JP2016222650A - プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤及びプロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対する新規な細胞増殖抑制剤及び治療剤の提供。
【解決手段】下記式で例示される化合物又はその塩を含む細胞増殖抑制剤及び治療剤。

（Ｒ^１及びＲ^２はＨ又はアルキル基；いずれもアルキル基である場合、Ｒ^１及びＲ^２が結合するＮとともに、又はＮに加えて、Ｏ、Ｓ、及びＮから選ばれる少なくとも１種の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい；ｎは０以上の整数）
【選択図】なし

Description

本発明は、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤及びプロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤に関する。

プロテアソームは、細胞内でタンパク質の分解を行う巨大な酵素複合体であり、ユビキチンにより標識されたタンパク質をＡＴＰ依存的に分解する作用を有する。ユビキチンにより標識されたタンパク質をプロテアソームで分解する系は、ユビキチン−プロテアソームシステムと称され、細胞周期制御、シグナル伝達等の様々な生命活動に関与していることが明らかになっている。

近年、癌細胞内におけるプロテアソームの働きを阻害することにより、癌細胞内に異常タンパク質を蓄積させ、癌細胞を死滅させる抗癌剤の開発が行われている。既に、プロテアソーム阻害剤の一種であるボルテゾミブ（Bortezomib）は、難治性多発性骨髄腫の治療剤として臨床適用されている。また、ボルテゾミブ以外にも、種々のプロテアソーム阻害剤が提案されている。例えば、特許文献１には、タモキシフェン類縁体を有効成分として含有するプロテアソーム阻害剤が開示されている。

特開２００８−９４８３６号公報

ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤は、種々の癌に対して高い細胞増殖抑制作用を示すが、癌の中には、プロテアソーム阻害剤に対して抵抗性を示すプロテアソーム阻害剤抵抗性癌も存在する。また、多くの抗癌剤について、長期投与により癌細胞が抗癌剤に対する耐性（抵抗性）を獲得することが知られている。実際、ボルテゾミブを用いた臨床試験においても、不応例又は耐性例が報告されている。このため、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対しても有効な薬剤の開発が望まれている。

そこで、本発明は、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対する新規な細胞増殖抑制剤及び治療剤を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ 下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤。

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ^１及びＲ^２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ^１及びＲ^２は、Ｒ^１及びＲ^２が結合する窒素原子とともに、又はＲ^１及びＲ^２が結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選ばれる少なくとも１種の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。ｎは０以上の整数を示す。実線及び破線で構成される２ヶ所の２重線は、いずれか一方が単結合を示し、他方が２重結合を示す。）

＜２＞ 下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤。

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ^１及びＲ^２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ^１及びＲ^２は、Ｒ^１及びＲ^２が結合する窒素原子とともに、又はＲ^１及びＲ^２が結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選ばれる少なくとも１種の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。ｎは０以上の整数を示す。実線及び破線で構成される２ヶ所の２重線は、いずれか一方が単結合を示し、他方が２重結合を示す。）

本発明によれば、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対する新規な細胞増殖抑制剤及び治療剤を提供することができる。

ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対して式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ａ、ＲＩＤ−Ｂ、ＲＩＤ−Ｃ、又はＲＩＤ−Ｅ）を作用させた場合における細胞増殖抑制作用を示す図である。 ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対して式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ｆ、ＲＩＤ−Ｇ、又はＲＩＤ−Ｈ）を作用させた場合における細胞増殖抑制作用を示す図である。 ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対してプロテアソーム阻害剤（ＡＬＬＮ又はラクタシスチン）を作用させた場合における細胞増殖抑制作用を示す図である。 マウスの左右の背部皮下にヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を移植した後、９日目から６８日目までの週２回、左背部に式（１）で表される化合物の塩（ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩）を投与し、右背部に生理食塩水を投与した場合の、６８日目におけるマウス背部の腫瘤の外観を示す図である。 ４匹のマウスの左右の背部皮下にヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を移植した後、９日目から６８日目までの週２回、左背部に式（１）で表される化合物の塩（ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩）を投与し、右背部に生理食塩水を投与した場合における腫瘍体積の推移を、平均値±標準誤差で示した図である。 ４匹のマウスの左右の背部皮下にヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を移植した後、９日目から６８日目までの週２回、左背部に式（１）で表される化合物の塩（ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩）を投与し、右背部に生理食塩水を投与した場合の、各マウスにおける腫瘍体積の推移を示した図である（（Ａ）：左背部、（Ｂ）：右背部）。 式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ｂ又はＲＩＤ−Ｄ）のＤＮＡ結合能を示す図である。 ヒト肝臓癌細胞株ＨｕＨ−７に対して式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ｂ）（同図（Ａ））又はジメチルスルホキシド（同図（Ｂ））を作用させた場合におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す図である。

