JP2016204327A - 生体組織固定用組成物及び生体組織固定用組成物入り容器 - Google Patents

Abstract

【課題】他の試薬との取り違えを抑制することができる生体組織固定用組成物及び生体組織固定用組成物入り容器を提供する。【解決手段】水、ホルムアルデヒド及び色素を有効成分として含有する、生体組織固定用組成物120、及び、容器110と、容器１１０内に収容された生体組織固定用組成物１１０と、封印テープ130とを備える、生体組織固定用組成物１１０入り容器110。【選択図】図１

Description

本発明は、生体組織固定用組成物及び生体組織固定用組成物入り容器に関する。

病院や研究機関等では、生体組織標本の固定が日常的に行われている。生体組織標本の固定には、一般的に、３〜５％パラホルムアルデヒド溶液又はホルマリン液が使用される。

ホルマリン液としては、日本薬局方で定められた局方ホルマリン液を５〜１０倍程度に希釈したものが一般的に用いられている。局方ホルマリンとは、３５〜３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液に、安定化剤（にごり防止）として５〜１３ｗ／ｖ％程度のメタノールが加えられたものである（非特許文献１を参照）。局方ホルマリンを１０倍希釈したものは１０％ホルマリン液と呼ばれる。１０％ホルマリン液中のホルムアルデヒドの濃度は３．５〜３．８ｗ／ｖ％程度である。

第十六改正日本薬局方、厚生労働省編、第１２８８頁

３〜５％パラホルムアルデヒド溶液や１０％ホルマリン液は、無色透明の液体であるため、病院や研究機関における生体組織標本の固定作業中に他の試薬と取り違えてしまう場合がある。

そこで、本発明は、他の試薬との取り違えを抑制することができる生体組織固定用組成物及び生体組織固定用組成物入り容器を提供することを目的とする。

本発明は、以下の通りである。
（１）水、ホルムアルデヒド及び色素を有効成分として含有する、生体組織固定用組成物。
（２）前記色素がｐＨ指示薬又は組織染色剤である、（１）に記載の生体組織固定用組成物。
（３）容器と、前記容器内に収容された（１）又は（２）に記載の生体組織固定用組成物と、封印テープとを備える、生体組織固定用組成物入り容器。

本発明によれば、他の試薬との取り違えを抑制することができる生体組織固定用組成物及び生体組織固定用組成物入り容器を提供することができる。

実験例１で作製した生体組織固定用組成物入り容器を示す写真である。 （ａ）は、生体組織固定用組成物入り容器の１実施形態の構造を説明する斜視図である。（ｂ）は、（ａ）におけるＡ−Ａ線断面図である。 （ａ）〜（ｄ）は、実験例２の結果を示す写真である。 （ａ）〜（ｄ）は、実験例３の結果を示す写真である。 （ａ）〜（ｈ）は、実験例４の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例５の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示す写真である。

［生体組織固定用組成物］
１実施形態において、本発明は、水、ホルムアルデヒド及び色素を有効成分として含有する、生体組織固定用組成物を提供する。

本実施形態の生体組織固定用組成物は、色素を含有していることにより着色されている。このため、他の試薬と容易に区別することができ、取り違えを抑制することができる。

本実施形態の生体組織固定用組成物において、ホルムアルデヒドの濃度は、生体組織の固定が行える濃度であれば特に制限されず、例えば２〜５０ｗ／ｖ％であってよい。

本実施形態の生体組織固定用組成物において、ホルムアルデヒドの少なくとも一部は、パラホルムアルデヒドＨＯ（ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ［ｎは６〜１００程度の整数を表す。］等の重合体やギ酸等の酸化物を形成していてもよい。

本実施形態の生体組織固定用組成物は、例えば、局方ホルマリン液を水で希釈したものに色素を添加したものであってもよく、パラホルムアルデヒドを水に溶解させたものに色素を添加したものであってもよい。

