチン１のいずれかで４０日間処理した細胞は、神経突起の枝分かれおよび接続が増加され、生残性の向上を示した。対照的に、未処理細胞は、２０日後に変性を示した。
図９において、ＨＣＮ−２細胞において、ＰＫＣ−εの活性化により、シナプス形成が誘発されることが例証される。ＨＣＮ−２細胞系は、ラスムッセン脳炎と関連する難治性発作のため大脳半球切除を受けている７才の患者から取り出した皮質組織から得た。細胞を、ＤＣＰＬＡ−メチルエステルまたはブリオスタチン１のいずれかで１０日間処理した。図９に示すとおり、ＤＣＰＬＡ−メチルエステルまたはブリオスタチン１のいずれかで処理したＨＣＮ−２細胞は、ニューロンの枝分かれを伴った著しい分化、ならびにＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの斑点状の共局在の増加を示し、シナプシン生成が示唆された。未処理細胞は、枝分かれならびにＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの斑点状の染色のない線維芽細胞様の形態を示した。したがって、ＰＫＣ−ε活性化によって、胎性および成体両方の神経細胞においてシナプス形成が誘発されうる。
抗アポトーシス
プロトコール：ヒト一次ニューロンを、チャンバー付きスライドで成長させ、ＰＫＣ−ε阻害剤の存在下、媒体（対照）、１００ｎＭ ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）、ＡＳＰＤ＋ブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）およびＡＳＰＤ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）、またはＡＳＰＤ＋ブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）で処理した。２４時間インキュベートした後、アネキシンＶフルオレセインを使用して細胞を染色して、アポトーシス細胞を検出しており、結果を以下の図１０に示す。ＡＳＰＤによってアポトーシスが誘発され、ＰＫＣ活性化因子は、ＡＳＰＤが誘発したアポトーシスを防いだ。データは、３通りの独立した実験の平均±ＳＥＭである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
プロトコール：ブリオスタチン１（１５μｇ／ｍ2）は、虚血（２−ＶＯ）／低酸素事象を終えてから２４時間後を出発点として、尾静脈から投与した（２用量／週、１０用量）。最後のブリオスタチン１投与から９日後に、海馬ＣＡ１野におけるアポトーシス細胞死について染色を行った。以下の図１１に、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を媒介とするｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）によって検出し、共焦点顕微鏡によって可視化した（二重盲検試験）、ＣＡ１海馬野におけるアポトーシス細胞死の低倍率（Ａ）および高倍率（Ｂ）の結果を示す。（Ｃ）放射状層におけるＴＵＮＥＬ染色の定量化（ｎ＝３匹、ｎ＝３０共焦点像）。Ｃｏｎ＝対照、Ｂｒｙ＝ブリオスタチン１、Ｉｓｃｈ＝脳虚血、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
ＡＳＰＤからの神経保護
Ａβは、インスリン分解酵素（インスリジン）、ネプリライシン、およびＥＣＥを含めた、いくつかの酵素によって、ｉｎ ｖｉｖｏで分解しうる（図１２）。ＰＫＣ−ε過剰発現は、ＥＣＥを活性化することが報告されているので（Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６；１０３：８２１５〜２０）、ＰＫＣ活性化因子がＥＣＥに与える効果を分析した。候補ＰＫＣ活性化因子を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｂｒｙｏ−０．２７ｎＭ、ＤＣＰ−ＬＡ−１μＭ、およびＤＨＡ−ＣＰ６ １μＭ）または培養ニューロン（ＤＨＡ−ＣＰ６−１μＭ、ＥＰＡ−ＣＰ５−１μＭ、およびＡＡ−ＣＰ４−１μＭ）のいずれかに加え、１２または２４ウェルのいずれかのプレートで成長させた。種々の期間が経過後、細胞を収集し、ＥＣＥ活性を蛍光定量的に測定した。