JP2016217956A - 炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのｓ１００ａ９の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 炎症性腸炎（ＩＢＤ）を研究するモデル系において、Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）スコアに代わり得るバイオマーカーを提供する。
【解決手段】炎症性腸疾患のバイオマーカーとして、Ｓ１００Ａ９を使用することで、病態をスコア化したＤＡＩスコアよりも早期に腸の炎症状態を診断することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのＳ１００Ａ９の使用に関するものである。

Ｓ１００ファミリーに属するＳ１００Ａ８およびＡ９の複合体であるカルプロテクチンは、分子量３６，０００のタンパク質である。糞便中のカルプロテクチンを測定することにより、炎症性腸炎疾患（ＩＢＤ）の診断に利用できることから（非特許文献１）、既に糞便中のカルプロテクチン測定キットが海外で製造発売されている（Ｅｕｒｏｓｐｉｔａｌ社、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ社など）。

しかしながら、カルプロテクチンは、ＩＢＤの診断に利用できるものの、必ずしも臨床状態を反映しているとは言い難い面があった。たとえば、実施例に示すように、ＩＢＤの１つである潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のモデルラット糞便中のカルプロテクチンは炎症状態を反映していない。

Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１０；３４１：ｃ３３６９ 第４１回日本毒性学会学術年会 セッションＩＤ：Ｐ−１３６ ２０１４年７月２日〜４日（木村恵人 日精バイリス株式会社）で報告された「デキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス潰瘍性大腸炎モデルの検討」

一般に、ＩＢＤを研究するモデル系においては、主に便の状態を観察してスコア化するＤｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）によって病態の程度が評価されており（非特許文献２）、この手法は生体内の炎症状態を反映する良い方法ではあるものの、便状態を主観的に判断するため、判定する人によりＤＡＩスコアに差が生じやすいことが問題とされていた。

一方、従来、上述したように、カルプロテクチンとＩＢＤとの関係に関しては明示されているものの、カルプロテクチンの構成成分であるＳ１００Ａ９タンパク質とＩＢＤとの関連性は十分に検討されていない。

本発明者は、ＩＢＤを研究するモデル系において、ＤＡＩスコアに代わり得るバイオマーカーを見いだすべく鋭意検討を重ねた結果、Ｓ１００Ａ９タンパク質が、病態をスコア化したＤＡＩスコアよりも早期に、かつ客観的に腸の状態を反映することを見いだし、本発明を完成させた。

従来、ＩＢＤモデルを用いた評価は、ＤＡＩスコアを中心とした主観的な方法が採用されていたが、糞便中Ｓ１００Ａ９を測定することによって、ＤＡＩスコアよりも客観的、かつ早期に腸の炎症状態を反映する結果を得ることができる。

また、すでにカルプロテクチンとＩＢＤの関係は報告されているが、実施例に示すように必ずしも糞便中カルプロテクチンが病態を反映していない。一方で糞便中Ｓ１００Ａ９をマーカーとして用いた場合には、より病態に即した結果を得ることができる。

以上より、糞便中Ｓ１００Ａ９は従来法よりも、客観的で早期に病態に合った結果を得ることのできる有用なマーカーである。さらに、ＩＢＤの寛解状態の判断は、医師により異なるが、多くは内視鏡検査によるため患者への負担が大きい。しかしながら、代替法として糞便中Ｓ１００Ａ９を測定することにより、非侵襲的かつ簡易に腸の状態を調べることが可能となる。

図１は、ラットの体重変化を示したものである。表の縦軸が体重（ｇ）、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群、四角印がコントロール群の平均値を表している。 図２は、ＤＡＩスコアの変化を示したものである。表の縦軸がＤＡＩスコア、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群、四角印がコントロール群の平均値を示す。＊Ｐ＜０．０５ ＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ） 図３は、腸の平均比重を比較したものである。縦軸が比重であり、左グラフがＤＳＳ投与群、右グラフがコントロール群の平均値を示した。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ） 図４は、便中のＳ１００Ａ９濃度の変化を示したものである。表の縦軸が便１ｍｇ中のＳ１００Ａ９量、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群、四角印がコントロール群の平均値を示す。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ） 図５は、便中のカルプロテクチン濃度の変化を示したものである。縦軸が便中のカルプロテクチン濃度、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群での平均値を示した。コントロール群は検出限界以下のため図中には示していない。

