JP2016506726A - 動物プランクトンを計数するためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

水溶液中の本来の場所にて動物プランクトンの密度測定を行うための方法及びシステムが記載される。この方法は、水溶液の体積Ｖの少なくとも１つの画像を獲得するステップと、少なくとも１つの画像を処理し、画像内の粒子を識別するステップと、識別された粒子を各粒子の鮮鋭度に基づいて分析するステップと、計数対象の動物プランクトンを識別するステップとを含む。

Description

本発明は、液体媒体中の動物プランクトン(zooplankton)、特に水媒体中のカイアシ類を計数するための装置及び方法に関する。

カイアシ類は、稚魚のための1種の「ビタミン剤（ｖｉｔａｍｉｎ ｂｏｍｂ）」であることがよく知られている。カイアシ類は、動物プランクトンの１種であり、ワムシ類よりも栄養価が高い。本発明の狙いは、カイアシ類の卵を生産し、それを採取して、さらなる販売のために純化することができるようにすることである。魚への餌として使用されるとき、卵が培養されて孵化され、得られたカイアシ類が、魚に給餌するために使用される。カイアシ類は、例えば水産養殖施設又は水族館で、海洋魚の仔魚のための餌として使用することができる。また、希少鑑賞魚の幼魚のための最初の餌としてカイアシ類の卵を与えることで、良好な結果が実現されている。カイアシ類は、アカルティア・トンサ（Ａｃａｒｔｉａ ｔｏｎｓａ）種のものでよい。

カイアシ類の卵の生産のためのカイアシ類用の大量生産プラントにおいて、卵生産のための自動化プロセスを提供することが望まれる。カイアシ類密度の手動計数は時間がかかり、この理由及び他の理由から、生餌の生産は、海洋魚種に関する生産コストのかなりの部分を占める。今日のカイアシ類プラントは、カイアシ類の成長及び密度に応じて餌を撒くために、ヒト操作者が存在することを必要とする。仔魚タンク内でのカイアシ類培養及び餌密度のより良い監視を可能にするために、より効率的な測定法が必要とされる。カイアシ類を、サイズ及び形状の面で、培養水中に存在する他の粒子と視覚的に区別することができることを利用することによって、計数プロセスを自動化することができる。

培養水中でワムシ類を計数するための自動化プロセスが図１に概略的に示されており、Ｍ． Ｏ． ＡＬＶＥＲ他「Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｏｔｉｆｉｅｒ Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｆｅｅｄｉｎｇ ｔａｎｋｓ」；Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３６ （２００７） １１５−１２１で述べられている。撮像ボックス１が、内部に物体ガラス（object glass）２を設けられる。コンピュータ制御されたポンプ３及び弁４が、１つ又は複数の給餌タンク５から、撮像ボックス１内部の物体ガラス２内に試料を自動的に抽出することを可能にする。物体ガラスは、デジタル・カメラ６からある距離で、規定の体積を提供する。規定の体積は、物体ガラス２を構成する２つのガラス板間の空間によって提供される。２つのガラス板の間の空間は、所望のサンプル体積と、カメラの焦点深度とに応じて選択することができる。高い密度に関しては、ワムシ類が写真内で重なり合わないようにするために、より短い空間を選択すべきである。体積中のワムシ類は、デジタル・カメラによって撮影され、デジタル画像が、デジタル処理によって処理されて、固定体積内部でのワムシ類密度が得られる。図２は、図１に示される従来技術のワムシ類カウンタの光源７と、物体ガラス２と、カメラ・レンズ６との構成を示す。照光は、各辺に沿って４個のダイオードを有する正方形状に取り付けられた１６個の発光ダイオード７によって提供される。正方形は、カメラで見ることができる円錐範囲（カメラ視線）が発光ダイオード７の間に入るように構成される。このセットアップは、暗視野条件を提供し、水中の粒子によって光が反射され、ワムシ類及び他の粒子が、暗い背景に対する明るいスポットとして画像内に現れる。暗視野条件は、明視野条件よりも良いコントラストを画像に与える。

