JP2016515534A - 子癇症及び子癇前症を治療するための方法 - Google Patents

子癇症及び子癇前症を治療するための方法 Download PDF

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Abstract

患者においてＥＤＬＦを検出することによって、子癇症または子癇前症を有する患者を検出するための方法。抗ジゴキシン抗体療法に対して応答性であり得る患者をスクリーニングするための方法も説明される。ＥＤＬＦを検出するためのシステムは、ナノワイヤバイオセンサーを含む。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本国際特許出願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９９，４３８号に対する優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、妊娠女性における内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）レベルの測定、及び有効量の抗ジゴキシン抗体またはその結合フラグメントの投与を含む、子癇症及び子癇前症の診断及び治療に関する。本発明は、妊娠中の胎児合併症、すなわち脳室内出血と関連付けられる状態の治療及び／または予防も伴う。本発明は、ＥＤＬＦレベルの測定ならびに患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかの表示を提供する、ＥＤＬＦの検出及び測定のための技法をさらに含む。任意のそのような状態を治療するために有効量の抗ジゴキシン抗体またはその結合フラグメントを投与するための技法がさらに提供される。
背景技術
子癇前症（ＰＥ）は、妊娠女性の間の主な死亡原因である。妊娠の後半における高血圧及びタンパク尿は、依然としてこの障害を診断するために使用されているが、全身性浮腫、高尿酸血症、血小板減少症、神経学的変化、及び／または肝酵素の上昇も起こる可能性があり、その疾患のより深刻な形態の前兆となり得る。Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔａｌ．２０００；２４（１）：２４−２８、Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８９；１６１（５）：１２００−１２０４。ＰＥは、初回妊娠において、及び肥満女性においてより頻繁に起こる。Ｚａｖａｌｚａ−Ｇｏｍｅｚ Ａｒｃｈ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ．２０１１；２８３：４１５−４２２。追加として、ＰＥは、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）につながる場合が多く、早産の主な原因である。Ｎｅｓｓ＆Ｓｉｂａｉ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．２００６；１９５：４０−４９。
確立されたＰＥにおいて多くの異常が報告されているが、これらの異常のそれぞれとＰＥの原因または中間病態生理との関連は依然として未知である。臨床的に確立された疾患に先行し得る、頻繁に見られる１つの異常は、母体血管内皮に対する全身性損傷である。これらの変化は、ＰＥを発症することになる妊娠において数週間前に現れる。Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８９；１６１（５）：１２００−１２０４。そのような傷害は、炎症性サイトカイン、活性酸素種、細胞表面接着分子、及び元の損傷に続発する血管緊張の局所作用調節因子を含む、内皮機能不全のマーカーの放出を伴う。ＬａＭａｒｃａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２００７；９（６）：４８０−４８５。ＰＥの原因は完全に知られているわけではないため、ＰＥが起こるかどうか、またはいつ起こるかを試験するための直接的な方法も、ＰＥを予防または治療するための有効な治療もない。深刻な場合、たとえそれが妊娠の早期に起こるとしても、唯一の有効な治療は、母親を守るために胎児を分娩することである。
ＰＥにつながる最早の生理学的事象について、ＰＥが早期胎盤機能不全を合併する妊娠として始まることを示唆する証拠がある。Ｓａｎｋａｒａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ ｉｎ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００６；８：１−２０。ＰＥは、少なくとも部分的に、血液を、その酸素及び栄養素とともに胎児−胎盤系に供給する母体らせん動脈の不完全な適応に起因するというのが現在の考えである。これは、かん流下で低酸素症、白血球及び血小板の活性化を含む、活性酸素種及び炎症性メディエータの局所放出を伴う胎盤損傷をもたらし、循環サイトカイン値、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロン−γ、及びインターロイキン−６を増加させると考えられている。Ｇｒａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２；９（３）：１４７−１６０、Ｓｏｌｅｙｍａｎｌｏｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００５；９０（７）：４２９９−４３０８。これらは順に、胎盤、胎児、及び母体内皮機能に対するより全身性の作用につながることがあり、より広い母体、及び恐らく胎児の酸化的ストレスの証拠とともに、より増大した炎症反応を引き起こし、臨床疾患を有する母親における内皮損傷を潜在的に説明する。
ＰＥを有する女性において見出される追加の異常は、［Ｎａ＋，Ｋ＋］ＡＴＰａｓｅ（ナトリウムポンプ、ＳＰとも呼ばれる）の天然阻害剤であると思われる内因性「ジギタリス様」因子（ＥＤＬＦ）の循環レベルの上昇である。Ｇｒａｖｅｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１９８４；５９：１０７０−４、Ｖａｌｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ．１９８５；１９２：２２９−３２、Ｇｒａｖｅｓ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１９８７；１０（Ｓ Ｐｔ ２）：Ｉ−８４−６、Ｇｒａｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１９９５；８：５−１１。追加として、これらの因子は、ジゴキシン、ウアバイン、及び他の強心配糖体抗体と交差反応することが示され、ＥＤＬＦがジゴキシン、ウアバイン、ブファリン、プロスシラリジンＡ、及び／またはマリノブファゲニンと構造的に関連する化合物であることを強く示唆している。Ｈａｍｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１；８８：６２５９−６２６３、Ｇｏｔｏ＆Ｙａｍａｄａ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１９９８；２０：５５１−５６。しかしながら、ＰＥにおける循環因子の正確な構造は不明である。ジゴキシン等の既知の強心剤と生物学的及び免疫学的特性を共有するＥＤＬＦは、動物及びヒトの多くの組織及び体液において見出された。増加したＥＤＬＦのレベルは、本態性、何らかの二次的及び実験的高血圧の病因における原因因子であり得る。Ｇｌａｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，１９９４；７：１０１６−２５、Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１９９５；８：９２１−７、Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１９９５；９：３９−４６。
Ｄｉｇｉｂｉｎｄ及びＤｉｇｉｆａｂは、それぞれヒツジにおいて育成されたポリクローナル抗ジゴキシン抗体に由来する市販のＦａｂフラグメントである。Ｄｉｇｉｂｉｎｄ及びＤｉｇｉｆａｂ（ジゴキシンＡＢと称される）は、ジゴキシンを結合し、［Ｎａ＋，Ｋ＋］ＡＴＰａｓｅに結合するためにジゴキシンを使用不可能にすることによって、ジゴキシン過剰摂取及び付随する毒性の治療に使用される。Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３０７：１３５７−６２。ジゴキシンＡＢ−ジゴキシン複合体は、血液中に蓄積し、腎臓によって排出される。正味の影響は、体内のジゴキシンのその受容体への結合から平衡を転換することであり、その作用を減弱させる。高ＥＤＬＦレベルを有する高血圧の実験的モデルにおいて、ＤｉｇｏｘｉｎＡＢは、血圧を低下させることが実証され、抗体がＥＤＬＦと交差反応し、不活性化する証拠を提供する。これは、はるかに大規模なインビトロ文献によって支持される。Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．８：９２１−７、Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．９：３９−４６。
以前の研究は、ＥＤＬＦが構造的に、イソプレノイド／ステロイド経路、複数のステップを含む非常に複雑な経路によって合成される不飽和ラクトン環を有するステロイド配糖体ジゴキシンまたは類似体であると報告した。この研究の場合、内因性ジゴキシン合成経路の重要中間体が関心対象であった。ステロイド合成の以前の研究は、ケトコナゾールが、いくつかのサイトクロームＰ４５０依存性酵素を阻害することによって、生殖腺及び副腎ステロイド産生を遮断するサイトクロームＰ４５０依存性酵素の一般的な阻害剤であることを実証した。Ｌｏｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１４９５−１４９９、Ｍｉｏｓｓｅｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｎｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｐａｒｉｓ）５８：４９４−５０２。メチルステロールのコレステロールへの変換を遮断することによって、ヒトのコレステロール合成も阻害する。Ｋｒａｅｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２３８ ９０５−９１１。
現在、子癇症及び子癇前症の治療は、子癇症、子癇前症、または抗ジゴキシン抗体もしくはその結合フラグメント療法に応答し得るそれらの症状を有する女性を特定する診断方法の欠如に悩まされている。したがって、当該技術分野において、子癇症、子癇前症、またはそれらの症状を有する女性の診断方法及び抗ジゴキシン抗体またはその結合フラグメント併用療法、すなわち、どの子癇前症及び／または子癇症の女性がＤｉｇｏｘｉｎＡＢによる治療から恩恵を受けるかを予測する治療的診断試験の必要性がある。
発明の概要
一実施形態において、子癇症または子癇前症を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を予防するために、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、脳室内出血を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、早期分娩される（妊娠４０週より前）結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を予防するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、早期分娩される（妊娠４０週より前）結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。。
一実施形態において、早産と関連付けられる胎児合併症を治療するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、胎児が早期分娩され得る（妊娠４０週より前）妊娠ヒト患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
別の実施形態において、早産と関連付けられる胎児合併症は、ＩＶＨまたはＮＥＣを含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者において妊娠を延長させる方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、子癇症または子癇前症の危険性がある患者を治療するための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）該試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、（ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することであって、該ＥＤＬＦの存在が、子癇症または子癇前症を示す、検出することと、（ｄ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、胎児及び／または新生児にＩＶＨの危険性がある患者を治療するための方法は、（ａ）患者から試料を得ることと、（ｂ）該試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、（ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することであって、該ＥＤＬＦの存在が、子癇症または子癇前症を示す、検出することと、（ｄ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与すること。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延を患う患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、脳室内出血を治療するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、脳室内出血を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、脳室内出血を治療するための方法は、（ａ）胎児に脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、脳室内出血の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、脳室内出血の危険性がある患者を治療するための方法は、（ａ）脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）該試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、（ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することであって、該ＥＤＬＦの存在が脳室内出血を示す、検出することと、を含み得る。
一実施形態において、子癇症または子癇前症を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）アッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を予防するために、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、脳室内出血を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、早期分娩される（妊娠４０週より前）結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を予防するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、早期分娩される（妊娠４０週より前）結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。別の実施形態において、胎児は、妊娠４０週より前に分娩され得る。
一実施形態において、早産と関連付けられる胎児合併症を治療するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、胎児が早期分娩され得る（妊娠４０週より前）妊娠ヒト患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、子癇症または子癇前症を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
別の実施形態において、早産と関連付けられる胎児合併症は、ＩＶＨまたはＮＥＣを含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者において妊娠を延長させる方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
別の実施形態において、フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または抗原を結合することができる抗体の部分であり得る。
別の実施形態において、抗ジゴキシン抗体は、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性（ｃｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり得る。
別の実施形態において、抗ジゴキシン抗体または抗原結合フラグメントは、標識に結合され得る。別の実施形態において、標識は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射活性標識であり得る。別の実施形態において、常磁性標識は、アルミニウム、マンガネーゼ、白金、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムであり得る。
別の実施形態において、抗ジゴキシン抗体は、固体支持体に結合され得る。別の実施形態において、固相支持体は、ビーズ、試験管、シート、培養皿、ナノワイヤ、または試験片であり得る。さらなる実施形態において、固体支持体は、配列であり得る。
一実施形態において、シリコンナノワイヤバイオセンサーは、固定化された抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシンＦａｂ抗体フラグメントを含み得る。さらなる実施形態において、フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または抗原を結合することができる抗体の部分であり得る。別の実施形態において、抗体は、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性であり得る。別の実施形態において、バイオセンサーは、生物試料中に少なくとも約１００ｎＭのジゴキシンの感受性を有し得る。
一実施形態において、ＥＤＬＦを検出する方法は、生物試料を、固定化された抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシンＦａｂ抗体フラグメントを含むナノワイヤバイオセンサーと接触させることと、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、を含み得る。
一実施形態において、子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料、任意に血液試料を得ることと、（ｂ）該生物試料をナノワイヤバイオセンサーと接触させることを含む、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することであって、約１００ｎＭを超えるＥＤＬＦレベルが、子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性を示す、決定することと、を含み得る。
一実施形態において、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料、任意に血液試料を得ることと、（ｂ）該生物試料をナノワイヤバイオセンサーと接触させることを含む、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することであって、１００ｎＭを超えるＥＤＬＦレベルが、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性を示す、決定することと、を含み得る。
一実施形態において、子癇症または子癇前症について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料、任意に血液試料を得ることと、（ｂ）該生物試料をナノワイヤバイオセンサーと接触させることを含む、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することであって、１００ｎＭを超えるＥＤＬＦレベルが、子癇症または子癇前症を示す、決定することと、を含み得る。
別の実施形態において、試料は、血液、血清、血漿、または胎盤試料であり得る。
別の実施形態において、抗ジゴキシン抗体アッセイは、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、またはそれらの組合せであり得る。
別の実施形態において、ＥＤＬＦレベルは、１００ｎＭ ＥＤＬＦを超え得る。
別の実施形態において、投与されるジゴキシン抗体の投薬量は、少なくとも０．００６ｍｇジゴキシン結合能／Ｋｇ未満であり得る。別の実施形態において、投薬量は、６時間以下の期間にわたって投与され得る。
一実施形態において、方法は、抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含み得る。別の実施形態において、方法は、その後の投薬量での抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含み得る。別の実施形態において、方法は、治療上有効な量のコルチコステロイドを投与することをさらに含み得る。別の実施形態において、方法は、その後の投薬量での抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含み得る。
別の実施形態において、方法は、治療上有効な量の降圧薬を投与することをさらに含み得る。別の実施形態において、降圧薬は、ラベタロール、アルテノロール、ニフェジピン、１−メチルドーパ、ヒドララジン、メチルドーパ（Ａｌｄｏｍｅｔ）、ラベタロール（ＮｏｒｍｏｄｙｎｅまたはＴｒａｎｄａｔｅ）、クロニジン（Ｃａｔａｐｒｅｓ）、またはそれらの組合せであり得る。
別の実施形態において、方法は、治療上有効な量の硫酸マグネシウムまたはフェニトインを投与することをさらに含み得る。別の実施形態において、ジゴキシン免疫Ｆａｂは、ヒツジジゴキシン免疫Ｆａｂであり得る。別の実施形態において、用量は、約１０．０ｍｇ以下であり得る。別の実施形態において、用量は、約５．０ｍｇ以下であり得る。別の実施形態において、用量は、約０．０１〜１．０ｍｇの範囲内であり得る。別の実施形態において、用量は、約０．０１ｍｇ〜０．５ｍｇの範囲内であり得る。
