JP2016176039A - 水溶性近赤外発光ナノ粒子及び蛍光標識材 - Google Patents

Abstract

【課題】in-vivoイメージングに好適な近赤外域を高効率かつ安定して発光できる水溶性の蛍光標識材を提供する。
【解決手段】ダイヤモンド構造を有するとともに表面を炭化水素膜で被覆した一つまたは複数のシリコンナノ結晶をブロック共重合体で覆った構造を有する蛍光標識材が提供される。シリコンナノ結晶のサイズを調節することで、生体の透過性が高い近赤外域で高い効率で発光する。
【選択図】図１

Description

本発明はシリコンナノ（Ｓｉ）粒子を用いた水溶性近赤外発光ナノ粒子に関し、またこのナノ粒子を使用した蛍光標識材に関する。

生体内において、特定の分子が、いつ、どこで、どの分子と連関して機能しているかを理解することで、生命科学機構を解明し、創薬スクリーニングに繋げようとする学術研究が活発に行われている。最も一般的な生体分子の観察方法は、対象となる分子を蛍光標識し、蛍光顕微鏡下で分子の動態や位置、さらに他分子との相互作用を調べる蛍光イメージング法である。分子生物学の実験などにおいて、試験管や培養器などの中でヒトや動物の組織を用いて、体内と同様の環境を人工的に作り、生体反応を観察することをin-vitroイメージングと呼ぶ。一方、小動物を用い生体内や細胞内で生体反応を観察することをin-vivoイメージングと呼ぶ。近年になって特に、in-vivoイメージングが注目されている。in-vivo蛍光イメージングとは、生体内にある蛍光標識を生体外部から光励起し、蛍光標識剤からの発光を生体外に設置した光検出器へ導きイメージングを行う方法であるので、生体内の細胞を外部より生体を傷つけることなく、非侵襲で観察することができる点で特徴的である。

in-vivoイメージングに際して、外部へ発光を取り出すためには、励起光及び発光が生体を透過する必要がある。多くの蛍光材料の励起光として使用される紫外光は、生体の吸収が高く、ほとんど透過することができないので好ましくない。また、４００〜７００ｎｍの可視光はヘモグロビンやそのほかの生体構成物質の吸収が大きいため好ましくない。一方で１０００ｎｍ以上の波長では、水の吸収が強くなるために透過率が低くなり好ましくない。それゆえ、７００〜１０００ｎｍの近赤外波長域がin-vivoイメージングに好ましい波長域である。当該波長域は「生体の分光学的窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域である。それゆえ効率良いin-vivoイメージングを行うには、７００〜１０００ｎｍの近赤外波長域で光励起及び発光を示す蛍光材料が求められている。

一般的に蛍光標識材として有機系色素が最も汎用であるが、次に示す問題を抱えている。
・近赤外発光する色素の種類が少ない。
・発光量子収率は１０〜３０％程度と高くない（比較例３で実証）。
・励起極大と発光極大のストークスシフトが短いので、蛍光イメージング画像において励起光によるバックグラウンドの上昇を抑える策がない。このため、励起極大ではなく、なるべく短波長で励起することでイメージング画像のコントラストを上げる必要がある。その点で、発光量子収率は１０〜３０％は高いと言えない。
・有機物に特有の励起光照射時の光劣化、光分解伴う低耐久性、劣化に伴う退色が見られる。この問題は有機物を使用する限り解決することが難しい。

このような問題（特に４番目）を根本的に解決するには、発光体を無機物で代替することが望ましい。その候補物質として希土類イオンを内包する無機ナノ物質が注目されてきた。しかしながら、これらにも以下に示す問題がある。
・近赤外波長域で光励起および発光する物質は少ない。
・発光量子収率も１０％以下と充分でなく、感度も充分でない。ここで検出感度を高めようと励起光強度を上げると、イメージング画像において、標識されていない領域へ映り込んだ励起光が、イメージング像のコントラストを低くする（非特許文献１）。
・強い励起光は、生体分子に侵襲性を齎す光毒性の問題を引き起こす。この問題は有機色素を用いた場合でも同様である。

