JP2016501861A

JP2016501861A - オートファジーを誘導する方法及び組成物

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Publication number: JP2016501861A
Application number: JP2015544044A
Authority: JP
Inventors: ウー・ロン−ツン; ホーン・リン−イア; スン・ホイ−チン; チェン・リー−ウェン
Original assignee: ウーソフィアシューフェン; ウーロンツン
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2016-01-21
Also published as: EP2922556A1; CA2892157A1; CN105050609A; EP2922556A4; AU2012394926A1; HK1214764A1; WO2014081439A1

Abstract

オートファジー異常を有する被験者においてオートファジーを誘導する方法を提供する。本発明の方法は、被験者に治療有効量の霊芝抽出物を投与する工程を含み、ここで、前記オートファジーが被験者におけるタンパク質凝集の分解を増強することを特徴とする。

Description

本発明はオートファジーを誘導する方法に関し、特に、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）の抽出物を被験者に投与することにより該被験者においてオートファジーを誘導する方法に関する。

オートファジー（「自食作用」とも呼ばれる）は、タンパク質、タンパク質集合体、リソソーム中の分解のための細胞小器官など、細胞質成分を標的とする重要な生理的プロセスである。オートファジープロセスは神経のホメオスタシス維持にも不可欠であり、その機能不全は数々の疾病増加に直接関係がある。

オートファジーは飢餓中における細胞代謝維持のための細胞内栄養素リサイクルの目的を果たすとともに、ストレス下で蓄積された損傷した細胞小器官とタンパク質を排除する。

異常なオートファジーは、神経変性、肝臓病、癌などを含むがこれらに限らない疾病の主要な要因である。ヒトの神経変性疾患の多くが異常変異体および（または）ポリユビキチン化タンパク質の蓄積と過剰な神経細胞死に関係している。

神経成長因子（ＮＧＦ）は１９５１年に単離され、単離された初の神経因子である。ＮＧＦは星状膠細胞により成長中に成熟した動物で産生され、シナプス可塑性と機能的神経回路の確立に不可欠である。前脳基底野コリン作動性神経細胞の生存と機能の媒介における内因性ＮＧＦの重要性が示されており、この栄養因子の部分欠失が学習と記憶における明らかな障害と関連付けられているためである。

ＮＧＦは複数のモデルで神経保護的効果の可能性を示している。加えて、ＮＧＦはラットにおいて３−ＮＰやＭＰＴＰなどのミトコンドリア毒素により引き起こされる神経細胞死から保護することができる。したがって、ＮＧＦは神経変性疾患の治療における薬理的適用で重要な役割を果たすと考えられた。しかしながら、ＮＧＦのアクセスは血液脳関門（ＢＢＢ）により制限されており、抹消血管から投与されたとき代謝されやすいため、脳に直接注射される場合のみ使用可能である。ＮＧＦは脳室内に点滴され、またいくつかの副作用もあるため、この送達経路は非実用的である。したがって、内因性ＮＧＦ発現の調節は神経変性疾患における新しい治療戦略となり得る。

神経変性は神経細胞の構造または機能の進行的喪失を指す一般的な用語である。パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む多くの神経変性疾患が神経変性プロセスの結果として発生する。最近では神経変性疾患の類似性が多く発見されており、これらの疾病間で相互に関連し合っている。例えば、いくつかの神経変性疾患は、非定型タンパク質集合とも呼ばれる、異常な折り畳み構造のタンパク質の集合に関連している。

ハンチントン病（ＨＤ）は常染色体優性神経変性疾患であり、ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子のエクソン１におけるＣＡＧ３塩基対リピートの異常伸長により引き起こされる。ＨＤの主な特徴は、ＨＤの動物及び患者において影響を受けている線条体神経細胞の突然変異Ｈｔｔ（ｍＨｔｔ）凝集体形成である。このＨｔｔ遺伝子のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）ストレッチの３７を超えるグルタミンまでの伸長またはｐｏｌｙＱストレッチをコードする短いＮ末端フラグメントはこの疾患のマウスおよび細胞モデルにおいて凝集体を引き起こすに十分である。

霊芝はアジア諸国で長い歴史を持つ最も一般的な薬用菌類の１つである。霊芝の治療的有効性については多くの研究が行われてきた。霊芝の最も重要な薬理活性低分子成分はトリテルペノイドであり、肝臓保護、降圧、コレステロール低下、抗ヒスタミン、抗がん、抗血管形成などの作用があることが報告されている。しかしながら、その知能向上の性質については十分な研究がなされていない。

本発明の一態様において、オートファジー異常を有する被験者においてオートファジーを誘導する方法が提供される。本発明に基づき、この方法は治療有効量の霊芝抽出物を被験者に投与する工程を含み、そのうち、前記オートファジーが被験者におけるタンパク質凝集の分解を増強する。

本発明の一実施態様において、前記オートファジー異常は前記被験者中でタンパク質凝集を発現している細胞にあり、そのうち、前記細胞は神経細胞またはグリア細胞である。本発明の一実施態様において、前記タンパク質凝集は、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ（ｔａｕ）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、それらの変異型及び突然変異型、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される凝集である。

本発明の一実施態様において、前記オートファジー異常は、神経変性疾患、クローン病、加齢、心臓病、および肝臓病からなる群より選択される１つの疾患である。本発明の一実施態様において、前記神経変性疾患は、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および致死性家族性不眠症からなる群より選択される１つの疾患である。

本発明によれば、前記霊芝抽出物は前記被験者に経口投与される。

本発明の別の一態様において、オートファジー異常を有する被験者において、神経成長因子（ＮＧＦ）を活性化する方法を提供し、そのうち、前記ＮＧＦは前記被験者においてオートファジーを活性化させ、前記オートファジーが前記被験者におけるタンパク質凝集の分解を増強する。本発明によれば、前記方法は治療有効量の霊芝抽出物の前記被験者への投与を含む。

本発明の一実施態様において、前記オートファジー異常は前記被験者中でタンパク質凝集を発現している細胞にある。

本発明の一実施態様において、前記タンパク質凝集は、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、それらの変異型及び突然変異型、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される凝集である。

本発明の一実施態様において、前記タンパク質凝集は、ハンチンチン、アミロイドβ、α-シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１、それらの変異型及び突然変異型の１つ以上である。

本発明の別の一態様において、被験者における記憶障害を防止する方法が提供される。本発明によれば、前記方法は、前記被験者に治療有効量の霊芝抽出物を投与する工程を含み、そのうち、前記霊芝抽出物が被験者におけるオートファジーを活性化させる。

本発明の一実施態様において、前記霊芝抽出物は神経成長因子（ＮＧＦ）を誘導して前記被験者におけるオートファジーを活性化する。本発明の一実施態様において、前記オートファジーは前記被験者においてタンパク質分解を増強する。

本発明によれば、前記被験者はオートファジー異常を有する。本発明の一実施態様において前記オートファジー異常は、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および致死性家族性不眠症からなる群より選択される神経変性疾患である。

本発明の別の一態様において、オートファジー異常を有する被験者において、オートファジーを誘導するための組成物が提供され、そのうち、前記方法は、ガノデリン酸と薬学的に許容される担体を含む。本発明の一実施態様において、前記ガノデリン酸は、ガノデリン酸Ｃ２、ガノデリン酸Ａ、ガノデリン酸Ｈ、ガノデレン酸Ｄ、ガノデレン酸Ｄおよび１２−アセトキシガノデリン酸Ｆからなる群より選択される１つ以上である。

本明細書及び図面において、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）はＧａＬｕと短縮して表される。