正常ヒト胎盤から取られた馴化培地を、ＲＩＡによってＥＤＬＦについてアッセイし（ｙ軸）、ヒト赤血球中でＳＰを阻害するその能力についてもアッセイした（ｘ軸）。アッセイされたいくつかの培養培地について、２つのアッセイ間に良好な相関があった（Ｒ＝０．６９、ｐ＝０．０１９）。 子癇前症の女性（ｎ＝８、ＰＥ）対合併症のない妊娠女性（ｎ＝８、ＣＴＬ）からのタンパク質を含まない胎盤ホモジネート中のＥＤＬＦ濃度の、ラジオイムノアッセイによる比較を描く。未希釈ホモジネートの場合（未希釈、ｐ＝０．０００２）、または連続希釈の場合（１：２希釈 ｐ＝０．００２、１：３希釈 ｐ＝０．００２、１：４希釈 ｐ＝０．０２）、差は統計的に有意であった。 ケトコナゾールが胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。ヒト胎盤を、胎児組織及び母体組織に解剖した。緩衝培養培地中で４８時間、勾配濃度のケトコナゾールの非存在下または存在下で、これらをインキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。胎児側データ（パネルＡ）は、カトコナゾール濃度が高くなるにつれて、ＥＤＬＦ産生の有意かつ段階的な減少を示した（ｎ＝５、ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、ＥＤＬＦ値は対照に対して２μＭ以上の全濃度で有意に低かった、ダネットの検定）。母体側データ（パネルＢ）は、ケトコナゾールに応答して放出されたＥＤＬＦの変化がほとんどないことを示す（ｎ＝５、ｐ＜０．５１、ＡＮＯＶＡ）。 ケトコナゾールが胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。ヒト胎盤を、胎児組織及び母体組織に解剖した。緩衝培養培地中で４８時間、勾配濃度のケトコナゾールの非存在下または存在下で、これらをインキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。胎児側データ（パネルＡ）は、カトコナゾール濃度が高くなるにつれて、ＥＤＬＦ産生の有意かつ段階的な減少を示した（ｎ＝５、ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、ＥＤＬＦ値は対照に対して２μＭ以上の全濃度で有意に低かった、ダネットの検定）。母体側データ（パネルＢ）は、ケトコナゾールに応答して放出されたＥＤＬＦの変化がほとんどないことを示す（ｎ＝５、ｐ＜０．５１、ＡＮＯＶＡ）。 １７ ＯＨ−プロゲステロンがヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を解剖し、緩衝培養培地中で４８時間、勾配濃度の１７−ヒドロキシプロゲステロンの非存在下または存在下でインキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。データは、１７−ヒドロキシプロゲステロン濃度が高くなるにつれて、ＥＤＬＦ産生の段階的増加を示す（ｎ＝６、ｐ＝０．００３）。 １７ ＯＨ−プロゲステロンがヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を解剖し、緩衝培養培地中で４８時間、勾配濃度の１７−ヒドロキシプロゲステロンの非存在下または存在下でインキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。データは、１７−ヒドロキシプロゲステロン濃度が高くなるにつれて、ＥＤＬＦ産生の段階的増加を示す（ｎ＝６、ｐ＝０．００３）。 １７ ＯＨ−プロゲステロンがヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を解剖し、緩衝培養培地中で４８時間、勾配濃度の１７−ヒドロキシプロゲステロンの非存在下または存在下でインキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。データは、１７−ヒドロキシプロゲステロン濃度が高くなるにつれて、ＥＤＬＦ産生の段階的増加を示す（ｎ＝６、ｐ＝０．００３）。 プレグネノロンがヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに培養したヒト胎盤を、２μＭプレグネノロンに様々な期間曝露した。プレグネノロンに曝露された胎盤は、ＥＤＬＦ放出の顕著かつ段階的な低減を示した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１、全ての後次値は、６時間の値と比較して低減した、ｐ＜０．０５、ダネットの検定）。 低酸素症がヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を解剖し、緩衝培養培地中、正常酸素及び低酸素条件下で２４時間（パネルＡ）または４８時間（パネルＢ）インキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。データは、２４時間（ｎ＝６、ｐ＝０．０２７、ウィルコクソン）及び４８時間（ｎ＝６、ｐ＝０．０２７、ウィルコクソン）の両方で、低いＯ２圧に応答して放出されるＥＤＬＦの増加を示した。 低酸素症がヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を解剖し、緩衝培養培地中、正常酸素及び低酸素条件下で２４時間（パネルＡ）または４８時間（パネルＢ）インキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、組織から放出されたＥＤＬＦの量を測定した。データは、２４時間（ｎ＝６、ｐ＝０．０２７、ウィルコクソン）及び４８時間（ｎ＝６、ｐ＝０．０２７、ウィルコクソン）の両方で、低いＯ２圧に応答して放出されるＥＤＬＦの増加を示した。 Ｈ２Ｏ２がヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を、５ｎＭの過酸化水素の非存在下または存在下で４８時間培養した。培養培地を回収し、ＲＩＡを使用して、放出されたＥＤＬＦを測定した。データは、５ｎＭ Ｈ２Ｏ２に応答して放出されたＥＤＬＦレベルの増加を示す（ｎ＝５、ｐ＝０．００９）。 ＴＮＦαがヒト胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を描く。新たに回収したヒト胎盤を、勾配濃度のＴＮＦαの非存在下または存在下で４８時間インキュベートした。培養培地を回収し、ＲＩＡによって、組織から放出されたＥＤＬＦを測定した。データは、ＴＮＦα濃度が高くなるにつれて、ＥＤＬＦ産生の段階的増加を示す（ｎ＝６、ｐ＜０．００１）。 低酸素症が胎盤ＲＯＳ放出に及ぼす影響を描く。ヒト胎盤を、培養培地中、正常酸素及び低酸素条件下で４８時間インキュベートした。培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡを使用して、組織から放出された脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）の量を測定した。データは、低いＯ２圧に応答して放出されたＬＰＯ量の増加を示す（ｎ＝６、ｐ＝０．０１）。 Ｈ２Ｏ２が胎盤ＲＯＳ放出に及ぼす影響を描く。ヒト胎盤を解剖し、緩衝培地中で４８時間、勾配濃度の過酸化水素の非存在下または存在下でインキュベートした。培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡによって、組織から放出された脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）の量を測定した。データは、Ｈ２Ｏ２濃度が高くなるにつれて、ＬＰＯレベルの段階的増加を示した（ｎ＝５、ｐ＝０．０１７、ＡＮＯＶＡ）。 低酸素症が胎盤ＴＮＦα放出に及ぼす影響を描く。ヒト胎盤を、培養培地中、正常酸素及び低酸素条件下で４８時間インキュベートした。培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡによって、組織から放出されたＴＮＦαの量を測定した。データは、低いＯ２圧に応答して放出されたＴＮＦα量の増加を示す（ｎ＝６、ｐ＝０．０３、ウィルコクソン）。 Ｈ２Ｏ２が胎盤ＴＮＦα放出に及ぼす影響を描く。ヒト胎盤を緩衝培地中で４８時間、勾配濃度の過酸化水素の非存在下または存在下でインキュベートした。培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡによって使用して、組織から放出されたＴＮＦαの量を測定した。変化はなかった（ｎ＝５、ｐ＝０．９１）。 Ｄｉｇｉｂｉｎｄ ＲＩＡの標準曲線を描く。ウアバイン濃度（−ログ［ウアバイン］として示される）を増加させることは、Ｄｉｇｉｂｉｎｄからの［３Ｈ］−ウアバインの段階的な移動を引き起こした。ｙ軸は、ｘ軸上に示されるウアバイン濃度の関数として、固定インキュベーション時間後に測定された放射能のカウントを表示する。 モノクローナル抗体ＲＩＡの標準曲線を描く。ウアバイン濃度（−ログ［ウアバイン］として示される）を増加させることは、Ｄｉｇｉｂｉｎｄからの［３Ｈ］−ウアバインの段階的な移動を引き起こした。ｙ軸は、ｘ軸上に示されるウアバイン濃度の関数として、固定インキュベーション時間後に測定された放射能のカウントを表示する。 ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療がＥＤＬＦ陽性対象における内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）の除去によるナトリウムポンプ活性の回復に及ぼす影響を描く。ＥＤＬＦ陽性対象及び陰性対象（１５）の両方を含めた元のＤＥＥＰ研究に対し、各時点で、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療された女性からの血漿中、より大きくかつより有意なＲＢＣ ＳＰ活性の増加／ＥＤＬＦの低減があった（ｔ＝１２時間：＋７．５％、ｐ＝０．０４；ｔ＝２４時間：＋１２．９％、ｐ＝０．００１６；ｔ＝４８時間：＋１３．４％、ｐ＝０．０４７、及び繰り越された最後の観察、すなわち、入手可能な最後の観察：ＳＰ活性の＋１２．１％増加、ｐ＝０．０１０）。プラセボを受けた対象は、変化を示さなかった。 ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療対プラセボ（ＰＬＢＯ）が、ＥＤＬＦ陽性対象において入手可能な２４〜４８時間の最後の観察におけるＣｒＣｌの変化に及ぼす影響を描く（ＥＤＬＦ＋対象：プラセボ−５３．２ｍＬ／分のＣｒＣｌ変化対ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）−４．５ｍＬ／分のＣｒＣｌ変化、ｐ＝０．００５）。 循環ＥＤＬＦレベルに従って、プラセボを受けるＰＥ女性におけるＣｒＣｌの変化を描く。対象がＥＤＬＦを有していないか、低ＥＤＬＦ（１〜２９％のＳＰ阻害）を有するか、または高ＥＤＬＦ（３０％以上のＳＰ阻害）を有するかに応じて対象を層別化した（ｐ＝０．０３２）。 ＦＡＢ、ヤギＦＡＢ（対照）、及びＢＳＡ（対照）上のＤｉＧｉの存在に対するＱＭＤｘ ＮＷシステムの応答を描く。このシステムの正規化応答は、ＮＷ導電率プロファイルの変動を開始する主な原因である。斜交平行カラムは、ベースライン値からの正の偏差を示す。 未修飾表面の原子間力顕微鏡表面プロファイル及び対応するＦＡＢ修飾表面を描く。
発明を実施するための形態
本明細書に記載される発明が完全に理解され得るために、以下の詳細な説明が記載される。本発明の様々な実施形態が詳細に説明され、提供される実施例によってさらに説明され得る。実施形態の追加の実行可能な変型は、容易に想定することができる。
定義
別途定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を表す。
本明細書の説明において、及び下記特許請求の範囲にわたって用いられる場合、文脈が別途明確に指示しない限り、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の指示対象を含む。
「約」は、本明細書で用いられる場合、当業者によって理解され、それが用いられる文脈に基づいてある程度異なるであろう。
「抗体」は、本明細書で用いられる場合、エピトープに適合し、それを認識する特定形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を広く指し、１つ以上の非共有結合相互作用は、分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する。典型的な抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての源、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ニワトリからのあらゆる種類の免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤが「抗体」であると考えられる。抗体には、キメラ抗体、ヒト抗体及び他の非ヒト哺乳類抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、ラクダ抗体、ナノ抗体、ＩｇＮＡＲ（サメ由来の一本鎖抗体）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２）が含まれるがこれらに限定されない。多くの抗体コード配列が説明され、他は当該技術分野において周知の方法によって挙げられ得る。Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４（１１）：２９０１−９、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５１８）：１６８−１７３、Ｎｕｔｔａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（４）：３１３−２６、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２８）：４４６−８、Ｇｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（６）：６５３−８を参照されたい。
「診断的」は、本明細書で用いられる場合、病態の存在または性質を特定することを広く指す。診断的方法は、それらの感度及び特異性において異なる。診断的アッセイの「感度」は、検査で陽性を示す罹患した個体のパーセンテージである（「真の陽性」のパーセント）。アッセイによって検出されない罹患した個体は、「偽の陰性」である。罹患していない、かつアッセイにおいて検査で陰性を示す対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断的アッセイの「特異性」は、１−偽の陽性率であり、「偽の陽性」率は、検査で陽性を示す疾患のない者の割合として定義される。特定の診断的方法は、状態の確定診断を提供しないことがあるが、この方法が診断を補助する陽性表示を提供することをもって足りる。
「診断する」は、本明細書で用いられる場合、疾患または症状を分類することと、疾患の重症度を決定することと、疾患の進行を監視することと、疾患の転帰及び／または回復の見通しを予測することと、を広く指す。「検出する」という用語も、前述のいずれかを任意に包含し得る。本発明に従う疾患の診断は、いくつかの実施形態において、対象から得られた生物試料中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを決定することによって影響されることがあり、決定されるレベルは、疾患に対する素因、または疾患の存在もしくは非存在と相関し得る。「対象から得られた生物試料」は、対象から物理的に除去されていない試料も任意に含み得ることに留意すべきである。
「有効量」は、本明細書で用いられる場合、疾患を治療するために患者に投与される場合、疾患のそのような治療をもたらすのに十分な化合物、抗体、抗原、または細胞の量を広く指す。有効量は、予防に有効な量、及び／または防止に有効な量であり得る。有効量は、兆候／症状の発生を低減するために有効な量、防止するために有効な量、兆候／症状の発生の重症度を低減するため、兆候／症状の発生を排除するため、兆候／症状の発生の発達を遅延させるため、兆候／症状の発生の発達を防止するため、及び／または兆候／症状の発生の予防をもたらすために有効な量であり得る。「有効量」は、疾患及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重、病歴、感受性、及び既存状態に応じて異なり得る。「有効量」という用語は、本発明の目的で「治療上有効な量」と同義である。
「イムノアッセイ」は、本明細書で用いられる場合、抗体を使用して特異的に抗原に結合させるアッセイを広く指す。イムノアッセイは、抗原を単離、標的、及び／または定量する特定の抗体の特異的結合特性の使用を特徴とし得る。
「単離された」は、本明細書で用いられる場合、それが天然に存在するその元の環境から除去され、したがってその天然環境からヒトの手によって改変された材料を広く指す。単離された材料は、例えば、ベクター系に含まれる外因性核酸、宿主細胞内に含有される外因性核酸、またはその元の環境から除去され、したがってヒトの手によって改変された任意の材料（例えば、「単離された抗体」）であり得る。
「標識」または「検出可能な部分」は、本明細書で用いられる場合、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物を広く指す。
「哺乳動物」は、本明細書で用いられる場合、皮膚の体毛被覆、及び雌において、子を育てるための乳汁産生乳腺を特徴とする、ヒトを含む哺乳類クラスの任意かつ全ての温血脊椎動物を広く指す。哺乳動物の例には、アルパカ、アルマジロ、カピバラ、ネコ、ラクダ、チンパンジー、チンチラ、ウシ、イヌ、ヤギ、ゴリラ、ハムスター、ウマ、ヒト、キツネザル、ラマ、マウス、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、ヒツジ、トガリネズミ、リス、及びバクが含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物には、ウシ科、イヌ科、ウマ科、ネコ科、ネズミ科、ヒツジ科、ブタ科、霊長類、及び齧歯類が含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物には、ワシントンＤＣにあるスミソニアン自然史博物館によって維持される世界の哺乳類に列挙される任意かつ全てのものも含まれる。
「患者」は、本明細書で用いられる場合、疾患状態を軽減するか、または疾患状態の発生もしくは再発を防止するかのいずれかのために治療を必要とする任意の動物を広く指す。また「患者」は、本明細書で用いられる場合、危険因子、病歴、感受性、症状、兆候を有し、疾患が以前に診断されたか、疾患の危険性があるか、または疾患の患者集団の一員である、任意の動物を広く指す。患者は、ヒト等の臨床患者、または随伴動物、家畜動物、畜産動物、珍しい動物、または動物園動物であり得る。「対象」という用語は、「患者」という用語と交換可能に用いられ得る。
「対象」は、本明細書で用いられる場合、本発明に従って治療されるのに適した者を広く指し、限定されないが鳥類及び哺乳類対象を含み、好ましくは哺乳類である。本発明の哺乳動物には、イヌ科、ネコ科、ウシ科、ヤギ科、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科、齧歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ科、霊長類、ヒトが含まれるがこれらに限定されない。本発明に従って治療されることを必要とする任意の哺乳類対象が適している。両性別及び任意の発達段階（すなわち、新生児、幼児、若年、青年、成人）のヒト対象を、本発明に従って治療することができる。本発明は、獣医目的で、ならびに薬物スクリーニング及び薬物開発の目的で、動物対象、特にマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及びウマ等の哺乳類対象で実行されてもよい。「対象」は、「患者」と交換可能に使用される。
疾患の「症状」は、本明細書で用いられる場合、患者によって経験され、疾患を示す任意の病的現象または構造、機能、もしくは感覚の正常からの離脱を広く指す。
「治療法」、「治療的」、「治療する」、または「治療」は、本明細書で用いられる場合、疾患を治療すること、疾患もしくはその臨床症状の発達を停止もしくは低減すること、及び／または疾患を緩和し、疾患もしくはその臨床症状の退行を引き起こすことを広く指す。治療法は、疾患、疾患の兆候、及び／または症状の予防、治療、修復、低減、軽減、及び／または緩和の提供を包含する。治療法は、進行中の疾患兆候及び／または症状（例えば、子癇症、子癇前症、及び／もしくは脳室内出血）を有する患者における兆候及び／または症状の軽減を包含する。治療法は、「予防」も包含する。「低減された」という用語は、治療の目的で、兆候及び／または症状の臨床的に有意な低減を広く指す。治療法は、再発または反復性兆候及び／または症状（例えば、子癇症、子癇前症、及び／もしくは脳室内出血）を治療することを含む。治療法は、兆候及び／または症状をいつでも除外すること、ならびに既存の兆候及び／または症状を低減すること、及び既存の兆候及び／または症状を排除することを包含するがこれらに限定されない。治療法は、慢性疾患（「維持」）及び急性疾患を治療することを含む。例えば、治療は、兆候及び／または症状（例えば、子癇症、子癇前症、及び／もしくは脳室内出血）の再発または反復を治療または予防することを含む。
ＥＤＬＦ及び子癇症／子癇前症
高レベルの免疫学的に検出されたＥＤＬＦは、正常な妊娠及びＰＥを合併する妊娠の両方で見出されるが、ＰＥのＥＤＬＦレベルは、正常な妊娠よりも実質的に高い。
内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）は、高血圧原性であり、妊娠の合併症である子癇前症（ＰＥ）を有する女性の血清及び胎盤中で増加するように思われる。抗ジゴキシン抗体Ｆａｂフラグメント（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅからＤｉｇｉｂｉｎｄ及びＤｉｇｉｆａｂとして市販）は、ＥＤＬＦのインビトロ効果及びＰＥのインビボ特徴を減弱させる。ラジオイムノアッセイ（ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡ）におけるＤｉｇｉｂｉｎｄまたはＤｉｇｉｆａｂは、ＥＤＬＦを測定することができ、このアッセイによって測定されたＥＤＬＦの量は、ＥＤＬＦの生体機能アッセイと比較できる。ヒト胎盤は、ＥＤＬＦの源であり、ＥＤＬＦを合成し、培養されたヒト胎盤組織の媒質中に放出する。ケトコナゾール、ステロイド合成阻害剤、及び１７−ＯＨプロゲステロンは、それぞれＥＤＬＦ放出を阻害するか、または増加させることが示され、合成経路の重複を証明する。胎盤低酸素症等のＰＥの異常、活性酸素種の増加、及び炎症性サイトカインの増加は、胎盤ＥＤＬＦ放出を増加させることを実証した。ＰＥを媒介すると考えられる因子に応答するＥＤＬＦの調節性分泌は、本研究の顕著な進歩を表す。低酸素症、酸化的ストレス、及びサイトカインは、全てＰＥにおいて増加することが示され、本発明者らは、これらの因子がＥＤＬＦ産生を調節することを示す。発明者らは、驚くべきことに、ケトコナゾール及び１７α−ヒドロキシプロゲステロンがＥＤＬＦ産生を改変し、したがってそれを使用してＥＤＬＦ合成経路を調節できることを発見した。したがって、ＤｉｇｏｘｉｎＡＢは、ＰＥの症状、特に高血圧を改善することができ、ＰＥの治療法で使用され得る。これは、重症のＰＥ女性におけるＤｉｇｉｂｉｎｄの臨床試験で最近検査され、正の結果を示した。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２７：６５５−６６２。
ヒト胎盤におけるＥＤＬＦの合成経路及び調節を決定する。
歴史的に、胎盤は、子癇前症（ＰＥ）の発達に必要な関与因子であると考えられている。胎盤／胎児の除去は、ＰＥの全特徴の急速な回復をもたらす。
ＥＤＬＦは、ＰＥのいくつかの特徴を媒介し得るが、胎盤は、ＥＤＬＦの源として重視されていなかった。最近の研究は、特に子癇前症的妊娠からの胎盤中の例外的に高いレベルのＥＤＬＦを報告した。Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｃｉ １８：１９０−１９９。胎盤は、ＥＤＬＦを合成し、放出することができる。胎盤組織は、高レベルの１つ以上のＥＤＬＦを有することが示された。Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｃｉ １８：１９０−１９９。胎盤組織は、ＥＤＬＦを産生し、放出する。ケトコナゾール、ステロイド合成遮断剤は、胎盤ＥＤＬＦ産生を用量依存的に著しく低減したが、ステロイド合成の基質として作用し得る１７−ＯＨプロゲステロンは、ＥＤＬＦの合成及び放出を増加させた。プロゲステロン自体は、ＥＤＬＦ産生に対してほとんど、または全く影響を及ぼさないように思われた。これら２つのステロイドに対する胎盤応答の差は、胎盤中の１７−ヒドロキシラーゼの非存在と関係し得、プロゲステロンを、中間体としてさえも１７−ＯＨ基を必要とする産生物にさらに処理する胎盤の能力を制限する。Ｕｇｅｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７１：２０３−２１１を参照されたい。ＥＤＬＦは、胎盤中で産生され、ステロイド合成に関与する酵素を必要とする。
ＰＥ妊娠において異常レベルで存在することが実証されたいくつかの循環または局所作用する調節化合物。これらのいくつかは、より高レベルの炎症性サイトカイン、低酸素、活性酸素種の増加、及び血管新生促進因子の増加／抗血管新生因子の減少である。腫瘍壊死因子−α（炎症性サイトカイン）は、低濃度のＨ２Ｏ２、活性酸素種と同様に、正常なヒト胎盤からのＥＤＬＦ放出の著しい増加を引き起こした。低酸素は、ＥＤＬＦ出力を穏やかに増加させるように思われた。
初期の研究は、インターロイキン−６（第２の炎症性サイトカイン）、プレグネノロン（早期ステロイド経路中間体）、胎盤成長因子、血管内皮成長因子（いずれも血管新生促進因子）、及びｓＦＬＴ−１（抗血管新生の可溶性受容体）を用いて実験を行った。これらの全てはＰＥにおいて増加し、ＥＤＬＦがＰＥにおいて増加した理由を説明する。
ヒト胎盤からＥＤＬＦを単離し、その化学構造を特徴付ける。
内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）は、体内で産生され、血中で循環する化合物である。ＥＤＬＦは、高血圧性疾患及び腎機能に関与する。これらの化合物は、最も一般的な形態の高血圧において直接的な役割を有する。Ｈａｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）″Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｄｉｇｉｔａｌｉｓ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．″Ｉｎ Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｌａｒａｇｈ（Ｅｄｓ）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １０５５−１０６７、Ｇｒａｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ３８：４３３−４４４。ＥＤＬＦは、子癇前症（ＰＥ）において積極的な役割を果たし、これまでの研究は、ＥＤＬＦが、多くのＰＥ女性において高血圧を媒介し得ることを示唆する。Ｇｒａｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ５９：１０７０−４、Ｇｒａｖｅｓ（１９８７）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １０（Ｓ Ｐｔ ２）：Ｉ−８４−６、Ｇｒａｖｅｓ（２００７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １２：２４３８−２４４６、Ｇｏｏｄｌｉｎ（１９８８）Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３１８：５１８−５１９、Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １０：１１Ａ、Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ １６：５２９−５３１、及びＡｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２９：２８４−９。