結果を以下で図１３に示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。すべての試験ＰＫＣ活性化因子が、（エタノールのみと比べて）ＥＣＥ活性の増大をもたらした。ＥＣＥは、ジアシルグリセロールが結合するＣＩドメインをもたないことから、これにより、ブリオスタチンによる活性化が、ＥＣＥの直接の活性化によるものでなく、ＰＫＣによってＥＣＥまたは一部のＥＣＥ賦活中間体がリン酸化される結果として生じたに相違ないことが示唆される。この結果からは、ＰＫＣ活性化因子によるＥＣＥの間接的な活性化が、患者におけるＡβのレベルを低下させる有用な手段となりうることも示唆される。
プロトコール：一次海馬ニューロンを、対照緩衝液（未処理）、Ａβ（１μＭ、オリゴマー型）、または０．５ｎＭブリオスタチンで２４時間処理した。一部の細胞は、Ａβプラス０．５ｎＭブリオスタチンで２４時間同時処理し（Ｂｒｙｏ＋Ａβ）、またはＡβで１２時間予め処理し、洗浄し、次いでブリオスタチンでさらに１２時間処理した（Ａβ＋Ｂｒｙｏ）。次いで、細胞を溶解させ、全ＲＮＡを単離した。ラットＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡに対する専用プライマーを使用する実時間ＰＣＲから、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡの相対的な発現変化を定量的に測定した（図１４）。代表的なゲル像も、以下で図１４に示す（平均＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、未処理と比べたＡβ；＃Ｐ＜０．０５、Ａβのみと比べたＢｒｙｏ＋ＡβまたはＡβ＋Ｂｒｙｏ）。
プロトコール：
試験Ａ− ＤＣＰＬＡ（５００ｎＭ）：一次海馬ニューロンを、対照緩衝液（未処理）、Ａβ（１μＭ、オリゴマー）、または５００ｎＭ ＤＣＰＬＡで２４時間処理した。一部の細胞は、Ａβで１２時間予め処理し、次いで５００ｎＭ ＤＣＰＬＡで１２時間処理し（Ａβ＋ＤＣＰ−ＬＡ）、またはＡβプラス５００ｎＭ ＤＣＰ−ＬＡで２４時間同時処理した（ＤＣＰ−ＬＡ＋Ａβ）。全ＲＮＡを単離し、ラットＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡに対する専用プライマーを使用する実時間ＲＴ−ＰＣＲから、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡの相対的な発現変化を定量的に測定した（図１５）。代表的なゲル像も、以下で図１５に示す（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、未処理と比べたＡβ；＃Ｐ＜０．０５、Ａβのみと比べたＡβ＋ＢｒｙｏまたはＢｒｙｏ＋Ａβ）。
試験Ｂ− ＤＣＰＬＡ−メチルエステル（１００ｎＭ）：一次海馬ニューロンを、対照緩衝液（未処理）、１μＭ Ａβ、または１００ｎＭ ＤＣＰ−ＬＡ ＭＥ（メチルエステル型のＤＣＰ−ＬＡ）で２４時間処理した。一部の細胞は、Ａβで１２時間予め処理し、次いで１００ｎＭ ＤＣＰ−ＬＡ ＭＥで１２時間処理し（Ａβ＋ＤＣＰ−ＬＡ ＭＥ）、またはＡβプラス５００ｎＭ ＤＣＰＬＡ ＭＥで２４時間同時処理した（ＤＣＰ−ＬＡ ＭＥ＋Ａβ）。全ＲＮＡを単離し、ラットＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡに対する専用プライマーを使用する実時間ＲＴ−ＰＣＲから、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡの相対的な発現変化を定量的に測定した（図１６）。代表的なゲル像も、以下で図１６に示す（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、未処理と比べたＡβ；＃Ｐ＜０．０５、Ａβのみと比べたＡβ＋ＢｒｙｏまたはＢｒｙｏ＋Ａβ）。