ｍＨｔｔ７４Ｑ発現ＰＣ１２細胞モデルにおけるＮＧＦの効果を示す図である。ＮＧＦを投与した細胞のＦＭＩ率である。ヒストグラムは２つの独立した実験で測定されたＦＭＩの定量化を表す（ｎ＝６）。ｍＨｔｔ７４Ｑ発現ＰＣ１２細胞モデルにおけるＮＧＦの効果を示す図である。ｍＨｔｔ−７４Ｑを発現しており、ＮＧＦ５０ｎｇ／ｍｌを投与した細胞における、凝集の減少を表す蛍光分布の左へのシフトを示す。Ｘ軸で緑色蛍光の大きさが測定され、Ｙ軸にその蛍光度合いを示す細胞数が表される。データは±ＳＤ（^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｄｏｘなしと比較；^＃Ｐ＜０．０５、Ｄｏｘありと比較、スチューデントのｔ検定）。ｍＨｔｔ７４Ｑ発現ＰＣ１２細胞モデルにおけるＮＧＦの効果を示す図である。ＮＧＦはオートファジー小胞形成を増強し、さらに、ｍＨｔｔの分解を促進する。細胞中のオートファジー液胞がＭＤＣを使用して染色された。ＮＧＦ投与後の細胞において増強されたＭＤＣ染色が認められた。白い矢印はＮＧＦ投与済の細胞におけるＭＤＣとＥＧＦＰの共局在を示し、黄色い矢印はＤｏｘ投与済細胞内におけるＥＧＦＰ凝集及びＭＤＣ染色斑点を表す。したがって、Ｄｏｘ細胞において珍しいＥＧＦＰおよびＭＤＣの共局在があった（尺度:１０μｍ）。ｍＨｔｔ７４Ｑ発現ＰＣ１２細胞モデルにおけるＮＧＦの効果を示す図である。ＭＤＣ染色の定量化。結果は、未投与の対照群（Ｄｏｘなし）に対して１細胞当たりの斑点面積として表される。ｍＨｔｔ７４Ｑ発現ＰＣ１２細胞モデルにおけるＮＧＦの効果を示す図である。各条件におけるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩプロテインレベルのウェスタンブロットである（ラパマイシン２００ｎＭがオートファジー誘導のための陽性対照群として使用された）（ｎ＝３）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１Ｄｏｘなしと比較、^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１Ｄｏｘと比較、スチューデントのｔ検定。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。一次（ｐｒｉｍａｒｙ）星状膠細胞にＧａＬｕがｍＲＮＡ分析用に６時間投与された。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。たんぱく質分析用にＧａＬｕが２４時間投与された。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。ＧａＬｕが２４時間投与された星状膠細胞培養から収集された２０倍濃縮馴化培地（ＧａＬｕ−ＡＣＭ）中のＮＧＦを示すウェスタンブロットである。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。フローサイトメトリーにより測定されたＧａＬｕ−ＡＣＭによるｍＨｔｔ−７４Ｑ凝集の阻害を示す。ヒストグラムは２つの独立した実験（ｎ＝６）で測定されたＦＭＩの定量化を表す。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。ｍＨｔｔ−７４Ｑを発現し、ＧａＬｕ−ＡＣＭ１００μｇｍｌ^−１が投与された細胞における蛍光分布の左へのシフト、すなわち凝集数の減少を示す。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。ＧａＬｕによるＭＤＣ強度の増強。ＧａＬｕ投与済細胞におけるＭＤＣとＥＧＦＰの共局在が白い矢印で示されている（尺度:１０μｍ）。ＭＤＣ染色の定量化が未投与の対照群（Ｄｏｘなし）に対して１細胞当たりの斑点面積として表されている。霊芝、星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の調整された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ミトコンドリア新生、ＨＤ細胞モデルにおける弱毒化ｍＨｔｔ誘導欠損を示す図である。各条件におけるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩプロテインレベルを示すウェスタンブロットである（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ２００ｎＭがオートファジー誘導のための陽性対照群として使用された）（ｎ＝３）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１Ｄｏｘなしと比較、^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１Ｄｏｘと比較、スチューデントのｔ検定。霊芝が一次星状膠細胞におけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を特異的に増加したことを示す図である。星状膠細胞に霊芝が６時間投与され、神経栄養因子の発現を分析するためＲＴ−ＰＣＲが行われた（ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦおよびＢＤＮＦ）。星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の霊芝抽出物誘導神経突起形成を示す図である。霊芝あり／なしで２４時間処理された一次星状膠細胞からの馴化培地（霊芝−ＡＣＭ）が収集された。ＰＣ１２細胞にＧａＬｕ−ＡＣＭまたはＮＧＦが投与された。星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の霊芝抽出物誘導神経突起形成を示す図である。霊芝あり／なしで２４時間処理された一次星状膠細胞からの馴化培地（霊芝−ＡＣＭ）が収集された。ＰＣ１２細胞にＧａＬｕ−ＡＣＭまたはＮＧＦが投与された。星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、ＰＣ１２細胞中の霊芝抽出物誘導神経突起形成を示す図である。霊芝あり／なしで２４時間処理された一次星状膠細胞からの馴化培地（霊芝−ＡＣＭ）が収集された。ＰＣ１２細胞にＧａＬｕ−ＡＣＭまたはＮＧＦが投与された。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ２の効果を示す図である。ＧａＬｕエタノール抽出物のＨＰＬＣ分析である。逆相ＨＰＬＣプロファイル、カラム：ＮｕｃｌｅｏｓｉｌＣ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；５μｍ）。移動相は０．１％の含水酢酸及びアセトニトリルを含み、３０〜３２％のアセトニトリルで０〜４０分間、３２〜４０％のアセトニトリルで４０〜６０分間、４０％のアセトニトリルで６０〜６５分間、４０〜８２％のアセトニトリルで６５〜７０分間の線形勾配プログラム；流量：０．８ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍが用いられた。合計６のトリテルペノイドが推測された。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ２の効果を示す図である。ＧａＬｕ抽出物から特定された（Ａ〜Ｆ）６つのトリテルペノイドの化学構造である。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ２の効果を示す図である。各成分が６時間投与された後の星状膠細胞におけるＮＧＦｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析である。β−アクチンの発現がインターナルコントロールとして使用された。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ２の効果を示す図である。活性を５０％増加させる（ＥＣ１．５）ために必要な化合物の濃度を決定することで有効性が追跡され、最大活性潜在性が記録された。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ２の効果を示す図である。ＰＣ１２細胞がＧａＬｕ−ＡＣＭまたはＮＧＦ（陽性対照）が２４時間投与され、神経突起形成活性が神経突起形成割合により示された。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ２の効果を示す図である。活性を５０％増加させる（ＥＣ１．５）ために必要な化合物の濃度を決定することで有効性が追跡され、最大活性潜在性が記録された。結果は３つ以上の独立した測定の対照±ＳＤの相対指数（ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｄｅｘ）として表される（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡの後Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ_２の効果を示す図である。フローサイトメトリーで測定されたガノデリン酸Ｃ_２−ＡＣＭによるｍＨｔｔ−７４Ｑ凝集の阻害。ガノデリン酸Ｃ２−ＡＣＭが投与された細胞のＦＭＩ率。２つの独立した実験（ｎ＝６）で測定されたＦＭＩの定量化を示すヒストグラム。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ_２の効果を示す図である。ｍＨｔｔ−７４Ｑを発現し、ガノデリン酸Ｃ_２−ＡＣＭ２０μｇ／ｍｌが投与された細胞における蛍光分布の左へのシフト、凝集の減少を示している。