ＥＤＬＦを、Ｄｉｇｉｂｉｎｄを抗体結合剤として使用し、親和性クロマトグラフィーによってヒト胎盤標本から単離した。限外ろ過技法に加えてＥＤＬＦのこの抗体親和性単離は、比較的短い時間に生物学的標本からのＥＤＬＦの精製を可能にする。発明者らは、驚くべきことに、合併症のない妊娠であってもヒト胎盤が豊富なＥＤＬＦを有することを発見した。ＥＤＬＦのホモジネートからの抗体分離後に、単離されたＥＤＬＦをさらに分離し、ＨＰＬＣクロマトグラフィー技法によって精製することができ、高度に精製された材料につながる。ＥＤＬＦ構造は、様々な化学分析及び質量分析（ＭＳ）によって分析した。
ウアバインは、１つのＥＤＬＦを表し得るか、または少なくともＥＤＬＦに化学的に類似し得る。ウアバインを良好にイオン化し、ＭＳによって分析して、特徴的な溶出時間及び質量スペクトルを提供した。加えて、無傷の分子の良好なフラグメント化は、タンデムＭＳ−ＭＳ技法を使用して実現し、構造情報が得られ得ることを確認した。
胎盤ホモジネート中に高レベルのＥＤＬＦが見出された。ＥＤＬＦの胎盤産生は、過酸化水素または腫瘍壊死因子αによって増加した。
Ｄｉｇｉｂｉｎｄを使用してＥＤＬＦに選択的に結合させることより、相当量（例えば、約８０％）の阻害剤を組織ホモジネートから除去した。限外ろ過を使用して、精製中のある特定の段階でＥＤＬＦを放出することにより、最も望ましくない不純物を排除した。次にＨＰＬＣ分離法を使用して、１つ以上のＥＤＬＦをさらに単離し、精製した。ＥＤＬＦアッセイを使用して、ＥＤＬＦが分離カラム中から溶出したことを決定した。次に個々のＥＤＬＦを回収し、備蓄して、質量分光分析に提出することができる。キャピラリー液体クロマトグラフィーは、いくつかの質量分析計の１つに結合され得る。
抗体
抗体は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽いポリペプチド鎖（「軽鎖」）、及び分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重い鎖（「重鎖」）からなり得る。Ｅｄｅｌｍａｎ（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：５を参照されたい。「Ｙ」構成のジスルフィド結合によって４つの鎖を接合し、軽鎖は、「Ｙ」構成の口部から始まり重鎖を囲む。「Ｙ」構成の「分枝」部分は、Ｆａｂ領域と指定され、「Ｙ」構成の幹部分は、ＦＣ領域と指定される。アミノ酸配列の配向は、「Ｙ」構成の上部のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端に向かう。Ｎ末端は、それを誘発した抗原に対して特異性を有する可変領域を有し、約１００アミノ酸長であり、軽鎖と重鎖との間及び抗体間でわずかな変化がある。
可変領域は、各鎖内で、鎖の残りの長さを延長し、特定クラスの抗体内で抗体の特異性によって変化しない定常領域（すなわち、それを誘発する抗原）に結合される。免疫グロブリン分子のクラス（例えば、γ、μ、α、δ、及びε重鎖定常領域に対応するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）を決定する定常領域には５つの既知の主要クラスがある。本明細書に記載される抗体及び抗体フラグメントは、ヒト、ヒト化、マウス、ヒツジ、ウシ、またはブタであり得る。本明細書に記載される抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントであり得る。
定常領域またはクラスは、補体の活性化（Ｋａｂａｔ（１９７６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［２ｎｄ Ｅｄ．］ｐａｇｅｓ ４１３〜４３６、Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｗｉｎｓｔｏｎ）及び他の細胞応答（Ａｎｄｒｅｗｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １−１８、Ｋｏｈｌ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４８：１８７）を含む、抗体の後次エフェクター機能を決定するが、可変領域は、それが反応する抗原を決定する。軽鎖は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかで調製され得る。軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合され、免疫グロブリンがハイブリドーマまたはＢ細胞のいずれかによって生成される場合、２つの重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合によって互いに結合される。
そのような条件下での抗体に対する特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を必要とし得る。例えば、ラット、マウス、またはヒト等の特定種からの精液塩基性タンパク質に対して育成されたポリクローナル抗体を選択し、精液塩基性タンパク質と特異的に反応性であり、精液塩基性タンパク質の多型変異体及び対立遺伝子を除いて、他のタンパク質とは反応性でないそれらのポリクローナル抗体のみを得ることができる。この選択は、他の種からの精液塩基性タンパク質分子と交差反応する抗体を控除することによって実現され得る。多様なイムノアッセイフォーマットを使用して、特定タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを日常的に使用して、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択する。例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９９８）ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。典型的に、特異的または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンド信号またはノイズであり、より典型的には約１０〜１００倍超のバックグラウンドである。
抗体フラグメント
全体免疫グロブリン（またはそれらの組換え対応物）に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント（例えば、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、または他のフラグメント）が合成され得る。「フラグメント」または最小免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技法を用いて設計され得る。例えば、本発明で使用するための「Ｆｖ」免疫グロブリンは、融合された可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することによって産生され得る。抗体の複合、例えば、２つの異なるＦｖ特異性を備えるダイアボディも関心対象である。免疫グロブリンの抗原結合フラグメントには、ＳＭＩＰ（小分子免疫薬剤）、ラクダ抗体、ナノ抗体、及びＩｇＮＡＲが含まれるがこれらに限定されない。
抗ジゴキシンＦａｂ（ＤＩＦ）は、ジゴキシンジカルボキシメトキシルアミン（ＤＤＭＡ）、ジゴキシン誘導体に選択的に結合するＦａｂ抗体フラグメントであり得る。抗ジゴキシンＦａｂ（ＤＩＦ）は、ジゴキシン免疫Ｆａｂ、Ｄｉｇｉｂｉｎｄ、ＤｉｇｉＦａｂ、またはそれらの組合せであり得る。抗ジゴキシン抗体は、ジゴキシンに選択的に結合する抗体であり得る。Ａｎｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９０；８１：１７４４、Ｓｉｎｃｌａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９，２８（３）：３５２−３５６。
抗ＥＤＬＦ抗体及びその抗体フラグメントは、本明細書に記載される方法で使用され得る。抗ＥＤＬＦ抗体及びそのフラグメントは、例えば、ＷＯ１９９４／０１２２１０に記載されている。
薬学的組成物
「薬学的組成物」は、哺乳動物への投与に適した化学的または生物学的組成物を指す。そのような組成物は、口腔、上皮、硬膜外、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋内、鼻腔内、眼球内、腹腔内、髄腔内、くも膜下、静脈内、経口、非経口、浣腸または坐薬を介して直腸的、皮下、真皮下、舌下、経皮、及び経粘膜を含むがこれらに限定されない多数の経路の１つ以上を介した投与のために特異的に配合され得る。加えて、投与は、注入、粉末、液体、ゲル、ドロップ、または他の投与手段によって起こり得る。
「薬学的賦形剤」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性治療薬が配合される担体、通常は液体である。本発明の一実施形態において、活性治療薬は、本明細書に記載されるヒト化抗体、またはその１つ以上のフラグメントである。賦形剤は、一般に、配合物に対していかなる薬理活性も提供しないが、化学的及び／または生物学的安定性、ならびに放出特徴を提供し得る。例示的な配合物は、例えば、Ｇｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１ｓｔＥｄ．］において見出され得る。
薬学的組成物は、典型的に、製造及び保管の条件下で無菌及び安定でなければならない。本発明は、薬学的組成物が凍結乾燥形態で存在することを企図する。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序構造として配合され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）を含有する溶媒または分散媒質、及びその適切な混合物であり得る。本発明は、薬学的組成物中の安定剤の包含をさらに企図する。
本発明の抗ジゴキシン抗体及びそのフラグメントは、様々な投薬形態の薬学的組成物に配合され得る。本発明の薬学的組成物を調製するために、少なくとも１つの抗ジゴキシン抗体、またはその結合フラグメントが、医薬製剤の技術分野における当業者に周知の技法に従って、活性成分として適切な担体及び添加剤と密に混合され得る。Ｇｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１ｓｔＥｄ．］を参照されたい。例えば、本明細書に記載される抗体は、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２中に配合され、５．０ｍｇ／ｍＬの無色透明の液体溶液として供給され得る。
同様に、液体調製物のための組成物には、水、アルコール、油、グリコール、保存剤、香味剤、着色剤、及び懸濁剤を含むがこれらに限定されない適切な担体及び添加剤とともに、溶液、エマルション、分散液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルが含まれる。非経口投与のための典型的な調製物は、無菌水またはポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、ラッカセイ油、もしくはゴマ油を含むがこれらに限定されない非経口的に許容される油等の担体とともに活性成分を含み、可溶性または保存を補助するための他の添加剤が含まれてもよい。溶液の場合、粉末に凍結乾燥された後、使用前に速やかに再構成され得る。分散液及び懸濁液の場合、適切な担体及び添加剤には、水性ゴム、セルロース、ケイ酸塩、または油が含まれる。
列挙される実施形態のそれぞれについて、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントは、多様な投薬形態によって投与され得る。当業者に既知の任意の生物学的に許容される投薬形態、及びその組合せが企図される。そのような投薬形態の例には、無制限に、再構成可能な粉末、エリキシル、液体、溶液、懸濁液、エマルション、粉末、顆粒、粒子、微粒子、分散性顆粒、カシェー、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、デポーインプラント、注入剤（皮下、筋内、静脈内、及び皮内を含む）、点滴、及びそれらの組合せが含まれる。
多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム等）を組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。さらに、本明細書に記載される組成物は、持続放出配合物中、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物中に配合され得る。抗ジゴキシン抗体、またはその抗原結合フラグメントは、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤等の急速放出に対して化合物を保護する担体で調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）等の生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような配合物の調製のための多くの方法は、当業者に既知である。
当業者は、例えば、本明細書の開示及びＧｏｏｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ′ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［１２ｔｈ Ｅｄ．］、Ｈｏｗｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ′ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ［２ｎｄ Ｅｄ．］、及びＧｏｌａｎ，（２００８）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ［２ｎｄ Ｅｄ．］の教示によって導かれる、日常実験を通して投与の有効な投薬量及び頻度を決定することができるであろう。Ｇｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１ｓｔＥｄ．］も参照されたい。
投与経路
本明細書に記載される組成物は、次の経路、口腔、上皮、硬膜外、点滴、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋内、鼻腔内、眼球内、腹腔内、髄腔内、くも膜下、静脈内、経口、非経口、肺、浣腸または坐薬を介して直腸的、皮下、真皮下、舌下、経皮、及び経粘膜のいずれかで投与され得る。好ましい投与経路は、静脈内注入または点滴である。投与は局所であり得、組成物は、疾患の部位（複数可）に直接、その近くに、局所的に、その付近、その部位、その周辺、またはそれに近接して投与され、組成物は、患者に付与され、広範囲にわたって体内を通過し、それによって疾患の部位（複数可）に到達する。局所投与（例えば、注入）は、疾患を包含する、及び／もしくは疾患に影響される細胞、組織、器官、及び／もしくは器官系、ならびに／または疾患の兆候及び／もしくは症状が活性であるか、または起こる可能性がある場所（例えば、胎盤）への投与によって実現され得る。投与は、局所効果を有する局所性であり得る、組成物は、その作用が所望される場所（例えば、胎盤）に直接適用される。
列挙される実施形態のそれぞれについて、抗ジゴキシン抗体または抗原結合フラグメントは、当該技術分野において既知の通り、多様な投薬形態によって投与され得る。当業者に既知の任意の生物学的に許容される投薬形態、及びその組合せが企図される。そのような投薬形態の例には、無制限に、チュアブル錠、即溶錠、発泡錠、再構成可能な粉末、エリキシル、液体、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、多層錠剤、二層錠剤、カプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、トローチ、チュアブルトローチ、ビーズ、粉末、ガム、顆粒、粒子、微粒子、分散性顆粒、カシェー、ドルシェ、坐薬、クリーム、局所剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、デポーインプラント、摂取剤、注入剤（皮下、筋内、静脈内、及び皮内を含む）、点滴、及びそれらの組合せが含まれる。
混合物によって含まれ得る他の化合物は、例えば、医学的不活性成分（例えば、固体及び液体希釈剤）、例えば、錠剤またはカプセルのためのラクトース、デキストロースサッカロース、セルロース、デンプン、またはリン酸カルシウム、軟カプセルのためのオリーブ油またはオレイン酸エチル、及び懸濁液もしくはエマルションのための水もしくは植物油；シリカ、タルク、ステアリン酸、マグネシウム、またはステアリン酸カルシウム、及び／またはポリエチレングリコール等の潤滑剤；コロイド粘土等のゲル化剤；トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウム等の増粘剤；デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン等の結合剤；デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、またはデンプングリコール酸ナトリウム等の崩壊剤；発泡混合剤；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベート、または硫酸ラウリル等の湿潤剤；及びそのような配合物に対する既知の添加剤である、保湿剤、保存剤、緩衝剤、及び抗酸化剤等の他の治療上許容される副成分である。
経口投与のための液体分散剤は、シロップ、エマルション、溶液、または懸濁液であり得る。シロップは、担体として、例えば、サッカロース、またはグリセロール及び／もしくはマンニトール及び／もしくはソルビトールを有するサッカロースを含有し得る。懸濁液及びエマルションは、担体、例えば、天然ゴム、アガー、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有し得る。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の有効量の抗ジゴキシン抗体及びその抗体フラグメントを含む薬剤投薬量単位を含む１つ以上の容器を含むキットを提供する。キットは、指示、案内、ラベル、マーケティング情報、警告、または情報パンフレットを含み得る。
投薬量
本発明の任意の実施形態に従う治療組成物中のＥＤＬＦ、抗体、及びその抗原結合フラグメントの量は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重、患者病歴、危険因子、疾患の素因、投与経路、既存の治療計画（例えば、他の薬剤との考えられる相互作用）、及び体重等の因子によって異なり得る。投薬計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与され得るか、いくつかの分割用量が時間をかけて投与され得るか、または危急の治療状況によって示されるように、用量が比例的に低減もしくは増加され得る。
投与の容易性及び投薬量の均一性のために、投薬量単位形態の非経口組成物を配合することが特に有益である。投薬量単位形態は、本明細書で用いられる場合、治療される哺乳類対象のための単一投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された既定量の抗体及びそのフラグメントを含有する。本発明の投薬量単位形態の仕様は、個体における感受性の治療のために、抗体及びそのフラグメントの固有の特徴、及び実現される特定の治療効果、ならびに抗体及びそのフラグメント等の化合技術に内在する制限によって決められ、直接依存する。本発明の抗体及びそのフラグメントまたはその適切な薬学的組成物が有効である哺乳動物（例えば、ヒト）の状態の治療するための治療用途において、本発明の抗体及びそのフラグメントは、有効量で投与され得る。本発明に適した投薬量は、組成物、薬学的組成物、または本明細書に記載される任意の他の組成物であり得る。
投薬量は、単回用量、２倍用量、３倍用量、４倍用量、及び／または５倍用量として投与され得る。投薬量は、単独で、同時に、及び連続的に投与され得る。
投薬形態は、当業者に既知の任意の放出形態であり得る。本発明の組成物は、活性成分の即時放出、または活性成分の持続放出もしくは制御放出を提供するように配合され得る。持続放出もしくは制御放出調製剤において、活性成分の放出は、長時間にわたって（例えば、４〜２４時間）血中レベルが治療範囲内であるが、毒性レベルより下に維持される速度で起こり得る。好ましい投薬形態には、即時放出、長期放出、拍動放出、可変放出、制御放出、時限放出、持続放出、遅延放出、長時間作用型、及びそれらの組合せが含まれ、当該技術分野において既知である。
組成物の薬理活性は、当該技術分野において既知の標準薬理学的モデルを使用して監視され得ることを理解されたい。さらに、ＥＤＬＦ、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物は、部位特異的送達に適したポリマーマトリックスもしくは膜に組み込まれ得るか、またはカプセル化され得、あるいは部位特異的送達を生じさせることができる特定の標的薬剤で官能化され得ることを理解されたい。これらの技法ならびに他の薬物送達技法は、当該技術分野において周知である。特定の状況に対する最適投薬量の決定は、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｇｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１ｓｔＥｄ．］を参照されたい。
治療方法
本発明は、子癇症または子癇前症を有するか、または子癇症または子癇前症の危険性がある患者が、高レベルのＥＤＬＦを有するかどうかを決定することと、ＥＤＬＦ陽性である場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にＦａｂフラグメントを投与することと、を含む、子癇症または子癇前症の治療を提供する。
また、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者は、ＥＤＬＦレベルについて試験することができ、ＥＤＬＦ陽性である場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にＦａｂフラグメントを患者に投与する。
妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者は、試料、任意に血液、血清、または胎盤試料を得ることによってＥＤＬＦについて試験することができ、イムノアッセイに基づいて、ジゴキシン−免疫抗体イムノアッセイで試料をアッセイして、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定し、患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にＦａｂフラグメントを患者に投与する。
また、イムノアッセイに基づいて、ジゴキシン−免疫抗体イムノアッセイを患者で行って、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定し、患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にＦａｂフラグメントを患者に投与することによって患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を防止することができる。
脳室内出血は、治療を必要とする患者において治療することができ、ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、早期分娩される（妊娠４０週より前）結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行い、イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体Ｆａｂフラグメントを患者に投与することと、を含む。
患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を防止するために、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することができ、ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、早期分娩される（妊娠４０週より前）結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行い、イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にＦａｂフラグメントを患者に投与することと、を含む。
早産と関連付けられる胎児合併症を治療するための方法は、ジゴキシン免疫抗体イムノアッセイを、胎児が早期分娩され得る（妊娠４０週より前）妊娠ヒト患者で行い、イムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にＦａｂフラグメントを患者に投与することと、を含む。
早産と関連付けられる胎児合併症は、ＩＶＨまたはＮＥＣを含み得る。
妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者において妊娠を延長させる方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体ラジオイムノアッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、（ｂ）ラジオイムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
子癇症または子癇前症の危険性がある患者を治療するための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）該試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、（ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することであって、該ＥＤＬＦの存在が、子癇症または子癇前症を示す、検出することと、（ｄ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