プロトコール：ヒトネプリライシンを過剰発現させるＳＨＳＹ５Ｙ細胞（ＳＨ＋ｈＮＥＰ細胞）を、ブリオスタチン（Ｂｒｙｏ、１ｎＭ）不在または存在下で、１μＭのオリゴマーＡβ（１−４２）と共に４時間インキュベートした。一部の細胞は、Ｒｏ ３２−０４３２（Ｒｏ、２μＭ、ＰＫＣ阻害剤）で３０分間予め処理し、次いでＢｒｙｏで処理した。次いで、細胞表面に位置するタンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンビーズを使用して抽出した後、ネプリライシン抗体を使用して免疫沈降させた。免疫沈降物を、ネプリライシン抗体を使用するウエスタンブロット分析にかけた（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、未処理と比べたＡβ；＃Ｐ＜０．０１、Ｂｒｙｏと比べたＲｏ＋Ｂｒｙｏ）。結果を以下で図１７に示す。
プロトコール：インタクトなＳＨ＋ｈＮＥＰ細胞を、ブリオスタチン（Ｂｒｙｏ、１ｎＭ）不在または存在下で、２．５μｇのモノマーＡβ（１−４２）と共に４時間インキュベートした。一部の細胞は、ブリオスタチン（１ｎＭ）の存在下、ホスホラミドン（ＰＡ、１０μＭ、特異的ネプリライシン阻害剤）、Ｒｏ ３２−０４３２（Ｒｏ、２μＭ、ＰＫＣ阻害剤）、またはＰＡ＋Ｒｏで４時間同時処理した。次いで、２０％トリクロロ酢酸による反応からＡβペプチドを沈殿させ、Ａβペプチド１−１６抗体（６Ｅ１０）を使用して免疫ブロットした。矢印によって、４ｋＤａ前後である、モノマーＡβペプチドの大きさを示す（図１８）。ウエスタンブロットにおいて展開されたタンパク質バンドのデンシトメトリー測定を行い、相対的発現変化として割り当てた（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、未処理と比べたＢｒｙｏ；＃Ｐ＜０．０１、Ｂｒｙｏと比べたＰＡ、Ｒｏ、またはＰＡ＋Ｒｏ）。
ｉｎ ｖｉｖｏ神経変性からの保護
アルツハイマー病：本開示によるＰＫＣ活性化因子は、海馬野におけるシナプス後樹状突起スパインおよびシナプスの減少を防ぎ、アルツハイマー病マウスにおけるシナプス前小胞の減少を防ぐなど、神経変性のｉｎ ｖｉｖｏ徴候を後退させることがある（図１９および２０）。ＰＫＣ活性化因子によって、アルツハイマー病マウスにおける学習および記憶障害ならびにアミロイド斑形成を防ぐこともできる（図２１）。
プロトコール：２ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスに、ブリオスタチン１（３０μｇ／ｋｇ、腹腔内注射）を１週間に２回投与した。５ヶ月齢の時点で、マウスの脳からの海馬切片を、免疫組織化学および共焦点顕微鏡分析用に加工処理した。結果は、ニューロン減少（Ｃ、Ｄ）を原因としないスピノフィリン密度（Ａ、Ｂ）の分析について示す。ブリオスタチンは、ＤｉＩ染色および共焦点顕微鏡観察で評価されたとおり、キノコ型スパイン形状の樹状突起スパイン（Ｅ〜Ｇ）、ならびに、電子顕微鏡観察で評価されたとおり、シナプス（Ｈ〜Ｊ）の減少も予防した。未処置群（野生型およびトランスジェニック（Ｔｇ）マウス）には、処置群と同じ媒体体積、送達機構、および投与頻度を経験させた。
プロトコール：２ヶ月齢の５ＸＦＡＤマウスに、ＤＣＰＬＡ（２０ｍｇ／ｍ2、尾静脈注射）を１週間に２回投与した。５ヶ月齢の時点で、マウスの脳からの海馬切片を、免疫組織化学および共焦点顕微鏡分析用に加工処理した。結果は、軸索ボタン（シナプトフィジン顆粒）（Ｃ）およびニューロン減少（Ｅ、Ｆ）を原因としない、スピノフィリン密度（Ａ、Ｂ）、シナプトフィジン密度（Ａ、Ｄ）の分析について示す。ＤＣＰＬＡは、キノコ型スパイン形状の樹状突起スパインおよびシナプス（Ｇ、Ｉ）の減少も防いだ。未処置群（野生型およびトランスジェニック（Ｔｇ）マウス）には、処置群と同じ媒体体積、送達機構、および投与頻度を経験させた。
プロトコール：５ヶ月齢の５ＸＦＡＤマウスを、直径１１４ｃｍの迷路プールにおいて水面の約２ｃｍ下に沈められた隠れた足場（直径９ｃｍ）を見つけるように、５〜６日間訓練した（３〜４テスト／日）。訓練用テストの後、足場を取り外して探索テスト（四分円試験または記憶保持テスト）を課して、四分円においてマウスが移動した距離によって、その位置についての記憶保持を査定した。ブリオスタチン（３０μｇ／ｋｇ、腹腔内注射）またはＤＣＰ−ＬＡ（２０ｍｇ／ｍ２、尾静脈注射）による処置（２ヶ月齢から開始、２回／週）によって、学習（Ａ、Ｃ）および記憶障害（Ｂ、Ｄ）が予防され、アミロイド沈着が減少した（Ｅ、Ｆ）。未処置群（野生型およびトランスジェニック（５Ｘ）マウス）には、処置群と同じ媒体体積、送達機構、および投与頻度を経験させた。