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ_２の効果を示す図である。ガノデリン酸Ｃ_２−ＡＣＭがＭＤＣ強度を増強した。白い矢印はガノデリン酸Ｃ_２−ＡＣＭが投与された細胞におけるＭＤＣとＥＧＦＰの共局在を示す（尺度:１０μｍ）。ＭＤＣ染色の定量化が未投与の対照群（Ｄｏｘなし）に対して１細胞当たりの斑点面積として表される。霊芝の成分特定とＰＣ１２細胞とＨＤモデルにおけるガノデリン酸Ｃ_２の効果を示す図である。各条件におけるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩプロテインレベルのウェスタンブロットを示す（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ２００ｎＭがオートファジー誘導のための陽性対照群として使用された）（ｎ＝３）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１Ｄｏｘなしと比較、^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１Ｄｏｘと比較、スチューデントのｔ検定。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。霊芝抽出物投与による３−ＮＰモデルにおける行動パフォーマンスの向上を示す図である。ＬＴＰ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける短時間の断眠を示す図である。まず、マウスに霊芝が３日間与えられた（２０、５０、１２５ｍｇ／ｋｇ／日）。４日目、マウスは穏やかな睡眠妨害（ｇｅｎｔｌｅｈａｎｄｌｉｎｇ）により５時間断眠された。断眠後、半数のマウスが電気生理学的実験用に犠牲にされ、残りのマウスはケージに残された。２４時間後、リバウンド試験の電気生理学的実験用にマウスが犠牲にされた。ＬＴＰ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける短時間の断眠を示す図である。ＴＢＳ誘導ＬＴＰの維持は断眠（ＳＤ）マウスからのスライスにおいて大きく分断された（０＝０．００２）。ＭＥＤ６４システムによる海馬ＣＡ１モニタリングのフィールド興奮性後シナプス電位（ｆＥＰＳＰ）に対する霊芝が与えられたマウスの効果を示す図である。４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対し、説明のとおりの霊芝が与えられた。５時間の断眠後、長期増強（ＬＴＰ）が異なる群（対照群、断眠群（ＳＤ）、霊芝投与（２０ｍｇ／ｋｇ／日）群）に誘導された。ＭＥＤ６４システムによる海馬ＣＡ１モニタリングのフィールド興奮性後シナプス電位（ｆＥＰＳＰ）に対する霊芝が与えられたマウスの効果を示す図である。２４時間のリバウンド睡眠後、マウスが犠牲にされ、ｆＥＰＳＰが記録された。そしてＬＴＰが異なる群（対照群、ｎ＝６；断眠群（ＳＤ）、ｎ＝７、霊芝投与（２０ｍｇ／ｋｇ／日）群、ｎ＝５）に誘導された。ＭＥＤ６４システムによる海馬ＣＡ１モニタリングのｆＥＰＳＰに対する霊芝が与えられたマウスの効果を示す図である。４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対し、説明のとおりの霊芝が与えられた。５時間の断眠後、ＬＴＰが異なる群（対照群、断眠群（ＳＤ）、霊芝投与（５０ｍｇ／ｋｇ／日）群）に誘導された。ＭＥＤ６４システムによる海馬ＣＡ１モニタリングのｆＥＰＳＰに対する霊芝が与えられたマウスの効果を示す図である。２４時間のリバウンド睡眠後、マウスが犠牲にされ、ｆＥＰＳＰが記録された。そしてＬＴＰが異なる群（対照群、ｎ＝６；断眠群（ＳＤ）、ｎ＝７、霊芝投与（５０ｍｇ／ｋｇ／日）群、ｎ＝５）に誘導された。ＭＥＤ６４システムによる海馬ＣＡ１モニタリングのｆＥＰＳＰに対する霊芝が与えられたマウスの効果を示す図である。４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対し、説明のとおりの霊芝が与えられた。５時間の断眠後、ＬＴＰが異なる群（対照群、断眠群（ＳＤ）、霊芝投与（１２５ｍｇ／ｋｇ／日）群）に誘導された。ＭＥＤ６４システムによる海馬ＣＡ１モニタリングのｆＥＰＳＰに対する霊芝が与えられたマウスの効果を示す図である。２４時間のリバウンド睡眠後、マウスが犠牲にされ、ｆＥＰＳＰが記録された。そしてＬＴＰが異なる群（対照群、ｎ＝６；断眠群（ＳＤ）、ｎ＝７、霊芝投与（１２５ｍｇ／ｋｇ／日）群、ｎ＝５−７）に誘導された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける断眠と受動回避タスクを示す図である。まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して受動回避訓練が行われた。行動セッション（ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌｓｅｓｓｉｏｎ）後、対照群の動物が元のケージに戻され、残りのマウスが５時間全断眠された。断眠時間の後すぐに第１セッションが実行された。このセッションの後、すべての動物が第２試験セッションまで元のケージに戻された。３つの投与量の霊芝抽出物が与えられた断眠マウスの体重と食料摂取量を示す図である。まず、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに３つの投与量（２０、５０、１２５ｍｇ／ｋｇ／日）の霊芝が与えられた。対照群のマウスには普通食が与えられた。霊芝を与える前（１日目）、霊芝投与期間（１〜５日目）、断眠時にマウスの体重が測定された。３つの投与量の霊芝抽出物が与えられた断眠マウスの体重と食料摂取量を示す図である。霊芝投与期間中、食料摂取量が測定された。結果は５つの群間のマウス１匹あたりの体重平均値と食料摂取量で示された。３つの投与量の霊芝抽出物が与えられた断眠マウスの体重と食料摂取量を示す図である。３日間の霊芝投与後の異なる群の訓練セッション。３つの投与量の霊芝抽出物が与えられた断眠マウスの体重と食料摂取量を示す図である。異なる群でマウスが電撃を受けた平均回数。ＳＤ群（ｎ＝１１）、対照群と霊芝投与群（ｎ＝９）。断眠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する受動回避タスクでの霊芝の効果を示す図である。試験セッションで受動回避装置の暗箱に入るときの遅延（平均±ＳＥ）が訓練後に５時間の断眠マウスと元のケージにいたマウス（対照群）ごとに示された。２４時間リバウンド睡眠のデータも示された。対照群と比較して^＃ｐ＜０．００１（スチューデントのＴ検定）。ＳＤ対照群と比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。対照群（ｎ＝１２）、ＳＤ群（ｎ＝１５）、各霊芝投与群（ｎ＝１２）。５時間断眠後の霊芝投与マウスにおけるオートファジー増加を示す図である。８週齢のマウスに異なる濃度（２０、５０、１２５ｍｇ／ｋｇ）の霊芝が４日間投与された。５時間の断眠後、すぐにマウスが犠牲にされた。海馬と皮質が速やかに除去され、溶解された。全溶解物（ｔｏｔａｌｌｙｓａｔｅ）がＬＣ−３発現と切断用にアッセイされた。海馬中の溶解物である。５時間断眠後の霊芝投与マウスにおけるオートファジー増加を示す図である。皮質中の溶解物である。５時間断眠後の霊芝投与マウスにおけるオートファジー増加を示す図である。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアにより見積もられたブロット上のバンドの相対密度における統計結果を示すグラフ。ＬＣ３対ＧＡＰＤＨのタンパク質の相対密度が示されている。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６−８）である。^＊＊ｐ＜０.０１は対照群と比較して統計的有意性が達成されたことを示す。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１は断眠対照群と比較して統計的有意性が達成されたことを示す。２４時間の睡眠リバウンド後の霊芝投与マウスにおけるオートファジー増加を示す図である。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに異なる濃度（２０、５０、１２５ｍｇ／ｋｇ）の霊芝が５日間投与された。２４時間のリバウンド睡眠後、すぐにマウスが犠牲にされた。海馬と皮質が速やかに除去され、溶解された。全溶解物（ｔｏｔａｌｌｙｓａｔｅ）がＬＣ−３発現と切断用にアッセイされた。海馬中の溶解物である。２４時間の睡眠リバウンド後の霊芝投与マウスにおけるオートファジー増加を示す図である。皮質中の溶解物である。２４時間の睡眠リバウンド後の霊芝投与マウスにおけるオートファジー増加を示す図である。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアにより見積もられたブロット上のバンドの相対密度における統計結果を示すグラフ。ＬＣ３対ＧＡＰＤＨのタンパク質の相対密度が示されている。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６−８）である。^＊＊ｐ＜０.０１は対照群と比較して統計的有意性が達成されたことを示す。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１は断眠対照群と比較して統計的有意性が達成されたことを示す。

