JP2012525429A - 神経保護性マンネンタケ組成物およびその使用法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、マンネンタケエキスの投与を含む、神経変性障害、例えばパーキンソン病およびアルツハイマー病を治療する方法を提供する。本発明はまた、ミクログリア細胞にマンネンタケエキスを適用することにより該細胞の活性化を阻害する方法も提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、2009年4月29日に出願された米国仮出願第61/173,802号の恩典を主張し、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
本願は、2009年4月29日に出願された米国仮出願第61/173,802号の恩典を主張し、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
発明の背景
パーキンソン病（PD）はよく知られた神経変性疾患であり、動作緩徐、筋固縮、安静時振戦および平衡障害を引き起こす。多くの患者はこの疾患の進行に伴い、不安、うつ、便秘、認知症等の非運動症状を発症する。
パーキンソン病（PD）はよく知られた神経変性疾患であり、動作緩徐、筋固縮、安静時振戦および平衡障害を引き起こす。多くの患者はこの疾患の進行に伴い、不安、うつ、便秘、認知症等の非運動症状を発症する。
PDの症状を軽減する薬は存在するものの、これらの薬の常用はPDの進行を阻止する効果はなく、かつ消耗性の副作用と関連している。したがって、神経変性の進行の遅延さらには停止を目的とする神経保護療法を開発することに大きな関心が寄せられている。
残念ながら、PD等の神経変性障害の発病機序に関する知識不足により、効果的な神経保護療法の開発が阻まれている。PDにおける神経変性の原因となる病因および発病機序は未知のままである。いくつかの証拠の軌跡が、進行性神経変性に至る事象のカスケードにミクログリアの活性化および炎症のプロセスが関与しているとの説を支持している（Kreutzberg, G. W., 1996, Trends Neurosci., 19: 312-318; Miller, G., 2005, Science, 308: 778-781（非特許文献1および2））。PD患者の黒質における変性ニューロン近傍には多くの活性化ミクログリアが存在する（McGeer, P. L. et al., 1988, Neurology, 38: 1285-1291（非特許文献3））。
ミクログリアは、中枢神経系における常在性かつ生得性の免疫細胞であり、神経炎症プロセスにおいて重要な役割を果たしている。ミクログリアは二つのメカニズムを通じて活性化され得、神経毒性をもたらす（Block, M. L. et al., 2007, Nat. Rev. Neurosci., 8: 57-69（非特許文献4））。第一にミクログリアは、炎症トリガー、例えばLPSおよびその他の毒素を認識し（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurochem., 81: 1285-1297（非特許文献5））、活性化され、神経毒性の炎症促進因子およびサイトカインを産生することによって、ニューロン損傷を開始し得る。その後、これらの因子はDAニューロンの抗酸化物質を枯渇させ得、ミトコンドリア機能を損なわせ得、グルタミン酸塩の再取り込みを阻害し得（Persson, M. et al., 2005, Glia, 51: 111-120（非特許文献6））、CNS組織損傷を開始させ得る（Taupin, V. et al., 1997, European Journal of Immunology, 27: 905-913（非特許文献7））。加えて、サイトカイン、例えばTNF-αは、他の静止ミクログリアを活性化し得、これが炎症反応を亢進し、それによってROS、NOおよびスーパーオキシドラジカルの自己インプリケーション（auto-implication）が生じ、高酸化性の過酸化亜硝酸種を形成する（Mosley, R. L. et al., 2006, Clin. Neurosci. Res., 6: 261-281; Tansey, M. G. et al., 2007, Exp. Neurol., 208: 1-25（非特許文献8および9））。SNにおけるTNF依存的なミクログリアの活性化は、NADPHオキシダーゼの活性化を通じて酸化ストレス環境を生み出す（Mander, P. K. et al., 2006, The Journal of Immunology, 176: 1046-1052（非特許文献10））。
IL-1βは、血液脳関門を破壊し白血球によるCNSへの浸潤を促進することを通じてCNS炎症の進展に関与することが示されている（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurochem., 81: 1285-1297; Wen, L. L. et al., 2007, Exp. Neurol., 205: 270-278（非特許文献5および11））。NOは膜透過性であり、過剰に蓄積されたNOはスーパーオキシドと反応して過酸化亜硝酸を形成し、これはタンパク質、脂質およびDNAを攻撃および修飾でき、かつ抗酸化防御を枯渇させることができる（Persson, M. et al., 2005, Glia, 51: 111-120; Taupin, V. et al., 1997, European Journal of Immunology, 27: 905-913（非特許文献6および7））。多くのミクログリア由来ROS、例えばスーパーオキシドは効果的に細胞膜を横断することができないため、これらの細胞外ROSがドーパミン作動性ニューロンに過剰に侵入してニューロン内有毒事象を誘発する可能性は低いが；スーパーオキシドは細胞外空間でNOと迅速に反応でき、かつ近傍のニューロンの細胞膜を容易に横断できかつ細胞内成分を損傷するより安定な酸化性物質を形成する（Mosley, R. L. et al., 2006, Clin, Neurosci. Res., 6: 261-281（非特許文献8））。