上記２種類の蛍光体で起きる問題を解決するために、化合物半導体量子ドットナノ粒子の研究が活発に行われている。近赤外波長域で利用できる物質は、短波長側（７００ｎｍ〜）から、カドミウムテルル、インジウム砒素、硫化鉛である。これらの物質は以下の特徴を有する。
・カドミウムテルルは耐光性に優れる。
・硫化鉛やカドミウムテルルの発光量子収率は４０％以上である。
・近赤外波長域で発光色をチューニングできる。さらにスペクトル波長位置は粒子サイズに依存するので、バイオイメージングにおいて異なる分子間相互作用をパラレル観察することも可能となるといった格別の観察法を提供することもできる。

ところが、これらは一方では以下の問題を持っているが、これらの問題は物質の基本物性なので変えることができない。
・励起極大と発光極大のストークスシフトが短いので、蛍光イメージング画像において励起光によるバックグラウンドの上昇を抑える策がない。このため、励起極大ではなくなるべく短波長で励起することでイメージング画像のコントラストを上げる必要がある。結果として、高い発光量子収率を活かすことができない。
・これらの化合物半導体を構成する原子の多くは環境規制によって使用制限を受けている。環境省の「水質汚濁に係る環境基準」の「別表１ 人の健康の保護に関する環境基準」（非特許文献２）によれば、たとえば、カドミウム、鉛、砒素の水質汚濁に係わる環境基準は、各々０．００３ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌときわめて微量である。このような環境規制のために、これらの物質は将来的に安定して使用できる物質とはならない。

上述したような、これまでに使用され、あるいは提案されてきた物質についての諸問題を解消するため、蛍光標識材としてシリコンを使用することが考えられる。充分に大きなシリコン結晶は間接遷移型バンド構造を有する単元素半導体として知られ、室温で１．１４ｅＶほどの大きさのバンドギャップをもつ。間接遷移型バンド構造を有するために、光励起キャリアの放射性再結合を起こすためには運動量保存則を満足させる必要がある。そのエネルギーを格子振動から得るために、高い発光効率で蛍光を放射することは原理的に不可能である。ところがダイヤモンド構造結晶の大きさを８ｎｍより小さな球状粒子に微小化すると、充分に大きな結晶に比べて１００００倍以上の発光量子収率を有するフォトルミネッセンス特性を示すようになる。発光量子収率は一般的に１％以上あれば、蛍光標識材として利用できる。シリコンは化合物半導体のナノ粒子よりも細胞毒性が極めて低いことが知られているので、生体で使用される蛍光標識材として期待されている（非特許文献３）。

シリコンナノ粒子を蛍光標識材として水系で利用するためには、水、生理的塩溶液、りん酸緩衝食塩液中で溶媒和し、長期間にわたって安定で、近赤外励起時に発光量子収率１％以上の近赤外発光特性を有する必要がある。ところがシリコンは酸素が存在する環境下に置かれると酸化されてしまう。例えば、２ｎｍの粒子径をもつシリコンを大気中へ放置すると、室温下でもナノ粒子表面から徐々に酸化が進行し２週間ほどで酸化シリコンになってしまう（比較例６で実証）。

酸化の問題を解決すると同時に水溶性を付与するために、ナノ粒子表面を適切な有機単分子膜で修飾する方法が報告されている。汎用的には極性官能基を末端にもつ不飽和炭化水素分子が利用される。極性官能基としてはカルボキシル基、アミノ基、糖環、スルフォン基、水酸基、フォスフォン基、オリゴヌクレオチドが代表的であり、生体親和性も高い（特許文献１〜４）。このような不飽和炭化水素分子において極性基とは逆末端にある二重結合（或いは三重結合でも良い）は、ヒドロシリル化を通じてナノ粒子最表面のケイ素原子と炭素−ケイ素共有結合を形成し、単分子としてナノ粒子表面へ固定化される。表面修飾の点では、金や白金ナノ粒子の表面修飾で利用されるチオール分子も利用できる。しかしながら酸化を抑制できる点において、炭素―ケイ素の共有結合を介した表面修飾は、弱い化学吸着である硫黄―ケイ素分子間相互作用よりも好ましい。