本発明についてより完全に理解できるように、以下、いくつかの具体的な詳細を説明する。

霊芝試料の準備
乾燥霊芝（Ｌｅｙｓｓ．ｅｘＦｒ．）Ｋａｒｓｔ．を８５％（ｖ／ｖ）エタノールに浸漬し、低分子画分を抽出した（ＭＷ＜１０００ダルトン）。抽出物をロータリー真空エバポレーター内で濃縮し、凍結乾燥した後、使用まで−２０℃で保管した。ＨＰＬＣにより分離された霊芝の小分子抽出物を取得した。ＮｅｕｌｃｏｓｉｌＣ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍｉ．ｄ．５μｍ）を使用して室温下で逆相ＨＰＬＣ分析を行った。移動相は０．１％の含水酢酸（ｖ／ｖ、Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）を含み、３０〜３２％のＢで０〜４０分間、３２〜４０％のＢで４０〜６０分間、４０％のＢで６０〜６５分間、４０〜８２％のＢで６５〜７０分間、８２〜１００％のＢで７０〜８５分間の線形勾配プログラムを使用した。溶出物が２５４ｎｍで監視され、定流量は０．８ｍｌ／分に設定された。ブルカー・ダルトニクス製イオントラップ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ、米国ビレリカ）がＥＳＩインターフェイス経由でアジレント１１００ＨＰＬＣ装置に接続された。ＬＣ溶出物がポストカラム分割比２：１でＥＳＩ源に導入された。衝突ガスとして超高純度ヘリウム（Ｈｅ）、ネブライザーガスとして高純度窒素（Ｎ_２）が使用された。負イオンモードにおいて最適化されたパラメータは、ネブライザー、３０ｐｓｉ；乾燥気体、８Ｌ／分；乾燥温度、３５０℃であった。フルスキャンＭＳ分析用に、ｍ／ｚ５０〜１５００の範囲でスペクトルが記録された。データ依存的分析は、フルスキャンＭＳで最も多い２つのイオンがタンデム質量分析計をトリガーするように設定された（ＭＳ^ｎ、ｎ＝２）。

細胞培養
星状膠細胞豊富化培養が、台湾国立陽明大学の動物センターより入手した生後１日のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから作製された。短時間内に皮質組織がトリプシンで消化された。得られた解離細胞が１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで懸濁され、１００ｍｍの培養皿で培養された。培養３日後、細胞に再度新鮮な１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭが与えられ、さらに３日間３７℃で維持された。細胞はトリプシンで解離された後、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで懸濁され、使用前に１０ｃｍ皿で７〜８日間培養された。この方法で作製された星状膠細胞は、星状膠細胞の特異的マーカーであるグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体での免疫組織化学的染色による判定で約９０〜９５％の星状膠細胞を含有した。神経幹細胞培養が１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから作製された。皮質組織のトリプシン消化により取得された細胞が、１Ｌのローラーボトルに１％のＮ２、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１００g／ｍｌのＢＳＡを含む１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地で７日間懸濁され（２×１０^５細胞／ｍｌ）、ニューロスフェアが形成された。ニューロスフェアが神経幹細胞の特異的マーカーであるネスチンに対する抗体により調べられた。ニューロン・グリア共培養用に、神経幹細胞が分化のため成熟するまで７日間１％のＮ_２と１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地で培養された。ＰＣ１２細胞が１０％の熱不活化ウマ血清と５％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで維持された。すべての培養は５％のＣＯ２／９５％空気の湿った大気中で３７℃に維持された。

ｍＨｔｔ−７４Ｑ発現ＰＣ１２細胞
７４のポリグルタミン繰り返し配列（ｍＨｔｔ−７４Ｑ）を持つＨＤ遺伝子エクソン１フラグメントがＣ末端に融合されたＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む哺乳動物発現ベクターがＤｒ．ＤａｖｉｄＣ．Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ’ｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙより寄贈された。ＰＣ１２安定細胞が、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％の熱不活化ウマ血清、５％のＦＢＳ、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８のＤＭＥＭを含む標準培地中の１００ｇ／ｍｌのハイグロマイシンで３７℃、５％ＣＯ_２で維持された。細胞は１２ウェルプレートにおいて１ウェル当たり２ｘ１０^５で播種され、２００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン２４時間でｍＨｔｔ−７４Ｑ発現が誘導された。導入遺伝子の発現は培地からドキシサイクリンを除去して停止された。細胞は未処理のまま、またはＮＧＦ（１０、５０、１００ｎｇ／ｍｌ）、霊芝−ＡＣＭ（２０、１００、５００μｇ／ｍｌ）、ガノデリン酸Ｃ２−ＡＣＭ（４、２０、１００μｇ／ｍｌ）を投与して遺伝子とタンパク質発現分析用に上述の濃度で２４時間、またはミトコンドリア活性およびｍＨｔｔ−７４Ｑ凝集分析用に４８時間置かれた。その後細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、遠心分離された。細胞は、ｍＨｔｔ−７４ＱのＥＧＦＰ蛍光のＦＡＣＳ分析（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、それに続くＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による１００００イベントの平均蛍光強度分析用に１％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定された、またはリアルタイムＰＣＲ分析用に処理された。蛍光色素であるモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）（Ｓｉｇｍａ）がオートファジー液胞のトレーサーとして使用された。細胞が０．０５ｍＭのＭＤＣを使い３７℃で３０分間染色された。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで４回洗浄された。試料がマウントされ、蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ−７０とＰＯＴ２、米国）を使用し、励起波長３３５ｎｍ、放射（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）５２５ｎｍで分析された。オートファジー活性のレベルを反映する染色の色の強度が、Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ分析システム（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、米国）で測定された。ＭＤＣの斑点を定量化するため、少なくとも４つのランダムな領域がイメージングされ、１細胞当たりの斑点面積の平均数が算出された。

ＲＮＡ抽出とリアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ−ＢｅｅＴＭＲＮＡ抽出試薬（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ、テキサス州フレンズウッド）を使用してＲＮＡが作製された。５μｇのトータルＲＮＡのアリコートがＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用してβ−アクチン、ＮＧＦ、ＰＧＣ−１αの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析用にｃＤＮＡを産生するためにＡＭＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でインキュベーションされた。マウスβ−アクチンの発現レベルが内部参照（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として使用された。相対遺伝子発現レベルが２⁻ΔΔＣＴ法で算出された。１００−２５０−ｂｐフラグメントが各遺伝子について特異的プライマーを使用して増幅された（表１）。

ウェスタンブロット
放射性免疫沈降法アッセイ溶解バッファを使用して細胞溶解液が作製され、約２０μｇのタンパク質がロードされ、ウェスタンブロット分析が行われた。星状膠細胞馴化培地（ＡＣＭ）が霊芝投与２４時間後に収集され、２００×ｇで２０分間遠心分離されて細胞破片が除去された。上清がロード前に凍結乾燥器で２０倍に濃縮された。一次抗体は、マウスＮＧＦペプチドに対する１：１，０００希釈ウサギポリクローナル抗体（アミノ酸４０〜６３）（Ｃａｔｎｏ．ａｂ６１９８、Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）、マウスＬＣ３に対する１：１，０００希釈ウサギポリクローナル抗体（Ｃａｔｎｏ．ＰＭ−０３６、ＭＢＬ、日本）、ローディング対照として使用されたＧＡＰＤＨに対する１：１０，０００希釈抗体（Ｃａｔｎｏ．ａｂ９３８５、Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）が含まれた。抗体結合タンパク質が化学発光検出増強用の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ二次抗体系を使用して染色された（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国バッキンガムシャー）。