これら因子はすべて、鍵となる転写因子NF-κBを活性化し、NF-κBはアポトーシス促進遺伝子を上方制御してニューロン死を誘導できる（Baeuerle, P. A. and Heknel, T., 1994, Annu. Rev. Immunol., 12: 141-179; Delhase, M. et al., 2000, Nature (London), 406: 367-368（非特許文献12および13））。
第二に、ミクログリアはニューロン損傷に反応して過剰に活性化され得、それによって隣接ニューロンに対して有毒性となり（Block, M. L. and Hong, J. S., 2005, Prog. Neurobiol., 76: 77-98; Teismann, P. et al., 2003, Mov. Disord., 18（非特許文献14および15））、ニューロン死の永続的な連鎖をもたらす。
いくつかの研究は、損傷したDAニューロンがマトリックスメタロプロテイナーゼ3（MMP3）（Kim, Y. S. et al., 2005, J. Neurosci., 25: 3701-3711（非特許文献16））、α-シヌクレイン（Zhang, W. et al., 2005, The FASEB Journal, 19: 533-542（非特許文献17））およびニューロメラニン（Kim, Y. S. et al., 2005, J. Neurosci., 25: 3701-3711; Zecca, L. et al., 2003, Trends Neurosci., 26: 578-580（非特許文献16および18））を放出することを明らかにしており、これらはミクログリアを活性化し、かつPDにおける神経変性に関与していると考えられている。これらの事象はすべて、進行性の神経変性に至る悪循環を形成する（図9）。
マンネンタケ（Ganoderma lucidum）は、健康促進のための代替医薬として広く使用されている。マンネンタケから抽出された成分は、免疫調節、炎症抑制およびフリーラジカル除去等の薬理学的作用を有することが研究により示されている。さらに、マンネンタケエキスは抗腫瘍効果を有することが開示されている（例えば米国特許第6,613,754号；同第7,135,183号（特許文献1および2））。
しかし、マンネンタケが外因的または内因的刺激に対するミクログリア細胞の炎症反応を軽減し、かつ／またはドーパミン作動性ニューロンの変性に対する保護を与え得ることはこれまで報告されていない。
Kreutzberg, G. W., 1996, Trends Neurosci., 19: 312-318
Miller, G., 2005, Science, 308: 778-781
McGeer, P. L. et al., 1988, Neurology, 38: 1285-1291
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Persson, M. et al., 2005, Glia, 51: 111-120
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Mosley, R. L. et al., 2006, Clin. Neurosci. Res., 6: 261-281
Tansey, M. G. et al., 2007, Exp. Neurol., 208: 1-25
Mander, P. K. et al., 2006, The Journal of Immunology, 176: 1046-1052
Wen, L. L. et al., 2007, Exp. Neurol., 205: 270-278
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Delhase, M. et al., 2000, Nature (London), 406: 367-368
Block, M. L. and Hong, J. S., 2005, Prog. Neurobiol., 76: 77-98
Teismann, P. et al., 2003, Mov. Disord., 18
Kim, Y. S. et al., 2005, J. Neurosci., 25: 3701-3711
Zhang, W. et al., 2005, The FASEB Journal, 19: 533-542
Zecca, L. et al., 2003, Trends Neurosci., 26: 578-580
概要
本発明は、マンネンタケエキスを用いて神経変性障害、例えばパーキンソン病（PD）を治療するための材料および方法を提供する。本発明により、マンネンタケエキスが神経保護性であることが見出された。特定の態様において、本発明に従い、マンネンタケエキスを、ミクログリアの活性化を阻害するために使用することができる。
本発明は、マンネンタケエキスを用いて神経変性障害、例えばパーキンソン病（PD）を治療するための材料および方法を提供する。本発明により、マンネンタケエキスが神経保護性であることが見出された。特定の態様において、本発明に従い、マンネンタケエキスを、ミクログリアの活性化を阻害するために使用することができる。
一つの態様において、マンネンタケエキスの保護効果は、LPS、およびMPP+に曝露された細胞膜の両方によるミクログリア由来毒性因子（NO、TNF-α、IL-1βおよびスーパーオキシド）の産生を阻害するマンネンタケの能力に起因する。したがって、マンネンタケは、本発明に従い、神経変性障害の治療に使用することができる。
一つの局面において、本発明は、黒質におけるミクログリアの活性化を阻害する方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、そのような治療を必要とする被験体に対する有効量のマンネンタケエキスの投与を含む。
有利なことに、マンネンタケの副作用は最小限であり、よってこれは、ヒトにおける長期的使用に適したものとなっている。
したがって、本発明は、神経変性障害に罹患した患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量のマンネンタケエキスを投与する工程を包含する方法を提供する。
配列の簡単な説明
配列番号:1は、本発明によるインターロイキン-1β（IL-1β）のフォワードプライマーである。
配列番号:1は、本発明によるインターロイキン-1β（IL-1β）のフォワードプライマーである。
配列番号:2は、本発明によるインターロイキン-1β（IL-1β）のリバースプライマーである。