以下、本発明を適用したプロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤及びプロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤の実施形態の一例について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本明細書において「プロテアソーム阻害剤抵抗性癌」とは、プロテアソーム阻害剤に対して抵抗性を示す癌を意味し、抵抗性が内因性であるか獲得性であるかを問わない。「プロテアソーム阻害剤抵抗性癌」の細胞をプロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮ（N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal）又はラクタシスチン（Lactacystin）の存在下で４８時間培養し、ＷＳＴ−１試薬を添加して更に２時間培養した後、細胞の生存率を測定した場合、典型的な例では、細胞の生存率が５０％となるときのＡＬＬＮ又はラクタシスチンの濃度（ＩＣ_５０）は３μＭを超える。
「プロテアソーム阻害剤抵抗性癌」の癌種は特に限定されず、皮膚癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮体及び頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍、白血病等が挙げられる。

本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

＜プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤＞
プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤（以下、単に「細胞増殖抑制剤」ともいう。）は、下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。

式（１）中、Ｒ^１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は、水素原子又はアルキル基を示す。
Ｒ^１又はＲ^２がアルキル基である場合、アルキル基の炭素数は１〜３０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましく、１〜５であることが更に好ましい。アルキル基は、直鎖状及び分岐鎖状のいずれであってもよく、直鎖状であることが好ましい。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。

式（１）において、Ｒ^１及びＲ^２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ^１及びＲ^２は、Ｒ^１及びＲ^２が結合する窒素原子とともに、又はＲ^１及びＲ^２が結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選ばれる少なくとも１種の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。単環式複素環としては、５員環〜７員環が好ましい。単環式複素環の具体例としては、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、アザシクロヘプタン環、ジアザシクロヘキサン環、モルホリン環、チオモルホリン環等が挙げられる。

式（１）中、ｎは０以上の整数を示す。ｎは１〜３０の整数であることが好ましく、１〜１０の整数であることがより好ましく、１〜５の整数であることが更に好ましく、１又は２であることが特に好ましい。

式（１）中、実線及び破線で構成される２ヶ所の２重線は、いずれか一方が単結合を示し、他方が２重結合を示す。すなわち、式（１）で表される化合物には、下記式（１−１）で表される化合物（１，１−ビス置換フェニル−２−フェニル−１−ブテン化合物）と、下記式（１−２）で表される化合物（４，４−ビス置換フェニル−３−フェニル−１−ブテン化合物）とが含まれる。下記式（１−１）で表される化合物はリダイフェン（Ridaifen）とも称され、下記式（１−２）で表される化合物はプロリダイフェン（Proridaifen）とも称される。

上記式（１）で表される化合物の具体例を以下に挙げる。ただし、上記式（１）で表される化合物は、これらの具体例に限定されるものではない。

式（１）で表される化合物は、例えば、特開２００８−９４８３６号公報に記載の方法に従って製造することができる。式（１）で表される化合物は、幾何異性体が存在しないため異性体の分離操作が必要なく、効率的に製造することができる。

式（１）で表される化合物は、特開２００８−９４８３６号公報に記載のとおり、プロテアソーム阻害剤として公知の化合物であるが、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対して、細胞増殖を効果的に抑制することができる。この細胞増殖抑制作用は、プロテアソームの阻害に起因するものではなく、２本鎖ＤＮＡへの結合及びそれに伴うＤＮＡの断片化に起因するものと推測される。したがって、式（１）で表される化合物を用いることにより、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤を製造することができる。細胞増殖抑制剤は、医薬用途に用いるものであってもよく、医薬以外の用途（研究用途等）に用いるものであってもよい。

細胞増殖抑制剤は、式（１）で表される化合物の塩であってもよい。塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩などが挙げられる。

細胞増殖抑制剤は、使用態様に応じて、式（１）で表される化合物又はその塩以外の成分を含有していてもよい。例えば、細胞増殖抑制剤は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、細胞増殖抑制剤は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。

細胞増殖抑制剤を医薬用途に用いる場合、細胞増殖抑制剤の剤形は特に制限されない。細胞増殖抑制剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。

細胞増殖抑制剤を医薬用途に用いる場合、細胞増殖抑制剤の投与量は、投与対象、投与経路、症状等に応じて適宜決定される。

＜プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤＞
プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤（以下、単に「治療剤」ともいう。）は、式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。式（１）で表される化合物及びその塩は細胞増殖抑制剤の場合と同様であるため、詳細な説明を省略する。