胎児及び／または新生児にＩＶＨの危険性がある患者を治療するための方法は、（ａ）患者から試料を得ることと、（ｂ）該試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、（ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することであって、該ＥＤＬＦの存在が、子癇症または子癇前症を示す、検出することと、（ｄ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を患者に投与することと、を含み得る。
子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与することと、を含み得る。
妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延を患う患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与することと、を含み得る。
脳室内出血を治療するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法は、（ａ）ジゴキシン免疫抗体ラジオイムノアッセイを、脳室内出血を患う患者で行うことと、（ｂ）ラジオイムノアッセイに基づいて、患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、（ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与することと、を含み得る。
脳室内出血を治療するための方法は、（ａ）胎児に脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与することと、を含み得る。
脳室内出血の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、（ｄ）該ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを該患者に投与すること。
脳室内出血の危険性がある患者を治療するための方法は、（ａ）脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、（ｂ）該試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、（ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することであって、該ＥＤＬＦの存在が脳室内出血を示す、検出することと、を含み得る。
抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または抗原を結合することができる抗体の部分であり得る。
抗体は、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性であり得る。
抗体またはフラグメントは、標識に結合され得る。別の実施形態において、標識は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射活性標識であり得る。別の実施形態において、常磁性標識は、アルミニウム、マンガネーゼ、白金、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムであり得る。
抗体は、固体支持体に結合され得る。固相支持体は、ビーズ、試験管、シート、培養皿、ナノワイヤ、または試験片であり得る。固体支持体は、アレイであり得る。ナノワイヤは、配列され得る。Ｔｈｅ Ｈｅｍｍｉｌａ，ｅｔ ａｌ．″Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓａｍｐｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｓｉｌｉｃｏｎ ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．″Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅ．Ｔｅｃｈｏｌ．，２０１４。抗ジゴキシン抗体は、ナノワイヤバイオセンサー上に固定され得る。
シリコンナノワイヤバイオセンサーは、固定化された抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシンＦａｂ抗体フラグメントを含み得る。フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または抗原を結合することができる抗体の部分であり得る。抗体は、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性であり得る。バイオセンサーは、生物試料中に少なくとも約１００ｎＭのジゴキシンの感受性を有し得る。
ＥＤＬＦを検出する方法は、生物試料を、固定化された抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシンＦａｂ抗体フラグメントを含むナノワイヤバイオセンサーと接触させることと、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、を含み得る。
子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料、任意に血液試料を得ることと、（ｂ）該生物試料をナノワイヤバイオセンサーと接触させることを含む、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することであって、約１００ｎＭを超えるＥＤＬＦレベルが、子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性を示す、決定することと、を含み得る。
妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料、任意に血液試料を得ることと、（ｂ）該生物試料をナノワイヤバイオセンサーと接触させることを含む、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することであって、１００ｎＭを超えるＥＤＬＦレベルが、妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性を示す、決定することと、を含み得る。
子癇症または子癇前症について患者をスクリーニングするための方法は、（ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料、任意に血液試料を得ることと、（ｂ）該生物試料をナノワイヤバイオセンサーと接触させることを含む、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、（ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することであって、１００ｎＭを超えるＥＤＬＦレベルが、子癇症または子癇前症を示す、決定することと、を含み得る。
試料は、血液、血清、血漿、または胎盤試料であり得る。
抗体イムノアッセイは、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイからなる群から選択されるアッセイであり得る。
ＥＤＬＦレベルは、１００ｎＭ ＥＤＬＦを超え得る。ＥＤＬＦレベルは、約１００、２００、３００、４００、または５００ｎＭ ＥＤＬＦであり得る。ＥＤＬＦレベルは、約１００、２００、３００、４００、または５００ｎＭ ＥＤＬＦを超え得る。
投与されるジゴキシン抗体の投薬量は、少なくとも０．００６ｍｇジゴキシン結合能／Ｋｇ未満であり得る。投与されるジゴキシン抗体の投薬量は、少なくとも０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、または０．０１０ｍｇジゴキシン結合能／Ｋｇ未満であり得る。投薬量は、６時間以下の期間にわたって投与され得る。投薬量は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間以下の期間にわたって投与され得る。
抗体フラグメントは、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、または脱イオン水中で静脈内投与され得る。抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントは、ヒト化またはキメラ化され得る。
本明細書に記載される治療の方法は、その後の投薬量でのジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含み得る。本明細書に記載される治療の方法は、治療上有効な量のコルチコステロイドを投与することをさらに含み得る。本明細書に記載される治療の方法は、その後の投薬量でのジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含み得る。
本明細書に記載される治療の方法は、治療上有効な量の降圧薬を投与することをさらに含み得る。降圧薬は、ラベタロール、アルテノロール、ニフェジピン、１−メチルドーパ、またはヒドララジンであり得る。
本明細書に記載される治療の方法は、治療上有効な量の硫酸マグネシウムまたはフェニトインを投与することをさらに含み得る。ジゴキシン免疫Ｆａｂは、ヒツジジゴキシン免疫Ｆａｂであり得る。用量は、約１０．０ｍｇ以下であり得る。用量は、約５．０ｍｇ以下であり得る。用量は、約０．０１〜１．０ｍｇの範囲内であり得る。用量は、約０．０１ｍｇ〜０．５ｍｇの範囲内であり得る。用量は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇであり得る。
診断方法
抗ＥＤＬＦ及びその抗体フラグメントは、ＥＤＬＦの存在または非存在を検出するための診断的方法で使用され得る。抗ＥＤＬＦ抗体及びその抗原結合フラグメントは、（ａ）試験試料を、ＥＤＬＦに結合する抗体またはそのフラグメントと接触させることと、（ｂ）抗体−エピトープ複合体についてアッセイすることであって、該エピトープの存在が癌を示す、アッセイすることと、を含む方法で使用され得る。さらに、抗ＥＤＬＦ抗体及は、（ａ）ＥＤＬＦに結合する標識モノクローナル抗体またはそのフラグメントを該患者に投与することと、（ｂ）ＥＤＬＦの存在を検出することであって、該エピトープの存在が癌を示す、検出することと、を含む、患者におけるＥＤＬＦの存在を検出するための方法で使用され得る。抗体−エピトープ複合体は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイによって検出され得る。試料は、組織検体、リンパ、尿、脳髄液、羊水、炎症性滲出液、血液、または血清である試料であり得る。
その抗ＥＤＬＦ抗体は、ＥＤＬＦの存在または非存在を検出するための診断的方法で使用され得、抗原の存在は、子癇症、子癇前症、及び／または脳室内出血を示す。診断的方法は、子癇症、子癇前症、及び／もしくは脳室内出血の危険性がある患者、または症状のない患者に用いることができる。
ＥＤＬＦに選択的に結合する抗体は、組換えであり得る。ＥＤＬＦに選択的に結合する抗体のフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または抗原を結合することができる抗体の部分であり得る。ＥＤＬＦに選択的に結合する抗体のフラグメントは、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性であり得る。ＥＤＬＦに選択的に結合する抗体は、限定されないが、化学発光標識、常磁性標識（例えば、アルミニウム、マンガネーゼ、白金、酸素、ランタナム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウム）、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射活性標識を含む標識に結合される。
追加として、その抗ＥＤＬＦ抗体は、配列等の固体支持体（例えば、ビーズ、試験管、シート、培養皿、または試験片）に結合され得る。
方法は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、ＣＣＤ低光監視システム、ｘ線、ＣＴ走査、シンチグラフィー、光共鳴撮像、単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、超音波、常磁性撮像、及び内視鏡光干渉断層撮影によって、ＥＤＬＦを撮像することを含み得る。
ＥＤＬＦは、子癇症、子癇前症、及び／または脳室内出血のバイオマーカーとして使用され得る。対象の血清等の生物試料中のＥＤＬＦの検出は、抗ＥＤＬＦ抗体またはそのフラグメントによって行われ得る。例えば、生物試料（例えば、血清または胎盤試料）を対象から得た後、ＥＤＬＦを（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＰＣＲによって）測定し、正常対象からの対応する試料と比較する。測定方法には、核酸検出の任意の方法、例えば、アンチセンスＥＤＬＦ ＤＮＡまたはｃＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用する原位置ハイブリダイゼーション、超高スループット配列決定、ナノストリング技術、マイクロアレイ、ローリングサークル増幅、近接媒介ライゲーション、ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ ＣｈＩＰ、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ、またはＥＤＬＦ結合抗体が含まれる。比較的高レベルのＥＤＬＦは、子癇症、子癇前症、及び／または脳室内出血の存在及び／または重症度を示す。
その抗ＥＤＬＦ抗体は、診断的方法のためのＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉計）技法で使用され得る。ＳＱＵＩＤ技法は、酸化鉄のナノ粒子を抗体に結合することを含み、次にそれらを患者に注入する。例えば、Ｈａｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ４３：４７４００４を参照されたい。ＳＱＵＩＤ方法において、次に患者は、超伝導量子干渉計（ＳＱＵＩＤ）内で、高感度磁気コイルで囲まれる。磁場が生成され、金属ナノ粒子の全てが一方向に整列する。磁場が破壊される場合、ナノ粒子は、弛緩してそれらの元の状態に戻るにつれて電磁信号を発する。信号の強度を測定することによって、いくつの金属粒子、したがってどれだけのＥＤＬＦが存在し得るか、及び患者のどこにＥＤＬＦが位置するかを知ることができる。例えば、Ｓｈａｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：１４２−１５４を参照されたい。
試料及び試料の調達
本明細書に記載される方法で使用される試料は、対象（患者）から採取することができ、血液、血清、血漿、胎盤、またはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない。診断的アッセイに供する前に、試料を適切な希釈剤で任意に希釈することができる。
多くの周知の組織または液体回収方法を用いて、対象における関心対象のマーカーのＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはポリペプチドのレベルを決定するために、対象から生物試料を回収することができる。組織または流体回収方法の例には、細針生検、針生検、コア細針生検、及び外科的生検（例えば、脳生検）、ならびに洗浄が含まれるがこれらに限定されない。用いられる手順にかかわらず、一旦検体／試料が得られると、マーカーのレベルを決定することができ、したがって診断を行うことができる。
ＥＤＬＦの検出
本発明は、生物試料中の本発明のＥＤＬＦを検出するための方法を提供し、生物試料を、本発明に従うＥＤＬＦを特異的に認識する抗体と接触させることと、該相互作用を検出することと、を含み、相互作用の存在は、生物試料中のＥＤＬＦの存在と相関する。
本明細書に記載されるＥＤＬＦは、疾患及び／またはそれを示す状態を診断するためのマーカーの非限定例である。本発明の各マーカーは、子癇症、子癇前症、及び／または脳室内出血の予後、予測、スクリーニング、早期診断、進行の決定、治療法選択、及び治療監視を含むがこれらに限定されない様々な用途のために、単独または組合せで用いられ得る。
アッセイ
ＥＤＬＦ、抗体、及びＥＤＬＦに結合する抗原結合フラグメントをアッセイで使用して、試料中のマーカーを定性的または定量的に検出し、分析することができる。例えば、ＥＤＬＦ、抗体、及びＥＤＬＦに結合する抗原結合フラグメントを、ナノワイヤバイオセンサーアッセイで使用して、試料中のマーカーを定性的または定量的に検出し、分析することができる。例えば、抗ＥＤＬＦ抗体が生物試料中でＥＤＬＦに結合する場合、抗ＥＤＬＦ抗体は、その導電率を変化させるナノワイヤに付加され得る。さらに、抗ジゴキシン抗体が生物試料中でジゴキシンに結合する場合、抗ジゴキシン抗体は、その導電率を変化させるナノワイヤに付加され得る。ナノワイヤは、配列で並べられ得る。ナノワイヤは、チップに結合され得る。例えば、ジゴキシンを検出するための方法は、生物試料、任意に血液試料を得ることと、生物試料、任意に血液試料を、抗ジゴキシン抗体を含むナノワイヤを含むチップと接触させることと、導電率を測定することとであって、導電率の変化がジゴキシンの存在を示す、測定することと、を含み得る。この方法は、導電率の変化に基づいて、試料中に存在するジゴキシンの量を測定することをさらに含み得る。
例えば、ＥＤＬＦ、抗体、及びＥＤＬＦに結合する抗原結合フラグメントを、イムノアッセイで使用して、試料中のマーカーを定性的または定量的に検出し、分析することができる。この方法は、ＥＤＬＦに特異的に結合する抗体を提供することと、試料を抗体と接触させることと、試料中のマーカーに結合された抗体の複合体の存在を検出することと、を含む。
ＥＤＬＦは、多数の十分に認識された免疫学的結合アッセイのいずれかを使用して検出及び／または定量化され得る。有用なアッセイには、例えば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイが含まれる。例えば、米国特許第４，３６６，２４１号、同第４，３７６，１１０号、同第４，５１７，２８８号、及び同第４，８３７，１６８号を参照されたい。一般に、対象から得られた試料は、ＥＤＬＦに特異的に結合する抗体と接触させることができる。
任意に、抗体を固体支持体に固定して、抗体を試料と接触させる前に、複合体の洗浄及び後次単離を促進することができる。固体支持体の例には、例えば、マイクロタイタープレート、ナノワイヤ、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズの形態のガラスまたはプラスチックが含まれるがこれらに限定されない。抗体は、固体支持体に結合され得る。
試料を抗体でインキュベートした後、混合物を洗浄すると、形成された抗体−マーカー複合体が検出され得る。これは、洗浄した混合物を検出試薬でインキュベートすることによって実現され得る。代替として、試料中のマーカーは、例えば、第２の標識抗体を使用して、結合されたマーカー特異的抗体を検出する間接的アッセイを使用して、及び／または例えば、マーカーの別個のエピトープに結合するモノクローナル抗体が混合物と同時にインキュベートされる、競合もしくは阻害アッセイにおいて検出され得る。
アッセイ全体で、インキュベーション及び／または洗浄ステップは、各試薬の複合後に必要とされ得る。インキュベーションステップは、約５秒〜数時間、好ましくは約５分〜約２４時間で異なり得る。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイフォーマット、マーカー、溶液量、濃度に依存する。通常、アッセイは、周囲温度で実行されるが、それらはある温度の範囲にわたって行われ得る（例えば、１０℃〜４０℃）。
イムノアッセイを使用して、対象からの試料中のマーカーの試験量を決定することができる。第１に、試料中のマーカーの試験量は、上記のイムノアッセイ方法を使用して検出され得る。マーカーが試料中に存在する場合、上記の適切なインキュベーション条件下でマーカーに特異的に結合する抗体との抗体−マーカー複合体を形成する。抗体−マーカー複合体の量は、標準と比較することによって任意に決定され得る。上記の通り、マーカーの試験量は、測定単位が対照量及び／または信号と比較できる限り、絶対単位で測定される必要はない。いくつかのイムノアッセイは、当該技術分野において既知であり、ＥＤＬＦ及び本明細書に記載される該抗原に特異的な抗体は、限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、磁気イムノアッセイ、イムノブロット、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫組織化学分析、及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含む、そのようなイムノアッセイで使用され得る。Ｗｉｌｄ，（２００８）［Ｅｄ．］Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ［３ｒｄ Ｅｄ．］Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい。
放射性撮像方法
ＥＤＬＦ、抗体、及びＥＤＬＦに結合する抗原結合フラグメントは、子癇症、子癇前症、及び／または脳室内出血を診断するために、放射性撮像方法で使用され得る。これらの方法には、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が含まれるがこれらに限定されない。これらの技法の両方は、非侵襲性であり、例えば、子癇症、子癇前症、及び／または脳室内出血を検出する等、様々な組織事象及び／または機能を検出及び／または測定するために使用できる。ＳＰＥＣＴは、任意に２つの標識と同時に使用され得る。米国特許第６，６９６，６８６号を参照されたい。
本明細書で述べられる全ての刊行物（例えば、非特許文献）、特許、特許出願公開、及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示す。全てのそのような刊行物（例えば、非特許文献）、特許、特許出願公開、及び特許出願は、それぞれ個々の公開、特許、特許出願公開、または特許出願が、参照により特異的かつ個々に組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料は、本発明または本発明の試験で使用され得るが、適切な方法及び材料が本明細書に記載される。材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
ここで一般に説明される本発明は、単に本発明のある特定の態様及び実施形態の説明の目的で含まれ、本発明を限定するものではない次の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
実施例
実施例１
胎盤ホモジネートの調製。
これらの初期研究のために、分娩直後に胎盤を正常な妊娠及び子癇前症的妊娠の両方から入手し、完全厚切片（約２ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍ）を除去し、液体窒素中で急速冷凍して、後の処理及びアッセイまで−８０℃で保管した。手術用メスを使用して胎盤小片を薄片に削り、組織薄片を、１５個のステンレス鋼球とともにＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｋｒｏ除膜器ステンレス鋼シリンダーに入れた。内容物を含むシリンダー全体を液体窒素中に４〜５分間沈めた。シリンダーの内容物を完全に冷凍した後、シリンダーをＳａｒｔｏｒｉｕｓボールミルに入れ、２０００ｒｐｍで１０分間振とうした。内容物が微粉末になるまで、浸水及び振とうのプロセスを繰り返した。胎盤ホモジネートを、シリンダーから５０ｍＬ円錐管に移し、脱イオン化Ｈ２Ｏを添加することによって容量を最大５ｍＬにした。タンパク質を除去するために、２容量のメタノール（１０ｍＬ）をホモジネートに徐々に添加しながら、混合物を連続して５分間渦動させた。次に胎盤試料混合物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿したタンパク質を除去した。上清を新たな円錐管に移し、真空で終夜乾燥させて残留メタノールを除去した。次に、脱イオン化Ｈ２Ｏを使用して、容量を元の容量の５ｍＬに戻した。胎盤ホモジネートを、さらなる処理及びアッセイのために−８０℃で保管した。
胎盤外植片培養物及び馴化培地の回収
これらの研究のために、分娩直後に合併症のない妊娠から胎盤を入手し、４〜５個の小組織片（約５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ）を内部胎児側から切除した。組織片を滅菌したはさみで小片に切断した。目に見える血栓及び血管はどれも滅菌したピンセットで除去した。残りの絨毛をＰＢＳで繰り返し洗浄し、絨毛間腔から血液を除去した。次に約５ｍｇ／ウェルの絨毛組織を、滅菌した紙タオルで軽く押さえて水気を切り、１ウェル当たり１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有する５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む６ウェル細胞培養プレート中、３７℃で４８時間、９５％空気及び５％ＣＯ２で満たされたインキュベーター内でインキュベートした。