従来の水溶性シリコンナノ粒子の発光波長は、可視短波長域（４００〜５００ｎｍ）に偏重している。可視短波長域は生体構成物質の吸収が大きい波長域である点でin-vivoだけでなくin-vitro環境でのイメージングにも最適であるとは言えない。可視中長波長域（５００〜７００ｎｍ）で使用できる水溶性シリコンナノ粒子について、ナノ粒子はカルボキシル基、ヌクレオチド何れかの官能基をもつ単分子膜で終端されている（非特許文献４（レビュー論文））。一方、近赤外発光する水溶性シリコンナノ粒子に関する報告例は少ない。その少数例について示す。まずシリコンをナノ粒子にすることで７００〜１１００ｎｍの発光波長域において発光色を連続的に変調できることは知られている（非特許文献５（レビュー論文））。近赤外で発光する水溶性シリコンナノ粒子を合成するために、両親媒性分子で構築されたミセルで保護する方法が報告されている（非特許文献６）。

ところがシリコンナノ粒子に対して上述のような対策を施しても、次に示す問題は解決できないままであった。

［問題１］
・近赤外波長域における発光の量子収率は励起極大で励起した場合に８％以下である。近赤外発光の励起極大は電子構造的に紫外域にあるので、通常イメージングに使用する可視中長波長域で光励起すると、発光の量子収率はさらに低くなる。それゆえ励起に大きなフォトンエネルギーを必要とし、さらにコントラストの高いイメージングが困難であった。

［問題２］
・発光スペクトルの半値幅は５００ｍｅＶ以上で、化合物半導体量子ドットの発光スペクトルの半値幅（３００ｍｅＶ以下）と比べると大きい。発光のチューニング特性を利用した多色蛍光イメージングは、半値幅が小さく対称性の高い発光スペクトルを用いて行うのが好ましく、５００ｅＶの半値幅は適当でない。

［問題３］
・シリコンナノ粒子における発光ピークは発光波長に依存せず一般的に長波長側へ裾をひくため対称性が低い。７００〜１１００ｎｍの波長域において発光極大は粒子サイズに依存するが、発光スペクトルの終点の波長位置は粒子サイズに依存せず同じである。このようにして現れるスペクトルの裾の広さは、多色蛍光イメージングのコントラスト性を下げる結果となる。そのような理由から、これまでに近赤外波長域における多色蛍光イメージングを達成した例はない。そしてこのような特徴的なスペクトル特性は間接遷移型半導体をナノ粒子化したときに現れる特徴であり、結晶粒子の微小化に伴う実空間における電子とホールの波動関数の重なりを通じたゼロフォノン遷移に起因すると考えられてきた。

これについてより詳細に説明すれば、以下の通りである。シリコンのバルク結晶は、間接遷移型のバンド構造を有するために、光励起キャリア（電子および正孔）のバンド間再結合には波数選択則が要求される。つまり運動量保存則を満たすためには、フォノンの関与が必要とされる。しかし、バルク結晶を小さくナノ粒子にまで微小化すると、ナノ結晶中では電子と正孔（あるいは励起子やエキシトン）が微粒子内に閉じ込められ、実空間での電子と正孔それぞれの波動関数が重なるとともに、波数空間でも不確定性原理によりエキシトンの波数の広がりΔｋが大きくなる。結果として、波数選択則が崩れることで、フォノンの関与なくキャリアのバンド間再結合が可能となる。しかしこの遷移は直接遷移型バンド構造におけるバンド間再結合とは根本的に異なる。微粒子化によるΔｋの広がりを利用しているために、バルクバンド構造を反映した伝導帯の底と価電子帯の頂のエネルギーギャップ差に相当するフォトンエネルギーは全ての蛍光スペクトルに含まれる。結果として蛍光スペクトルの終点波長に相当するフォトンエネルギーはナノ結晶のサイズに依存せず伝導帯の底と価電子帯の頂のエネルギーギャップに一致する。それゆえ、蛍光スペクトルは長波長側へ裾を引くことになる。