配列番号:3は、本発明による腫瘍壊死因子α（TNF-α）のフォワードプライマーである。
配列番号:4は、本発明による腫瘍壊死因子α（TNF-α）のリバースプライマーである。
詳細な説明
本発明は、マンネンタケエキスを用いて神経変性障害を治療するための材料および方法を提供する。本発明により、マンネンタケエキスが神経保護性であることが見出された。特定の態様において、マンネンタケエキスは、本発明に従い、神経変性障害、例えばパーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）を治療するためおよび／またはミクログリアの活性化を阻害するために使用することができる。
本発明は、マンネンタケエキスを用いて神経変性障害を治療するための材料および方法を提供する。本発明により、マンネンタケエキスが神経保護性であることが見出された。特定の態様において、マンネンタケエキスは、本発明に従い、神経変性障害、例えばパーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）を治療するためおよび／またはミクログリアの活性化を阻害するために使用することができる。
一つの態様において、マンネンタケエキスの保護効果は、マンネンタケがミクログリア由来毒性因子の産生を阻害できることに起因する。これらの因子は、例えば、NO、TNF-α、IL-1βおよび／またはスーパーオキシドであり得る。活性化されたミクログリアは神経変性の原因と考えられるので、したがって、マンネンタケエキスは、本発明に従い、神経変性障害の治療に使用することができる。
一つの局面において、本発明は、黒質におけるミクログリアの活性化を阻害する方法を提供する。好ましい態様において、本発明の方法は、そのような治療を必要とする被験体に対する有効量のマンネンタケエキスの投与を含む。
したがって本発明は、神経変性障害に罹患した患者を治療するための方法であって、該患者に有効量のマンネンタケエキスを投与する工程を包含する方法を提供する。
有利なことに、マンネンタケの副作用は最小限であり、よってこれは、ヒトにおける長期的使用に適したものとなっている。マンネンタケエキスは、例えば、熱湯抽出およびアルコール抽出により調製できる。
一つの態様において、マンネンタケエキスは、低温抽出によりメタノールを用いてマンネンタケの子実体から得られる。特定の態様において、多糖の収率は、マンネンタケの子実体に対して約0.6%（w/w）であり、エルゴステロールの収率は約0.35%（w/w）である。
本発明により、マンネンタケエキスは、ミクログリア由来のNO、TNF-α、IL-1βおよびスーパーオキシドの産生を減少させることによりミクログリアの活性化を有意に阻害することが見出された（図3、4および5）。マンネンタケは、ミクログリアの活性化により誘導されるNO、TNF-α、IL-1βおよびスーパーオキシドのレベルを、濃度依存的な様式で低下させた。マンネンタケに起因するミクログリア阻害は、TNF-αおよびIL-1βの産生を低下させる能力と整合するTNF-αおよびIL-1βのmRNA発現によって、さらに確認された。
ミクログリア活性化の阻害に加えて、マンネンタケは、ミクログリアにより誘導される神経変性を妨害することによりドーパミン作動性ニューロンを保護するためにも使用することができる。PDにおいて、黒質細胞の変性は、環境中または内因性の毒性反応により開始され得るミクログリアの活性化と関連しているかまたはミクログリア活性化が先行することすらある。（LPSにより誘導される）ミクログリア活性化は神経変性を開始させ得、かつミクログリアはMPP+により誘導されるドーパミン作動性神経変性を悪化させ得る。有利なことに、マンネンタケの使用によりミクログリアに起因する損傷が好転し、DAの取り込みが有意に増加した（図７および８）。MPP+モデルにおいて、マンネンタケの保護機能は、ニューロン・グリア共培養物またはMES 23.5細胞共培養物で違いがなかった。
したがって、本発明は、有効量のマンネンタケエキスを投与することによりミクログリアの活性化を阻害する方法を提供する。好ましくは、ミクログリア細胞と接触するマンネンタケエキスの濃度は100μg/ml超であり、より好ましくは200μg/ml超であり、最も好ましくは400μg/ml超である。
本発明はさらに、神経変性障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量のマンネンタケエキスを投与する工程を包含する方法を提供する。
本発明による治療を受けることのできる患者は、哺乳動物を含む、マンネンタケエキスによる治療が提供される任意の生物である。開示される化合物および治療方法の恩恵を享受できる哺乳動物種には、類人猿、チンパンジー、オラウータン、ヒト、サル；ならびに家畜（すなわちペット）、例えばウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットおよびハムスターが含まれるがこれらに限定されない。有利なことに、本発明は、保護目的のためまたは発症した疾患および状態の治療のために長期的に使用できる。
本発明に従いマンネンタケエキスを用いて治療できる変性疾患、障害および状態の例には、神経学的および神経変性性の疾患および状態、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、末梢性ニューロパシー、帯状疱疹、脳卒中、外傷性障害；脳神経外科の様々な神経変性事象；統合失調症、てんかん、ダウン症候群およびターナー症候群が含まれるがこれらに限定されない。
本発明により治療可能な上記の疾患および状態の列挙は、網羅または限定を意図しておらず、そのような神経変性疾患および障害の一例として示されている。
本発明の別の局面は、マンネンタケエキスを含む組成物を提供する。該組成物はまた、薬学的に許容できる担体、添加剤または賦形剤も含み得る。マンネンタケエキスと他の成分の比率は、該エキスの溶解度および化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な治療手順により決定される。
治療有効量は、治療される状態、その重篤度、採用する治療計画および使用する剤の薬理動態ならびに治療される患者により異なる。