ワムシ類カウンタの原理は、十分にゆっくりと移動し、ポンピングや光などの刺激に強くは応答しない有機体に関して使用することができる。しかし、アカルティア属（Ａｃａｒｔｉａ）のカイアシ類や多くの他の種などの有機体は、移動が速く、ポンピングによって引き起こされる圧力勾配に反応し、また、光に向かう強い動きを示す。タンクから試料をポンプするとき、この挙動は、測定体積中のプランクトン密度がタンク内の密度に等しいという仮定を無効にする。

Ｍ． Ｏ． ＡＬＶＥＲ他「Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｏｔｉｆｉｅｒ Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｆｅｅｄｉｎｇ ｔａｎｋｓ」；Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３６ （２００７） １１５−１２１

本発明は、上述した問題に対する解決策を提供する。

第１の態様では、本発明は、水溶液中の本来の場所（in situ：現場）にて動物プランクトンの密度測定を行うための方法であって、
−水溶液の体積Ｖの少なくとも１つの画像を獲得するステップと、
−少なくとも１つの画像を処理し、画像内の粒子を識別するステップと、
−識別された粒子を各粒子の鮮鋭度に基づいて分析するステップと、
−計数対象の動物プランクトンを識別するステップと
を含む方法を提供する。

各粒子の鮮鋭度（sharpness）を分析するステップは、各識別された粒子の境界をトレースするステップを含むことがある。さらに、各粒子の鮮鋭度を分析するステップはまた、少なくとも１つの画像から、隣接する画素間の強度の変化率に基づいて、各粒子の境界に沿った各画素に関する強度勾配（intensity gradient）を計算するステップと、各粒子の境界に沿った全ての画素の平均（mean）強度勾配を計算するステップとを含むこともある。各粒子の鮮鋭度を分析するステップは、さらに、少なくとも１つの画像内の全般的なコントラストレベルに関して平均強度勾配を補正するステップを含むことがある。

この方法は、さらに、どの粒子が計数対象の動物プランクトンであるかを識別する形状パラメータに基づいて、少なくとも１つの画像内の識別された粒子をフィルタするステップを含むこともある。画像獲得及び処理と相互作用して、水溶液の体積を照明するための照明デバイスを制御することができる。

第２の態様では、本発明は、水溶液中の本来の場所にて動物プランクトンの密度測定を行うためのシステムであって、水溶液の体積Ｖの少なくとも１つの画像を獲得するための撮像デバイスと、撮像デバイスからある距離に配置されたプレートとを備え、上記の距離と、撮像デバイスの視野角とが、撮像デバイスによって撮像される水溶液の体積Ｖを定義し、システムがさらに、撮像デバイスからの少なくとも１つの画像の画像処理を行い、画像内の粒子を識別し、識別された粒子を各粒子の鮮鋭度に基づいて分析し、計数対象の動物プランクトンを識別する画像処理デバイスを備えるシステムを提供する。

さらなる実施例では、撮像デバイスは、少なくとも１つのデジタル・カメラを含むカメラ・ハウジングを備えることがある。水溶液の体積を照明する少なくとも１つの照明デバイスが提供される。画像処理デバイスからのフィードバックに基づいて撮像デバイス及び照明デバイスを制御するための制御装置を提供することもできる。

さらなる態様では、本発明は、水溶液中の動物プランクトンであるカイアシ類の密度を求めるための上記のシステム及び方法の使用を提供する。上記のシステム及び方法は、自動化された動物プランクトン卵生産施設内でカイアシ類への餌の分配を制御するために使用することもできる。動物プランクトンは、カイアシ類でよい。

さらなる態様では、本発明はまた、上記の方法を実施するための、処理装置及び可読記憶媒体を備えるコンピュータで実行されるように適合されたコンピュータ・プログラムも提供する。さらなる態様では、本発明は、上で定義した方法を実施するための命令を記憶されたコンピュータ・プログラム製品を提供する。