前述したように、式（１）で表される化合物又はその塩は、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対して、細胞増殖を効果的に抑制することができる。このため、式（１）で表される化合物又はその塩を用いることにより、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤を製造することができる。
なお、「治療」には、癌を消失又は縮小させることのほか、癌細胞の増殖を抑制すること、癌転移を防ぐこと等も含まれる。

治療剤は、式（１）で表される化合物又はその塩以外の成分を含有していてもよい。例えば、治療剤は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、治療剤は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。

治療剤の剤形は特に制限されない。治療剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。

治療剤の投与量は、投与対象、投与経路、症状等に応じて適宜決定される。

プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤を投与対象者に投与することにより、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療方法が提供される。すなわち、式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含む医薬組成物を投与することを含むプロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療方法が提供される。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

以下の実施例及び参考例では、式（１）で表される化合物として、下記のＲＩＤ−Ａ〜ＲＩＤ−Ｈの８種類の化合物を使用した。これらはいずれもリダイフェンと総称される化合物である。

なお、ＲＩＤ−Ｈを除く７種類の化合物は、特開２００６−１１７６４８号公報の実施例２及び実施例３、並びに特開２００８−９４８３６号公報の実施例１〜実施例４に記載された方法に従って製造した。
また、ＲＩＤ−Ｈは、既報（Makoto Hasegawa et al., European Journal of Medicinal Chemistry, 71, 290-305 (2014)）に従って製造した。ＲＩＤ−Ｈの物性データは以下のとおりである。

1,1-Bis{4-[3-(dipyrrolidin-1-yl)propoxy]phenyl}-2-phenyl-1-butene (RID-H);
Mp: 64-65 ℃;
IR (neat): 3034, 2957, 1605, 1507, 1173, 817 cm^-1;
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.17-7.07 (7H, m, Ar), 6.88-6.86 (2H, m, Ar), 6.76-6.73 (2H, m, Ar), 6.54-6.51 (2H, m, Ar), 4.04 (2H, t, J = 6.50 Hz, OCH₂), 3.88 (2H, t, J = 6.50 Hz, OCH₂), 2.63 (2H, t, J = 7.25 Hz, NCH₂), 2.56-2.45 (12H, m, NCH₂, 3-H and pyrrolidinyl 2-H), 2.02 (2H, tt, J = 7.25, 6.50 Hz, -CH₂-), 1.92 (2H, tt, J = 7.25, 6.50 Hz, -CH₂-), 1.81-1.75 (8H, m, pyrrolidinyl 3-H), 0.92 (3H, t, J = 7.50 Hz, 4-H);
¹³C NMR (CDCl₃): δ 157.7, 156.8 (Ar), 142.7 (1-C), 140.8 (2-C), 137.9, 136.2, 135.7, 131.9, 130.5, 129.7, 127.8, 125.8, 113.9, 113.2 (Ar), 66.30, 66.07 (OCH₂), 54.25, 54.20 (pyrrolidinyl 2-C), 53.22, 53.17 (NCH₂), 29.0 (3-C), 28.95, 28.86 (-CH₂-), 23.43, 23.40 (pyrrolidinyl 3-C), 13.6 (4-C);
HR MS (ESI): calcd for C₃₆H₄₇N₂O₂([M + H]⁺) 539.3638, found 539.3614.

［実施例１：式（１）で表される化合物の細胞増殖抑制作用の確認］
式（１）で表される化合物の細胞増殖抑制作用を確認するため、プロテアソーム阻害剤に対する抵抗性が知られているヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を準備した（S.L. Holbeck et al., Mol. Cancer Ther., 9(5), 1451-1460 (2010)）。
１５％のウシ胎児血清、１００００ユニット／Ｌのペニシリン、１０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、２５μｇ／ＬのアンホテリシンＢ、及び１０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有するマッコイ５Ａ改変培地中、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でＳＫ−ＯＶ−３細胞を培養した。次いで、ＳＫ−ＯＶ−３細胞を１０００個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。２４時間培養した後、式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ａ、ＲＩＤ−Ｂ、ＲＩＤ−Ｃ、ＲＩＤ−Ｅ、ＲＩＤ−Ｆ、ＲＩＤ−Ｇ、又はＲＩＤ−Ｈ）を、終濃度が０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、又は５μＭとなるように各ウェルに添加した。比較のため、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮ又はラクタシスチンを、終濃度が０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、又は１０μＭとなるように各ウェルに添加した。コントロールとしては、式（１）で表される化合物又はプロテアソーム阻害剤の代わりにジメチルスルホキシドを各ウェルに添加した。
その後、４８時間培養し、ＷＳＴ−１試薬（（株）同仁化学研究所）を１ウェル当たり１０μＬ添加して更に２時間培養した。そして、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定することで細胞数を計測し、生存率を求めた。