本発明のマンネンタケエキスは、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従い製剤化することができる。製剤化は、当業者に周知かつ容易に入手可能な多くの情報源に記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science (Martin E W [1995] Easton Pa., Mack Publishing Company, 19th ed.)には、本発明と関連して使用できる製剤化が記載されている。
非経口投与に適した製剤には、例えば、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤および、意図されるレシピエントの血液に対して製剤を等浸透圧にする溶質を含み得る、水性滅菌注射液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含み得る、水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量容器または、多用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供してもよく、かつ注射する際に滅菌担体液、例えば水しか必要としない冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即時調合注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤等から調製され得る。本発明の製剤は、上で具体的に言及された成分に加えて、目的の製剤の種類を考慮しつつ当技術分野において常用されている他の剤も含み得ることを理解されたい。
本発明のマンネンタケエキスはまた、伝統的な漢方医学手法に従って製剤化することもできる。ある疾患、状態または障害の治療に有効な製剤の組成および投与量は、標準的な臨床技術により、その疾患、状態または障害の性質に左右される。
処方量の伝統的漢方薬は、容易に、ヒトまたは動物への投与に適した任意の形態の薬にすることができる。適切な形態には、例えば、チンキ剤、煎剤、乾燥エキスが含まれる。これらは経口的に摂取することもでき、静脈注射を通じてまたは粘膜を通じて適用することもできる。活性成分はまた、カプセル剤、散剤、パレット（pallet）、香錠、坐剤、経口液剤、胃腸用低温殺菌懸濁注射剤、微量または多量の注射剤、凍結粉末注射剤、低温殺菌粉末注射剤などとして製剤化され得る。上記の方法はすべて当業者に公知であり、書籍に記載されており、かつ生薬を用いる医療従事者に広く使用されている。
チンキ剤は、薬草をアルコール溶液、例えばワインまたは蒸留酒に懸濁することによって調製される。一定期間懸濁した後、該液体（アルコール溶液）は、例えば一日二回または三回、毎回ティースプーン一杯分で投与され得る。
煎剤は生薬製剤の一般的な形態である。これは伝統的に素焼き鉢の中で調製されるが、ガラス、エナメル、またはステンレス鋼の容器中でも調製可能である。製剤を一定期間水中に浸漬させた後、沸騰させて、水の量が例えば半分に減るまで煮詰める。
エキスとは、薬草の本質的成分の濃縮物である。典型的には、本質的成分は、適切に選択した溶媒、典型的には水、エタノール／水混合液、メタノール、ブタノール、イソブタノール、アセトン、ヘキサン、石油エーテルまたはその他の有機溶媒に薬草を懸濁することによって、薬草から抽出される。抽出工程はさらに、マセレーション、パーコレーション、リパーコレーション、向流抽出、高速抽出によって、または超臨界（温度／圧力）二酸化炭素抽出によって促進され得る。ろ過により薬草残留物を取り除いた後、抽出液をさらに蒸発させることによって濃縮し、軟エキス（extractum spissum）を得、かつ／または噴霧乾燥、真空オーブン乾燥、流動床乾燥または冷凍乾燥によって、最終的には乾燥エキス（extracum siccum）を得る。軟エキスまたは乾燥エキスをさらに、投与に望ましい濃度まで、適切な液体中で溶解させてもよく、または丸剤、カプセル剤、注射剤等のような形態に加工してもよい。
本明細書中で参照または引用したすべての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明確な開示と相反しない限り、すべての図面および表を含むその全体が参照により組み入れられる。
材料および方法
材料
マンネンタケエキスはPuraPharm Corporation（Guangxi, CN）からの好意により提供いただいた。該エキスは、メタノールおよび低温抽出技術によって子実体から得たものであった。使用したエキスの多糖およびエルゴステリンの含有量を規定した。多糖の収率は、マンネンタケの子実体に対して0.6%（w/w）であり、エルゴステロールは0.35%であった。マンネンタケはリン酸緩衝生理食塩水に溶解させた。細胞培養試薬はGibco（Grand Island, NY）から入手し、[3H]ドーパミン（DA）はPerkinElmer Life Science（Boston, MA）から購入した。リポ多糖およびグリース試薬はSigma（St. Louis, MO）から購入した。ラットCD11bに対するモノクローナル抗体（OX-42）はSerotec（Oxford, UK）から入手した。Diaclone（Besancon, FRA）からラットTNF-α検出用ELISAキットの提供を受け、スーパーオキシドアッセイキットWSTおよびラットIL-1β ELISAキットはそれぞれ、Dojindo、九州、日本およびIBL（群馬、日本）から入手した。リアルタイムPCR試薬はTakara（東京、日本）から提供を受けた。
材料
マンネンタケエキスはPuraPharm Corporation（Guangxi, CN）からの好意により提供いただいた。該エキスは、メタノールおよび低温抽出技術によって子実体から得たものであった。使用したエキスの多糖およびエルゴステリンの含有量を規定した。多糖の収率は、マンネンタケの子実体に対して0.6%（w/w）であり、エルゴステロールは0.35%であった。マンネンタケはリン酸緩衝生理食塩水に溶解させた。細胞培養試薬はGibco（Grand Island, NY）から入手し、[3H]ドーパミン（DA）はPerkinElmer Life Science（Boston, MA）から購入した。リポ多糖およびグリース試薬はSigma（St. Louis, MO）から購入した。ラットCD11bに対するモノクローナル抗体（OX-42）はSerotec（Oxford, UK）から入手した。Diaclone（Besancon, FRA）からラットTNF-α検出用ELISAキットの提供を受け、スーパーオキシドアッセイキットWSTおよびラットIL-1β ELISAキットはそれぞれ、Dojindo、九州、日本およびIBL（群馬、日本）から入手した。リアルタイムPCR試薬はTakara（東京、日本）から提供を受けた。