本発明により、動物プランクトンの数が、水溶液中の本来の場所にて計数される。動物プランクトンは、ポンピング、溶液中で誘発される流れ、又は強い光によって影響を及ぼされない。これは、測定対象の動物プランクトンに影響を及ぼす又は危害を加えることなく、単純で高い信頼性の測定を提供する。測定は、交換が必要とされる移動部分又は管及び物体ガラスに依拠せず、低コストで行うことができる。

次に、本発明の例示的実施例を、以下の図面を参照して述べる。

従来技術によるワムシ類カウンタの概要を示す図である。 図１に示される従来技術のワムシ類カウンタの光源と、物体ガラスと、カメラ・レンズとの構成を示す図である。 本発明の一実施例による動物プランクトンに関するカウンタの概略図である。 本発明の一実施例による動物プランクトンに関するカウンタの概略図である。 本発明の一実施例による動物プランクトンを計数するためのシステムであって、動物プランクトン用のカウンタが水溶液中に浸漬されるシステムの概略図である。 ２つの個体に焦点が合っている画像を示す、アカルティア・トンサを計数するための本発明の一実施例によるカウンタの使用の一例を示す図である。 幾つかの個体が異なる合焦度（degree of focus）である画像を示す、アカルティア・トンサを計数するための本発明の一実施例によるカウンタの使用の一例を示す図である。 アカルティア・トンサを計数するための方法の一実施例によるカウンタの使用の一例を示す図であって、カイアシ類の密度が時間の関数として示されている図である。 画像が幾つかの個体アカルティア・トンサを異なる合焦度で示す、２つの光源を設けられた本発明の一実施例によるカウンタの使用の一例を示す図である。

図３ａは、水溶液中の動物プランクトン１１用の現場カウンタ（in situ counter）１０を示す。カメラ１２の形態での撮像デバイスが、防水カメラ・ハウジング１３内に配置される。カメラ・ハウジングは、カメラ用の窓を設けられている。カメラは、好ましくは、画素を用いたデジタル画像を提供するデジタル・カメラであるが、他のデジタル・カメラ撮像デバイスも想定され得る。背景プレート１４が、カメラ１２の前に、カメラ・レンズ２１と平行に提供される。カメラの視線１５は、背景プレート１４によって画定された領域内に入る。背景プレート１４は、カメラ・ハウジング１３に接続されたアーム（図示せず）に取り付けることができる。背景プレート１４は、撮影対象の動物プランクトン１１のための良好なコントラストを得られるように白色である。図３ｂに示されるように、カメラ・レンズ２１の視野角（カメラの視線）、及びカメラ・レンズと背景プレート１４との間の距離が、カメラによって撮影される体積Ｖを定義する。体積Ｖ内に、カメラ・レンズ２１の焦点区域１７によって制限されるより小さな体積Ｖ_２が存在し、そこでは、水中の粒子が鮮鋭に捕捉される。従って、体積Ｖ_２は、カメラの視野によって２次元で画定され、焦点区域１７によって３つめの次元が画定される。この焦点区域１７内部の粒子のみが、画像内で鮮鋭になる。カメラによって獲得された画像は、画像処理デバイスによって処理され、画像内の粒子が識別される。識別された粒子は、各粒子の鮮鋭度に基づいて分析され、計数対象の動物プランクトンが識別される。体積Ｖ_２が既知であるので、密度を得ることができる。

光源１６がカメラの側部に提供され、撮影対象の体積Ｖを照明する。光源１６は、好ましくは白色光を提供し、発光ダイオード（ＬＥＤ）又は別の適切な光源でよい。光源は、カメラ・ハウジング１３、又はカメラ・ハウジングに接続されたアームに取り付けることができる。さらなる実施例では、カメラ・ハウジングは、カメラの各側に配置された２つの光源を設けられることがある。これは、より均一であり、より強い照明を可能にし、白色プレート背景と撮影対象の体積内の動物プランクトンとの間のより強いコントラストを提供する。