ケトコナゾール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）、１７α−ヒドロキシプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ）、またはプレグネノロン（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩ，ＵＳＡ，２μＭ）、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ）または過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ，１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ）を、インキュベーションの開始時に個々に組織培養物に添加した。経時変化実験（６時間、１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間）を行い、可能性のある基質１７α−ヒドロキシプロゲステロンの影響を研究した。低Ｏ２培養実験のために、培養プレートを、２％酸素、５％二酸化炭素、９３％窒素（Ａｉｒｇａｓ ＡｃｕＧｒａｖ（登録商標），Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ，ＵＳＡ）を含有するガスを毎日流した可搬式空気室（Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｒｎｂｅｒｇ，Ｄｅｌ Ｍａｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）に最大４８時間入れた。空気室を、３７℃を維持するために、標準インキュベーター内に収容した。インキュベーションの最後に、培養培地の試料を１５ｍＬ円錐管内に回収し、４０００ＲＰＭで２分間遠心分離することによって、残留絨毛を全て除去した。上清を馴化培地として最後の処理及びアッセイまで−８０℃で保管した。
ジゴキシン免疫抗体ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
均質化及び組織培養プロセスの後、ホモジネート及び馴化培地試料を回収し、ラジオイムノアッセイによってアッセイした。Ｄｉｇｉｂｉｎｄ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）を、一次抗体抗ＥＤＬＦ／ウアバインとして使用し、ウサギ抗ヒツジ免疫グロブリン（ＩｇＧ）Ｆａｂフラグメント抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を、二次抗体として使用した。Ｄｉｇｉｆａｂ（Ｐｒｏｔｈｅｒｉｃｓ／ＢＴＧ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）もまた、アッセイで一次抗体として使用され得、Ｄｉｇｉｆａｂ及びＤｉｇｉｂｉｎｄの生物学的同等性に起因して同様の結果を生成することが予想される。Ｄｉｇｉｂｉｎｄ及びＤｉｇｉｆａｂは、ヒツジにおいて産生され、ヒトにおいてジゴキシンの過剰摂取に対抗するために治療的に使用される抗ジゴキシン抗血清のＦａｂフラグメントを表す。トリチウム化ウアバイン（３０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）をトレーサーとして使用した。勾配濃度の冷ウアバイン溶液を標準として使用した。１００μＬ分量の標本または標準ウアバイン溶液（５０ｎＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭ、３μＭ）、プラス５０μＬの２．２２×１０−８Ｍトリチウム化ウアバイン溶液、３００μＬの１．８μｇ／ｍＬ Ｄｉｇｉｂｉｎｄ溶液、６０μＬの２．１２×１０−７Ｍ ２°Ａｂ溶液、及び１０μＬの１０ｍＭ ｐＨ７．４トリス緩衝液を複合し、十分に混合した後、室温で終夜インキュベートして、抗原−抗体結合を許した。馴化培地のアッセイの場合、試料がＤＭＥＭ培地を含有するため、１００μＬのＤＭＥＭを各標準の反応溶液に添加し、１００μＬの脱イオン化Ｈ２Ｏを標本の反応溶液に添加して、それらを同じ容量にした。いくつかの馴化培地／ホモジネート標本または較正溶液中の標準冷ウアバイン中のＥＤＬＦは、Ｄｉｇｉｂｉｎｄの標識ウアバインと競合し、次に二次（２°）抗体を添加して、一次（１°）抗体−抗原複合体に結合し、その溶解性を減少させた。終夜のインキュベーション後、５６３μＬの１６％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−６０００（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を各反応溶液に添加し、抗体−抗原複合体を沈殿させた。１３，２００ｒｐｍで３０分間の遠心分離後、上清を破棄し、ペレットを５００μＬの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。次に、４ｍＬのＥｃｏｓｃｉｎｔＴＭ、シンチレーション流体（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ）を再懸濁した溶液に添加し、混合物をシンチレーションカウンターによって測定して、ＥＤＬＦ濃度を決定した。全ての個別標本を２回アッセイした。
プロゲステロン実験
ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡの結果がＥＤＬＦレベルを表したことを保証するために、主な胎盤ステロールであるプロゲステロンの効果をアッセイで試験した。勾配濃度の２０μＬ容量のプロゲステロン溶液（最終濃度１．００×１０−９Ｍ、１．００×１０−８Ｍ、及び１．００×１０−７Ｍ）、１００μＬの脱イオン化Ｈ２Ｏ、１００μＬの馴化培地試料、５０μＬのトリチル化ウアバイン溶液、３００μＬのＤｉｇｉｂｉｎｄ溶液、６０μＬの２°Ａｂ溶液、及び１０μＬの１０ｍＭ ｐＨ７．４トリス緩衝液を複合し、十分に混合した。プロゲステロン溶液の代わりに２０μＬの脱イオン化Ｈ２Ｏを含有する反応溶液を、負の対照として使用した。混合溶液をインキュベートし、沈殿させて、ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡ手順に記載の通り分析した。
脂質ヒドロペルオキシド及びＴＮＦα決定アッセイ
過酸化水素で、または低Ｏ２条件下で培養された胎盤外植片からの馴化培地を回収し、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）及びヒトＴＮＦ−α Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）によって製造者の方法に従ってアッセイし、脂質酸化のレベルを決定した。
ルビジウム（Ｒｂ＋）取込みの黒鉛炉原子吸光分析（ＧＦＡＡ）
これは、ＥＤＬＦの機能的バイオアッセイを表す。培養された胎盤組織から放出されたＥＤＬＦを含有する馴化培地を、上記の通りＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡによってアッセイし、見掛けＥＤＬＦ濃度を決定した。同時に、同じ試料を、細胞Ｒｂ＋の取込みによって、黒鉛炉原子吸光装置（ＧＦＡＡ，モデル４１００Ｚ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してアッセイし、新鮮なヒト赤血球（ＲＢＣ）への［Ｎａ＋，Ｋ＋］ＡＴＰａｓｅ依存性Ｒｂ＋輸送を測定した。ウアバインをこのアッセイで使用し、［Ｎａ＋，Ｋ＋］ＡＴＰａｓｅ活性の完全阻害を実現した。妊娠していない健常な志願者から血液を採取し、ＥＤＴＡを含有する管に入れ、室温で１時間放置し、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して血漿を除去した。残りのＲＢＣを２容量（１０ｍＬ）のＲｂＣｌ緩衝液（ＮａＣｌ １３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＲｂＣｌ ６．７３ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４ ８．１０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、及びＭｇＣｌ２ １．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４５を含有し、Ｋ＋を省く）で３回洗浄し、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離することによって細胞再開集する前に、５分間渦動させた。洗浄後、１０％ヘマトクリット（Ｈｃｔ）ＲＢＣ溶液を調製し、８００μＬのこの１０％ Ｈｃｔ ＲＢＣ溶液、１００μＬの馴化培地試料または対照（１．００×１０−３Ｍ 最終濃度のウアバイン）を、１００μＬのＤｉｇｉｂｉｎｄ溶液（１．００×１０−６Ｍ 最終濃度）の有無にかかわらず、エッペンドルフ管内で混合し、３７℃、２２０ｒｐｍで、４５分間インキュベーター内で揺らして、Ｒｂ＋イオンの細胞への取込みを許した。インキュベーション後、各バイオアッセイ溶液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＲＢＣをＲｂＣｌ緩衝液から単離した。次に１ｍＬの氷冷洗浄緩衝液（塩化コリン１４９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２ １．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭＯＰＳ ５．８８ｍｍｏｌ／Ｌ、トリス２．１２ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４０を含有する）を添加することによってＲＢＣを洗浄し、再度遠心分離して残余細胞外Ｒｂ＋を除去した。この洗浄プロセスを３回繰り返した。脱イオン化Ｈ２Ｏの添加によって細胞を溶解し、遠心分離して細胞ゴースト除去し（４０００ｒｐｍ）、−８０℃で終夜保管した。次にＧＦＡＡ装置の標準走査によってＲｂ＋の細胞への取込みを測定し、ＥＤＬＦが［Ｎａ＋，Ｋ＋］ＡＴＰａｓｅ媒介性イオン輸送を阻害する能力を決定した。ＧＦＡＡステップの前に、１０μＬのＲＢＣから単離されたシトソルを、脱イオン化Ｈ２Ｏで５００μＬに希釈し、Ｒｂ＋イオン定量化のために、そこから１０μＬをＧＦＡＡのオートサンプラーが注入した。全ての試料を３回アッセイした。
統計分析
結果は、平均＋１ＳＥＭとして報告される。ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡによって測定されたＥＤＬＦと、ＧＦＡＡ Ｒｂ＋イオン取込みアッセイによって測定されたＥＤＬＦとの比較を、ピアソンの積率相関係数分析によって行った。時間または濃度が胎盤組織からのＥＤＬＦ放出に及ぼす影響を、ダネットの対比較を用いてＡＮＯＶＡによって分析した。２つの群が関与する比較は、両側スチューデントｔ検定によって行った。ｐ値＜０．０５を有意と見なした。
結果
ＳＰ阻害剤またはＥＤＬＦは、胎盤ホモジネート中に存在し、ＰＥを有する女性からの胎盤においてより多い量が観察された。胎盤はＥＤＬＦを産生する。胎盤外植片がＥＤＬＦを放出できるかどうかを決定し、次に任意のそのような材料を、それがＳＰを阻害する能力及び複雑なＥＤＬＦに対するジゴキシン抗体Ｆａｂフラグメント（ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ）と相互作用する能力の両方によって認識され得るかどうかについて試験した。これを実現するために、第１の作業は、ＥＤＬＦに結合することが示されたジゴキシン抗体Ｆａｂフラグメント、Ｄｉｇｉｂｉｎｄを使用するイムノアッセイを開発することであった。
Ｄｉｇｉｂｉｎｄを用いるＥＤＬＦ特異的イムノアッセイ
ＤＥＥＰ試験と呼ばれる臨床試験は、増加した血清ＥＤＬＦレベルを有する子癇前症女性が、プラセボ治療と比較して、Ｄｉｇｉｂｉｎｄによる臨床効果を経験したことを見出した。Ｇｒａｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １２：２４３８−２４４６。さらに、最近の研究では、Ｄｉｇｉｂｉｎｄによって結合され、不活性化されたＰＥを有する女性からの血清及び胎盤の両方に存在するＥＤＬＦも指摘している。Ｍｅｎｅｚｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍｅｒ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １６：１０６２−１０６５。Ｄｉｇｉｂｉｎｄは、ＰＥに見出される活性ＥＤＬＦを認識し、結合し得るため、Ｄｉｇｉｂｉｎｄを一次抗体として使用するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用してＰＥを検出することができる。このアッセイは、観察可能な血清ＥＤＬＦを有し、結果的にＤｉｇｏｘｉｎＡＢ（抗ジゴキシン抗体）治療に対して好ましく応答するはずである女性を特定するプローブとして、すなわち、どの女性がＤｉｇｏｘｉｎＡＢによる治療から恩恵を受けるかを予測するための治療診断的試験として機能し得る。トリチル化ウアバインをトレーサーとして使用し、勾配濃度の非放射性標識ウアバインを標準として使用し、標準曲線を発達させた。
上記ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡを使用して、ＰＥを有する妊娠女性の血清中のＥＤＬＦを測定した。一部の女性は、他より実質的に高い濃度のＥＤＬＦを有していた。このアッセイは、胎盤ホモジネート中のＥＤＬＦの測定にも良好に適用された。
この新規のＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡを使用して、ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡ、及び赤血球Ｒｂ取込みのＳＰ阻害の両方によってアッセイされた１１個の馴化培地標本は、これら２つのアッセイ間に有意な相関があったことを実証した（図１、Ｒ＝０．６９、ｐ＝０．０１９）。
データは、ＰＥを有する女性からのタンパク質欠失胎盤ホモジネートが、ＰＥ血清中で見出されるより高い、時にははるかに高いＥＤＬＦレベルを有するように思われた。この観察は、胎盤がＥＤＬＦの源であり得ることを示唆した。ＰＥ血清で見出されたように、一部の妊娠女性は、他より実質的に高いＥＤＬＦの胎盤濃度を有していた。さらに、ＰＥを有する女性からの胎盤ホモジネート中のＥＤＬＦ濃度と、合併症のない妊娠女性からのものとの比較は、ＰＥ胎盤が、組織ＥＤＬＦレベルを増加させたことを示し、正常モノジネートとＰＥホモジネートとの間のこの差は、標本を連続希釈しても依然として有意であった（図２、未希釈血清、ＰＥ３２．８８±１４．６３対ＣＴＬ７．４４±１．１５×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＝０．０００２；１：２希釈、ＰＥ２０．７６±１１．２９対ＣＴＬ６．２８±０．８５×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＝０．００２；１：３希釈、ＰＥ１６．９６±９．１２対ＣＴＬ５．０４±０．５０×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＝０．００２、１：４希釈、ＰＥ１５．６１±１１．４７対ＣＴＬ４．１７±０．５４×１０−８Ｍ ウアバイン対照、ｐ＝０．０２）。この研究及び２つのアッセイの以前の比較は、胎盤がＥＤＬＦ源であること、及びＤｉｇｉｂｉｎｄを抗体として用いるＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡが、胎盤中のＥＤＬＦを適切に測定し、適正感度を有することの証拠を提供する。
最後に、新たに外植された正常ヒト胎盤の培養培地中に分泌されたＥＤＬＦも評価することができた。正常胎盤培養物からの媒質中のＥＤＬＦ濃度は、ＰＥ血清中に見出されるものの範囲内であった。
胎盤中のＥＤＬＦ合成及び合成経路
胎盤をＰＥにおけるＥＤＬＦ源として特定することに加えて、その組織産生に関するさらなる理解を提供することも関心対象であり、どの経路がその産生に関与し得るかの表示を含む。ＥＤＬＦはステロールであり、結果としてその合成経路は、ステロイド合成経路とステップを共有し得る。これらの経路の既知の基質があり、関与する酵素のいくつかを遮断することができるいくつかの薬剤もある。
ＥＤＬＦがステロイド合成経路におけるステップを必要としたかどうかを決定するために、ステロイド合成を遮断する薬剤であるケトコナゾールを使用する実験を行った。Ａｇｕａｎａｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２８：５０９−５１４、Ｇｒａｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｃａｒｄｉｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２２（Ｓ２）：Ｓ５４−５７。この薬物が外植胎盤組織に適用された場合、用量依存的にＥＤＬＦ産生及び培養培地中への放出の顕著な低減を引き起こした。正常ヒト胎盤の胎児組織において、ケトコナゾールに応答するＥＤＬＦ産生の有意な減少があったが（図３Ａ、それぞれ漸増濃度のケトコナゾールを用いる、（１．０μＭ）７．９９±１３．２１、（２．０μＭ）５．５８±８．９１、（５．０μＭ）１．６０±１．６２、（１０．０μＭ）１．４７±１．６４、（２０．０μＭ）１．２５±１．４３対対照レベル１７．７８±３３．２１×１０−８Ｍ ＲＩＡウアバイン当量；分数変化のＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）、母体組織は、これらの条件下で実質的に少ない産生を示し、ほとんど変化がないか、またはむしろ未治療の組織と比較して４８時間のケトコナゾール治療によりＥＤＬＦ産生のわずかな増加を示した（図３Ｂ、それぞれ漸増濃度のケトコナゾールを用いる、（１．０μＭ）１．９０±２．０５、（２．０μＭ）１．７９±１．９６、（５．０μＭ）１．８３±２．０３、（１０．０μＭ）１．７３±１．８２、（２０．０μＭ）２．４６±２．６０対対照１．２３±１．４１×１０−８Ｍ ＲＩＡウアバイン当量；分数変化のＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．５１）。基底胎児ＥＤＬＦレベルは、基底母体レベルより高かった（ｐ＝０．０３）。これらの結果は、ケトコナゾールがＥＤＬＦ産生及び放出に対して顕著な阻害効果を有することを確認する。
ＥＤＬＦ産生がステロイド合成に使用される酵素を必要とするかどうかを評価する試みにおいて、発明者らは、ステロイド合成の前駆体または中間体として機能し得る、したがってＥＤＬＦ合成及び放出を増加させ得る作用因子を試験した。２つの可能性のあるステロイド前駆体を試験し、療法の合成経路に共通するステップを特定した。勾配濃度の１７α−ヒドロキシプロゲステロン（１７Ｐ）を胎盤組織培養物に適用した。胎盤は１７−加水分解酵素を欠失することが報告されているため、この特定のステロイドを選択した。図４は、４８時間の１７Ｐ治療が、高レベルのＥＤＬＦを培養培地中に用量依存的に放出したことを示す（それぞれ漸増濃度の１７Ｐを用いる、（０．２０μＭ）３．６０±１．０６、（０．５０μＭ）３．７６±０．８４、（１．０μＭ）４．４０±１．１２、（２．０μＭ）４．９１±１．５２対対照２．２８±０．４１×１０−８Ｍ ウアバイン当量；ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００３、濃度１．０及び２．０μＭが対照より有意に多い、ダネットの検定）。ＥＤＬＦ合成におけるその役割をさらに特徴付けるために、最適濃度（２．０μＭ）の１７Ｐを使用して時間依存的実験も行った。１７Ｐの非存在下の対照標本は、媒質中のＥＤＬＦが、より長いインキュベーション時間で増加したことを示した（図５Ａ、ｎ＝５、６時間８．７６±２．５６、１２時間２３．７０±６．９２、２４時間３９．３２±１４．７６；３６時間６７．５９±２６．８９、４８時間８１．３８±１８．７７×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）。さらに、培養培地への１７Ｐの添加は、培養物中のＥＤＬＦの蓄積を時間依存的に増強し、対照と比較して各時点で有意に多くのＥＤＬＦを産生した（図５Ｂ、ｎ＝５、６時間１２．６０±３．８１、１２時間２８．３０±６．３０、２４時間５５．３９±３３．６２、３６時間９５．００±４０．４４、４８時間１３２．４３±７４．３７×１０−８Ｍ ウアバイン当量、傾向の場合ｐ＜０．００１ ＡＮＯＶＡ、１７ＰのＡＵＣ対１７ＰなしのＡＵＣの効果比較の場合ｐ＝０．０３）これらの結果は、１７Ｐが胎盤ＥＤＬＦ合成を調節することを立証する。
多くのステロイドの早期前駆体であるプレグネノロンを用いる実験を行った。これらの実験は、２μＭプレグネノロンへの６時間の曝露後に胎盤ＥＤＬＦ産生の顕著な低減を示した。馴化培地中のＥＤＬＦ濃度は、ｎ＝５、６時間３２５．６±６１．０×１０−８Ｍ；１２時間１３６．１±２７．７×１０−８Ｍ；２４時間１４８．４±１５．１×１０−８Ｍ；３６時間１１３．６±１４．４×１０−８Ｍ；４８時間４８．５±７．４×１０−８Ｍ；ｐ＜０．００１ ＡＮＯＶＡであり、全ての他の値は、６時間値と比較して著しく低減した、ｐ＜０．０５、ダネットの検定。図６を参照されたい。この特定薬剤の場合、より早い時点も評価した。プレグネノロン治療前、次に２μＭプレグネノロンへの曝露から３時間及び６時間後に馴化培地を回収した。馴化培地中の量は、これら３つの時点にわたって明らかに変化しなかったが、結果は変動的であった。全体として、わずかだが重要でないＥＤＬＦの減少があった（ｎ＝５）。プレグネノロン前８１．３±１３．７×１０−８Ｍ、３時間７７．４±２５．０×１０−８Ｍ、６時間７６．８±３５．０×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＞０．０５。
胎盤からのＥＤＬＦ放出の調節
ＰＥは、多くの異常を伴う。それらの中で、胎盤低酸素症、活性酸素種の産生増加、及びより高い局所及び循環レベルの炎症性サイトカインが機序的に重要であると考えられる。
以前の研究は、低酸素症がＰＥの発達に寄与することを示唆したため、２１％ Ｏ２下で培養された組織と比較して低いＯ２条件下で胎盤組織を培養し、次に培地中のＥＤＬＦレベルを測定し、治療を対照と比較した。図７Ａ及び７Ｂは、低酸素症が、２４時間及び４８時間インキュベーション後ともに、ＥＤＬＦ産生及び培養培地中への放出を最小限刺激したことを示す（２４時間：２％ Ｏ２ ７．００±１．６２対２１％ Ｏ２ ５．９４±１．０９×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＝０．０２８ ウィルコクソン検定；４８時間：２％ Ｏ２ ３．４５±０．６６対２１％ Ｏ２ ２．９２±０．５９×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＝０．０２８、ウィルコクソン）。変化は、統計的に有意であるか、または統計的ｐ値カットオフであった。
酸化ストレスがＰＥ中で増加することが示されたため、活性酸素種である過酸化水素を使用し、培養物中の胎盤組織を治療し、媒質をアッセイして媒質へのＥＤＬＦ放出に対する効果を明らかにした。勾配濃度のＨ２Ｏ２で治療された６個の個々の胎盤から得た標本を分析することによって、５ｎＭのＨ２Ｏ２は、最大ＥＤＬＦ産生及び放出を誘導する量であることを見出した。この濃度は、未治療の胎盤からの馴化培地と比較して、２倍近くの放出ＥＤＬＦ量をもたらした（図８、４．８７±１．５７対２．８２±０．６０×１０−８Ｍ ウアバイン当量、ｐ＝０．００９）。より高い濃度（１０ｎＭ、２０ｎＭ）のＨ２Ｏ２で治療された培養胎盤の培地において、ＥＤＬＦレベルは、５ｎＭ Ｈ２Ｏ２で治療されたものに等しいか、またはわずかに低かった。これらの観察は、Ｈ２Ｏ２がＥＤＬＦ産生に及ぼす影響が、恐らく組織損傷またはＥＤＬＦの損傷にも起因して、より高い濃度で平坦化し、さらなる影響または悪影響も有しない。
ＴＮＦαを使用する実験を行い、胎盤ＥＤＬＦ産生に及ぼすその影響を試験した。アッセイデータは、４８時間のＴＮＦα治療後、培養培地中に放出されたＥＤＬＦのレベルが著しく増加し、この影響がＴＮＦα濃度に依存していたことを示した（図９）：ｎ＝６、（１．０ｎＭ）２．４１±０．８０、（２．０ｎＭ）２．７５±０．９８、（５．０ｎＭ）２．７６±０．８０、（１０．０ｎＭ）３．５１±０．６９（２０．０ｎＭ）４．４７±０．９９対ＴＮＦαなしの対照１．９６±０．６４×１０−８Ｍ ウアバイン当量；ｐ＜０．００１、２つのより高い濃度は、対照より著しく高い、ｐ＜０．０５、ダネットの検定）。これらの結果は、ＴＮＦαがいくつかの他の変化を媒介するＴＮＦαに加えて、ＥＤＬＦ放出の増加をもたらすことを立証する。
低酸素症及び酸化ストレスが脂質過酸化及びヒト胎盤からのＴＮＦα放出に及ぼす影響
本明細書で論じられるように、潜在的に低Ｏ２圧、及び確実に低い濃度のＨ２Ｏ２は、高いＥＤＬＦレベルを誘導した。ＰＥ中の胎盤細胞膜修飾に対するこれらの因子の役割をさらに評価するために、脂質ヒドロペルオキシドイムノアッセイを使用して、低Ｏ２またはＨ２Ｏ２で治療した胎盤培養培地中の脂質過酸化を定量した。図１０は、低酸素圧対正常酸素レベルが脂質ペルオキシドに及ぼす影響をまとめている（ｎ＝６、正常Ｏ２ ５．８５±３．１１対低Ｏ２ １０．３０±５．７２μＭ；ｐ＝０．０１）。図１１は、胎盤が段階的濃度のＨ２Ｏ２（図１１、ｎ＝５、それぞれ（１．０ｎＭ）６．６２±３．３１、（５．０ｎＭ）９．１７±３．１８、（１０．０ｎＭ）１１．４３±３．６７、（２０．０ｎＭ）１３．１３±５．０４対対照５．０５±２．６９μＭ脂質ペルオキシド；ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０１７、最高の２つの濃度は対照とは著しく異なる、ｐ＜０．０５、ダネットの検定）。しかしながら、２％ Ｏ２及び５ｎＭ Ｈ２Ｏ２の脂質過酸化のレベルは、非常に類似しており、レベルは低Ｏ２に対してわずかに高いだけである。
胎盤ＴＮＦα産生に対する低酸素症及び酸化ストレスの相互作用