卒中：本開示によるＰＫＣ活性化因子は、脳虚血と関連する学習および記憶力低下を救済するなど、神経変性のｉｎ ｖｉｖｏ徴候を後退させることがある（図２２および２３）。ＰＫＣ活性化因子はまた、脳虚血によって誘発された損傷後の背側海馬ＣＡ１野において、ニューロン減少を予防し、神経栄養活性およびシナプス強度を増強しうる（図２４）。
プロトコール：試験ラットの初期評価に着手して、その空間学習（２テスト／日、６日間）および記憶（最後のテストから２４時間後に１分の探索テスト）を観察した。探索試験から１日後に脳虚血を引き起こした後、ブリオスタチン１（１５μｇ／ｍ2）を、虚血（２−ＶＯ）／低酸素事象を終えてから２４時間後を出発点として、尾静脈から投与した（２用量／週、１０用量）。最後のブリオスタチン１投与から２週間後に、２回目の探索試験を実施した。虚血／処置前の訓練用テスト（２テスト／日、６日間）の間のラットの空間水迷路成績について、結果をＡに示す（平均±ＳＥＭ；テスト：Ｆ１１，３８３＝４０．４８３、Ｐ＜０．００１；群：Ｆ３，３８３＝０．３１５、Ｐ＞０．０５）。訓練用テスト後、虚血および／または処置前の探索試験の結果をＢ〜Ｅに示す（四分円４が目標物四分円であった）。虚血および／または処置の前（事前−Ｉｓｃｈ）および後（事後−Ｉｓｃｈ）の目標物四分円比率について、結果をＦに示す。虚血および／または処置の前（事前−Ｉｓｃｈ）および後（事後−Ｉｓｃｈ）の、目標物位置の最初の横断の待ち時間について、結果をＧに示す。ラットは、８匹／群であった（Ｂｒｙ−ブリオスタチン１、Ｉｓｃｈ−脳虚血）（＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ：Ｐ＞０．０５）。
プロトコール：ブリオスタチン１（１５μｇ／ｍ2）を、虚血（２−ＶＯ）／低酸素事象を終えてから２４時間後を出発点として、尾静脈から投与した（２用量／週、１０用量）。空間学習（２テスト／日、４日間）および記憶（１分の探索試験、最後のテストから２４時間後）におけるラットの能力を、ブリオスタチン１の最後の投与から９日後に最初の訓練を開始して評価した。訓練用テスト（平均±平均値の標準誤差）の間の逃避潜時について、結果をＡに示し、Ｂ〜Ｅには、訓練用テスト後の記憶保持試験の結果を示し（四分円４が、訓練用テストの際に隠れた足場が置かれた目標物四分円であった）、Ｆは、（目標物四分円水泳距離を非目標物四分円における平均水泳距離で割ることにより算出した）目標物四分円比率についての結果を示し、Ｇは、（新たな位置に置かれた目に見える足場を用いた）可視足場試験の結果を示す。（Ｂｒｙ−ブリオスタチン１、Ｉｓｃｈ−脳虚血、ＮＳ−有意でない）（＊Ｐ＜０．０５）。
プロトコール：ラットに、ブリオスタチン１（１５μｇ／ｍ2、尾静脈注射）を、虚血／低酸素事象を終えてから２４時間後に開始して５週間投与した。最後のブリオスタチン１投与から９日後（虚血／低酸素事象からおよそ７週間後）、結果は、ブリオスタチンが、ニューロン減少を予防したことを示唆した（Ａ）。ブリオスタチン１は、脳虚血によって引き起こされる脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の免疫蛍光強度の増大も誘発した（Ｂ）。ブリオスタチン１は、Ｃ（免疫組織化学）、Ｄ（Ｄｉｌ染色）において示す共焦点顕微鏡像において、またＥ（電子顕微鏡法）で示されるとおり、樹状突起スパインおよびシナプスの減少も防いだ。未処置群には、処置群と同じ媒体体積、送達機構、および投与頻度を経験させた。
外傷性脳損傷：本開示によるＰＫＣ活性化因子は、外傷性脳損傷によって誘発される認知不良から防御するなど、神経変性のｉｎ ｖｉｖｏ徴候を後退させることがある（図２５）。
プロトコール：最小限の外傷性脳損傷を引き起こしてから１時間後、マウスに、５回の腹腔内ブリオスタチン１注射処置を、１４日間にわたり、２通りの注射用量２０および３０μｇ／ｋｇで施した（各群Ｎ＝９）。連続する注射の最後の回から１時間後、マウスの認知能力をＭＷＭで試験した。マウスは、１日６回、４日間試験した。５日目に、足場を取り除き、マウスの記憶保持を試験した。結果から、両方の用量で、ｍＴＢＩによって誘発される認知不良から完全に防御されることが示唆される。データは、一方向ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＡＮＯＶＡを使用して分析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示した。両方の用量で、損傷マウスの学習能力が保全された（ｐｂ０．０１）。ここで使用した両方の用量（２０および３０μｇ／ｋｇ）を繰り返し注射することで、ｍＴＢＩによって誘発される学習障害から防御された（それぞれｐｂ０．０１およびｐｂ０．０２）。より多い注射用量（３０μｇ／ｋｇ−「Ｃ」）では、対照非損傷マウスの学習も向上したが（ｐｂ０．０２）、より少ない用量（２０μｇ／ｋｇ−「Ａ」）では、非損傷マウスに対する効果はなかった。ｍＴＢＩ群により少ない用量を投与すると、その学習課題の習得が、対照マウスを超えるほどにも向上した（ｐｂ０．０１５）。