ミクログリアおよびMES 23.5細胞の培養
ミクログリアは、Laboratory Animal Centerから供給された12〜24時間齢のウィスターラットの脳から単離および精製した（Le, W. D. et al., 2001, J. Neurosci., 21: 8447-8455）。簡単に説明すると、脳を切り出し髄膜を取り除いた後、組織を細断し、37℃で20分間トリプシン（0.1Mリン酸緩衝液中の0.25%トリプシン-EDTA）で消化し、これを熱加工したパスツールピペットで粉砕し、200μMナイロンセルストレーナーを通してろ過した。800rpmで5分間遠心分離した後、組織を、10%ウシ胎仔血清（FBS）を含有するDMEMに懸濁し、75cm2フラスコにフラスコ1つあたり細胞5×105 個/mlの密度で播種した。播種から二週間後、フラスコを180rpmで4時間振盪し、浮遊細胞を回収し、800rpmで5分間遠心分離した。さらなる実験処理のために、これらの細胞を再懸濁し、96ウェルプレートにプレーティングした。
ミクログリアは、Laboratory Animal Centerから供給された12〜24時間齢のウィスターラットの脳から単離および精製した（Le, W. D. et al., 2001, J. Neurosci., 21: 8447-8455）。簡単に説明すると、脳を切り出し髄膜を取り除いた後、組織を細断し、37℃で20分間トリプシン（0.1Mリン酸緩衝液中の0.25%トリプシン-EDTA）で消化し、これを熱加工したパスツールピペットで粉砕し、200μMナイロンセルストレーナーを通してろ過した。800rpmで5分間遠心分離した後、組織を、10%ウシ胎仔血清（FBS）を含有するDMEMに懸濁し、75cm2フラスコにフラスコ1つあたり細胞5×105 個/mlの密度で播種した。播種から二週間後、フラスコを180rpmで4時間振盪し、浮遊細胞を回収し、800rpmで5分間遠心分離した。さらなる実験処理のために、これらの細胞を再懸濁し、96ウェルプレートにプレーティングした。
ドーパミン作動性細胞株MES 23.5はWei-dong Le教授、Department of Neurology, Baylor College of Medicine, Houstonから贈与された。MES 23.5細胞は、ラット胎仔脳細胞とマウスN18TG2神経芽腫細胞の体細胞融合から得られたものである（Crawford, G. D. et al., 1992, J. Neurosci., 12: 3392-3398）。MES 23.5細胞は発生段階のSN緻密帯のニューロンの多くの特性を示し、かつ、このような初期研究にいくつかの利点を、例えば初代培養物よりも高い均質性、ならびにフリーラジカルを介した細胞毒性およびカルシウム依存的な細胞死の両方に対する感受性などを提供する。MES 23.5細胞を、ポリリジンプレコートした24ウェルプレートに104個/cm2の密度で播種し、これを、37℃、95%大気/5% CO2の加湿インキュベーター内、サトー成分（Sato's component）を含むDMEM中で維持した。培養したMES 23.5細胞の一部はミクログリアと共培養した。
反応性ミクログリアとMES 23.5細胞の相互作用を研究するため、ミクログリアおよびMES 23.5細胞を24ウェル培養プレートで共培養した。簡単に説明すると、精製したミクログリアを1×104個/ウェルの密度でプレーティングし、1日後に、MES 23.5細胞を2:1（MES 23.5対ミクログリア）の比で添加した。共培養物を、2%熱不活性化ウシ胎仔血清を含有するサトー馴化培地で維持した。ミクログリアまたはMES 23.5細胞の培養物を個別にまたは一緒に、陽性対照としてのリポ多糖（LPS、0.25μg/ml）、マンネンタケエキス（50〜400μg/ml）またはMES 23.5細胞膜成分（150μg/ml）で24時間処理した（Le, W. D. et al., 2001, J. Neurosci., 21: 8447-8455）。
免疫細胞化学
パラホルムアルデヒドで固定した細胞培養物を以前に記載されたように免疫染色した（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurosci., 22: 782-790）。ミクログリアはモノクローナル抗体OX-42で染色した。簡単に説明すると、細胞培養物を3% H2O2で15分間処理し、次いで適切な正常血清でブロッキングした後、抗体希釈液中で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurosci., 22: 782-790）。適切なビオチニル化二次抗体および次いでABC試薬と共にインキュベートした後、結合した複合体を3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）による発色により可視化した。画像はNikon倒立顕微鏡で記録した。
パラホルムアルデヒドで固定した細胞培養物を以前に記載されたように免疫染色した（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurosci., 22: 782-790）。ミクログリアはモノクローナル抗体OX-42で染色した。簡単に説明すると、細胞培養物を3% H2O2で15分間処理し、次いで適切な正常血清でブロッキングした後、抗体希釈液中で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurosci., 22: 782-790）。適切なビオチニル化二次抗体および次いでABC試薬と共にインキュベートした後、結合した複合体を3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）による発色により可視化した。画像はNikon倒立顕微鏡で記録した。
MES 23.5細胞膜画分の調製