ＴＮＦαイムノアッセイを使用して、４８時間の低Ｏ２（２％）または４８時間の５ｎＭ Ｈ２Ｏ２のいずれかに応答するヒト胎盤の培養培地中のＴＮＦα濃度を測定した。図１２は、４８時間の低Ｏ２治療が、正常２１％酸素条件下でインキュベートされた培地より多くのＴＮＦα放出を誘導したことを示すが（ｎ＝６、１２６．８０±２４９．６１対１９．０１±１０．１６ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０３、ウィルコクソン検定）、図１３に示されるように、段階的に増加する濃度のＨ２Ｏ２を添加することによるＴＮＦα放出の著しい増加はなかった、ｎ＝５、（１．０ｎＭ）１８．６１±１３．６０、（５．０ｎＭ）１４．９５±６．３９、（１０．０ｎＭ）１５．８３±６．６３、（２０．０ｎＭ）１３．５０±３．４３対対照１５．１３±３．９８ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．９０）。
考察
ＥＤＬＦは、本態性及び実験的高血圧における潜在的な高血圧原性因子であり、ＰＥの状況において増加することも見出された。ＥＤＬＦは末梢血管抵抗を増加させる一方、潜在的に心拍出量を維持する。ＥＤＬＦの胎盤源は、分娩後の母体循環からのＥＤＬＦの速やかな消失、及び出産後の母体高血圧の速やかな回復を説明する。本明細書に提示されるデータは、ヒト胎盤がＥＤＬＦの豊富な源であるだけでなく、それがＥＤＬＦを合成し、馴化培地中にＥＤＬＦを放出することを実証する。これらの分泌されたＥＤＬＦの存在は、抗体アッセイ及びナトリウムポンプ阻害を測定する機能アッセイの両方によって実証された。ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡは、ＰＥを経験する女性が、ＤｉｇｉｂｉｎｄまたはＤｉｇｉｆａｂで有効に治療され得るかどうかを決定するために有用なアッセイである。
ＤｉｇｏｘｉｎＡＢ ＲＩＡ及びＧＦＡＡの両方を提供する研究は、ケトコナゾールが胎盤中のＥＤＬＦ産生の阻害剤であるが、１７α−ヒドロキシプロゲステロンが直接または間接的にＥＤＬＦ合成を調節することを立証した。これらの影響は用量依存性であった。
プレグネノロンを用いる実験は、ステロイド合成経路が胎盤中のＥＤＬＦの産生に関与することも立証する。外植された胎盤組織に対するプレグネノロンの適用は、ＥＤＬＦ産生を低減する。したがって、ＥＤＬＦは、ヒト胎盤によって合成され、分泌される。
２４時間及び４８時間の低酸素（２％ Ｏ２）治療は、組織培養物中の胎盤からのＥＤＬＦ産生及び放出の軽度の増加を誘導すると思われた。
臨床証拠は、胎盤中の酸化ストレスのマーカーがＰＥにおいて上昇することを示す。Ｈ２Ｏ２がＥＤＬＦ産生に及ぼす影響を試験し、低濃度のＨ２Ｏ２が、培養物中に置かれた健常なヒト胎盤組織からのＥＤＬＦ産生及び放出を刺激し得ることを見出した。Ｈ２Ｏ２に応答する変化は、低Ｏ２で観察されたものよりはるかに顕著であった。ＲＯＳ所見は、上記の低酸素所見と一致し、さらにＰＥと関連付けられるこれらの異常が、それらが始まる複雑な経路の１つ以上を通してＥＤＬＦ合成及び放出を規制し得ることをさらに実証する。
内皮機能不全は、ＰＥの主な病態生理学的特徴である。改変された内皮機能は、特にＰＥにおける増大した炎症応答を伴い、ＴＮＦαの循環サイトカインレベルの増加を含む。ＴＮＦαは、ヒト胎盤ＥＤＬＦの産生及び放出を用量依存的に刺激する。したがって、ＴＮＦαの低減（例えば、抗ＴＮＦα、抗ＴＮＦα受容体またはＴＮＦαの産生を阻害するか、もしくは有効性を低減する他の薬物もしくは生物学的薬剤）は、ＰＥの状況においてＥＤＬＦの胎盤産生を低減し、それによってＥＤＬＦにより直接または間接的に引き起こされるＰＥの症状を低減する。したがって、抗ＥＤＬＦ抗体は、ＥＤＬＦの存在を検出し、ＥＤＬＦのレベルを定量するためにイムノアッセイで使用され得る。さらに、高レベルのＥＤＬＦは、子癇症及び子癇前症、ならびに抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント療法に対する応答を示す。
実施例２
治療診断的アッセイの要約
妊娠が子癇前症（ＰＥ）を合併し、高レベルのそのようなＥＤＬＦを有する妊娠女性の特定は、それらの同じ因子に結合し、それらの効果を低減する抗Ｆａｂフラグメント療法の適切な使用を可能にする。
背景
数十年間にわたり多くの研究が、内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）と呼ばれることもあるナトリウムポンプの内因性阻害剤に関する大量の研究を提供してきた。Ｇｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ １９９２；４４：３７７−９９、Ｈａｄｄｙ ＦＪ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ ＶＭ Ｊｒ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｄｉｇｉｔａｌｉｓ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｉｎ Ｂｒｅｎｎｅｒ ＢＭ ａｎｄ Ｌａｒａｇｈ ＪＨ（ｅｄｓ）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５；ｐｐ １０５５−１０６、Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＨ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ １９８７；３８：４３３−４４４、Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９４；３：１０７−１１１。増加レベルのこれらの因子は、多くの高血圧障害に関与している。これらのＥＤＬＦが増加する理由は不明であるが、ヒト本態性高血圧、多くの二次形態のヒト高血圧において、高血圧の多くの実験動物モデルにおいて、及び妊娠の高血圧障害である子癇前症において、血清中でそれらが増加することを支持する圧倒的なデータがある。Ｇｒａｖｅｓ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９８４；５９：１０７０−４、Ｇｒａｖｅｓ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９８７；１０（Ｓ Ｐｔ ２）：Ｉ−８４−６、Ｇｒａｖｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００７；１２：２４３８−２４４６。証拠は、これらの因子がジゴキシン及び他の心臓作用ステロールと構造的に類似し、同様の活性を示すことを支持する。
これらの因子は、高血圧を実験的に引き起こし得る。血管系におけるナトリウムポンプ（ＳＰ）の阻害は、血管収縮の増加及び結果として生じる血圧の増加につながる。これらの影響は、ジゴキシン毒性を治療するために使用される２つの抗ジゴキシン抗体Ｆａｂを含むジゴキシンに配向されるいくつかの抗体によって予防または逆転され得る。Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８２；３０７：１３５７−６２、Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；９：３９−４６。
ＤＥＥＰ研究
ＤＥＥＰ試験は、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）Ｄｉｇｉｂｉｎｄの多施設二重盲検登録臨床試験であった。その理論的根拠は、子癇前症の女性が、ＰＥの特徴を媒介するより高レベルのＥＤＬＦを有することであった。Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９４；３：１０７−１１１、Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＨ．Ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｏｕａｂａｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９８４；５９：１０７０−４、Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌｉｓ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９８７；１０（Ｓ Ｐｔ ２）：Ｉ−８４−６。
ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、ＥＤＬＦに結合してそれらの作用を遮断し、それによってＰＥの特徴を逆転させる。Ｇｏｏｄｌｉｎ ＲＣ：Ａｎｔｉｄｉｇｏｘｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ １９８８；３１８：５１８−５１９、Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９７；１０：１１Ａ、Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９６；１６：５２９−５３１。具体的に、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）の子癇前症レシピエントは、プラセボを受ける子癇前症より著しく良好な腎機能を示した。さらに、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、予測通り、循環ＥＤＬＦレベルを低下させた。
ＤＥＥＰ研究において、これらの重症子癇前症女性は、合併症のない妊娠中の妊娠女性と比較して、著しく高いレベルのＳＰ阻害（ＥＤＬＦの尺度）を示した。しかしながら、全てのＰＥ女性がそれらの循環中に存在する好ましいレベルのＥＤＬＦを有していたわけではないことも観察された。ＤＥＥＰ対象の約２０％が、ごくわずかなレベルのＥＤＬＦを有していた。そのような女性において、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、効果がないと予想される。
ＥＤＬＦ陰性であり、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けた女性は、母体または胎児パラメータの変化を示さなかった。ＥＤＬＦ陽性の女性がジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けた場合、循環ＥＤＬＦの低減及び腎機能の改善を示し続けたが、より少ない数にもかかわらず、さらにより顕著な差異、及びより大きな統計的有意性を伴った。加えて、多くの追加のパラメータは、改善された差異及びより良好な統計的差異を示した。例えば、ＥＤＬＦ陽性、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療したＰＥ女性において、胎児脳室内出血及び母体肺水腫の割合の顕著で統計的に有意な低減が見出された。ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、分娩を２４時間遅延させ、そのような女性における降圧薬の使用は少なかったが、これらの差異は統計的に有意でなかった。
ＥＤＬＦ陽性ＰＥ女性は、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療による利益を示す可能性があるが、ＥＤＬＦ陰性ＰＥ女性は、不要で高価な治療を受け得る。この分類は、ＥＤＬＦ陽性を測定する抗体ベースの血液アッセイによって実現され得る。そのような「治療診断的」アッセイの開発は、それから恩恵を受けるであろう個々のＰＥ女性のみに対するジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療の論理的適用を可能にする。
治療診断の開発
発明者らは、妊娠女性からの血清に適用され得るＥＤＬＦを測定するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を開発した。これは、Ｄｉｇｉｂｉｎｄを使用して実現され、このようなジゴキシン抗体Ｆａｂは、治療薬として、プローブとして使用された。トリチル化ウアバインをトレーサーとして使用し、勾配濃度の非放射性標識ウアバインを使用して標準曲線を発達させた。この競合結合アッセイの典型的な標準曲線は、図１４に示されている。このアッセイを使用して、ＰＥ女性からの血清中のＥＤＬＦを測定することが可能である。また、ナトリウムポンプに媒介されるＲｂ＋取込みの阻害を測定するバイオアッセイと、Ｄｉｇｉｂｉｎｄを抗体として用いるＲＩＡとの間には相関がある。
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の調査を、免疫原としてのジゴキシンに対して行い、ＥＤＬＦに結合するもの見出し、３つのＭａｂは、ＥＤＬＦとの使用可能な相互作用を示し、治療診断的アッセイで使用され得る。標準曲線の例は、図１５に提供される。
実施例３
内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）は、子癇前症の女性において上昇し、予定日の遠い子癇前症女性における抗ジゴキシン抗体Ｆａｂ（ＤＩＦ）の使用は、母体血圧を低減し、腎機能を維持する。ここでの目的は、母体血清中の陽性ＥＤＬＦと関連付けられる重症子癇前症の女性におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療が、母体の周産期転帰を改善するかどうかを決定することであった。
研究デザイン
これは、妊娠２３ ５／７〜３４週の間に待機的に管理された（１９名はプラセボを受け、１７名はジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けた）陽性ＥＤＬＦ状態を有する重症子癇前症女性におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）のランダム化プラセボ対照二重盲検から計画された二次分析である。一次転帰変数は、腎機能の変化（クレアチニンクリアランス、ＣｒＣｌ）及び降圧薬の使用であった。二次転帰は、母体及び周産期転帰であった。
結果
ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けたＥＤＬＦ陽性の女性は、プラセボと比較してベースラインからのＣｒＣｌの弱い減少を有した（−４．５±１２．９対−５３．２±１２．６ｍＬ／分、ｐ＝０．００５）。彼女らは、より少ない降圧薬の使用に向かう傾向も有していた（４１％対６３％、ｐ＝０．１２）。追加として、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療された女性は、より低率の肺水腫（１／１７対６／１９、ｐ＝０．０３５）、より低率の全新生児脳室内出血（ＩＶＨ、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）：０／１７対プラセボ：５／１９、ｐ＝０．０１５）、及び出生時体重＜１２５０ｇの乳児におけるＩＶＨ（ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）：０／１４対プラセボ：５／１１、ｐ＝０．０１２）を有していた。
結論
ＥＤＬＦ陽性の予定日の遠い重症子癇前症女性において、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）の使用は、母体及び新生児転帰の改善と関連付けられる。これらの所見は、重症子癇前症及び陽性ＥＤＬＦ状態を有する予定日の遠い女性の管理におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）の利益を評価する大規模な多施設試験の必要性を示唆する。
報告された子癇前症の発生率は、全妊娠の３〜５％の範囲である。この発生率は、母体肥満、妊娠性糖尿病、慢性高血圧、妊娠時の高母体年齢、及び多胎妊娠等の子癇前症（ＰＥ）のいくつかの危険因子の罹患率の上昇のために増加することが予想される。Ｂａｒｔｏｎ＆Ｓｉｂａｉ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００８；１１２：３５９−３７２。
妊娠＜３４週の重症ＰＥを合併する妊娠は、高い母体及び周産期合併症の割合と関連付けられ、これらの合併症の割合は、発症時の在胎月齢、ならびに使用される管理の種類（即時分娩対待機的管理）に依存する。Ｓｉｂａｉ＆Ｂａｒｔｏｎ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００７；１９６：５１４．ｅ１−５１４．ｅ９。＜３４週の重症ＰＥ女性の管理は、母体と胎児の安全の保持、及び生存し、長期または集中新生児ケアを必要としない新生児の分娩を目的とする。最近の研究は、妊娠２４週〜３４週の重症ＰＥ女性の選択群において待機的管理が可能であること、及びそのような管理が新生児転帰を改善するが、ＨＥＬＬＰ症候群等の母体合併症、肺水腫、腎機能の低下、及び子癇の割合の増加にも関連することを示唆した。Ｓｉｂａｉ＆Ｂａｒｔｏｎ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００７；１９６：５１４．ｅ１−５１４．ｅ９。
内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）は、ナトリウムポンプ（ＳＰ）の循環阻害剤のファミリーを表す。そのようなＳＰ阻害は、直接血管収縮を引き起こし、本態的及び実験的高血圧における血圧の上昇に関連している。Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；９：３９−４６、Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９７；１０：１３４２−４８、Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；８：９２１−７、Ｇｌａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９４；７：１０１６−２５。ＥＤＬＦは、ＰＥ女性の循環においても上昇する。Ｇｒａｖｅｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９８４；５９：１０７０−４、Ｇｕｓｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ９８４；１５：８３−８５、Ｓｅｅｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９９２；７４：１５０−６、Ｌｏｐａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９９；１７：１１７９−１１８７。Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｃｉ ２０１１；１８：１９０−１９９。特定の市販抗ジゴキシン抗体Ｆａｂのインビトロ添加は、ＥＤＬＦがＳＰに及ぼす阻害作用を低減した。Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；９：３９−４６。
この同じＦａｂは、ＥＤＬＦによって媒介されると考えられる高血圧の動物モデルにおいて、降圧作用を有することも示された。Ｋｒｅｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；８：９２１−７。以前に、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）のＰＥ女性への投与は、母体血圧を低減し、腎機能を維持または改善した。Ｇｏｏｄｌｉｎ ＲＣ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８８；３１８：５１８−９、Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９６；６（６）：５２９−３１、Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇ ２００９；２９：２８４−２８９。実際に、これらのデータは、重症子癇前症女性におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）のランダム化二重盲検プラセボ対照試験（ＤＥＥＰ試験）につながった。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。この研究は、試験に登録された全女性において、腎機能に対するジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療からの利益を実証した。しかしながら、この試験は、妊娠延長または母体転帰の改善に関する利益を見出さなかった。ＤＥＥＰ試験の一次分析は、女性のＥＤＬＦ状態を考慮に入れていなかった。ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）が、ＥＤＬＦ陽性の女性においてのみ効果的であることは可能であり、可能性もある。
ＤＥＥＰ試験に登録された５１対象において循環ＥＤＬＦが後次にベースラインで測定された場合、約２０％が検出可能な循環ＥＤＬＦを有していなかった。提案された作用機序（すなわち、ＥＤＬＦに結合し、不活性化する）を考慮すると、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）投与は、循環ＥＤＬＦを有していなかった女性において影響を及ぼさないはずであり、それらを包括解析に含めることは、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）が測定可能なＥＤＬＦを有する子癇前症女性に及ぼす明らかな影響を排除し得る。
ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）の効果をＥＤＬＦ陽性の女性において評価したＤＥＥＰ試験から計画された二次分析。この研究の目的は、母体血清中の陽性ＥＤＬＦ活性と関連付けられる重症ＰＥ女性におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療が、母体及び周産期転帰を改善するかどうか、及びその効果が登録時の循環ＥＤＬＦレベルに依存するかどうかを決定することであった。
材料及び方法
元の研究デザイン及びＥＤＬＦのナトリウムポンプ阻害アッセイ
ＤＥＥＰ研究の詳細な説明は、以前に公開されている。Ａｄａｉｒ ＣＤ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ ＶＭ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｌａｍ ＧＫ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＤ，Ｓａａｄｅ Ｇ，Ｌｅｗｉｓ ＤＦ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｃ，Ｄａｎｏｆｆ ＴＭ，Ｃｈａｕｈａｎ Ｎ，Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ Ｍ，ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ ＤＥＥＰ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆａｂ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｅｖｅｒｅ Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。つまり、全参加者は、重症ＰＥの米国産科婦人科学会基準を満たした妊婦であった。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。各研究施設においてＩＲＢ承認が得られており、全対象は参加前に告知による署名同意書を提供した。他の適格基準には、２３週と５日〜３４週の妊娠、及び主治医により判断される７２時間以内の胎児の予定分娩が含まれた。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。元の研究の意図は、２つの主要エンドポイント、腎機能の尺度としてのクレアチニンクリアランスの変化及び高血圧の改善または悪化の尺度としての降圧薬の使用に関するジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）（Ｄｉｇｉｂｉｎｄ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）の有効性を試験することであった。女性をジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）またはプラセボにランダム化し、最大計８用量を６時間毎に静脈内付与した。ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を、研究に含まれた５１名の女性のうち２４名に投与した。患者、医師、及び研究室職員は、治療群に対して知らされず、ＥＤＬＦ状態を含む全ての臨床パラメータは、研究について知らされる前に編集された。降圧薬の使用及び分娩のタイミングを含む研究患者におけるＰＥの治療は、主治医によって判断される臨床状態によって決定された。
元の研究の一部として、血漿中のＥＤＬＦは、正常な妊娠していない候補者から新たに得られた赤血球のＳＰを阻害する血漿の能力によって測定された。阻害剤の存在下及び非存在下での人工培地から赤血球へのＲｂ＋イオンのＳＰ媒介性取込みを測定するこのアッセイは、以前に説明され、他の研究において検証されている。Ｚｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００５；１６：２９１−２９６。
ＥＤＬＦが存在する場合、より少ないＲｂ＋がＲＢＣのシトソルに取り込まれる。ＥＤＬＦ活性は、ベースライン（薬物前またはプラセボ）、ならびに１２時間２４時間、及び４８時間に３回決定した（ｔ＝０、１２、２４、４８時間）。ベースラインでのＲｂ＋取込みアッセイの結果を使用し、患者がＥＤＬＦ陰性であるか、またはＥＤＬＦ陽性であるかに分類した。元の試験に登録された５１名の女性の中で、ＥＤＬＦの試料を入手することができ、４６対象において評価したとこと、１０名（２２％）が陰性であり、３６名（７８％）が陽性であった。この二次分析は、ＥＤＬＦ陽性であった３６名の女性に注目する（内１９名がプラセボを受け、１７名がジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けた）。