［問題４］
・細胞深部の蛍光イメージングを行うためには、生体透過性の高い７００ｎｍよりも長波長帯で光励起することが好ましいが、シリコンナノ粒子は当該波長域の光をほとんど吸収しないので励起効率が極めて低い。それゆえ、励起強度を強くする必要がある。
・励起に紫外光を用いることによる別の問題として、イメージングの対象が生細胞や生組織である場合においては、これらに損傷を与えてしまう。また、イメージング対象がＤＮＡやたんぱく質などである場合においては、紫外光によりこれら分子に損傷が加えられる可能性があり、塩基配列の決定や活性サイトの決定などを精度良く行うに際しての妨げとなる場合があった。近赤外励起（近赤外発光を行うための技術）として、赤外光励起により赤外発光する材料として希土類を含有した蛍光体（所謂「アップコンバージョン蛍光体」）が知られている（非特許文献７）。このような粒子を蛍光標識材に用いると、励起光として近赤外光を使用することができるため、紫外光等のように被分析物に悪影響を及ぼさない。しかしながら、当該粒子は、希土類のドープ量を選択することで任意のアップコンバージョン発光を得ることができるが、異なる発光色を得るにはドープする希土類の材料を選択しなければならないこと、発光色が限定され、選択が困難であるという問題がある。

また、水溶性ナノ粒子合成のため、ブロック共重合体を使用することが知られている。例えば、プルロニックは低毒性で生体適合性の良い等の優れた特色を有しているために、医薬品、化粧品などで利用されている（非特許文献８）。これを転用して、プルロニックで表面修飾したナノ粒子を生体利用する試みがある（特許文献５、特許文献６）

本発明は上述した従来技術の問題点を解消し、高発光効率かつ高安定性の水溶性近赤外発光シリコンナノ粒子及びそれを用いた蛍光標識材を提供することを課題とする。

本発明の一側面によれば、ダイヤモンド構造を有する一つまたは複数のシリコンナノ結晶と、前記シリコンナノ結晶のそれぞれの表面を覆う炭化水素膜と、前記表面が炭化水素膜で覆われた一つまたは複数のシリコンナノ結晶を覆うブロック共重合体とを設けた、水溶性であり、励起光の照射により近赤外域で発光するシリコンナノ粒子が与えられる。
ここで、前記シリコンナノ粒子は励起光の照射により７００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のピーク波長で発光してよい。
また、前記発光のスペクトルの半値幅は１５０ｍｅＶ〜３００ｍｅＶであってよい。
また、前記シリコンナノ粒子の発光量子収率が３０％以上であってよい。
また、前記一つまたは複数のシリコンナノ結晶はサイズが１．９ｎｍ〜６．１ｎｍの範囲であってよい。
また、前記シリコンナノ結晶は単分散粒子であってよい。
また、前記シリコンナノ粒子は近紫外域の励起光の照射による二光子吸収に基づいて近赤外域で発光してよい。
また、前記ブロック重合体がプルロニック系界面活性剤であってよい。
本発明のほかの側面によれば、前記何れかのシリコンナノ粒子を有する蛍光標識材が与えられる。

本発明によれば、非常に高い効率で蛍光を発するとともに、急峻な形状の発光スペクトルを有するようにできる新規な構造の水溶性近赤外発光シリコンナノ粒子及びそれを用いた蛍光標識材が提供される。