ＰＣ１２バイオアッセイを使用した星状膠細胞馴化培地（ＡＣＭ）中のＮＧＦ様タンパク質検出
神経突起形成を評価するため、ＰＣ１２細胞がポリ−Ｄ−リジンコート２４ウェルプレート上に低密度（１ｃｍ^２当たり２×１０^４細胞）でプレートされた。２４時間後、接着性ＰＣ１２細胞がＰＢＳで洗浄され、神経突起形成をモニタリングするために未処理または霊芝投与済みの星状膠細胞培養のいずれかから得た馴化培地でインキュベーションされた（１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで低血清条件を使用）。光学顕微鏡で１群につき８〜１０の画像が撮影され、細胞体の直径を超えた神経突起を備えた細胞の割合（超出神経突起を備えた細胞割合）が１画像当たり１００〜２００細胞を調べることにより分析された。画像は実験条件を知らされていない評価者により分析された。ＡＣＭの作製時、星状膠細胞は２４時間霊芝が投与され、ＰＢＳで洗浄された後、低血清培地（霊芝なし）が与えられた。２４時間後、培地は２００×ｇで２０分間遠心分離されて細胞破片が除去され、上清がＡＣＭとして収集されてすぐに使用された。マウスのＮＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．、Ｌｔｄ、米国）が陽性対照群として使用された。

コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）アッセイ、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒアッセイ及びミトコンドリア／核ＤＮＡ比率
ＰＣ１２またはｍＨｔｔ−７４Ｑ細胞（１ウェル当たり２ｘ１０^４細胞）が９６ウェルプレートにプレートされた。２４時間後、細胞は霊芝ＡＣＭまたはＮＧＦ馴化培地（１ウェル当たり１００μｌ）で４８時間インキュベーションされた。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性が細胞のタンパク質で標準化され（ＢｉｏＲｅｄプロテインキットで測定）吸光度の変化がマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＷａｌｌａｃＶｉｃｔｏｒ２）を使用して測定された。活性は対照群の条件に相対して表された。ＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎＦＭ染色でミトコンドリア含有量が、ＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＲｅｄ（テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ））染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でミトコンドリア膜電位がそれぞれ検出された。細胞は霊芝ＡＣＭまたはＮＧＦ含有培地で２４時間または４８時間インキュベーションされた。細胞は無血清ＤＭＥＭで洗浄され、１００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎＦＭまたはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＲｅｄ（ＴＭＲＭ）で３０分間染色された。未染色の対照群試料が染料を含まない無血清ＤＭＥＭでインキュベーションされたが、染色された試料として同じ濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が使用された。染色後、細胞はＰＢＳで３回洗浄された。染色された細胞が蛍光顕微鏡で検出された。マイクロプレートアッセイに、染色は蛍光マイクロプレートリーダー（励起波長４８５ｎｍ、放射波長５２０ｎｍ）で検出された。染色された（及び未染色の対照群）細胞がフローサイトメトリー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析され、続いてＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による１０，０００イベントの平均蛍光強度の分析が行われた。ミトコンドリア／核ＤＮＡ比率がリアルタイムＰＣＲで分析された。細胞（１ウェル当たり２ｘ１０^５細胞）が１２ウェルプレートにプレートされた。２４時間後、細胞は霊芝ＡＣＭまたはＮＧＦ含有培地で４８時間インキュベーションされた。ゲノムＤＮＡ（ミトコンドリア及び核ＤＮＡの両方を含む）が細胞から抽出された。ＤＮＡ（１０ｎｇ）が定量化リアルタイムＰＣＲで増幅された。プライマーを表１に示す。

動物と３−ＮＰ中毒
台湾国家実験動物センター（ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｅｒ、台湾台北市）から入手した６０匹の１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成熟雄マウスが恒温で飼育され、試験室用普通食（ＰＭＩ、米国ミズーリ州ブレントウッド）と水（自由飲水）が与えられた。実験手順は台湾国立陽明大学の動物研究委員会（ＡｎｉｍａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＮａｔｉｏｎａｌＹａｎｇ−ＭｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔａｉｗａｎ）より承認された。ミトコンドリア毒である３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）（Ｓｉｇｍａ、フランス）（Ｓｔｏｃｋ１０ｍｇ／ｍｌ）がｐＨ７．４で０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解され、濾過された（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．２２μｍ）後、使用まで４℃で保管された。次の若干変更を加えたスケジュールに従い、マウスは１日２回１２時間間隔（毎日午前１０：００と午後１０：００）で３−ＮＰ溶液の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受けた：神経変性プロセスを増加するために最大６００ｍｇ／ｋｇの３−ＮＰ濃度が使用された：２０ｍｇ／ｋｇ×４注射、４０ｍｇ／ｋｇ×４注射、６０ｍｇ／ｋｇ×６注射（合計累積投与量：７日間で６００ｍｇ／ｋｇ）。合計６０匹のマウスは、４つの３−ＮＰ投与群と生理食塩水の投与を受けた対照群の５つの群に分けられた。３−ＮＰにより損傷が誘発された後（８日目）、マウスには普通食または異なる濃度の霊芝（１日２４、６０または１５０ｍｇ／ｋｇ）を含む普通食が１４日間与えられた。

行動スコア
行動が次の基準に従い、０〜５の等級でスコアリングされた。等級０、正常行動；等級１、軽度の後肢障害による全般的な移動の遅さ；等級２、協調運動不全がある明らかな歩行異常；等級３、ほぼ完全な後肢の麻痺；等級４、前肢の障害による移動不能；等級５、横臥または死亡。マウスの行動は実験条件を知らされていない２名の独立した評価者によりスコアリングされた。

ロータロッド実験
ロータロッド実験を使用して各群のマウスの知覚運動能力が検査された。実験の前に、各動物はロータロッド装置上で３日間にわたり３回の連続したセッションで最大１８０秒訓練された。この作業をマスターしなかった動物は実験から除外された。装置は直径５０ｃｍのディスクにより４つの区域に分割された直径６．０ｃｍの棒体を備えている。棒体が１４ｒｐｍと２２ｒｐｍの加速された速度で回転された。各実験では最大実験潜時１８０秒で動物が落下するまで装置上に滞在できた時間が計測された。３回の個別の測定で計測された時間が記録され、平均値が算出された。

組織処理とＧＦＡＰ免疫組織化学
行動実験と２週間の薬物治療の完了後、すべての動物が致死量のペントバルビタールナトリウム（ｉ．ｐ．）で麻酔された。マウスはｐＨ７．４、０．１ＭＰＢＳ中の１０ｍｌの０．９％ＮａＣｌに続いて３０ｍｌの４％パラホルムアルデヒドでかん流された。脳が除去され、同じ固定液に２４時間置かれた。その後０．１ＭＰＢＳ中の３０％のスクロース液に移され、沈むまで置かれた。脳が凍結され、−７０℃で保管され、３０μｍのクリオスタット冠状切片にカットされ、免疫組織化学用に浮遊により収集された。ＧＦＡＰ免疫染色用に、凍結切片が上述のように作成され、ＰＢＳで３回すすいだ後、４％ウシ血清アルブミンでブロックされた。ブロック後、切片は反応性神経膠症の形態学的マーカーであるＧＦＡＰ（１：１０００稀釈、ＮＯＶＯＵＳ、米国リトルトン）を認識する一次モノクローナル抗体を含むトリス緩衝液中で、４℃でオーバーナイト培養された。切片はＰＢＳで３回洗浄され、ペルオキシダーゼブロッキング用に３０分間３％Ｈ_２Ｏ_２でインキュベーションされた。ラビット抗マウスの二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：２００希釈；ＤＡＫＯキット；Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマークグロストルプ）で複合され（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、ジアミノベンジジンが添加された後、切片は実験条件を知らされていない評価者により光学顕微鏡で神経膠症について分析された。