一次転帰変数は、一次分析と同じ、すなわち、腎機能の変化（ＣｒＣｌ）及び降圧薬の使用であった。降圧薬の使用は、１）治療段階中の降圧薬の最初の使用、または２）研究への登録時に既に降圧薬を服用している対象における治療段階中の降圧薬の増加、または３）持続的な重症高血圧によって必要とされる送達として定義された。
二次転帰は、母体（例えば、肺水腫、ＨＥＬＬＰ症候群、かすみ目）、胎児（例えば、持続的に不安定な胎児状態、胎児心臓透写異常（頻脈、徐脈、脈間変動性の減少、または変動性徐脈もしくは晩発性徐脈等の異常パターン）、及び新生児合併症（例えば、新生児出生時体重、呼吸困難症候群、及び脳室内出血（ＩＶＨ））の臨床及び研究室マーカーであった。
統計分析
分析は、受託試験機関（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｉｎｃ）によって盲検的に行われた。
モデルのスクリーニング値、治療群、妊娠年齢、及び研究施設によるＡＮＣＯＶＡによって、またはモデルの治療、妊娠年齢、及び施設によるロジスティック回帰分析によって理連続データを分析した。カテゴリーデータは、バーナード直接確率検定によって分析した。Ｍｅｈｔａ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ １９９３；４７：９１−９８．Ｃｈａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｍｅｄ．１９９８；１７：１４０３−１４１３。ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。ＣｒＣｌの変化は、治療時間からスクリーニング値を引いた差（ｍＬ／分）として計算された。
結果
表１は、ＥＤＬＦ陽性ＰＥ女性の２つの治療群間の登録時の人口統計学的特徴を比較する。分析された変数のいずれかにおいて、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けた女性またはプラセボを受けた女性と有意差はなかった。
ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）が循環ＥＤＬＦ活性に及ぼす影響。
ＥＤＬＦ陽性女性のジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、ＥＤＬＦ陽性及び陰性対象の両方を含んでいた初期ＤＥＥＰ分析と比較したとき、治療前ＥＤＬＦレベルと比較して、循環ＥＤＬＦレベルのより大きくより統計的に有意な低減を実証した（図１）。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。全対象分析において（すなわち、ＥＤＬＦ陽性及び陰性対象の両方を含む）、１２〜２４時間の差のみが有意であった（＋１１．０％ ＳＰ活性の回復、ｐ＝０．０３）。
ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）が一次転帰尺度に及ぼす影響。
図２Ａは、ＣｒＣｌの変化に関して、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療の効果をプラセボと比較する。ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受けているＥＤＬＦ陽性の重症ＰＥ女性は、プラセボと比較して、ベースラインから著しく小さいＣｒＣｌの低下を有していた。さらに、対照群における腎機能の低下は、ＥＤＬＦレベルに明らかに関連していた（３０％超のＳＰ阻害を有する女性、ｐ＝０．０３２、図２Ｂ）。全対象分析と比較して、降圧薬の使用に対する治療とプラセボとの間の差異はより大きかったが、これらの差異は統計的有意性に至らなかった（ＥＤＬＦ陽性：４１％ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）対６３％プラセボ、ｐ＝０．１２、全対象：４６％ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）対５２％プラセボ、ｐ＝０．４）。
ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）が二次転帰に及ぼす影響
表２は、研究登録からの潜伏期間、分娩時の妊娠年齢、出生時体重、胎児心拍数（ＦＨＲ）図の変化、異常のあるＦＨＲ試験の割合、新生児呼吸困難症候群、新生児ＩＶＨ、及び死亡を２つの研究間で比較する。ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療したＥＤＬＦ陽性のＰＥ女性は、プラセボ治療した女性より２６時間長い分娩潜伏期間を有したが、この差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１７）。出生時体重に無関係の乳児のＩＶＨの割合ならびに１２５０グラム未満の出生時体重のＩＶＨの割合は、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受ける女性の新生児において有意に低かった（全乳児の場合、ｐ＝０．０１５及び＜１２５０グラムの乳児の場合、ｐ＝０．０１２）。
表３は、２つの研究群間の母体合併症を比較する。母体肺水腫の割合は、プラセボを受ける女性と比較して、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を受ける女性において著しく低かった（ｐ＝０．０３５）。特記事項として、本研究のＥＤＬＦ陰性対象は、治療群にかかわらず、肺水腫を経験しなかった。
ＰＥにおける増加レベルのＥＤＬＦに対する証拠は十分にある。Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ｓｏｄｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｕｎｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．（Ｒｅｖｉｅｗ）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００７；１２：２４３８−２４４６。重症ＰＥの治療におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）の細菌の臨床試験は、疾患の母体特徴に関与するＥＤＬＦについて追加の支持を提供した。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。しかしながら、全てのＰＥ女性が検出可能なレベルのＥＤＬＦを有するとは思われず、したがってジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療から利益を受ける可能性は非常に低いであろう。独立したグループは、最近、彼らの研究における子癇前症女性の８２％が、正常血圧の妊娠女性において見出されるレベルを超える尿中ＥＤＬＦレベル（候補ＥＤＬＦであるマリノブファゲニンに対する抗体アッセイによって測定された）を有していたことを報告した。Ａｇｕｎａｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１１；２８：５０９−５１４。このＥＤＬＦ陽性のレベルは、本研究において観察された７８％と十分に一致する。ＥＤＬＦ陽性であった対象に注目するこの分析の主な所見は、１）ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）に応答する治療前レベルと比較した循環ＥＤＬＦの低減は、元の全患者研究において観察された変化よりも程度が大きく、より有意であった。Ａｄａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２。２）ＥＤＬＦ陽性対象においてジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）がクレアチニンクリアランスに及ぼす影響は、プラセボを受けるＥＤＬＦ陽性対象と比較して、各治療時点で優れていた。３）二次母体尺度の中で、ＥＤＬＦ状態が考慮された場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療されたＰＥ女性が、プラセボと比較して肺水腫の発症が著しく少なく、４）ＥＤＬＦ陽性女性におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、全乳児において著しく少ないＩＶＨ症例と関連付けられた。全てのＩＶＨが出生時体重＜１２５０グラムの新生児において発生したことに留意されたい。
血漿ＥＤＬＦレベルが高いほど、未治療の女性における腎機能の低下が激しいという追加の示唆は、潜在的に新規の所見である。以前に、低下した腎機能が循環ＥＤＬＦレベルの増加をもたらすことが推定され、これは真であり得るが、ＥＤＬＦは、腎機能が低減され得る手段として考慮されないことも真である。Ａｇｕｎａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１１；２８：５０９−５１４。
ＥＬＤＦは、肺水腫と関連していなかった。しかしながら、高い循環ＥＤＬＦは、脳水腫と関連付けられている。Ｌｕｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ １９９９；１４１：６９１−６９７、Ｗｉｊｄｉｃｋｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔ Ｍｅｄ Ｊ １９８７；２９４：７２９−７３３、Ｒａｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ Ｓｕｐｐｌ １９９４；６０：９８−１００。追加として、ＰＥの動物モデルにおいて、ラットにマリノブファゲニン、ナトリウムポンプ阻害剤、及びＥＤＬＦ候補を投与し、アルブミンに透過性の腸間膜後毛細管細静脈を発達させた。Ｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００９；３０：２６−３３。ＳＰ阻害は、房水産生を低減する方法としても研究されている。Ｄｉｓｍｕｋｅ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００９；９３：１０４−１０９。ＳＰによるイオンの圧送は、膜間の水分子の移動を伴い、これがイオンと密接に関連する。ポンプの各サイクルで輸送される各２Ｋ＋イオンに対して３つのＮａ＋イオンが細胞から出ると仮定すると、ＳＰ活性の低減は、細胞膜の内面の水の蓄積と関連付けられる可能性があり、潜在的に組織内の水貯留を生じさせる。
ＣｒＣｌ及び肺水腫以外の母体尺度は、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療による統計的に有意な改善を実証しなかったが、いくつかの母体異常の発生は、ＥＤＬＦ陽性、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療群の半分以上低減され、集合的にジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）がこれらの女性の一部において陽性結果をもたらし得ることを示唆する。
ＥＤＬＦ陽性女性におけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療は、一般に、また具体的に、ＩＶＨリスクの高い低出生時体重の乳児において著しく少ないＩＶＨ症例と関連付けられた。ＥＤＬＦは、以前にＩＶＨと関連付けられていなかった。それ故に、ＩＶＨにおけるその潜在的役割及びジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）が乳児をＩＶＨから保護する可能性は、本研究では直接取り上げなかった。高いＥＤＬＦレベルは、脳室内出血のある動物において見出されるが、明らかに、ＥＤＬＦがＩＶＨを引き起こす、またはそれに貢献する能力のより詳細な評価が必要である。Ｍｅｎｅｚｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２００３；１６：１０６２−１０６５。したがって、ＥＬＤＦは、ＩＶＨにつながる過程において役割を有し得る。
ＥＤＬＦレベルは、より重症の疾患に対する応答であり得るが、ＥＤＬＦ陽性女性のみにおけるジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）に応答する利益の発見は、ＰＥ及びその合併症においていくつかの病因的役割を果たす可能性を高める。これらが単なるランダムアーチファクトである場合に予測されるように、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療されたＥＤＬＦ陽性ＰＥ女性において、胎児または新生児パラメータが著しく悪化しないと述べることもできる。
ＥＤＬＦがどのように胎児／新生児作用をもたらし得るかについて、出生直後の胎盤、臍帯血、及び胎児循環における循環ＥＤＬＦ活性の存在に対する十分な証拠があるが、特定の相互作用は定義されていない。Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｃｉ ２０１１；１８：１９０−１９９、Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ １９８７；７３：２９１−２９７、Ｖａｌｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １９８３；１０２：９４７−９５０
要約すると、この二次分析の発見は、ＥＤＬＦが、ＰＥの母体観点において少なくとも貢献的役割を果たし、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療が、ＥＤＬＦ陽性であるという条件で、重症子癇前症女性において多くの母体合併症を軽減するようであるという強力な証拠を提供する。ＰＥ女性のＥＤＬＦ陽性サブセットにおけるこれらの分析は、ＥＤＬＦが母体肺水腫において役割を有する可能性を高める。誰が治療から利益を受けるかを決定するためのＥＤＬＦの迅速測定、すなわち、治療診断の開発は、ＰＥ女性のジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）治療に関するいかなる将来の研究においても有用な評価ツールとなると思われる。
これらの発見は、新生児ＩＶＨの発生におけるＥＤＬＦの可能性のある役割について、及び抗ジゴキシンＦａｂによる治療がこの重大な致命的新生児合併症の発生率を低下させ得るかどうかという興味深い疑問を提起する。したがって、ＥＤＬＦのイムノアッセイを使用して、新生児ＩＶＨの危険性がある胎児を妊娠している患者における高レベルのＥＤＬＦを検出することができ、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを投与して、新生児ＩＶＨを治療または予防することができる。
Figure 2016515534
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実施例４
ＥＤＬＦを検出するためのナノワイヤＦＥＴバイオセンサー
シリコンナノワイヤバイオセンサー（ＳＮＢ）システムは、内因性ジギタリス様因子（ＥＤＬＦ）の検出に使用され得る。ＤｉｇｉＦＡＢ（ジゴキシン免疫Ｆａｂ）分子をナノワイヤの表面に固定し、ＥＤＬＦバイオセンサーを作る。このバイオセンサーは、ＥＤＬＦが混入していない対照緩衝液と比較して、混入緩衝液中のＥＤＬＦの結合を検出することができた。このＳＮＢは、混入血清試料（１００ｎＭ〜１０μＭ）からのＥＤＬＦの良好かつ特異的な検出に使用できる。ＱｕａｎｔｕＭＤｘナノワイヤセンサー技術を使用して、非混入ヤギ−Ｆａｂ及びＢＳＡ対照試料に対して、４％平均を超えるＥＤＬＦの存在下、約１６３％の正規化平均信号変化が観察された。ＥＤＬＦに対する観察可能な応答は、ＦＡＢ修飾表面の８８％において、４時間のインキュベーション期間後に明らかであった。
方法
簡素化実験アプローチを使用し、ＥＤＬＦの存在に対するセンサーアレイの電気応答を検証した。初期デバイス状態の特徴付けを用いて、制御された環境条件下で生物学的に関連するタンパク質モデルを使用する実験との直接比較において、溶媒和ＥＤＬＦ（この例ではジゴキシン）の存在下での測定可能な変化を定義した。多重化アッセイは、様々な濃度のジゴキシン（１００ｎＭ〜１０μＭ）に対する電気感知システムの応答を実証する。
プラズマアッシャーを使用して、ナノワイヤを洗浄し、活性化した。ナノワイヤの酸化物表面を、ＡＰＴＥＳ（エタノール中の１％溶液）を使用して化学的に修飾し、ナノワイヤの表面上に露出したＮＨ２頭基を産生する。適切なタンパク質（ＤｉｇｉＦＡＢ、抗ヒトＩｇＧ ＧａｔＦＡＢ（ｈＦＡＢ）、ＢＳＡ、１ｍＭ）の液滴（１０μＬ）及び結合剤（ＤＭＡＰ、ＥＤＣ、１０μＭ）をチップ表面の上に蒸着した。各例における反応混合物を、湿潤環境において室温で終夜インキュベートした。続いてチップを過剰１０×ＰＢＳ緩衝液で洗浄し（３回行った）、脱イオン水で再度洗浄した（３回）。窒素流を使用して過剰な水分を表面から除去し、次にチップを真空オーブン内に入れて乾燥させた（２０分、５０℃）。乾燥後、２つのプローブＡｇｉｌｅｎｔ Ｂ１５００プローブステーションを使用し、−５Ｖ〜＋５Ｖを通すことによってナノワイヤのコンダクタンスを測定した。初期コンダクタンス研究の完了時、緩衝液中に混入されたジゴキシン（０．５×ＳＳＣ及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液中１μＭ）を、チップのナノワイヤ領域の上に蒸着させ、室温で４時間、湿潤環境内で再度インキュベートした。次にチップを、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する過剰０．５×ＳＳＣ緩衝液で十分に洗浄し（３回）、Ｈ２Ｏを脱イオン化し、Ｎ２で乾燥させた後、真空オーブンに挿入して５０℃で２０分間さらに乾燥させた。乾燥後、２つのプローブＡｇｉｌｅｎｔ Ｂ１５００プローブステーションを使用し、−５Ｖ〜＋５Ｖを通すことによってナノワイヤのコンダクタンスを再度測定した。
結果
固定化ＤｉｇｉＦＡＢを捕捉分子として使用し、検出実験をＱＭＤｘ ＳＮＢシステム上で行った。ナノワイヤ系の電気プロファイルを、ＤｉｇｉＦＡＢ、抗ヒトＩｇＧ−ＦＡＢ（ｈＦＡＢ−ＤｉｇｉＦＡＢと同様サイズの対照タンパク質）、及びＢＳＡ修飾ナノワイヤ表面上のジゴキシン導入前及び後（制御条件下）に独立して監視した。
典型的に、ｈＦＡＢ及びＢＳＡ上のジゴキシンに対する測定されたナノワイヤ応答は、１００％の例において感知システムの導電性プロファイルの減少を実証した。逆に、ジゴキシンがＦＡＢに導入された場合、システムの応答は反対であり、６３％の例において（最小）ナノワイヤシステムの導電性プロファイルの増加をもたらした。図１８Ａを参照されたい。原データに適用される場合、基本の正規化及び信号処理は、ナノワイヤシステム全体で１００％陽性応答率を確実にもたらす。
Figure 2016515534
生物試料中の検出を試験するために、ジゴキシンを血清に混入して実験を繰り返した。結果は、今回は複雑な試料マトリックスにおいてＥＤＦＬを検出するＳＮＢの能力を再度実証した。ジゴキシン（及び他のＥＤＬＦ）に対するＤｉＧｉＦＡＢの特異性は、適切な化学を認識する技術の能力及び特異性における信頼度を示唆する。ＦＡＢ飽和表面の例は、図１８Ｃにおいて実証され、ケイ素表面上のＤｉｇｉＦＡＢの良好な固定化を示している。
したがって、このシステムは、システムがＥＤＬＦを検出することを可能にする。ＥＤＬＦ混入血清試料による結果は、ＳＮＢが生物試料からＥＤＬＦを検出できることを支持する。したがって、このシステムは、血中のＥＤＬＦを検出するためのシステム及び方法に適用され得、いずれもＥＤＬＦを濃縮し、常磁性ビーズ上に固定された捕捉分子を使用して、それらを血清試料から単離する。これは、ＥＤＬＦを検出するための方法におけるこのシステムの使用を可能にし得る。
当業者であれば、単なる日常実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は、次の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
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Ｋｒｅｐ ＨＨ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｐｒｉｃｅ ＤＡ，Ｌａｚａｒｕｓ Ｍ，Ｅｎｓｉｇｎ Ａ，Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ ＰＡ，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＮＫ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｉｇｉｂｉｎｄ：ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；９：３９−４６．
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Ａｄａｉｒ ＤＡ，Ｈｉｎｓｈａｗ Ｇ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊ，Ｒｏｓｅ Ｊ，Ｖｅｉｌｌｅ Ｊ−Ｃ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ Ｖ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｆａｂ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｍｅａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９７；１０：１１Ａ
Ａｄａｉｒ ＣＤ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ ＶＭ，Ｔａｙｌｏｒ Ｋ，Ｅｒｎｅｓｔ ＪＭ，Ｆｒｙｅ ＡＨ，Ｅｖａｎｓ Ｃ，Ｖｅｉｌｌｅ Ｊ−Ｃ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｅｎｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａ ｍｕｌｔｉｆｅｔａｌ ｓｅｃｏｎｄ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９６；１６：５２９−５３１
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Ｋｒｅｐ ＨＨ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｐｒｉｃｅ ＤＡ，Ｌａｚａｒｕｓ Ｍ，Ｅｎｓｉｇｎ Ａ，Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ ＰＡ，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＮＫ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｉｇｉｂｉｎｄ：ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；９：３９−４６．
Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ ＰＡ，Ｅｎｓｉｇｎ Ａ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＮＫ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａ ｌａｂｉｌｅ ｄｉｇｉｔａｌｉｓ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓａｔｅ：Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９７；１０：１３４２−４８．
Ｋｒｅｐ Ｈ，Ｐｒｉｃｅ ＤＡ，Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ Ｐ，Ｔａｏ Ｑ−Ｆ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＮＫ．Ｖｏｌｕｍｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ：ｒｅｖｅｒｓａｌ ｂｙ ａｎ Ｆａｂ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｇｏｘｉｎ ｉｎ ＤＯＣＡ：ｓａｌｔ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９５；８：９２１−７．
Ｇｌａｔｔｅｒ ＫＡ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＮＫ，Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ ＰＡ，Ｔａｏ ＱＦ，Ｆｒｅｍ ＧＪ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＨ，Ｌａｚａｒｕｓ ＪＭ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ［Ｎａ，Ｋ］ＡＴＰａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９４；７：１０１６−２５．
Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＨ．Ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｏｕａｂａｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９８４；５９：１０７０−４．