知能障害：本開示によるＰＫＣ活性化因子は、脆弱Ｘトランスジェニックマウスにおいてシナプスの数を回復させるなど、神経変性のｉｎ ｖｉｖｏ徴候を後退させることがある（図２６）。
プロトコール：２ヶ月齢の脆弱Ｘトランスジェニックマウスに、ブリオスタチン（２５μｇ／体重ｋｇ、腹腔内注射）を１週間に２回、３ヶ月間投与した。結果は、ブリオスタチンによって、シナプス（Ａ、Ｂ）、シナプス前軸索ボタン内のシナプス前小胞（Ｃ、Ｄ）、およびシナプス後樹状突起スパイン（Ｅ、Ｆ）の減少が奪回されたことを示している。未処置群（ＷＣおよびＴＣ）には、処置群と同じ媒体体積、送達機構、および投与頻度を経験させた。
正常動物モデルにおける学習および記憶の強化
本開示によるＰＫＣ活性化因子は、水迷路訓練後の健康なラットにおいて、学習および記憶と関連するキノコ型スパイン形成およびシナプスを強化しうる（図２７および２８）。
プロトコール：疾患のない健康な（４〜５ヶ月齢の）褐色Ｎｏｒｗａｙラットをこの研究において使用した。ａ〜ｅに示すとおり、ブリオスタチンによって、水迷路訓練後の健康なラットにおいて、キノコ型スパインの形成が強化された。水迷路訓練（１日４回の水泳を５日間）後に記憶が保持されると、（ｅ）有孔シナプス後肥厚部（ＰＳＤ）を伴うキノコ型樹状突起スパインおよびシナプスの数は増加したが、斑状ＰＳＤ（ｄ）を伴うものは増加しなかった。水迷路訓練の間にブリオスタチンを与えると、（ｄ）斑状ＰＳＤを伴うキノコ型スパインは有意に増加し、（ｅ）有孔ＰＳＤを伴うキノコ型スパインは増強された。Ｎｖ＝無処置対照、Ｓｗ＝水泳対照、Ｍｚ＝水迷路処置、およびＭｚ／Ｂｒ＝水迷路処置＋ブリオスタチン処置。
プロトコール：疾患のない健康な（４〜５ヶ月齢の）褐色Ｎｏｒｗａｙラットをこの研究において使用した。水迷路訓練の間にブリオスタチンを与えると（１０μｇ／体重ｋｇ、腹腔内注射、１日おきに３回）、学習習得（ａ）、記憶保持（ｂ、ｃ）が促進され、またＰＫＣα阻害剤Ｒｏ ３１−８２２０によって阻害されたキノコ型スパインシナプスの、記憶に特異的な誘導が促進される（ｄ〜ｆ）。ブリオスタチン単独で、無処置ラットにおける非キノコ型スパイン密度が増大した（ｇ）。（Ｎｖ＝無処置対照、Ｓｗ＝水泳対照、Ｍｚ＝水迷路処置、およびＭｚ／Ｂｒ＝水迷路処置＋ブリオスタチン処置）。
下流のシナプス形成性生化学事象の誘導
本開示によるＰＫＣ活性化因子は、神経栄養因子のタンパク質合成を強化するなど、下流のシナプス形成性生化学事象を誘導しうる（図２９〜３１）。
プロトコール：ラット海馬一次ニューロンを、アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ、１０μｇ／ｍｌ、転写阻害剤）、ＡｃｔＤ＋ブリオスタチン（０．２７ｎＭ）で処理し、またはＲｏ ３２−０４３２（Ｒｏ、２μＭ）で２時間予め処理し、次いで、ＡｃｔＤ＋ブリオスタチンで２、４、６、８、および１０時間処理した後、全ＲＮＡを単離し、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＧＡＰ−４３、または対照としてのヒストンｍＲＮＡに対する専用のプライマーを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用した（Ａ）。３通りの独立した実験からのＲＴ−ＰＣＲの代表的なゲルを、Ｂ〜Ｆに示す。ＮＴＦ ｍＲＮＡの含有量は、Ａのように処理したニューロンから、実時間ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量化した。各時点における各ｍＲＮＡ量を、当初のｍＲＮＡレベル（１００％）と比較した。非線形回帰分析を行い、これにより一次減衰定数（ｋ）を得た。平均ｍＲＮＡ半減期（ｔ1/2）を、０．６９３／ｋとして算出し、表Ｆに報告した（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ブリオスタチン効果の査定のためＡｃｔＤと比べたＡｃｔＤ＋ブリオスタチン；＃Ｐ＜０．０５、Ｒｏ ３２−０４３２効果の査定のためＲｏ＋ＡｃｔＤ＋ブリオスタチンと比べたＡｃｔＤ＋ブリオスタチン）。