ニッスル染色細胞のカウント
実験後、ニッスル法を使用して線条体区域周囲の細胞密度が分析された。前述の方法が説明のとおり使用された。簡単に言うと、線条体全体のすべての切片がクレシルバイオレットで染色され、光学顕微鏡下で観察された。クレシルバイオレット染色を使用し、神経細胞は豊富な細胞質、多角形形状、少なくとも１つの発生（ｅｍａｎａｔｉｎｇ）プロセスを含む典型的な形態学的特徴を備えた領域において最大の細胞と認められた。一方で星状膠細胞プロファイルが円形の小さい、過色素性の核により神経細胞から区別された。ニッスル（＋）−神経細胞が６つの冠状切片ごとにイメージ上でカウントされ、脳当たり１０切片の平均が実験条件を知らされていない評価者により分析された。２００×２００μｍの視野の１フレームがカウントと測定に使用された。確定された細胞数と分析された各切片内の枠に囲まれた正方形領域を使用してニッスル（＋）−神経細胞の集合密度（ＰＤ）が計算された。次の式が使用された。

そのうち、ＰＤは集合密度（ｍｍ^−２）、Ｎｉはｉ番目の切片でカウントされた神経細胞の数（Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅの式により修正）を指し、ＳＡｉはｉ番目の分析された枠の正方形領域（ｍｍ^２）を指す。データは１群当たり３匹の平均±Ｓ.Ｄ.である。

ＳＤＨ活性の確定
溶媒対照群（ｃｏｎｔｒｏｌｖｅｈｉｃｌｅ）（３−ＮＰ単独または３−ＮＰと霊芝の投与群）の脳組織のＳＤＨ活性が前述のように測定された。各動物からの約２０の切片が０．１ＭＰＢＳ、３７℃で１５分間インキュベーションされ、ＳＤＨが活性化された。切片は大量の０．１ＭＰＢＳで洗浄され、０．３ｍＭのニトロブルーテトラゾリウム、０．０５Ｍのコハク酸ナトリウム、０.０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）により３０分間３７℃でインキュベーションされた。ＳＤＨ活性に無関係の非特異的染色を確定するため、隣接する切片がコハク酸エステルを除いた同じ培地でインキュベーションされた。切片は冷ＰＢＳで５分間すすいだ後、４％パラホルムアルデヒドで固定され、水ですすいでから最後に室温で乾燥された。ＳＤＨ活性のレベルを反映する青色染色の濃さがＩｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓＡｎａｌｙｓｉｓシステム（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、米国ベセスダ）により測定された。円形プローブが関心区域に配置され、組織のその部分の染色の相対的光学密度が測定された（０〜２５５のグレースケール範囲内）。１匹当たり１０の切片（１群当たり３〜４の脳）が実験条件を知らされていない評価者により分析された。

電気生理学実験
約４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスがエーテルにより麻酔され、続いてこれらマウスの脳が取得され、１２２ｍＭのＮａＣｌ、３．１ＫＣＬ、１．１ｍＭのＭｇＳＯ_４.８Ｈ_２Ｏ、１．３ｍＭのＣａＣｌ_２.２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのグルコース、０．４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、２５ｍＭのＮａＨＣＯ_３を含む人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）にすぐに浸漬された。小脳と嗅葉を除去した後、脳の３分の１が保持され、振動型組織スライサー（Ｄ．Ｓ．ＫＭｉｃｒｏｓｌｉｃｅｒ、モデルＤＴＫ−１０００）を使用して脳が３５０μｍのスライスにスライスされた。脳のスライスは脳の損傷部分を回復させるため９５％Ｏ_２と５％ＣＯ_２に保たれたａＣＳＦで２時間保存された。さらに脳のスライスはＭＥＤ６４プローブ（パナソニック；ＭＥＤ−Ｐ５１５ＡＰ）に配置され、デジタル顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＭＩＣ−Ｄ）を使用して適切な位置調整後に脳スライス上の対応する位置が撮影され、マルチチャネル記録システム（パナソニック、ＭＥＤ６４）を使用して脳スライスの電気生理学的反応が記録された。

ＭＥＤ６４（パナソニック）システムは、プローブ、コネクタ、統合型増幅器、Ｌｅｒｆｏｒｍｅｒソフトウェア１．５を搭載しており、プローブの中央に６４の微小電極が配置されていた。各微小電極は５０ｘ５０μｍ^２の大きさで、各電極間の距離は１５０μｍであった。最初の使用前に、プローブは硼酸塩緩衝液（０．１５Ｍ、ｐＨ４．８）中の０．１％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に８時間以上浸漬され、皮膜が形成された。その後、プローブは純水で洗浄され、蒸留水が注入されてパラフィルムで密閉された後、４℃で保管された。

記憶試験
受動回避試験を使用してマウスの海馬に関連付けられる記憶行動が評価された。前記マウスは明箱と暗箱の間に置かれ、マウスは全般的に暗箱に向かって移動した。しかし、マウスが暗箱に入ると、０．５ｍＡの電撃が２秒間連続して加えられ、電撃と暗箱を関連付けるように訓練した。マウスが明箱内に留まる潜時（ｔｉｍｅｌａｔｅｎｃｙ）がマウスの記憶（暗箱内での電撃）を評価する基礎として使用された。明箱内で３００秒を超えたマウスの潜時は記録されなかった。断眠マウスの記憶に対する霊芝の効果が観察・比較された。

マウスにおける睡眠遮断
受動回避試験の完了後、約１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスが睡眠遮断群とケージの中に留まったマウスの対照群に分けられた。これらすべてのマウスが同じ箱に入れられた。断眠群のマウスは合計５時間の断眠が実施された。マウスの眠気状態が主観的に観察され、マウスが眠そうに見えるときにケージを軽く叩いて眠らないようにした。ケージ内には十分な量の水と飼料が提供され、マウスは起きている間ケージ内を自由に移動できた。

統計分析
結果はすべて平均と±標準偏差（ＳＤ）で表された。２つを超える群間の平均の差の有意性は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して確定され、続いてＴｕｋｅｙの事後検定が行われた。スチューデントのｔ検定を使用して対を成す試料の統計的比較が行われた。Ｐ値＜０．０５が統計的有意性ありとみなされた。

ＮＧＦ投与がＨＤ細胞モデルにおけるｍＨｔｔ−７４Ｑ凝集を減少した
ＮＧＦ投与の効果を示すため、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）制御下でハンチントン病（ＨＤ）タンパク質（ｍＨｔｔ−７４Ｑ）を発現している遺伝子細胞モデルが使用された。ＨＤ細胞モデル中のｍＨｔｔ−７４Ｑの含量がＦＡＣＳ分析で特定された。ＮＧＦ投与でｍＨｔｔ−７４Ｑ蓄積の減少が観察された（図１Ａと図１Ｂ）。次に、ＮＧＦがｍＨｔｔ凝集を減少する潜在的メカニズムが調査された。これを達成するため、ＭＤＣ染色とＬＣ３−ＩＩ発現（図１Ｅ）のウェスタンブロット分析を使用してオートファジーの役割が評価された（図１Ｃと図１Ｄ）。ＬＣ３−ＩＩはオートファジーリソソームの特異的マーカーであった。ＮＧＦ投与細胞中ではオートファジー活性が上方制御され、Ｄｏｘ単独投与細胞では活性が若干誘導されたようであった。また、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）凝集の減少がＮＧＦ投与細胞で示された（図１Ａと図１Ｃ）。ＮＧＦ投与細胞ではさらにＥＧＦＰとオートファジー液胞の共局在が特定された。これは少なくとも部分的に、ｍＨｔｔ−７４Ｑ分解にオートファジーが関与したことを示唆している。しかし、Ｄｏｘ細胞単独におけるＭＤＣ−ＥＧＦＰの共局在は効率的でなかった。したがって、より多くの凝集が堆積され、これは輸送認識（ｃａｒｇｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）における欠陥による可能性がある。これらの結果を踏まえ、ＮＧＦによりトリガーされるより効率的なオートファジープログラムがより多くの分解とより少ない凝集形成を通じた細胞内のｍＨｔｔ凝集の減少につながったという見方が支持される。