ＲＩＤ−Ａ、ＲＩＤ−Ｂ、ＲＩＤ−Ｃ、又はＲＩＤ−Ｅを添加した場合のＳＫ−ＯＶ−３細胞の生存率を図１（Ａ）〜（Ｄ）に示す。また、ＲＩＤ−Ｆ、ＲＩＤ−Ｇ、又はＲＩＤ−Ｈを添加した場合のＳＫ−ＯＶ−３細胞の生存率を図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す。また、ＡＬＬＮ又はラクタシスチンを添加した場合のＳＫ−ＯＶ−３細胞の生存率を図３（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１〜図３の生存率は、いずれもコントロールにおける生存率を１００％としたときの相対値である。

図１及び図２に示すとおり、式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ａ、ＲＩＤ−Ｂ、ＲＩＤ−Ｃ、ＲＩＤ−Ｅ、ＲＩＤ−Ｆ、ＲＩＤ−Ｇ、又はＲＩＤ−Ｈ）を添加した場合には、５μＭ未満の濃度でＳＫ−ＯＶ−３細胞の生存率が５０％未満となった。一方、図３に示すとおり、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮを添加した場合には、１０μＭの濃度でもＳＫ−ＯＶ−３細胞の生存率は５２．８％であり、ラクタシスチンを添加した場合には、１０μＭの濃度でもＳＫ−ＯＶ−３細胞の生存率は５４．２％であった。
この結果から分かるように、式（１）で表される化合物は、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌に対しても、細胞増殖を効果的に抑制することができる。

［実施例２：式（１）で表される化合物のin vivoにおける細胞増殖抑制作用の確認］
実施例１と同様にヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を用いて、式（１）で表される化合物のin vivoにおける細胞増殖抑制作用を確認した。
４匹のヌードマウス（Balb/C nu/nu、５週齢）に標準的な飼料及び飲水を与えて７日間飼育した後、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を左右の背部皮下に移植した（１×１０^６個／部位）。移植初日をＤａｙ１とし、Ｄａｙ９からＤａｙ６８までの週２回、腫瘍体積を測定するとともに、生理食塩水に溶解したＲＩＤ−Ｂクエン酸塩（２．５ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ〜２０μＬ、左腫瘍）又は生理食塩水（１０μＬ〜２０μＬ、右腫瘍）を腫瘍内投与した。

Ｄａｙ６８におけるマウス背部の腫瘤の外観を図４に示す。図４から分かるように、生理食塩水を投与した右背部では腫瘤が大きく増大していたのに対し、生理ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩を投与した左背部では腫瘤が顕著に縮小していた。

左背部及び右背部の腫瘍体積の推移を図５及び図６に示す。
図５は、４匹のヌードマウスの左背部及び右背部の腫瘍体積の推移を、平均値±標準誤差で示したものである。図中の矢印は、腫瘍内投与の開始日を示す。測定データについては、反復測定２元配置分散分析（Two-factor repeated measures ANOVA）の後、テューキーの多重比較検定による統計解析を行った。図５から分かるように、ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩を投与することで、腫瘍体積の増大が顕著に抑制された。特にＤａｙ６１以降では、生理食塩水を投与した場合に比べて有意に腫瘍体積の増大が抑制された（ｐ＜０．０５）。

図６（Ａ）は、個々のヌードマウスの左背部の腫瘍体積の推移を示したものであり、図６（Ｂ）は、個々のヌードマウスの右背部の腫瘍体積の推移を示したものである。ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩を投与した４個体のうち３個体では、腫瘍細胞が消失した。比較的大きな腫瘤を形成した１個体についても、ＲＩＤ−Ｂクエン酸塩の継続投与により、腫瘍体積の増大が抑制された。

［参考例１：式（１）で表される化合物のＤＮＡ結合能の確認］
センス鎖として、ＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴ（配列番号１）の塩基配列からなり、５’末端をビオチン修飾した１本鎖ＤＮＡを準備した。また、アンチセンス鎖として、ＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）の塩基配列からなる１本鎖ＤＮＡを準備した。そして、これらの１本鎖ＤＮＡを２５．０℃で３０分間反応させ、ビオチン化２本鎖ＤＮＡを作製した。