距離アーム及び背景プレートを有するカメラ・ハウジング１３は、図３ｃに示されるように、監視対象の動物プランクトンを含む水溶液を収容するタンク１９内に浸漬されるように適合される。また、カメラ・ハウジング１３は、タンク内部の様々な位置に配置されるように、例えばポール１８に配置されることもある。ポールは、電動構成に接続されることがある。図３ｃにおける実施例では、ポール１８に取り付けてあるカメラ・ハウジング１３を有する実施例を示す。ポールは、タンク内部のどこにでも位置決めすることができるように、全ての方向で移動させることができる。図３ｃでの矢印は、図面を見やすくするために２方向での移動のみを示すが、他の方向も可能である。カメラ・ハウジング１３は、ポールにおいて上下に移動することができる。カメラ・ハウジング１３内部のカメラ１２は、画像を分析し、カメラ、光源、及び電動構成を制御するためのコンピュータ２０に接続される。図３ｃではコンピュータによって例示される制御装置は、画像処理デバイスからのフィードバックに基づいて撮像デバイス及び照明デバイスを制御する。

カメラは、動物プランクトンを計数するためのソフトウェアを有する制御デバイスに接続される。制御デバイスは、制御インターフェースを有する標準のコンピュータでよい。ソフトウェアは、本発明による画像処理アルゴリズムを設けられ、これは、以下にさらに詳細に説明する。光源は、光モジュールによって駆動される。光モジュールは、制御デバイスに接続される。また、制御モジュールは、光源を制御する光制御インターフェースを備える。光源及びカメラ用の制御インターフェースは、画像処理アルゴリズムを実装するソフトウェアによって調整される。光源は、好ましくは、動物プランクトンの挙動に対する影響を最小限にするために、新たな写真が撮影されるときに短期間だけ光を提供する。

現場カウンタのカメラは、動物プランクトンを含む水溶液中の体積Ｖの幾つかの画像を獲得する。所与の時点での動物プランクトンの数を計数するのには１つの画像で十分であり得るが、通常は、所与の時点での水溶液中の動物プランクトンの密度のより正確な推定値を提供するために、幾つかの連続する画像が獲得されて分析される。幾つかの連続する画像が獲得される場合、各画像は個別に処理され、次いで動物プランクトンの数の平均が推定される。少なくとも１つの画像が、画像処理アルゴリズムによって処理され、画像内の粒子が識別される。識別された粒子は、さらに各粒子の鮮鋭度に関して分析され、計数対象の動物プランクトンが識別される。各粒子の鮮鋭度に関する分析は、カメラ・レンズの焦点区域外の粒子のフィルタ除去を可能にし、それにより規定の体積Ｖ_２内の動物プランクトンの計数を可能にする。

画像処理アルゴリズムは、以下のステップを提供することができる。

各粒子の鮮鋭度の分析は、各識別された粒子の境界をトレースすることを含むことがある。少なくとも１つの画像から、隣接する画素間の強度の変化率に基づいて、各粒子の境界に沿った各画素に関する強度勾配を計算することができ、各粒子の境界に沿った全ての画素の平均強度勾配を計算する。少なくとも１つの画像内の識別された粒子は、どの粒子が計数対象の動物プランクトンであるかを識別する形状パラメータに基づいてフィルタすることができる。

画像処理アルゴリズムのステップのさらなる詳細を以下に提供する。

１．強度の平滑化。画像は、幾つか（ｎ×ｍ）の部分、例えば５×５の部分に分割される。各部分での画素に関して平均(average，mean又はmedian)強度が計算され、次いで、上記の幾つか（ｎ×ｍ）の部分（例えば５×５の部分）に関する平均強度(average intensities)の平均値(mean)からの偏差に基づいて各部分に関して上下に調節される。部分間の境界での鋭い勾配を避けるために、調節は、各画素において補間される。

２．高周波変動を除去するための画像の平滑化。

３．２値画像を提供するための画像の閾値設定。画像の閾値は、画像の平均強度レベルと画像内の最も暗い画素との間の強度レベルで、平均強度レベルから最小距離に設定される。閾値レベルを決定するための最も暗いレベル（最も暗い画素）に対する平均強度レベルの重み付けは、カメラによって撮影される体積の照光、及び測定対象の動物プランクトンに応じて調節可能である。得られる２値画像が反転され、それにより、閾値レベルよりも暗い画素が白くなり、残りの画素は黒くなる。