水溶性近赤外発光ナノ粒子の構造を示す概念図。 エッチング時間に伴う粉末X線回折図形の変化を示す図。 オクタデカン終端シリコンナノ粒子（左）およびプルロニック外殻形成後のナノ粒子（左）の典型的な透過型電子顕微鏡像。 典型的なナノ粒子の光吸収スペクトルとＰＬスペクトル。 粒子サイズで発光波長を連続的に制御できる本発明の水溶性ナノ粒子の典型的な（ａ）紫外可視吸収スペクトル、及び（ｂ）発光スペクトル（各ＰＬスペクトルの絶対量子収率を百分率でグラフ中に記入）。 カルボキシル基で終端されたシリコンナノ結晶粒子（比較例４）のｐＨの変化に伴う安定性を示す写真。 水溶性ナノ粒子の近赤外ＰＬスペクトルの蛍光極大波長と半値幅との関係を示すグラフ。ここで使用した水溶性ナノ粒子は遠心分離処理、クロマトグラフィー処理を行って高い単分散性および表面均質性を持つようにしたＳｉナノ結晶を内殻として含む本発明のＳｉナノ粒子である。

本発明のシリコンナノ粒子は図１に示すようなダブルシェル構造（コアを内殻及び外殻が二重に覆う構造）を有する水溶性のシリコンナノ粒子であり、７００〜１０００ｎｍの近赤外波長域内で強い発光を示す。図示するように、コアは１つ以上のシリコン（Ｓｉ）ナノ結晶で構成されており、ナノ結晶はダイヤモンド構造をもつ。このダイヤモンド構造は粒子の中心部から最表面まで維持されている。これによって、高い発光量子収率がもたらされる。アモルファス化を引き起こす最表面層の再構築を防ぐためにアルキル基等の炭化水素による錨効果が効果的である。

ここで、錨効果について説明すれば、Ｓｉナノ結晶の粒子径が２．５ｎｍ程度（発光極大で言えば８５０ｎｍ程度に相当する）にまで小さくなると内部よりも表面を構成する原子の数が圧倒的に多くなるので、Ｓｉナノ結晶の相構造を安定化させるためには、ナノ結晶内部から表面に向かって原子は最安定な構造をとろうと格子を歪ませ、時間経過とともに徐々にアモルファス構造へと構造緩和が起きる。この緩和はナノ結晶の粒子径に依存する。ところが、有機分子がナノ結晶表面に高密度に存在すると、有機分子同士が立体障害となり、また質量の大きな原子団が１つの表面シリコン原子に結合することで原子団は錨の役割を果たすので、表面近傍原子の再配列に基づく構造緩和が抑制され、表面までダイヤモンド構造が維持される。なお、Ｓｉナノ粒子表面を被覆する炭化水素の単分子膜としてアルキル単分子膜を使用する場合、その炭化水素鎖長さはＣ１〜Ｃ２２が好ましい。特にＣ１１以上が好ましい。なお、Ｃ２３より長い場合でも有効性が失われることはない。

なお、Ｓｉナノ結晶の粒子径が２．５ｎｍより小さくなると構造緩和が顕著になると言うだけであり、２．５ｎｍより大きくなっても構造緩和は起こる。水素原子では構造緩和を抑制できず、アルキル基などの炭化水素であれば抑制できる。構造緩和の起こる速度は粒子径に依存する。水素終端では粒子最表面はアモルファス化してしまうために、非輻射再結合をもたらす欠陥が多数形成される。ところがアルキル基などを接合させ秩序だった最表面を構築すると欠陥数が減るので、非輻射再結合の確率が大幅に減少する。これにより効率良い発光が得られることになる。それゆえ、構造緩和抑制は粒子のサイズに依存せず、全ての粒子で働くと考えるべきである。

また、ナノ結晶表面に炭化水素を結合させると、ナノ結晶最表面のＳｉ原子および点欠陥を無極性元素である炭素で終端することになるが、これにより非輻射遷移確率を低減させ、光励起キャリアの放射性再結合確率を増大させることができる。

各ナノ結晶は上述のように炭化水素の単分子膜で終端されている。当該炭化水素膜を内殻と称する。炭化水素膜はナノ結晶最表面に炭素−ケイ素共有結合を介して固定化されている。なお、単分子の組成に酸素、窒素、フッ素が含まれていると、単分子膜形成時にそれぞれの単分子内に存在する非共有電子対が隣り合う分子間で反発するため、単分子膜の分子密度が低くなる。その結果として、内部のＳｉナノ結晶が酸化し易くなり、また上述の錨効果が効率良く発揮されず、発光色の安定性が低下する。