一次星状膠細胞培養において霊芝がＮＧＦ発現を刺激した
外因性ＮＧＦは血液脳関門を通過できないため、臨床的利用が制限されており、内因性星状膠細胞のＮＧＦ誘導因子、霊芝の効果がテストされた。霊芝の投与後、ＲＴ−ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲ分析での測定によると、星状膠細胞はＮＧＦｍＲＮＡの発現において投与量依存的な増加を示した（図２Ａ）。霊芝の投与は細胞内ＮＧＦタンパク質発現も上方制御した（図２Ｂ）。ＮＧＦ誘導がＮＧＦ放出の増加を伴うか否かを調べるため、異なる濃度の霊芝が投与された星状膠細胞からの２４時間の馴化培地でのＮＧＦレベルが分析された。結果によると、霊芝の投与が培地に放出されるＮＧＦのレベルを投与量依存的に増加させることが示された（図２Ｃ）。このため、霊芝は星状膠細胞におけるＮＧＦの合成と分泌の両方を増強した。一次星状膠細胞培養におけるＮＧＦ発現に対する霊芝の効果の特異性を図３に示す。ＰＣ１２細胞が霊芝投与星状膠細胞（霊芝ＡＣＭ）から馴化培地でインキュベーションされたとき、神経突起形成活性が刺激された（図４Ａと図４Ｂ）。神経突起形成に対するＮＧＦの特異的活性は、５００μｇ／ｍｌの霊芝ＡＣＭとＮＧＦ特異的抗体でのＰＣ１２細胞との共インキュベーションによりブロックされた（図４Ａと図４Ｃ）。

ｍＨｔｔ−７４Ｑ発現ＨＤ細胞モデルにおける霊芝の効果
ハンチントン病細胞モデルにおけるｍＨｔｔ−７４Ｑ含量（ｍＨｔｔ−７４Ｑを発現する細胞）がＦＡＣＳ分析により特定された。霊芝ＡＣＭ投与が細胞におけるｍＨｔｔ−７４Ｑ凝集を減少した（図２Ｄと図２Ｅ）。霊芝ＡＣＭ投与はＭＤＣ密度（図２Ｆ）とＬＣ３−ＩＩ発現（図２Ｇ）も増強した。

霊芝のＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ分析：異なるガノデリン酸の特定とＮＧＦ刺激および神経突起形成活性に対するそれらの効果
霊芝のエタノール抽出物内の活性成分を特定するためにＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳが実施された。逆相ＨＰＬＣ分析を使用して霊芝のフィンガープリントが取得された。図５Ａに霊芝のエタノール抽出物のＨＰＬＣ−ＵＶプロファイルを示す。最適な抽出効率と良好な分離を得るために、抽出条件とクロマトグラフ条件が最適化された。粗抽出物中のトリテルペノイドの分析に、正／負イオンＥＳＩ−ＭＳが使用され、分子質量情報が取得された。霊芝のエタノール抽出物から６つの分画が推測され、構造が特定された（図５Ｂ）。これら抽出物すべての活性が星状膠細胞におけるＮＧＦｍＲＮＡ誘導と神経突起形成アッセイの手段でテストされた（図５Ｃと図５Ｅ）。活性を５０％増加するために必要とされる分画濃度を決定することにより有効性が追跡された（ＥＣ１．５）（図５Ｄと図５Ｆ）。ＮＧＦの刺激と神経突起形成活性はガノデリン酸Ｃ_２が豊富な分画中で特に際立った。

ｍＨｔｔ−７４Ｑ発現ＨＤ細胞モデルにおけるガノデリン酸Ｃ_２の効果
ハンチントン病細胞モデルにおけるｍＨｔｔ−７４Ｑ凝集を減少するためにガノデリン酸Ｃ_２−ＡＣＭ投与が観察された（図５Ｇと図５Ｈ）。ＭＤＣ染色（図５Ｉ）とＬＣ３−ＩＩ発現のウェスタンブロット分析（図５Ｊ）の手段で、ガノデリン酸Ｃ_２−ＡＣＭ投与細胞におけるオートファジー活性の上方制御が示された。

３−ＮＰ誘導マウス線条体変性に対する霊芝の効果
３−ＮＰモデル中のＮＧＦの神経保護的効果が観察されたため、このモデルを使用して生体内における霊芝の治療的効果がさらに評価された。前述の方法に若干の変更を加え、神経変性プロセスを増加するために６００ｍｇ／ｋｇまでの３−ＮＰ濃度が使用された。３−ＮＰにより損傷が誘発された後（８日目）、マウスには異なる濃度（２４、６０、または１５０ｍｇ／ｋｇ）の霊芝を含む食事が１４日間与えられた。図６Ａに示すように、３−ＮＰは中毒後８日目に重度の姿勢異常を誘発し、霊芝を含む食事が与えられた（６０ｍｇ／ｋｇと１５０ｍｇ／ｋｇの霊芝が１４日目にそれぞれ与えられた；２４ｍｇ／ｋｇの霊芝が２１日目に与えられた）マウスは行動スコアの早期回復を示した。マウスの知覚運動機能の回復を評価するためにロータロッド実験が１４日目と２１日目に行われたとき、３−ＮＰ投与対照群マウス（機能が損なわれたままであった）と比較して、１４日目の６０及び１５０ｍｇ／ｋｇの濃度、２１日目の２４ｍｇ／ｋｇの濃度による霊芝の投与によりパフォーマンスが改善された（図６Ｂと図６Ｃ）。このため、３−ＮＰ投与対照群の動物と比較して霊芝の投与は行動的欠陥を改善した。３−ＮＰにより誘発された神経毒性からの回復に対する霊芝の有効性が、マウスの脳の冠状切片のニッスル、ＧＦＡＰ、ＳＤＨ染色を使用して霊芝投与の終わりに検査された（図６Ｄ）。図６Ｄに、３−ＮＰ単独投与と、３−ＮＰに続いて３つの異なる投与量の霊芝の投与を受けたマウスの代表的画像を示す。３−ＮＰ単独が投与された動物は線条体神経細胞の明らかな喪失を示したが、霊芝を与えた群は線条体における神経細胞の喪失が少なかった。さらに、２４〜１５０ｍｇ／ｋｇの霊芝を含む食事は３−ＮＰに誘発された線条体神経細胞の喪失に対して投与量依存的な効果を示した。図６Ｅにニッスル染色からの神経細胞の定量化を示す。霊芝を含む食事の大きな神経保護的効果が観察された。また、霊芝を含む食事は３−ＮＰにより誘発されたＧＦＡＰ過剰活性化も弱毒化した。損傷を受けた線条体の領域周辺には、３−ＮＰ単独の投与を受けた群のほうが３−ＮＰと霊芝の投与を受けた群よりも多くのＧＦＡＰ陽性星状膠細胞があった。３−ＮＰは生体内におけるＳＤＨの不可逆阻害剤としてよく知られている。図６Ｄと図６Ｆに示すように、３−ＮＰの投与は、対照群と比較して、３−ＮＰ単独投与を受けたマウスの脳におけるＳＤＨ活性の大幅な阻害を誘発した。しかし、霊芝の投与は３−ＮＰにより誘発されたＳＤＨ活性の阻害を緩和した。まとめると、神経細胞カウントの結果とＧＦＡＰ及びＳＤＨ活性アッセイからのデータを組み合わせると、霊芝は３−ＮＰにより誘発された動物における線条体損傷に対して神経保護的効果を提供したことが示された。霊芝投与ありまたはなしの３−ＮＰモデルの線条体から単離されたｍＲＮＡがＮＧＦ発現レベルについて処理された。霊芝を含む食事が与えられたマウスは線条体におけるＮＧＦ発現が大幅に高かった（図６Ｇ）。この増加は、投与量依存的で、６０ｍｇ／ｋｇの霊芝はＮＧＦ発現の刺激が最大であり、対照群と比較して４．５倍増、３−ＮＰ群と比較して７倍増であった。