本実施形態の生体組織固定用組成物は、水、ホルムアルデヒド及び色素の他に、例えば、メタノール等の安定化剤、ｐＨ緩衝剤等の添加剤を含有していてもよい。

生体組織の固定は、本実施形態の生体組織固定用組成物に、固定対象である組織片を浸漬することにより実施することができる。

本実施形態の生体組織固定用組成物において、色素は、ｐＨ指示薬又は組織染色剤であることが好ましい。発明者は、本実施形態の生体組織固定用組成物の色素として、例えばメチレンブルー等を用いた場合、経時的に退色してしまい約３０日程度で無色になること、固定した生体組織に色素が沈着し病理検査の妨げとなる場合があることを見出した。発明者は更に、本実施形態の生体組織固定用組成物の色素としてｐＨ指示薬又は組織染色剤を用いることにより、これらの問題を解決することができることを見出した。発明者はまた、メチレンブルー等の色素は、生きた細胞の膜透過性を亢進させ、細胞毒性を示し、細胞を着色させることを見出した。

ｐＨ指示薬としては、例えば、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、メチルレッド、メチルオレンジ、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、リトマス等が挙げられる。また、組織染色剤としては、例えば、ヘマトキシリン、エオジン等が挙げられる。ｐＨ指示薬又は組織染色剤は１種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。色素の細胞毒性及び着色性が低いことが好ましい場合には、色素はｐＨ指示薬であることが好ましい。

色素として組織染色剤を用いた場合、当該色素は、生体組織固定用組成物を他の試薬と識別するための色素として機能するだけでなく、本来の組織標本の染色を行う色素としても機能することになる。組織染色剤は、本来組織標本の染色に用いられる色素であることから、顕微鏡診断等にも影響を与えることがない。

本実施形態の生体組織固定用組成物において、色素の添加量は、生体組織固定用組成物が着色し、生体組織固定用組成物に浸漬された標本を観察することができ、他の試薬と容易に区別できる程度であれば特に制限されず、生体組織固定用組成物を基準として、例えばｐＨ指示薬の場合は０．００１〜０．０２ｗ／ｖ％程度であってもよく、例えば組織染色剤の場合は０．０１〜０．５ｗ／ｖ％程度であってもよい。ここで、色素として２種以上を使用した場合には、色素の合計量が上記の範囲となるようにするとよい。

［生体組織固定用組成物入り容器］
１実施形態において、本発明は、容器と、前記容器内に収容された上記の生体組織固定用組成物と、封印テープとを備える、生体組織固定用組成物入り容器を提供する。

図１は、後述する実施例で作製した、本実施形態の生体組織固定用組成物入り容器１００を示す写真である。図１に示すように、生体組織固定用組成物入り容器１００は、容器１１０と、容器１１０内に収容された生体組織固定用組成物１２０と、封印テープ１３０とを備える。

容器１１０の材質は、生体組織固定用組成物の色が視認可能な程度に透明であるものであれば特に制限されず、例えばガラス、プラスチック等が挙げられる。しかしながら、容器１１０は、作業中に落として割れてしまう場合がある。容器１１０が割れて、保持されていた組織標本が容器から出た場合、医療現場等では検体の紛失事故となってしまう。仮に組織標本が見つかったとしても、本来容器に入っていた組織標本であるか否かの判断ができない。したがって、容器１１０の材質は、ガラスよりも、割れにくいプラスチックであることが好ましい。

プラスチックとしては、試薬の容器として通常用いられるものであれば特に制限されず、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。

容器１１０の形状は特に限定されず、生体組織標本を出し入れしやすい観点から、例えば円筒形状、四角柱形状等であってもよい。

また、複数同じ形状の容器が存在すると、操作及び識別が困難になる場合があるため、複数の容器を連結してまとめた形状にすることは、作業効率を向上させる観点から有効である。

図２（ａ）は、複数の容器を連結してまとめた形状の生体組織固定用組成物入り容器２００を示す斜視図である。図２（ｂ）は図２（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。生体組織固定用組成物入り容器２００は、容器１１０と、容器１１０内に収容された生体組織固定用組成物１２０と、封印テープ１３０と蓋体１４０とを備える。このような形状の容器であると、関連した標本をまとめて固定することができるため、作業効率を向上させることができる。

