JP2016507239A5 - - Google Patents

Claims (17)

1. 二本鎖の第一のＤＮＡに第一の配列モチーフのところでニックを入れることであって、これにより前記第一のＤＮＡは２以上のニックを含み、前記第一のＤＮＡは前記ニックの隣接部でも二本鎖を維持している、前記ニックを入れること、
   前記第一のＤＮＡ上の前記２以上のニックを第一の標識で標識すること、
   標識された前記二本鎖の第一のＤＮＡを線状化すること、及び
   線状化された前記二本鎖の第一のＤＮＡ上の前記第一の標識のパターンを検出すること、
   を含む、ＤＮＡを特性解析する方法。
2. 前記標識することがニックトランスレーションを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記２以上のニックのうち第一のニックは前記ＤＮＡの上鎖に存在し、前記２以上のニックのうち第二のニックは前記第一のＤＮＡの下鎖に存在し、
   前記ニックトランスレーションは、前記第一のニックと前記第二のニックとが互いに離れる方向へ移動することで前記第一のＤＮＡの脆弱部位の形成が最小限に抑えられることを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記第一のＤＮＡを第三の標識でマーキングすることをさらに含み、前記第三の標識は配列非特異的であり、前記第三の標識は前記第一の標識とは異なる、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第一のＤＮＡ上の前記ニックの少なくとも一部を修復することをさらに含む、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記標識することが、標識を含むｄＮＴＰの存在下にて、ポリメラーゼを用いて行われ、
   前記ポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ポリメラーゼがフラップ領域を残し、
   前記修復することがリガーゼにより修復することを含み、前記フラップ領域は除去されて、リガーゼによる前記修復に先立ってライゲーション可能なニックが回復され、前記フラップ領域が、少なくとも１つのヌクレオチドが限定的な濃度で存在する条件下又は含まれない条件下にて、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を用いて除去される、請求項５に記載の方法。
7. 前記線状化することが、前記線状化後に前記ＤＮＡが断片化されないように、反応推進条件を低下して行われる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
8. 第二のＤＮＡに第一の配列モチーフのところでニックを入れること、
   前記第二のＤＮＡ上の前記ニックを前記第一の標識で標識すること、
   前記第二のＤＮＡ上の前記ニックを修復すること、
   修復された前記第二のＤＮＡを第三の標識でマーキングすることであって、前記第三の標識は配列非特異的であり、前記第三の標識は前記第一の標識とは異なる、前記マーキングすること、
   前記第二のＤＮＡを線状化すること、及び
   線状化された前記第二のＤＮＡ上の前記第一の標識のパターンを検出すること、
   をさらに含む、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第一のＤＮＡに前記第一の配列モチーフのところでニックを入れることが、第一のニッキングエンドヌクレアーゼにより、前記第一のＤＮＡの１つの鎖に認識配列のところでニックを入れることを含み、
   第二のニッキングエンドヌクレアーゼにより、第二のＤＮＡの相補鎖に認識配列のところでニックを入れることであって、前記第二のＤＮＡの前記相補鎖は前記第一のＤＮＡの前記１つの鎖に対して相補的であり、前記第二のＤＮＡは二本鎖であり、前記第二のＤＮＡは前記ニックの隣接部でも二本鎖を維持している、前記ニックを入れること、
   前記第二のＤＮＡを前記ニックを入れる部位のところで第二の標識で標識すること、
   前記第二のＤＮＡ上の前記ニックを修復すること、
   前記第二のＤＮＡを線状化すること、並びに
   線状化された前記第一のＤＮＡ及び線状化された前記第二のＤＮＡ上の前記第一及び第二の標識のパターンを検出すること、
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記第一及び第二の標識が互いに同じ標識を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記第一のＤＮＡ及び前記第二のＤＮＡがそれぞれ同じ出所に由来する、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
12. 前記第二のニッキングエンドヌクレアーゼが前記第一のニッキングエンドヌクレアーゼと同じ配列モチーフを認識する、請求項９〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第二のＤＮＡの前記相補鎖の、前記第二のニッキングエンドヌクレアーゼによりニックを入れる部位から１ｋｂ未満の部位で、前記第一のＤＮＡに、前記第一のニッキングエンドヌクレアーゼによりニックを入れる、請求項９〜請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記線状化が、前記ＤＮＡをナノチャネル中へ輸送することを含む、請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 温度、ｄＮＴＰ濃度、補助因子濃度、バッファー濃度、又はこれらの任意の組み合わせを標識付与の間で調節することにより、ポリメラーゼの活性を調整することをさらに含む、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 標識されたモチーフの前記パターンを用いて、標識された前記第一のＤＮＡをアセンブルし、第一のＤＮＡマップを構築することをさらに含む、請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第一のＤＮＡ上の前記第一の標識の前記パターンを、参照ＤＮＡ上の標識のパターンと比較することをさらに含む、請求項１〜請求項１６のいずれか一項に記載の方法。