４．小さな粒子（少数の画素、典型的にはこの文脈では１〜１０個の画素に及ぶ粒子）を除去するための、反転された２値画像の削り取り（Erosion）。これらの小さな粒子の除去は、画像のさらなる画像処理のための計算時間を短縮する。

５．次いで、反転された２値画像内の粒子（連接された白色画素の集合）が、サイズによってフィルタされる。画像縁部に沿った粒子が除外され、残りの粒子が、鮮鋭度に関して分析される。鮮鋭度に関する分析は、最初に各粒子の境界をトレースすることによって行われる。粒子の境界に沿った各画素に関して、オリジナルの画像（即ち、ステップ１での画像処理の開始前に獲得された画像）から、隣接する画素間の強度の変化率に基づいて強度勾配が計算される。粒子の鮮鋭度は、元の画像での全般的なコントラストレベルに関して補正された、粒子の境界に沿った全ての画素の平均勾配として定義される。特定のレベルよりも低い鮮鋭度を有する全ての粒子が除外される。これは、カメラ・レンズの焦点区域外の粒子のフィルタ除去を表す。

６．鮮鋭度に基づくフィルタリング後の残りの粒子は、どの粒子が計数対象の動物プランクトン種であり、どの粒子がデトリタス（detritus:岩屑）又は他の有機体であるかを決定するために、円形度因子、伸び、慣性モーメント、凸形領域、密集性など周知の形状パラメータを使用してフィルタ処理されても良い。

上述した画像処理アルゴリズムにより、幾つかの識別された粒子が計数される。次いで、全てのこれらの識別された粒子が、処理された画像内で、画素単位でサイズを測定され、次いで、画素単位でのこのサイズを、各動物プランクトンに関する概算の体積推定値に変換することができる。

この原理は、場合によっては、仔魚を含む広範なプランクトン様生物で使用することができる。

まず高密度のカイアシ類で、次いで低密度のカイアシ類で、水槽内でカウンタを試験した。水槽内で穏やかな循環を生み出すために水槽のバブリング（Bubbling：泡だて）を行った。カウンタは、各密度に関して、各画像間で約７秒空けて毎時約５００画像を記憶するように設定した。

図４は、鮮鋭度に基づく画像処理後の画像の一例を示し、２匹のカイアシ類に焦点が合っている。図５は、鮮鋭度に基づく画像処理後の結果を示し、ここでは、個々のカイアシ類が異なる合焦度である。十分な鮮鋭度のカイアシ類のみが計数され、残りのカイアシ類はフィルタ除去される。図５では、カイアシ類の１つのみ、即ち上隅のカイアシ類のみが、計数するのに十分に鮮鋭である。十分な鮮鋭度に関する閾値は、カメラ及び照光セットアップに関して、画像の視認に基づいて予め設定される。

所与の時点での密度計数の一例が図６に提供されており、ここで、画像は、約２分毎に獲得される。試験中、画像毎に個々のカイアシ類の数を計数し、カイアシ類の密度を推定した。カイアシ類密度が、時間の関数としてプロットされる。図６でのカイアシ類の密度に関する数値は、非較正の数値であるが、数値間の相対変化は正しい。カウンタの較正は、カイアシ類の手動計数と比較することによって行うことができる。垂直線は、カイアシ類の密度が減少した時点を示す。カウンタによって計数されるカイアシ類の数、従って推定されるカイアシ類密度は、密度の減少に続いて起きる。

図７は、２つの発光ダイオードを使用した一例を示す。画像は、４〜５匹のカイアシ類個体を異なる合焦度で示す。即ち、数匹のカイアシ類に焦点が合っており、他のカイアシ類にはあまり焦点が合っていない。鮮鋭度は、４つの個体それぞれに関して決定される。画像の中心に最も近い個体と、中心から右上の個体とは、計数するのに十分な鮮鋭度である。これらの試験は、２つの発光ダイオードの使用によって良好なコントラストが実現されていることを示す。好ましくは、カメラのシャッタ時間はできるだけ短くすべきであり（約６、７ｍｓ）、撮影すべき体積内のカイアシ類がある程度運動するときに、良好な鮮鋭度を提供する。