内殻表面はブロック共重合体で覆われている。当該ブロック共重合体を外殻と称する。１つの外殻中に単一の内殻だけが収容されている場合もあり、また複数の内殻が収容されている場合もある。ブロック共重合体を構成するブロックの内で親水性が低い方のブロックが、内殻の炭化水素膜表面と疎水性相互作用を通じて化学吸着する。逆に親水性の高い方のブロックが最表面に露出し水溶性を与える。水溶性粒子の粒子径は内殻に内包される結晶数に依存し、およそ５〜８０ｎｍである。水溶性を与えることにより、水、生理的塩溶液、りん酸緩衝食塩液中で長期間安定となる。

一つの外殻中に複数の内殻を収容することでいくつかの利点が生じる。例えば、蛍光法を使用してナノ粒子の動きを生体外からモニタリングする際の光学系として、集団で粒子が動いてくれた方が粒子群からの蛍光強度が強いので、簡易なセットアップで蛍光観察可能になり、また励起強度も低くて済む。さらには長時間の蛍光モニタリングにも有用である。一つのナノ粒子に収容されている粒子群の個数がごく少数である場合、これらが退色してしまうとモニタリングはできなくなる。しかし、多数の粒子で構成されていれば、仮に幾つかの粒子が退色してしまっても問題は生じない。また、モニタリング技術という点では、励起強度を低くできると蛍光粒子の退色も抑制することができる。

もちろん、小さな蛍光粒子群にも利点は有る。すなわち、蛍光粒子群が小さければイメージングの解像度が高くなり、また微小空間のイメージングも可能になる。ブロック共重合体で覆われた粒子径の大きさを制御できれば、蛍光モニタリングの用途別に蛍光粒子を使い分けることができるようになる。

この水溶性のシリコンナノ粒子のフォトルミネッセンス（ＰＬ）は、生きた生体組織レベルの観察に好適とされる７００〜１０００ｎｍの近赤外波長域にある。当該粒子は二光子励起技術に最適の電子構造をもつ蛍光標識材なので、光励起に生体透過性の高い近赤外波長域の光を使用できる（当該波長域を「生体の分光学的窓」と呼ぶ）。また、７００〜１０００ｎｍの波長域内でのＰＬ波長の設定は、ナノ結晶のサイズ制御によって達成される。

その近赤外発光の絶対蛍光量子収率は３０％以上と高い値である。この収率は従来の水溶性Ｓｉナノ粒子より格段に高く。また商用化されている蛍光色素の蛍光量子収率よりも高い。このように高い絶対蛍光量子溜率が実現できた理由は、上で説明した構造で次の３項目が初めて満足されたことによる。
・ダイヤモンド構造が維持されること（光励起キャリアの遷移モードが一元化される）。
・炭化水素膜が表面酸化を抑制すること（酸化膜の形成は光励起キャリアの新たなる遷移モードを生む原因となる）。
・炭素−ケイ素結合の存在が、非輻射遷移を誘導する表面欠陥数を減少させること。

なお、３０％を超える量子収率は化合物半導体の量子ドット（ＣｄＴｅ、ＰｂＳｅ、ＰｂＳ、ＩｎＡｓ）でも実現可能である。しかしこれら量子ドットを構成する元素は毒性が高く生体での使用に適していない。

本発明に係るＳｉナノ粒子のＰＬスペクトルの半価幅は、図７に示すように１５０〜３００ｍｅＶとなった。これらの値は従来の水溶性Ｓｉナノ粒子よりも狭い。それらの半値幅の幾つかは近赤外発光する代表的な量子ドットＰｂＳに匹敵する。これはナノ構造（結晶性、サイズ、表面層）の精密な制御を達成したからである。更に、その発光スペクトルは図５に示す通り対称性が高く、また裾をひかないため、化合物半導体量子ドットに類似の発光チューニング特性が達成される。さらに近赤外波長域での多色蛍光イメージングも可能となる。