MES 23.5細胞をMPP+ 10μMに24時間曝露した後に、回収して0.25Mスクロース、100mM PBS、1mM MgCl2、1mM EDTAおよび2μMプロテアーゼインヒビターPMSFを含有する緩衝液に入れ、ガラス・テフロンホモジナイザーでホモジナイズした（Le, W. D. et al., 2001, J. Neurosci., 21: 8447-8455）。次に、ホモジネートを8000×gで10分間、4℃で遠心分離し、粗核画分を取り出した。上清を再度、100,000×gで60分間、4℃で遠心分離した。沈殿物をホモジナイズし、培養培地に懸濁し、これをニューロン膜画分として使用した。
MES 23.5細胞をMPP+ 10μMに24時間曝露した後に、回収して0.25Mスクロース、100mM PBS、1mM MgCl2、1mM EDTAおよび2μMプロテアーゼインヒビターPMSFを含有する緩衝液に入れ、ガラス・テフロンホモジナイザーでホモジナイズした（Le, W. D. et al., 2001, J. Neurosci., 21: 8447-8455）。次に、ホモジネートを8000×gで10分間、4℃で遠心分離し、粗核画分を取り出した。上清を再度、100,000×gで60分間、4℃で遠心分離した。沈殿物をホモジナイズし、培養培地に懸濁し、これをニューロン膜画分として使用した。
高親和性[3H]ドーパミン取り込みアッセイ
各ウェル中の細胞を1mlのクレープス・リンガー緩衝液（16mM NaH2PO4、16mM Na2HPO4、119mM NaCl、4.7mM KCl、1.8mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.3mM EDTAおよび5.6mM グルコース；pH 7.4）で洗浄した。次いでこの細胞を、10nM [3H]ドーパミンを含むクレープス・リンガー緩衝液（10μl/ウェル）と共に、37℃で30分間インキュベートした（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurosci., 22: 782-790）。並行して、ドーパミンおよび、ニューロンによる高親和性ドーパミン取り込みのインヒビターである1mMノミフェンシンの両方を添加したウェル（10μl/ウェル）において、ドーパミンの非特異的取り込みを測定した。その後、細胞を氷冷クレープス・リンガー緩衝液（1ml/ウェル）で三回洗浄し、1N NaOH（0.5ml/ウェル）で溶解させた。溶解産物を3mlのシンチレーション液と一晩混合し、放射線をPerkin Elmer 1450LSC Luminescence Counter（Waltham, USA）で測定した。特異的取り込みは、総放射線量に対して非特異的カウントを除算することによって決定した。
各ウェル中の細胞を1mlのクレープス・リンガー緩衝液（16mM NaH2PO4、16mM Na2HPO4、119mM NaCl、4.7mM KCl、1.8mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.3mM EDTAおよび5.6mM グルコース；pH 7.4）で洗浄した。次いでこの細胞を、10nM [3H]ドーパミンを含むクレープス・リンガー緩衝液（10μl/ウェル）と共に、37℃で30分間インキュベートした（Gao, H. M. et al., 2002, J. Neurosci., 22: 782-790）。並行して、ドーパミンおよび、ニューロンによる高親和性ドーパミン取り込みのインヒビターである1mMノミフェンシンの両方を添加したウェル（10μl/ウェル）において、ドーパミンの非特異的取り込みを測定した。その後、細胞を氷冷クレープス・リンガー緩衝液（1ml/ウェル）で三回洗浄し、1N NaOH（0.5ml/ウェル）で溶解させた。溶解産物を3mlのシンチレーション液と一晩混合し、放射線をPerkin Elmer 1450LSC Luminescence Counter（Waltham, USA）で測定した。特異的取り込みは、総放射線量に対して非特異的カウントを除算することによって決定した。
NOアッセイ
NOの生成は、放出されたNO代謝産物（硝酸塩および亜硝酸塩）をグリース試薬で測定することによって定量した（Mayer, A. M., 1998, Medicina (B Aires), 58: 377-385）。LPS/細胞画分に24時間曝露した後、培養培地サンプルを回収し、遠心分離によって無細胞化した。この培地を同量のグリース試薬と共に室温で10分間インキュベートした後、LP-400 ELISAリーダー（Diagnostics Pasteur, Marne-la-Coquette, France）において適切な標準を用い、540nmで吸光度を測定した。
NOの生成は、放出されたNO代謝産物（硝酸塩および亜硝酸塩）をグリース試薬で測定することによって定量した（Mayer, A. M., 1998, Medicina (B Aires), 58: 377-385）。LPS/細胞画分に24時間曝露した後、培養培地サンプルを回収し、遠心分離によって無細胞化した。この培地を同量のグリース試薬と共に室温で10分間インキュベートした後、LP-400 ELISAリーダー（Diagnostics Pasteur, Marne-la-Coquette, France）において適切な標準を用い、540nmで吸光度を測定した。
TNF-α、IL-1βおよびスーパーオキシドアッセイ
サンプルをNOサンプルと同じように調製し、ラットTNF-αキット、ラットIL-1β ELISAキットおよびスーパーオキシドアッセイキットWSTを製造元の指示に従って使用して、これらの因子の産生を決定した。測定は450nmで行った。
サンプルをNOサンプルと同じように調製し、ラットTNF-αキット、ラットIL-1β ELISAキットおよびスーパーオキシドアッセイキットWSTを製造元の指示に従って使用して、これらの因子の産生を決定した。測定は450nmで行った。
RNAの単離およびリアルタイムPCR