生体組織固定用組成物入り容器２００は６ウェルプレートの形状をしているが、ウェルの数はこれに限られず、例えば１２、２４、４８ウェル等であってもよい。また、ウェルの形状も円柱状には限られず、例えば四角柱状等であってもよい。

本実施形態の生体組織固定用組成物入り容器は、封印テープ１３０を備えている。このため、生体組織を固定する場合には意識的に封印テープ１３０を外す操作が必要であり、作業手順の確認になる。封印テープ１３０の形状は特に限定されず、図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、生体組織固定用組成物入り容器２００の一部に貼付するものであってもよく、例えば生体組織固定用組成物入り容器２００の外周を１周するものであってもよい。

また、例えば一度外した封印テープ１３０は破棄するという運用を行うことにより、封印テープ１３０があるものは未使用であることを示し、封印テープ１３０が無いものは生体組織が入っていることを示すという使い方ができる。このような運用によれば、例えば使用済みの生体組織固定用組成物を用いて別の生体組織を固定してしまうことによるコンタミネーション等を防止することができる。なお、封印テープ１３０の材質は特に制限されず、例えば紙、樹脂フィルム等が挙げられる。

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

[実験例１］
（生体組織固定用組成物の調製）
水、ホルムアルデヒド及び色素を有効成分として含有する生体組織固定用組成物を調製し、封印テープを備える容器に収容した。色素としては、ブロモチモールブルーを用いた。調製した生体組織固定用組成物は、着色していることから、他の試薬と容易に区別することができ、取り違えを抑制することができた。

本生体組織固定用組成物は、長期間（６ヶ月以上）保存しても色素の退色が認められなかった。また、本生体組織固定用組成物を用いて生体組織を染色したところ、病理検査の妨げとなる色素の沈着も認められなかった。

図１は、作製した生体組織固定用組成物入り容器を示す写真である。生体組織固定用組成物入り容器は、封印テープを備えることにより、未使用か使用済みかを容易に判断することができた。

［実験例２］
（色素の退色の検討）
《実施例１》
２０％緩衝ホルマリン溶液（武藤化学株式会社製）に０．００５ｗ／ｖ％のブロモチモールブルーを添加し、実施例１の生体組織固定用組成物を調製した。

《実施例２》
０．００５ｗ／ｖ％のブロモチモールブルーの代わりに０．００５ｗ／ｖ％のフェノールレッドを添加した以外は実施例１と同様にして、実施例２の生体組織固定用組成物を調製した。

《比較例１》
０．００５ｗ／ｖ％のブロモチモールブルーの代わりに０．００５ｗ／ｖ％のメチレンブルーを添加した以外は実施例１と同様にして、比較例１の生体組織固定用組成物を調製した。

《比較例２》
０．００５ｗ／ｖ％のブロモチモールブルーの代わりに適量の赤色１０２号（ニューコクシン）を添加した以外は実施例１と同様にして、比較例２の生体組織固定用組成物を調製した。

実施例１、実施例２、比較例１及び比較例２の生体組織固定用組成物を室温で１ヶ月間放置し、退色の有無について検討した。図３（ａ）は室温で１ヶ月間放置後の実施例１の生体組織固定用組成物の写真であり、図３（ｂ）は室温で１ヶ月間放置後の実施例２の生体組織固定用組成物の写真であり、図３（ｃ）は室温で１ヶ月間放置後の比較例１の生体組織固定用組成物の写真であり、図３（ｄ）は室温で１ヶ月間放置後の比較例２の生体組織固定用組成物の写真である。その結果、実施例１及び２の生体組織固定用組成物では色素の色調が保持されていた。これに対し、比較例１及び２の生体組織固定用組成物では色素の退色が観察された。

［実験例３］
（固定した生体組織への色素の沈着の検討）
実験例２で調製した実施例１、実施例２、比較例１及び比較例２の生体組織固定用組成物に、生体組織標本を浸漬させて１週間放置し、生体組織標本への色素の沈着の有無について検討した。