本発明により、Ｓｉが二光子励起近赤外バイオイメージング用の蛍光標識材として使用可能なことを初めて実験的に証明した。生体の蛍光イメージングでは、二光子吸収技術を利用するとコントラストが高く検出感度の良いイメージングが可能になる。なぜなら、二光子吸収を利用することで近赤外励起―近赤外発光を達成できるからである。さらに、二光子吸収であるために、シリコンナノ粒子を励起極大で励起させることが可能となる。つまり、生体外から近赤外光を放射して近赤外発光を得ることができる。さらに発光量子収率は７００〜１１００ｎｍの範囲内のいずれの波長帯においても３０％以上であるため、弱い励起光で検出感度の高いイメージングが可能となる。なお、二光子吸収技術自体は良く知られている事項であるため、その詳しい説明は省略する。

また、ＰＬ波長を近赤外域で細かくチューニングできる。それゆえ、狭い半値幅や裾を引かない発光スペクトル形状、またＰＬ波長を変化させても必要な励起波長が変化しないことと相俟って、単一励起照射下で異なる複数の生体分子間相互作用をパラレル観察（つまり、相互に独立して同時に観察）することを許す蛍光標識材を実現することができる。従来、このような標識材の報告例はない。

ここで発光スペクトルが裾を引かないことについて説明する。背景技術の項において［問題３］としてこの問題に言及した。しかしながら、本願発明者は、ダイヤモンド構造シリコンナノ粒子における近赤外発光スペクトルにおいて、長波長側へ裾を引くピークは表面極性およびサイズの異なる粒子群から成ることに帰着されることを見出した。それゆえ、従来の考え方どおり長波長側へ裾を引くピークの起源が電子構造に基づいているのであれば、これを制御する（スペクトル半価幅を狭くするなど）ことは不可能であるが、異なる粒子から構成されているのであれば、スペクトル半価幅を広げている原因を勘案した上で、同質のナノ粒子ごとに分類或いは分級していくことは可能であり、またこれを実験的に証明した。

また、本発明の水溶性標識材は従来のＳｉナノ粒子に比べて最も細胞毒性が低い。これは外殻に生体親和性が高く、両親媒性をもつプルロニック（ビーエーエスエフ コーポレーシヨン（ＢＡＳＦ社）の登録商標）を使用し、そして当該両親媒性分子が外殻を形成する際の自己組織化を制御したことで達せられた。具体的には、内殻は分子密度が高いアルキル単分子膜で構成されているために、疎水的である。それゆえ、プルロニックの低親水性ブロックが内殻と強く相互作用し、一方で外殻に生体親和性の高い親水ブロックが高密度で露出する分子膜構造を自己組織的に創りだすことができた。このような構造は、ベアなＳｉナノ粒子、水素原子で終端されたＳｉナノ粒子、シリカなど極性基で保護されたＳｉナノ粒子表面へ、単純にプルロニックの分子を作用させても形成できない。

なお、プルロニックとは、親水性のエチレンオキサイド（Ethylene Oxide、ＥＯ)と疎水性のプロピレンオキシド（Propylene Oxide、ＰＯ)とのトリブロック共重合型の非イオン性界面活性剤を指し、現在はＢＡＳＦ社から販売されている。ＥＯ重合度／ＰＯ重合度を変化させることで界面活性剤としての特性を変化させることができる。ここでは、ＥＯ重合度が１００、ＰＯ重合度が６５の（ＥＯ）１００（ＰＯ）１００（ＥＯ）１００の分子量１２５７０から成るプルロニック系界面活性剤を使用した。

更には、本発明のナノ粒子は、純水、生理的塩溶液、りん酸緩衝食塩液中に良く分散し、しかも半年以上安定であった。この点でも本発明のナノ粒子は生体に使用される蛍光標識材として望ましい特性を有する。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。ここで、実施例はあくまで本発明の理解を助けるためのものであって、本発明を限定するものでないことに注意すべきである。