本発明は、炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのＳ１００Ａ９の使用に関するものである。

Ｓ１００Ａ９を測定する試料としては、ヒトを含む動物の糞便試料を用いることができる。糞便試料は、便中のヘモグロビン測定時と同様の処理に付せばよく、たとえば、市販の便潜血検査用の採便容器を用いて糞便試料を採取し、適当な緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液に懸濁後、遠心分離等によって固液分離し、上清を試料として使用する。

試料を採取する対象の炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎、クローン病などの大腸、小腸、直腸などの腸に関連した炎症性疾患であれば、すべて対象とすることができる。

Ｓ１００Ａ９を測定するには、既にＳ１００Ａ９に対する抗体が市販（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ， ＳＡＢ１４０４３４８， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ｓ１００Ａ９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ）されていることから、それらを利用して、又は常法によりＳ１００Ａ９に対する抗体を取得し、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法（ＣｉｒｃｕＬｅｘ， ＣＹ−８０６２， ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ａ９／ＭＲＰ１４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１２；６：１７０−８１）により測定することが可能である。

以下、実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

（実施例）
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発ラットＵＣ潰瘍性大腸炎モデルにおいて、便中のＳ１００Ａ９を測定することにより、既存のＤＡＩスコアよりも客観的かつ早期に大腸の炎症を検出することが可能か検討した。

（１）手順：
（モデル作製）
薬物はＤＳＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ ＣＡＴ ＮＯ．１６０１１０ Ｍ．Ｗ．＝３６，０００−５０，０００）を使用した。実験には、６週齢のＳＤラット（オス）を用い、ＤＳＳ投与群７匹、コントロール群６匹に分けた。ラットは、一週間馴化後、投与群（Ｄ群）には３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳ水溶液、コントロール群（Ｃ群）には純水を１１日間自由飲水させた。

（便の回収）
毎朝Ｄ群、Ｃ群の便を回収した。回収方法は、飼育カゴの大きさに合うバットにネット（穴の大きさ４×５ｍｍ）をはり、便と尿を分けた。便は、Ｄａｙ０からＤａｙ１０の期間で回収した。回収時間は、午前８時から１２時までとした。

（ＤＡＩスコア判定）
便の状態を観察して下痢、血便の状態をスコア化し、足し合わせた値をＤＡＩスコアとした。判定基準は、下痢スコアが正常便で０、軟便で１、下痢便で２、水様便で３とし、血便スコアは正常便で０、茶色の便で１、赤茶けた色の便で２、血便で３とした。有意差検定は、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １２を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。

（サンプル処理）
回収した便は、あらかじめ重量を測定した１．５ｍＬチューブに入れ、再度重量を測定し、便のみの重さを記録した。５００μＬの検体希釈液を加えて、氷上で１５分間静置した。ホモジナイザーペッスルを使用して、便を懸濁した。その際にペッスルを５００μＬの検体希釈液で洗い、液量を計１，０００μＬとした。次に１２，０００ｇ ４℃ ５分間遠心し、上清を回収した。得られた上清は、測定まで−８０℃で保存した。

（便中カルＳ１００Ａ９濃度の測定 ＥＬＩＳＡ）
ラットＳ１００Ａ９測定ＥＬＩＳＡキットを用いて便中のＳ１００Ａ９量を測定した。凍結していた便から抽出した上清を解凍し、適宜検体希釈液で希釈した。スタンダードと希釈したサンプルを抗体固相プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温２時間静置した。洗浄液を用いてウェルを洗い、酵素標識抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温１時間静置した。再び洗浄操作を行い、発色液を１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温２０分間反応後、反応停止液を１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。操作終了後、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプルの濃度計算は、ＰＬＡＴＥ ｍａｎａｇｅｒ Ｖ４を用いた。

（便中Ｓ１００Ａ９量の計算）
便１ｍｇに含まれるＳ１００Ａ９量（ｎｇ）を求めるために、以下の計算式を用いた。有意差検定は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １２を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。

（便中カルプロテクチン濃度の測定 ＥＬＩＳＡ）
便中のカルプロテクチンは、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ社のＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを使用し、添付文書に従い測定した。有意差検定は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １２を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。

（ラットの解剖、腸の比重計算）
ラットを麻酔下で開腹後、腹部大静脈から全採血した。直腸から結腸まで摘出し、直腸側から走行方向に切り進めた。０．９（ｗ／ｖ）％食塩水で腸表面の内容物を洗い落とし、ペーパータオルの上に３回置き水分を軽く除いた後、腸の長さを測定後、湿重量を測定した。腸の比重は、湿重量（ｇ）を摘出した大腸の長さ（ｃｍ）で割り、計算した。有意差検定は、ＳｔａｔＶｉｅｗ ｖｅｒ５．０を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。