霊芝が断眠を防止して長期増強を減少した
マウスの実験ではマウスの記憶固定が短時間または長時間の断眠による影響を受ける可能性があることが実証された。５時間断眠法がマウスの海馬の長期増強（ＬＴＰ）に影響を与える可能性があることはよく知られている。ＬＴＰの良好なパフォーマンスは３０分の断眠後でも維持されず、時間経過とともに、マウスのＬＴＰが減少し、長期記憶概況を受けた。

マウスに３日間霊芝が与えられ、４日目の朝に、マウスに断眠が（導入）施された。断眠後、マウスはすべて２４時間自由に眠ることが許可され、その後実験が実施された。

断眠は霊芝を与えられていないマウスと比較して、霊芝を与えられたマウスのＬＴＰに大きな影響を与えないことが観察された。霊芝を与えられたマウスのＬＴＰは１３３．６±７％であったが、霊芝を与えられていないマウスのＬＴＰは１１３．５±５．９％であった。時間経過とともに、ＬＴＰの誘導程度は断眠が実施されなかった対照群のマウス（１４８．５±１６．７％）に近づいた（図８Ａ、図９Ａ、図１０Ａ）。長期記憶を示す可能性のある後期相の長期増強（Ｌ−ＬＴＰ）について、断眠に際し１２５ｍｇ／ｋｇ／日の霊芝が与えられたマウスの群は、表２に示すように、対照群の結果に近い結果（ｐ＝０．００１−０．４）を示した。さらに、表２に示すように、２０ｍｇ／ｋｇ／日と５０ｍｇ／ｋｇ／日の霊芝が与えられたマウスのＬ−ＬＴＰは、それぞれ１２６．９±２２．３％と１２７．６±１８．６％であり、さらに、これら２群のマウスのＬＴＰは断眠群のマウスのそれよりも高かった。加えて、マウスを２４時間自由に睡眠可能とした後、異なる投与群からのマウスのＬＴＰに有意な差はなかった（図８Ｂ、図９Ｂ、図１０Ｂ）。これらの結果は、正常な生理学的条件下で、霊芝はＬＴＰを異常に増強することはない可能性を示している。しかし、断眠による記憶固定への影響など、その他の外部要因が存在するとき、霊芝は記憶障害を防止または回復できる可能性がある。

霊芝がマウス海馬細胞のオートファジー活性を増加させ、断眠による記憶障害を防止または回復させた
受動回避試験訓練を含む断眠モデルが４日目の朝に実施された（図１１）。マウスは受動回避試験訓練前の３日間霊芝が与えられ、この霊芝の投与はマウスが学習に要した時間、またはマウスの訓練回数に影響を与えなかった（図１２Ｃ）。さらに、マウスの体重増加（図１２Ａ）と給餌方法（図１２Ｂ）も霊芝を混合した動物給餌の影響を受けなかった。

訓練完了後、５時間の断眠を経て受動回避試験が実施され、マウスがテストされた。対照群のマウスは暗箱に入ったとき電撃を受けた経験を明確に記憶していないことが観察された（潜時９６±７２．７）（図１４）。しかし、霊芝が与えられた群のマウスは潜時１６０．８±２０．６〜２４２．９±８９．９となり、対照群より悪いが、断眠群よりはよい結果となった。これらの結果は、霊芝が断眠による記憶障害を防止または回復させた可能性があることを示した。

実験後マウスは犠牲にされ、細胞海馬と皮質からオートファジー活性化のエビデンスが調べられた。断眠マウス（図１４）と霊芝が５日間与えられたマウス（図１５）の海馬と皮質を検出するためにウェスタンブロット分析が実施された。細胞オートファジーのレベルはマウスに与えられた霊芝の投与量に依存し（０．９±０．３８〜１．６３±０．４９）、ＬＣ３−ＩＩのレベルはマウス皮質の異なる群間で統計的有意差はないことが示された。これらの結果は、霊芝を与えることでマウスの海馬における細胞オートファジーが活性化されたことを示唆している。受動回避試験では海馬が動物行動における記憶の形成に関与していることが示されている。このため、海馬における細胞オートファジーの活性化が記憶固定に関与していることが観察された。

前述の説明は本発明の特徴及び機能について例示したのみであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者であれば本発明の要旨と原則に基づいた前述の説明におけるあらゆる相等の変更や変化は添付の請求項の範囲内に含まれることが明白であろう。

Claims

オートファジー異常を有する被験者においてオートファジーを誘導する方法であって、前記被験者に治療有効量の霊芝抽出物を投与する工程を含み、ここで、前記オートファジーが前記被験者におけるタンパク質凝集の分解を増強することを特徴とする、方法。
前記オートファジー異常が、前記被験者においてタンパク質凝集を発現する細胞に存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記被験者の前記細胞が神経細胞またはグリア細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
前記タンパク質凝集が、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、それらの変異型及び突然変異型、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される凝集であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記オートファジー異常が、神経変性疾患、クローン病、加齢、心臓病および肝臓病からなる群より選択される１つの疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記神経変性疾患が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および不眠症からなる群より選択される１つの疾患であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
前記霊芝抽出物が前記被験者に経口投与されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
オートファジー異常を有する被験者において神経成長因子（ＮＧＦ）を活性化させる方法であって、前記被験者においてＮＧＦによりオートファジーを活性化させる工程を含み、ここで、前記オートファジーが前記被験者におけるタンパク質凝集の分解を増強することを特徴とする、方法。
前記被験者に治療有効量の霊芝抽出物を投与する工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
前記オートファジー異常が、前記被験者においてタンパク質凝集を発現する細胞に存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
前記タンパク質凝集が、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、それらの変異型及び突然変異型、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される凝集であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
被験者における記憶障害を予防する方法であって、前記被験者に治療有効量の霊芝抽出物を投与する工程を含み、ここで、前記霊芝抽出物が前記被験者におけるオートファジーを活性化することを特徴とする、方法。
前記霊芝抽出物が神経成長因子（ＮＧＦ）を誘導し、前記被験者における前記オートファジーを活性化させることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
前記オートファジーが、前記被験者におけるタンパク質分解を増強することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
前記被験者がオートファジー異常を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
前記オートファジー異常が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および不眠症からなる群より選択される神経変性疾患であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
オートファジー異常を有する被験者においてオートファジーを誘導するための組成物であって、１つ以上のガノデリン酸と薬学的に許容される担体を含む、組成物。
前記ガノデリン酸が、ガノデリン酸Ｃ２、ガノデリン酸Ａ、ガノデリン酸Ｈ、ガノデレン酸Ｄ、ガノデレン酸Ｄおよび１２−アセトキシガノデリン酸Ｆからなる群より選択される１つ以上である、請求項１７に記載の組成物。