ビオチン化２本鎖ＤＮＡ（２μＭ）とＲＩＤ−Ｂ又はＲＩＤ−Ｄ（いずれも１０μＭ）とを、室温で１時間半、遮光下で反応させた。その後、ストレプトアビジン磁気ビーズ（（株）アプロサイエンス）を添加して室温で更に１時間反応させ、ビオチン化２本鎖ＤＮＡとストレプトアビジン磁気ビーズとの複合体を形成させた。複合体を回収し、超純水で３回洗浄した後、１００℃で５分間インキュベートすることにより、ビオチン化２本鎖ＤＮＡに結合したＲＩＤ−Ｂ又はＲＩＤ−Ｄを遊離させた。内標準物質であるベタインを終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように添加した後、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化法飛行時間型質量分析装置）によりＲＩＤ−Ｂ又はＲＩＤ−Ｄとベタインとを検出及び定量することで、式（１）で表される化合物（ＲＩＤ−Ｂ又はＲＩＤ−Ｄ）と２本鎖ＤＮＡとの結合能を評価した。

ＲＩＤ−ＢのＤＮＡ結合率を図７（Ａ）に示し、ＲＩＤ−ＤのＤＮＡ結合率を図７（Ｂ）に示す。図７中、「ＤＮＡ（＋）」はビオチン化２本鎖ＤＮＡを使用した実験群を示し、「ＤＮＡ（−）」はビオチン化２本鎖ＤＮＡの代わりに超純水を使用した実験群を示す。また、図７（Ａ）において「ｎ．ｄ．」は検出限界以下であることを示す。
図７から分かるように、ＲＩＤ−Ｂ及びＲＩＤ−Ｄのいずれも２本鎖ＤＮＡへの結合能を示した。この結果から、式（１）で表される化合物の細胞増殖抑制作用には、２本鎖ＤＮＡへの結合能が関係することが示唆される。

［参考例２：式（１）で表される化合物によるＤＮＡの断片化の確認］
ヒト肝臓癌細胞株ＨｕＨ−７を８ウェルカルチャースライドに４×１０^４個／ウェルとなるよう播種した後、３７℃で２４時間培養した。培養後、ＲＩＤ−Ｂを終濃度が１μＭとなるように各ウェルに添加し、３７℃で更に２４時間培養した。コントロールとしては、ＲＩＤ−Ｂの代わりにジメチルスルホキシドを各ウェルに添加した。
培養後、ＨｕＨ−７細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定した。次いで、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する０．１％クエン酸ナトリウム水溶液を添加し、氷上で２分間インキュベートすることにより浸透化処理を行った。浸透化処理後のＨｕＨ−７細胞は、MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct（（株）医学生物学研究所）を用いて染色し、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７１０、カールツァイス社）によりＴＵＮＥＬ陽性細胞を検出した。

ＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＨｕＨ−７細胞の顕微鏡像を図８（Ａ）に示し、ジメチルスルホキシドを添加した場合のＨｕＨ−７細胞の顕微鏡像を図８（Ｂ）に示す。図８から分かるように、ＲＩＤ−Ｂを添加した場合にはＴＵＮＥＬ陽性細胞が多数検出されたのに対し、ジメチルスルホキシドを添加したコントロールではＴＵＮＥＬ陽性細胞は検出されなかった。この結果から、式（１）で表される化合物の細胞増殖抑制作用には、２本鎖ＤＮＡへの結合に伴うＤＮＡの断片化が関係することが示唆される。

Claims (2)

1. 下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の細胞増殖抑制剤。
   
   （式中、Ｒ^１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ^１及びＲ^２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ^１及びＲ^２は、Ｒ^１及びＲ^２が結合する窒素原子とともに、又はＲ^１及びＲ^２が結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選ばれる少なくとも１種の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。ｎは０以上の整数を示す。実線及び破線で構成される２ヶ所の２重線は、いずれか一方が単結合を示し、他方が２重結合を示す。）
2. 下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、プロテアソーム阻害剤抵抗性癌の治療剤。
   
   （式中、Ｒ^１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ^１及びＲ^２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ^１及びＲ^２は、Ｒ^１及びＲ^２が結合する窒素原子とともに、又はＲ^１及びＲ^２が結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選ばれる少なくとも１種の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。ｎは０以上の整数を示す。実線及び破線で構成される２ヶ所の２重線は、いずれか一方が単結合を示し、他方が２重結合を示す。）