プロトコール：一次海馬ニューロンを、処理せずに、またはブリオスタチン（０．２７ｎＭ）で処理し、またはＰＫＣ阻害剤Ｒｏ ３２−０４３２（Ｒｏ、２μＭ）で２時間予め処理し、次いでブリオスタチンで１時間処理した後、細胞を溶解させ、ＨｕＤタンパク質抗体を使用する免疫沈降に使用した。免疫沈降物から、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲに使用して、ＨｕＤタンパク質と結合したＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡを増幅した。ＲＴ−ＰＣＲデータ用の代表的なゲルを、異なる３通りの実験から示す。ＨｕＤに結合した（Ｂ）ＢＤＮＦ、（Ｃ）ＮＧＦ、（Ｄ）ＮＴ−３、および（Ｅ）ＧＡＰ−４３ ｍＲＮＡの相対量を、実時間ＲＴ−ｑＰＣＲ（Ａ〜Ｅ）によって分析した％変化として示す（平均＋ＳＥＭ、未処理対照と比べて＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。一次海馬ニューロンを、処理せずに、またはブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、５，６−ジクロロベンゾイミダゾール−１−β−Ｄリボフラノシド（ＤＲＢ、５０μＭ、転写阻害剤）で処理し、またはＤＲＢで１時間処理してからブリオスタチンで６時間処理した後、細胞を溶解させ、次いで、（Ｆ）ＢＤＮＦ、（Ｇ）ＮＧＦ、または（Ｈ）ＮＴ−３タンパク質の合計量をＥＬＩＳＡによって定量的に測定し、相対的発現を％変化として示した（Ｆ〜Ｈ）（３通りの独立した実験からの平均＋ＳＥＭ、ｎ＞６、未処理対照と比べて＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
プロトコール：疾患のない健康な（４〜５ヶ月齢の）褐色Ｎｏｒｗａｙラットをこの研究において使用した。６日間の訓練から２日後、変化のない軸索ボタン密度（ａ、ｃ）の範囲内で樹状突起スパイン（ａ、ｂ）およびシナプス前小胞濃度（ａ、ｄ）が増加したことは、核からのＨｕＣおよびＨｕＤタンパク質の樹状突起軸への搬出が、無処置および水泳対照と比べて増加したことと相関した（ａ、ｅ）。こうした変化は、ブリオスタチン処置（１０μｇ／体重ｋｇ、腹腔内注射、１日おきに３用量）によって強化された。（Ｎｖ＝無処置対照、Ｓｗ＝水泳対照、Ｍｚ＝水迷路処置、およびＭｚ／Ｂｒ＝水迷路処置＋ブリオスタチン処置）。
Ａ−β分解酵素の活性の増大
ネプリライシン活性
プロトコール：インタクトなＳＨ＋ｈＮＥＰ細胞を、ブリオスタチン（１ｎＭ）不在または存在下で、１５分間、３０分間、１時間、または３時間インキュベートした。次いで、細胞を溶解させ、ネプリライシン活性を測定した。合計５０μｇの可溶化液を、基質としての０．５ｍＭのグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミドと共に、別々にインキュベートした。ロイシンアミノペプチダーゼと共にさらにインキュベートすると、遊離の４−メトキシ−２−ナフチルアミドが放出され、それを４２５ｎｍの発光で蛍光定量的に測定した（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、未処理条件と比較したＢｒｙｏ）。インタクトなＳＨ＋ｈＮＥＰ細胞を、０．２７、０．５、１、もしくは２ｎＭの濃度のブリオスタチン（Ｂｒｙｏ）不在または存在下で１時間インキュベートし、溶解させ、次いで、各条件についてのネプリライシン活性を、（Ａ）に示すとおりに蛍光定量的に測定した（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、未処理条件と比較したＢｒｙｏ）。結果を以下で図３２に示す（Ａ−異なる時点で測定した遊離４−メトキシ−２−ナフチルアミドの蛍光定量の結果、Ｂ−異なるブリオスタチン濃度で測定した遊離４−メトキシ−２−ナフチルアミドの蛍光定量の結果）。