総RNAは、RNAprepキットを製造元の説明書に従って使用して初代ミクログリア細胞から抽出した。RNAをランダム9マーでプライミングし、製造元の推奨プロトコルに従いAMV逆転写酵素を用いた逆転写（RT）によりcDNAに変換した（Schell, J. B. et al., 2007, J. Neuroimmunol., 189: 75-87; Liu, B. et al., 2000, J. Pharmacol. Exp. Ther., 293: 607-617）。次いで、得られたcDNAを、20μlの反応液中に終濃度で1×SYBR Green（Molecular Probes）および0.2μMの関心対象のプライマーセットを含むSYBR Premix Ex Taqを用いたリアルタイムPCRに供した。PCR混合物をDNA engine Opticon 2（MJ research; Waltham, MA）で反応させた。最初の10秒間の95℃変性工程の後、95℃で5秒間、60℃で30秒間および80℃で1秒間のサイクルを35回繰り返して反応液を反応させた。反応液から得られた生成物の融点が同等かつ適切であることを確認するため、溶解曲線分析を行った。使用した特異的プライマーを表1に列挙する（Schell, J. B. et al., 2007, J. Neuroimmunol., 189: 75-87）。標的転写産物の定量は、較正曲線に基づき行った。「ハウスキーピング」遺伝子であるβ-アクチンを内部対照遺伝子として標的化した。試験遺伝子のデータを、対応するβ-アクチンのデータにより標準化した。
総RNAは、RNAprepキットを製造元の説明書に従って使用して初代ミクログリア細胞から抽出した。RNAをランダム9マーでプライミングし、製造元の推奨プロトコルに従いAMV逆転写酵素を用いた逆転写（RT）によりcDNAに変換した（Schell, J. B. et al., 2007, J. Neuroimmunol., 189: 75-87; Liu, B. et al., 2000, J. Pharmacol. Exp. Ther., 293: 607-617）。次いで、得られたcDNAを、20μlの反応液中に終濃度で1×SYBR Green（Molecular Probes）および0.2μMの関心対象のプライマーセットを含むSYBR Premix Ex Taqを用いたリアルタイムPCRに供した。PCR混合物をDNA engine Opticon 2（MJ research; Waltham, MA）で反応させた。最初の10秒間の95℃変性工程の後、95℃で5秒間、60℃で30秒間および80℃で1秒間のサイクルを35回繰り返して反応液を反応させた。反応液から得られた生成物の融点が同等かつ適切であることを確認するため、溶解曲線分析を行った。使用した特異的プライマーを表1に列挙する（Schell, J. B. et al., 2007, J. Neuroimmunol., 189: 75-87）。標的転写産物の定量は、較正曲線に基づき行った。「ハウスキーピング」遺伝子であるβ-アクチンを内部対照遺伝子として標的化した。試験遺伝子のデータを、対応するβ-アクチンのデータにより標準化した。
（表１）IL-1βおよびTNF-αの増幅のためのプライマーおよび条件
統計学的分析
データは平均値±S.D.で表した。統計学的有意性は、SPSS 11.5を用いた分散分析（ANOVA）およびその後のLSD事後分析により評価した。p<0.05の値は統計学的に有意であるとみなされた。
データは平均値±S.D.で表した。統計学的有意性は、SPSS 11.5を用いた分散分析（ANOVA）およびその後のLSD事後分析により評価した。p<0.05の値は統計学的に有意であるとみなされた。
本明細書に記載される実施例および態様は例示目的で示されているにすぎないこと、それに鑑みた様々な改良や変形が当業者に示唆されかつ本願の精神および範囲に含まれることを、理解されたい。
実施例1 - LPSおよびMPP+処理したドーパミン作動性細胞膜により誘導されるミクログリアの活性化
神経変性におけるミクログリア活性化のモデルを樹立するため、LPSおよびMPP+で処理したドーパミン作動性細胞膜を、ミクログリア培養物またはドーパミン作動性ニューロン（MES23.5細胞株）とミクログリアとの共培養物のいずれかにおける刺激因子として使用した。
神経変性におけるミクログリア活性化のモデルを樹立するため、LPSおよびMPP+で処理したドーパミン作動性細胞膜を、ミクログリア培養物またはドーパミン作動性ニューロン（MES23.5細胞株）とミクログリアとの共培養物のいずれかにおける刺激因子として使用した。
ミクログリアは、モノクローナル抗体OX-42を用いてCR3補体受容体を染色することによって可視化した。ミクログリア培養物の純度は約95%である。静止ミクログリアは枝分かれした形状または二極もしくは多極の突起のいずれかを示した（図1aおよびb）。活性化ミクログリアはアメーバ状の形態を示した（図1cおよびd）。
多くの神経毒性因子の中でも、NO、TNF-α、IL-1βおよびスーパーオキシドは、ミクログリアの活性化により惹起されるドーパミン作動性神経変性の重要なメディエーターであると考えられる。LPSにより誘導されるミクログリア活性化を、ミクログリア活性化を反映すると数多く報告された二つのサイトカインであるTNF-αおよびIL-1βのレベル、ならびに活性化ミクログリアから放出されるいくつかの活性酸素種（ROS、NOおよびスーパーオキシド）のレベルを測定することによって特徴付けた。
未刺激のミクログリアはいずれのサイトカインもごく微量しか産生しない。LPS（0.25μg/ml）に曝露した後、TNF-αおよびIL-1βのレベルは、ミクログリア培養培地中で6〜11倍増加し、NOおよびスーパーオキシドのレベルは最大5〜11倍上昇した（図2）。
MES 23.5細胞はMPP+処理後にしかミクログリアを活性化しないことから、MPP+処理したMES 23.5細胞膜画分（CF）の活性化効果を試験した。MPP+処理した細胞膜画分（150μg/ml）とのインキュベート後、TNF-αおよびIL-1β産生は有意に4〜10倍増加した（図2）。MPP+膜画分処理したミクログリア培養培地からのNOおよびスーパーオキシドのレベルも測定し、これらが2〜10倍増加したことが分かった（図2）。
MPP+を用いないかまたはマンネンタケで処理した粗膜は、MPP+膜画分と比較して最小の活性化効果しか示さなかった。
実施例2 - マンネンタケはミクログリアに由来する炎症促進因子およびROSの産生を妨害する
ミクログリアは活性化の結果としてサイトカインを産生できる（20〜22）。マンネンタケの神経保護活性の根本的メカニズムを解明するため、ミクログリア由来の炎症性サイトカインおよびROSのレベルに対するマンネンタケの効果を調査した。ミクログリア細胞培養物を異なる量（50〜400μg/ml）のマンネンタケで30分間前処理した後、LPSまたはMPP+処理したCFに曝露した。