（２）結果
（体重変化）
ＳｔａｔＶｉｅｗ ｖｅｒ５．０のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施したところ、図１に示すように、Ｄａｙ０〜Ｄａｙ１０まで有意差は認められなかった。

（ＤＡＩスコア）
毎朝便を回収する際に便状を観察し、ＤＡＩスコア評価を実施した。Ｄ群、Ｃ群のスコアの平均値を図２に示す。ＤＡＩスコアは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ ＴｅｓｔでＤａｙ６からＤ群がＣ群より有意に高値を示した。Ｄ群とＣ群で有意な差が現われたのはＤａｙ６であった。また、Ｄ群において便に血が付着し始めた日（血便）の平均はＤａｙ６であった。

（腸の比重結果）
図３に示すように、ＤＳＳ投与群の平均値は０．１４ｇ／ｃｍ、コントロール群の平均値は０．０９５ｇ／ｃｍでありＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを行った結果有意な差が認められた。

（便中Ｓ１００Ａ９量の測定）
便１ｍｇ中のＳ１００Ａ９量を算出した結果を図４に示す。図４から明らかなように、Ｄ群は経時的に便中のＳ１００Ａ９量が増加しており、Ｃ群と比較してＤａｙ２において有意に高値を示した。

（便中カルプロテクチン濃度の測定）
図５に示すように、Ｄ群の便中カルプロテクチン濃度において経時的な変化を確認することはできなかった。もっとも炎症が酷くなっていると考えられたＤａｙ１０の便においても、便中カルプロテクチン濃度はＤａｙ５の濃度と差が認められなかった。また、コントロール群においては、大部分のサンプルにおいて測定限界以下となった。

（３）考察
（実験的潰瘍性大腸炎モデルラットの評価）
Ｄ群は、ＤＳＳを投与した結果ＤＡＩスコアが経時的に上昇することが確認でき、Ｄａｙ６でＣ群との間に有意な差が認められた。また、Ｄ群の血便初確認日の平均は、Ｄａｙ６であった。また、解剖結果よりＤ群においては腸の比重が大きくなっていることから肥厚を確認できた。以上の結果より、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）モデルとして適切であると判断した。

（Ｓ１００Ａ９測定キットの評価）
Ｓ１００Ａ９測定キットを使用した結果では、Ｄ群はＤａｙ２においてＣ群よりも有意な高値を示した。これは、ＤＡＩスコアで有意差が現われたＤａｙ６よりも早期に腸の炎症を捉えていることを示す。一方、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ社のカルプロテクチンキットを使用した結果では経時的変化、かつ炎症を反映した値が得られなかった。

以上の結果を踏まえ、糞便中のＳ１００Ａ９を測定することで、潰瘍性大腸炎モデルラットにおける経時的な変化を捉えることができ、病態をスコア化したＤＡＩスコアよりも早期に腸の状態を反映し、炎症性腸疾患のバイオマーカーとして有用であることを確認できた。また、ＵＣモデルラットの評価においては、便中のカルプロテクチンよりＳ１００Ａ９を測定する方が、より病態を反映していることも明らかとなった。

（便中Ｓ１００Ａ９濃度の測定 ＥＬＩＳＡ）
ラットＳ１００Ａ９測定ＥＬＩＳＡキットを用いて便中のＳ１００Ａ９量を測定した。凍結していた便から抽出した上清を解凍し、適宜検体希釈液で希釈した。スタンダードと希釈したサンプルを抗体固相プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温２時間静置した。洗浄液を用いてウェルを洗い、酵素標識抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温１時間静置した。再び洗浄操作を行い、発色液を１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温２０分間反応後、反応停止液を１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。操作終了後、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプルの濃度計算は、ＰＬＡＴＥ ｍａｎａｇｅｒ Ｖ４を用いた。

（便中カルプロテクチン濃度の測定）
図５に示すように、Ｄ群の便中カルプロテクチン濃度において経時的な変化を確認することはできなかった。もっとも炎症が酷くなっていると考えられたＤａｙ１０の便においても、便中カルプロテクチン濃度はＤａｙ５の濃度と差が認められなかった。また、コントロール群においては、大部分のサンプルにおいて検出限界以下となった。

Claims (2)

1. 炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのＳ１００Ａ９の使用。
2. 測定対象の試料が、糞便である、請求１記載のＳ１００Ａ９の使用。

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