図４（ａ）は実施例１の生体組織固定用組成物に浸漬した生体組織標本の写真であり、図４（ｂ）は実施例２の生体組織固定用組成物に浸漬した生体組織標本の写真であり、図４（ｃ）は比較例１の生体組織固定用組成物に浸漬した生体組織標本の写真であり、図４（ｂ）は比較例２の生体組織固定用組成物に浸漬した生体組織標本の写真である。その結果、実施例１及び２の生体組織固定用組成物では、生体組織標本への色素の沈着は認められなかった。これに対し、比較例１及び２の生体組織固定用組成物では、生体組織標本への色素の沈着が認められた。

［実験例４］
（生きた細胞に対する色素の毒性の検討）
膵癌細胞株の培養液に色素を添加し、細胞に対する色素の毒性を検討した。色素としては、トリパンブルー、メチレンブルー、ヘマトキシリン、エオジン、フェノールレッド、クレゾールレッド、ブロモチモールブルー及びリトマスを使用した。

図５（ａ）〜（ｈ）は、細胞の培養液への色素の添加から１０〜３０分後に細胞の様子を観察した顕微鏡写真である。図５（ａ）はトリパンブルー（０．１ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｂ）はメチレンブルー（０．００５ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｃ）はヘマトキシリン（０．１ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｄ）はエオジン（０．１ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｅ）はフェノールレッド（０．００５ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｆ）はクレゾールレッド（０．００５ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｇ）はブロモチモールブルー（０．００５ｗ／ｖ％）の結果を示し、図５（ｈ）はリトマス（０．００５ｗ／ｖ％）の結果を示す。

図５（ａ）〜（ｈ）において、生存細胞は無色透明であり、死細胞には色素による着色が認められた。その結果、フェノールレッド、クレゾールレッド、ブロモチモールブルー及びリトマスは、細胞毒性をほとんど示さないことが明らかとなった。

［実験例５］
（ブロモチモールブルーの最適濃度の検討１）
ブロモチモールブルー及びメチレンブルーを、図６に示す各濃度で膵癌細胞株の培養液に添加し、色素の添加から１０〜３０分後に細胞の様子を観察した。

図６（ａ）及び（ｂ）は、色素の添加から１０〜３０分後に細胞の様子を観察した顕微鏡写真である。図６（ａ）はブロモチモールブルーの結果を示し、図６（ｂ）はメチレンブルーの結果を示す。

その結果、ブロモチモールブルーは、０．００１〜０．０１５ｖ／ｗ％程度の濃度範囲で細胞毒性を示さず、標本の観察にも適していることが明らかとなった。一方、メチレンブルーは、いずれの濃度においても生細胞が青く染色され、細胞毒性が認められた。

［実験例６］
（ブロモチモールブルーの最適濃度の検討２）
ブロモチモールブルー及びメチレンブルーを、図７に示す各濃度で２０％緩衝ホルマリン溶液（武藤化学株式会社製）に添加し、色調を観察した。図７（ａ）はブロモチモールブルーの結果を示し、図７（ｂ）はメチレンブルーの結果を示す。その結果、いずれの色素においても、生体組織固定用組成物に浸漬された標本を観察することができる濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％程度以下であることが明らかとなった。

本発明によれば、他の試薬との取り違えを抑制することができる生体組織固定用組成物及び生体組織固定用組成物入り容器を提供することができる。

１００，２００…生体組織固定用組成物入り容器、１１０…容器、１２０…生体組織固定用組成物、１３０…封印テープ、１４０…蓋体。

Claims (3)

1. 水、ホルムアルデヒド及び色素を有効成分として含有する、生体組織固定用組成物。
2. 前記色素がｐＨ指示薬又は組織染色剤である、請求項１に記載の生体組織固定用組成物。
3. 容器と、前記容器内に収容された請求項１又は２に記載の生体組織固定用組成物と、封印テープとを備える、生体組織固定用組成物入り容器。