本発明の好ましい実施例を説明してきたが、これらの概念を組み込む他の実施例が使用されることもあることが当業者には明らかであろう。上述した本発明のこれら及び他の例は、例示としてのみ意図されており、本発明の実際の範囲は、添付の特許請求の範囲から決定すべきである。

Claims (17)

1. 水溶液中の本来の場所にて動物プランクトンの密度測定を行うための方法であって、
   前記水溶液の体積Ｖの少なくとも１つの画像を獲得するステップと、
   前記少なくとも１つの画像を処理し、前記画像内の粒子を識別するステップと、
   前記識別された粒子を各粒子の鮮鋭度に基づいて分析するステップと、
   計数対象の動物プランクトンを識別するステップと
   を含む方法。
2. 各粒子の鮮鋭度を分析するステップが、さらに、各識別される粒子の境界をトレースするステップを含む請求項１に記載の方法。
3. 各粒子の鮮鋭度を分析するステップが、さらに、
   前記少なくとも１つの画像から、隣接する画素間の強度の変化率に基づいて、各粒子の境界に沿って各画素に関する強度勾配を計算するステップと、
   各粒子の前記境界に沿った全ての画素の平均強度勾配を計算するステップと
   を含む請求項２に記載の方法。
4. 各粒子の鮮鋭度を分析するステップが、さらに、前記少なくとも１つの画像内の全般的なコントラストレベルに関して平均強度勾配を補正するステップを含む請求項３に記載の方法。
5. さらに、
   どの粒子が計数対象の動物プランクトンであるかを識別する形状パラメータに基づいて、前記少なくとも１つの画像内の前記識別された粒子をフィルタするステップ
   を含む請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. さらに、前記画像獲得及び処理と相互作用して、前記水溶液の体積を照明するための照明デバイスを制御するステップを含む請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
7. 水溶液中の本来の場所にて動物プランクトンの密度測定を行うためのシステムであって、
   前記水溶液の体積Ｖの少なくとも１つの画像を獲得するための撮像デバイスと、
   前記撮像デバイスからある距離に配置されたプレートを備え、前記距離と、前記撮像デバイスの視野角とが、前記撮像デバイスによって撮像される前記水溶液の前記体積Ｖを定義し、
   システムがさらに、前記撮像デバイスからの前記少なくとも１つの画像の画像処理を行い、前記画像内の粒子を識別し、前記識別された粒子を各粒子の鮮鋭度に基づいて分析し、計数対象の動物プランクトンを識別する画像処理デバイスを備える
   システム。
8. 前記撮像デバイスが、少なくとも１つのデジタル・カメラを含むカメラ・ハウジングを備える請求項７に記載のシステム。
9. 前記水溶液の前記体積を照明する少なくとも１つの照明デバイスを備える請求項７又は８に記載のシステム。
10. さらに、前記画像処理デバイスからのフィードバックに基づいて前記撮像デバイス及び前記照明デバイスを制御する制御装置を備える請求項７から９までのいずれか一項に記載のシステム。
11. 水溶液中の動物プランクトンであるカイアシ類の密度を求めるための請求項７から１０までのいずれか一項に記載のシステムの使用。
12. 自動化された動物プランクトン卵生産施設内でカイアシ類への餌の分配を制御するための請求項７から１０までのいずれか一項に記載のシステムの使用。
13. 水溶液中の動物プランクトンの密度を求めるための請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法の使用。
14. 自動化されたカイアシ類卵生産施設内での動物プランクトンへの餌の分配を制御するための請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法の使用。
15. 動物プランクトンがカイアシ類である請求項１１から１４までのいずれか一項による使用。
16. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法を実施するための、処理装置及び可読記憶媒体を備えるコンピュータで実行されるように適合されたコンピュータ・プログラム。
17. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法を実施するための命令を記憶されたコンピュータ・プログラム製品。