ミクログリアは活性化の結果としてサイトカインを産生できる（20〜22）。マンネンタケの神経保護活性の根本的メカニズムを解明するため、ミクログリア由来の炎症性サイトカインおよびROSのレベルに対するマンネンタケの効果を調査した。ミクログリア細胞培養物を異なる量（50〜400μg/ml）のマンネンタケで30分間前処理した後、LPSまたはMPP+処理したCFに曝露した。
図3および4に示されるように、少量（50μg/ml）のマンネンタケは最小の阻害効果しか有さなかったが、多量のマンネンタケ（100〜400μg/ml）による前処理は、濃度依存的な様式で、LPSまたはCFに起因するNOおよびSODの増加を大きく減少させた。
同等の濃度において、マンネンタケはまた、LPSおよびMPP+処理したCFの後のTNF-αおよびIL-1βの放出を有意に減少させた（図5）。
実施例3 - マンネンタケはミクログリアの存在下および非存在下でMPP+により誘導されるドーパミン作動性神経変性に対する保護を与える
炎症媒介性の神経毒性を評価するため、ドーパミン作動性MES23.5ニューロンを、ミクログリア共培養物の非存在下または存在下で100μM MPP+または0.25μg/ml LPSに24時間曝露し、[3H] DA取り込みアッセイを用いて神経毒性を評価した。
炎症媒介性の神経毒性を評価するため、ドーパミン作動性MES23.5ニューロンを、ミクログリア共培養物の非存在下または存在下で100μM MPP+または0.25μg/ml LPSに24時間曝露し、[3H] DA取り込みアッセイを用いて神経毒性を評価した。
MPP+に対する曝露は、MES23.5ニューロン単独の場合には約66%という[3H] DA取り込みの有意な減少をもたらしたのに対し、MES23.5とミクログリアの共培養物の場合には約74%の減少が認められた（図6）。
400μg/mlマンネンタケによる前処理は、MPP+により誘導された[3H] DA取り込みの減少を有意に保護し、ミクログリア共培養物の非存在下および存在下でそれぞれ約35%および38%しか減少させなかった。
実施例4 - マンネンタケはミクログリアの存在下でLPSにより誘導されるドーパミン作動性変性に対する保護を与える
ニューロン・ミクログリア共培養物を0.25μg/ml LPSに24時間曝露すると、[3H] DA取り込みは共培養物と比較して有意に約50%減少した（図7）。400μg/mlマンネンタケによる共培養物の前処理もまた、LPSにより誘導される[3H] DA取り込みの減少を有意に軽減した（マンネンタケ未処理で50%減少に対してマンネンタケ処理で22%減少）。
ニューロン・ミクログリア共培養物を0.25μg/ml LPSに24時間曝露すると、[3H] DA取り込みは共培養物と比較して有意に約50%減少した（図7）。400μg/mlマンネンタケによる共培養物の前処理もまた、LPSにより誘導される[3H] DA取り込みの減少を有意に軽減した（マンネンタケ未処理で50%減少に対してマンネンタケ処理で22%減少）。
実施例5 - マンネンタケはLPSおよびMPP+処理された膜によるTNF-αおよびIL-1β mRNAの発現亢進を阻害する
炎症促進因子の合成は様々なレベルで制御される。転写後、翻訳時および翻訳後のメカニズムが重要な役割を果たしている一方、主要な調節の現場は遺伝子の転写であるようである。TNF-αおよびIL-1βのmRNA発現レベルは対照細胞ではほとんど検出不可能であったが、LPSおよびCFによって有意に増加した。
炎症促進因子の合成は様々なレベルで制御される。転写後、翻訳時および翻訳後のメカニズムが重要な役割を果たしている一方、主要な調節の現場は遺伝子の転写であるようである。TNF-αおよびIL-1βのmRNA発現レベルは対照細胞ではほとんど検出不可能であったが、LPSおよびCFによって有意に増加した。
100〜400μg/mlのマンネンタケによる前処理は、用量依存的な様式でこれらの発現を阻害した。400μg/mlという多量のマンネンタケは90%保護を提供した（図8）。
本明細書に記載される実施例および態様は例示目的で示されているにすぎないこと、それに鑑みた様々な改良や変形が当業者に示唆されかつ本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることを、理解されたい。
Claims (20)
- 神経変性障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に有効量のマンネンタケ（Ganoderma lucidum）エキスを投与する工程を含む、方法。
- マンネンタケエキスがマンネンタケの子実体から低温抽出により得られる、請求項1記載の方法。
- マンネンタケの子実体に対する収率約0.6%（w/w）で多糖が得られる、請求項2記載の方法。
- マンネンタケの子実体に対する収率約0.35%（w/w）でエルゴステロールが得られる、請求項2記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
- 炎症を軽減させる、請求項1記載の方法。
- 炎症が神経炎症である、請求項6記載の方法。
- TNF-αの産生を低下させる、請求項1記載の方法。
- IL-1βの産生を低下させる、請求項1記載の方法。
- 活性酸素種の産生を低下させる、請求項1記載の方法。
- 一酸化窒素の産生を低下させる、請求項1記載の方法。
- スーパーオキシドの産生を低下させる、請求項1記載の方法。
- 神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、末梢性ニューロパシー、帯状疱疹、脳卒中、統合失調症、てんかん、ダウン症候群およびターナー症候群からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 神経変性障害がパーキンソン病またはアルツハイマー病である、請求項13記載の方法。
- 黒質におけるミクログリアの活性化を阻害する方法であって、ミクログリアに有効量のマンネンタケエキスを接触させる工程を含む、方法。
- マンネンタケエキスの有効量が100μg/ml超である、請求項15記載の方法。
- マンネンタケエキスがマンネンタケの子実体から低温抽出により産生される、請求項15記載の方法。
- TNF-αの産生を低下させる、請求項15記載の方法。
- IL-1βの産生を低下させる、請求項15記載の方法。
- マンネンタケエキスおよび医学的に許容できる担体を含む、組成物。
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