プロトコール：ＳＨ＋ｈＮＥＰ細胞を、処理せずに、またはブリオスタチン（Ｂｒｙｏ、１ｎＭ）で処理し、またはＰＫＣ阻害剤Ｒｏ ３２−０４３２（Ｒｏ、２μＭ）で３０分間予め処理し、次いでＢｒｙｏで１時間処理した後、細胞表面にあるタンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンビーズを使用してプルダウン（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）した後、ネプリライシン抗体を使用する免疫沈降にかけた。免疫沈降物を、ホスホ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒまたはネプリライシン抗体を使用するウエスタンブロット分析にかけた（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、未処理と比べたＢｒｙｏ；＃Ｐ＜０．０１、Ｂｒｙｏと比べたＲｏ＋Ｂｒｙｏ）。インタクトなＳＨ＋ｈＮＥＰ細胞を、ブリオスタチン（Ｂｒｙｏ、１ｎＭ）不在または存在下で１時間インキュベートした。一部の細胞は、Ｂｒｙｏ処理の前に、ＰＫＣ阻害剤Ｒｏ ３２−０４３２（Ｒｏ、２μＭ）で３０分間予め処理した。次いで、細胞を溶解させ、ネプリライシン活性を測定した。合計５０μｇの可溶化液を、基質としての０．５ｍＭのグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミドと共に、別々にインキュベートした。ロイシンアミノペプチダーゼと共にさらにインキュベートすると、遊離の４−メトキシ−２−ナフチルアミドが放出され、それを４２５ｎｍの発光で蛍光定量的に測定した。阻害研究については、基質を加える前に、細胞をホスホラミドン（ＰＡ、１０μＭ）と共に５分間プレインキュベートした（３通りの独立した実験の平均＋ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、未処理と比べたＢｒｙｏ；＃Ｐ＜０．０１、Ｂｒｙｏと比べたＲｏ、ＰＡ、またはＰＡ＋Ｒｏ）。結果を以下で図３３に示す（Ａ−ウエスタンブロット結果、Ｂ−蛍光定量の結果）。
ＥＣＥ活性化
ＰＫＣε過剰発現によって、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）が活性化されることが報告されている。ＰＫＣ活性化因子がＥＣＥに与える効果を、ここでは、ブリオスタチン、ＤＣＰ−ＬＡ、およびＤＨＡ−ＣＰ６を用いて測定した。すべてが、ＥＣＥ活性を持続的に増大させた。ＥＣＥは、ジアシルグリセロールが結合するＣ１ドメインまたはＰＫＣ様のホスファチジルセリンが結合するＣ２ドメインをもたないことから、これにより、活性化が、ＥＣＥの直接の活性化のためでなく、ＰＫＣによってＥＣＥまたは一部のＥＣＥ賦活中間体が間接的に活性化される結果として生じたに相違ないことが示唆される。
プロトコール：ブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＤＣＰ−ＬＡ（１μＭ）、ＤＨＡＣＰ６（１μＭ）、ＥＰＡ−ＣＰ５（１μＭ）、ＡＡ−ＣＰ４（１μＭ）、またはエタノールのみを、１２または２４ウェルプレートで成長しているＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に加えた。種々の期間経過後、細胞を収集し、以下の図３４に示すとおり、ＥＣＥ活性を、蛍光定量的に測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１）。
ｔａｕのＧＳＫ３βリン酸化の阻害
プロトコール：媒体を用いた野生型対照マウス（ＷＣ）、ブリオスタチン１を用いた野生型マウス（ＷＢ、２０μｇ／ｍ２、静脈内、２用量／週を１３週間）、媒体を用いた脆弱Ｘマウス（ＴＣ）、およびブリオスタチン１を用いた脆弱Ｘマウス（ＴＢ）からの海馬組織を解剖し、全ＧＳＫ−３βタンパク質を抽出し、ＧＳＫ−３βおよびホスホ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）抗体を使用するウエスタンブロット分析に使用した。３通りの独立した実験から、代表的なゲル像を図３５に示し、すべてのデータを％として示す（平均＋ＳＥＭ；＊＊Ｐ＜０．０１、ＷＣと比べたＷＢ；＊Ｐ＜０．０５、ＷＣと比べたＴＣ；＃Ｐ＜０．０１、ＴＣと比べたＴＢ）。