Ｇｕｓｄｏｎ ＪＰ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ ＶＭ Ｊｒ，Ｈｅｎｎｅｓｓｙ ＪＦ．Ａ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ９８４；１５：８３−８５．
Ｓｅｅｌｙ ＥＷ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＨ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９９２；７４：１５０−６．
Ｌｏｐａｔｉｎ ＤＡ，Ａｉｌａｍａｚｉａｎ ＥＫ，Ｄｍｉｔｒｉｅｖａ ＲＩ，Ｓｈｐｅｎ ＶＭ，Ｆｅｄｏｒｏｖａ ＯＶ，Ｄｏｒｉｓ ＰＡ，Ｂａｇｒｏｖ ＡＹ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｕｆｏｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ａｎｄ ｃａｒｄｅｎｏｌｉｄｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９９；１７：１１７９−１１８７．
Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ ＭＬ，Ａｄａｉｒ ＣＤ，Ｍａｓｏｎ ＬＡ，Ｔｏｒｒｅｓ Ｃ，Ｋｉｐｉｋａｓａ Ｊ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ｄｉｇｉｂｉｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｂ＋ ｕｐｔａｋｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｃｅｎｔａ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｃｉ ２０１１；１８：１９０−１９９．
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Ａｄａｉｒ ＣＤ，Ｂａｃｋａｌｅｗ ＶＭ，Ｔａｙｌｏｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｅｎｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ．Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９６；６（６）：５２９−３１．
Ａｄａｉｒ ＣＤ，Ｌｕｐｅｒ Ａ，Ｒｏｓｅ ＪＣ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｇ，Ｖｅｉｌｌｅ Ｊ−Ｃ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ ＶＭ．Ｔｈｅ ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｂ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ：ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇ ２００９；２９：２８４−２８９．
Ａｄａｉｒ ＣＤ，Ｂｕｃｋａｌｅｗ ＶＭ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｌａｍ ＧＫ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＤ，Ｓａａｄｅ Ｇ，Ｌｅｗｉｓ ＤＦ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｃ，Ｄａｎｏｆｆ ＴＭ，Ｃｈａｕｈａｎ Ｎ，Ｈｏｐｏａｔｅ−Ｓｉｔａｋｅ Ｍ，ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ ＤＥＥＰ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆａｂ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｅｖｅｒｅ Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１０；２７：６５５−６６２．
Ｚｈｅｎ Ｙ，Ｆｒａｎｚ ＫＢ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ．Ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｓａｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｕｂｉｄｉｕｍ ｕｐｔａｋｅ ｕｓｉｎｇ ｇｒａｐｈｉｔｅ ｆｕｒｎａｃｅ ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｒａｔｓ ｏｎ ａ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｅｔ．Ｊ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００５；１６：２９１−２９６．
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Ａｇｕｎａｎｎｅ Ｅ，Ｈｏｒｖａｔ Ｄ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｒ，Ｕｄｄｉｎ ＭＮ，Ｊｏｎｅｓ Ｒ，Ｋｕｅｈｌ ＴＪ，Ｇｈａｎｅｍ ＤＡ，Ｂｅｒｇｈｍａｎ ＬＲ，Ｌａｉ Ｘ，Ｌｉ Ｊ，Ｒｏｍｏ Ｄ，Ｐｕｓｃｈｅｔｔ ＪＢ．Ｍａｒｉｎｏｂｕｆａｇｅｎｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ．Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２０１１；２８：５０９−５１４．
Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｇｌａｔｔｅｒ Ｋ，Ｌａｚａｒｕｓ ＭＪ，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＮＫ．Ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ［Ｎａ，Ｋ］ＡＴＰａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９３；２２（Ｓ２）：Ｓ５４−５７．
Ｌｕｓｉｃ Ｉ，Ｌｊｕｔｉｃ Ｄ，Ｍａｓｋｏｖｉｃ Ｊ，Ｊａｎｋｏｖｉｃ Ｓ．Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｄｉｇｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ １９９９；１４１：６９１−６９７．
Ｗｉｊｄｉｃｋｓ ＥＦＭ，Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ Ｍ，Ｖａｎ Ｂｒｕｍｍｅｌｅｎ Ｐ，Ｄｅｎ Ｂｏｅｒ ＮＣ，Ｖａｎ Ｇｉｊｎ Ｊ．Ｄｉｇｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ．Ｂｒｉｔ Ｍｅｄ Ｊ １９８７；２９４：７２９−７３３．
Ｒａｐ ＺＭ，Ｓｃｈｏｎｅｒ Ｗ，Ｃｚｅｒｎｉｃｋｉ Ｚ，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ Ｇ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ＨＷ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｏ．Ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｏｕａｂａｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｃｏｌｄ ｉｎｊｕｒｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｒａｉｎ ｅｄｅｍａ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ Ｓｕｐｐｌ １９９４；６０：９８−１００．
Ｕｄｄｉｎ ＭＮ，ＭｃＬｅａｎ ＬＢ，Ｈｕｎｔｅｒ ＦＡ，Ｈｏｒｖａｔ Ｄ，Ｓｅｖｅｒｓｏｎ Ｊ，Ｔｈａｒａｋａｎ Ｂ，Ｃｈｉｌｄｓ ＥＷ，Ｐｕｓｃｈｅｔｔ ＪＢ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅａｋ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００９；３０：２６−３３．
Ｄｉｓｍｕｋｅ ＷＭ，Ｍｂａｄｕｇｈａ ＣＣ Ｆａｉｓｏｎ Ｄ，Ｅｌｌｉｓ ＤＺ．Ｏｕａｂａｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｈｕｍｏｕｒ ｏｕｔｆｌｏｗ ｆａｃｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ ｓｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｂｒｉｔ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００９；９３：１０４−１０９．
Ｍｅｎｅｚｅｓ ＪＣ，Ｄｉｃｈｔｃｈｅｋｅｎｉａｎ Ｖ．Ｄｉｇｏｘｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ａｍｅｒ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２００３；１６：１０６２−１０６５．
Ｍｏｒｒｉｓ ＪＦ，ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ＭＤ，Ｐｏｓｔｏｎ Ｌ，Ｓｍｉｔｈ ＳＥ，Ｍｕｌｖａｎｙ ＭＪ，Ｈｉｌｔｏｎ ＰＪ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｎｅｏｎａｔｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ １９８７；７３：２９１−２９７．
Ｖａｌｄｅｓ Ｒ Ｊｒ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ，Ｂｒｏｗｎ ＢＡ，Ｌａｎｄｔ Ｍ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｃａｕｓｉｎｇ ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｇｏｘｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １９８３；１０２：９４７−９５０．

Claims (48)

  1. 子癇症または子癇前症を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  2. 妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  3. 妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者を治療する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  4. 患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を予防するために、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、前記患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  5. 脳室内出血を治療するためにジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、早期分娩（妊娠４０週より前）の結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  6. 患者の新生児における脳室内出血（ＩＶＨ）を予防するために、抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメント、任意にジゴキシン免疫Ｆａｂを投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、早期分娩（妊娠４０週より前）の結果として胎児がＩＶＨを発症し得る妊娠ヒト患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、前記抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  7. 早産と関連付けられる胎児合併症を治療するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、胎児が早期分娩（妊娠４０週より前）され得る妊娠ヒト患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、前記抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  8. 早産と関連付けられる前記胎児合併症が、ＩＶＨまたはＮＥＣを含む、請求項７に記載の前記方法。
  9. 妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の少なくとも１つの症状を呈する妊娠ヒト患者において妊娠を延長させる方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、子癇症または子癇前症を患う患者で行うことと、
    （ｂ）アッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  10. 子癇症または子癇前症の危険性がある患者を治療するための方法であって、
    （ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）前記試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、
    （ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することと、ただし、前記ＥＤＬＦの存在が、子癇症または子癇前症を示す、
    （ｄ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  11. 胎児及び／または新生児にＩＶＨの危険性がある患者を治療するための方法であって、
    （ａ）患者から試料を得ることと、
    （ｂ）前記試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、
    （ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することと、ただし、前記ＥＤＬＦの存在が、子癇症または子癇前症を示す、
    （ｄ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ＤＩＦ）を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  12. 子癇症または子癇前症の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）子癇症または子癇前症の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、
    （ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、
    （ｄ）前記ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にジゴキシン免疫Ｆａｂを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  13. 妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延を患う患者から試料を得ることと、
    （ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、
    （ｃ）前記患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にジゴキシン免疫Ｆａｂを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  14. 妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にジゴキシン免疫Ｆａｂを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  15. 妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）妊娠性高血圧、子癇前症、子癇症、または子宮内胎児発育遅延の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、
    （ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、
    （ｄ）前記ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  16. 脳室内出血を治療するために抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する方法であって、
    （ａ）ジゴキシン免疫抗体アッセイを、脳室内出血を患う患者で行うことと、
    （ｂ）ラジオイムノアッセイに基づいて、前記患者がＥＤＬＦ陽性であるかどうかを決定することと、
    （ｃ）患者がＥＤＬＦ陽性であると決定される場合、前記抗ジゴキシン抗体またはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  17. 脳室内出血を治療するための方法であって、
    （ａ）胎児に脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、
    （ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、
    （ｄ）前記ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメントを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  18. 脳室内出血の抗ジゴキシン療法に対する応答性について患者をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、
    （ｃ）ＥＤＬＦレベルを決定することと、
    （ｄ）前記ＥＤＬＦレベルが１００ｎｍ ＥＤＬＦを超える場合、抗ジゴキシン抗体またはその抗体フラグメント、任意にジゴキシン免疫Ｆａｂを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
  19. 脳室内出血の危険性がある患者を治療するための方法であって、
    （ａ）脳室内出血の危険性がある患者から試料を得ることと、
    （ｂ）前記試料を抗ＥＤＬＦ抗体またはその抗体フラグメントと接触させることと、
    （ｃ）抗ＥＤＬＦ抗体または抗体フラグメント−ＥＤＬＦ複合体の存在を検出することと、ただし、前記ＥＤＬＦの存在が、脳室内出血を示す、を含む、前記方法。
  20. 前記フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または前記抗原を結合することができる抗体の部分である、請求項６、７、１２、１３、および１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記抗体が、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性（ｃｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）である、請求項６、７、１２、１３、および１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記抗体またはフラグメントが、標識に結合している、請求項６、７、１２、１３、および１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記標識が、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射活性標識である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記常磁性標識が、アルミニウム、マンガネーゼ、白金、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムである、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記抗体が、固体支持体に結合している、請求項６、７、１２、１３、および１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記固相支持体が、ビーズ、試験管、シート、培養皿、ナノワイヤ、または試験片である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記固体支持体が、アレイである、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記試料が、血液、血清、血漿、または胎盤試料である、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記抗体アッセイが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイからなる群から選択されるアッセイを含む、請求項１〜７、９、および１６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ＥＤＬＦレベルが、１００ｎＭ ＥＤＬＦを超える、請求項１２、１５、１７、および１８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 投与されるジゴキシン抗体の投薬量が、少なくとも０．００６ｍｇジゴキシン結合能／Ｋｇ未満である、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記投薬量が、６時間以下の期間にわたって投与される、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  33. その後の投薬量のジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含む、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の前記方法。
  34. 治療上有効な量のコルチコステロイドを投与することをさらに含む、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  35. その後の投薬量のジゴキシン免疫Ｆａｂの投与をさらに含む、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  36. 治療上有効な量の降圧薬を投与することをさらに含む、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  37. 降圧薬が、ラベタロール、アルテノロール、ニフェジピン、１−メチルドーパ、またはヒドララジンである、請求項３６に記載の方法。
  38. 治療上有効な量の硫酸マグネシウムまたはフェニトインを投与することをさらに含む、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記ジゴキシン免疫Ｆａｂが、ヒツジジゴキシン免疫Ｆａｂである、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  40. 用量が、約１０．０ｍｇ以下である、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 用量が、約５．０ｍｇ以下である、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  42. 用量が、約０．０１〜１．０ｍｇの範囲内である、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  43. 用量が、約０．０１ｍｇ〜０．５ｍｇの範囲内である、請求項１０〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  44. 固定化された抗ジゴキシン抗体、任意に抗ジゴキシンＦａｂ抗体フラグメントを含む、シリコンナノワイヤバイオセンサー。
  45. 前記フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または前記抗原を結合することができる抗体の部分、任意にジゴキシン免疫Ｆａｂである、請求項４４に記載のバイオセンサー。
  46. 前記抗体が、キメラ化、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二官能性、または共特異性である、請求項４５に記載のバイオセンサー。
  47. 前記バイオセンサーが、生物試料中、少なくとも約１００ｎＭのジゴキシンの感受性を有する、請求項４６に記載のバイオセンサー。
  48. 生物試料を請求項４４に記載のバイオセンサーと接触させることと、ＥＤＬＦの存在についてアッセイすることと、を含む、ＥＤＬＦを検出する方法。
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