α−セクレターゼの活性化
プロトコール：アルツハイマー病細胞系を、ブリオスタチン（０．１ｎＭ）、ベンゾラクタム（０．１ｎＭまたは１．０μＭ）、ＤＭＳＯ、スタウロスポリン（１００ｎＭ）での事前処理＋ブリオスタチン（０．１ｎＭ）と共に３時間インキュベートした。培地中のｓＡＰＰ−αの量を測定したが、結果を以下で図３６に示す。Ａにある結果は、十分に特徴付けられた剖検によって確認されたＡＤ細胞系において、ブリオスタチン（Ｂｒｙ、０．１ｎＭ、塗りつぶしのバー）が、３時間のインキュベート後に、培地中のｓＡＰＰ−αの量を劇的に高めたことを実証している（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）。グラフ単位は、媒体であるＤＭＳＯのみ（１）を基準としている。ブリオスタチンは、同じ濃度（０．１ｎＭ）で、別のＰＫＣ活性化因子であるＢＬより、有意に（Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後アッセイ）強力であった。スタウロスポリン（Ｓｔａ、１００ｎＭ）での事前処理（最も右のバー）によって、ブリオスタチン（０．１ｎＭ）の効果は完全に消滅した。ブリオスタチンは、ＡＤ細胞系より弱い程度にではあるが、２種の対照細胞系における分泌を強化することにおいても有効であった（斜線のバー）。（ＡＤ細胞系についての）時間的経過を図３６のＢに示す。分泌は、１５分のインキュベート（ブリオスタチン（Ｂｒｙｏ）、０．１ｎＭ）によって、明らかにほとんど強化され、１６０分のインキュベートでほぼ最大になり、３時間まで高められたままである。より低い濃度０．０１ｎＭのブリオスタチンは、はるかに緩慢であったが、１２０分のインキュベート後の分泌に関してはほぼ同じ効果をもっていた。

Claims (8)

  1. 神経保護性ＰＫＣ活性化因子を特定する方法であって、
    化合物を分析して、前記化合物が、次の属性：（ａ）非腫瘍形成性、（ｂ）非毒性、（ｃ）脳接触容易性、（ｄ）±３０％δ活性での、αおよびε特異性またはε特異性、（ｅ）ε−イソ酵素の下向き調節が最小限となること、（ｆ）シナプス形成性、および（ｇ）抗アポトーシス性を含むかどうかを判定することを含み、前記化合物が属性（ａ）から（ｇ）を含むとき、前記化合物を神経保護性ＰＫＣ活性化因子とする、方法。
  2. 前記化合物を分析して、前記化合物がＡＳＰＤに対して保護性であるかどうかを判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記化合物を分析して、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏ神経変性に対して保護性であるかどうかを判定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記化合物を分析して、前記化合物が、正常動物モデルにおいて学習および記憶を向上させるかどうかを判定することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記化合物を分析して、前記化合物が下流のシナプス形成性生化学事象を誘導するかどうかを判定することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記化合物を分析して、前記化合物がＡβ分解酵素の活性を増大させるかどうかを判定することをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記化合物を分析して、前記化合物がＧＳＫ３βを阻害するかどうかを判定することをさらに含み、前記化合物が前記属性の少なくとも５項目を含むとき、前記化合物を神経保護性ＰＫＣ活性化因子とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記化合物を分析して、前記化合物がα−セクレターゼを活性化するかどうかを判定することをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
JP2016503320A 2013-03-15 2014-03-15 神経保護性ｐｋｃ活性化因子を特定する方法 Pending JP2016516201A (ja)

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