［実験例１］
Ｓｉナノ結晶から蛍光を得るためには、ナノ結晶を８ｎｍより小さな粒子径範囲で制御し、ダイヤモンド構造をもつＳｉ結晶単相を得る必要がある。そこで、フッ化水素酸水溶液（４８％）によるエッチング時間を０〜５時間の間で制御し、Ｓｉ結晶単相が得られる範囲を見積もった。結晶相の定性には粉末Ｘ線回折法を用いた。

＜実施例１＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１５０℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２粉末を得た。フッ化水素酸水溶液中（４８％）で当該粉末を撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。撹拌時間は、７０〜１２０分の間で制御した。遠心分離処理を通じて得た粉末を乾燥後に粉末X線回折により定性分析した。

＜比較例１＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１５０℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２粉末を得た。フッ化水素酸水溶液中（４８％）で当該粉末を撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。撹拌時間は、２５〜７０分、１２０〜３００分の間でそれぞれ制御した。遠心分離処理を通じて得た粉末を乾燥後に粉末X線回折により定性分析した。

＜実施例１と比較例１との比較・検討＞
図２に、実施例１と比較例１から得た粉末Ｘ線回折図形を示す。フッ化水素酸水溶液中で粉末を撹拌することでＳｉＯ_２を除去した。ＳｉＯ_２の存在は２シータ＝２２°附近に現れる回折ピークの有無で判断した。一方、Ｓｉの存在は、２シータ＝２８°、４５°、５６°附近に現れる（１１１）、（２２０）、（３１１）面のＸ線回折に基づいて判断した。２５分のエッチング時間では両者とも存在しており、エッチング時間が長くなるほどＳｉＯ_２の存在を示す２シータ＝２２°のピークは小さくなった。そして７０〜１２０分の間では、ダイヤモンド構造をもつＳｉに由来する回折ピークだけになった。この範囲内で、エッチング時間に伴う各々の回折ピークのブロードニングは、Ｓｉナノ粒子のサイズダウンに基づく。一方、１２０分を超えると、２シータ＝１７°付近にＳｉ−Ｆ−Ｏ系の副次生成物が形成する。それゆえ、当該濃度のフッ化水素酸水溶液を用いてエッチングを行う際には、７０〜１２０分の間でＳｉナノ粒子のサイズを制御するのが良いと考えられる。

［実験例２］
本発明で提案した水溶性蛍光標識材はダブルシェル構造をもつＳｉナノ結晶で構成される。具体的には、１つ以上のＳｉナノ結晶をコアにもち、各ナノ結晶は発光特性を安定化させるために炭化水素膜で終端されている。そして水溶性を付与するブロック共重合体を外殻にもつ。実施例２では水溶性蛍光標識材（ダブルシェル構造により水溶化したＳｉナノ粒子）の典型的な合成方法と水系溶媒中での可溶性及び安定性を議論し、実施例３では、外殻の存在が発光特性を減じないことを実証する。

＜実施例２＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１５０℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で８０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。次にナノ結晶のトルエン分散液をプルロニック分散液と混合した。プルロニックにはＦ１２７を用い、酸水溶液（水：ＨＣｌ＝１０：１）中に溶媒和させることでプルロニック分散液を得た。１時間混合した後にトルエン相を除去した。透析により未反応のプルロニックおよび塩化水素を取り除いた。乾燥することで生成物を得た。生成物を純水、生理的塩溶液、りん酸緩衝食塩液へ、各々分散させた後に静置した。所定の時間静置し分散性および安定性を評価した。評価は目視および蛍光分光光度計にもとづき行った。

＜実施例３＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１５０℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で８０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。次にナノ結晶のトルエン分散液をプルロニック分散液と混合した。プルロニックにはＦ１２７を用い、酸水溶液（水：ＨＣｌ＝１０：１）中に溶媒和させることでプルロニック分散液を得た。１時間混合した後にトルエン相を除去した。透析により未反応のプルロニックおよび塩化水素を取り除いた。生成物を乾燥後に、無蛍光水に再分散させた。蛍光分光光度計を用いてフォトルミネッセンス（ＰＬ）スペクトルと励起スペクトルを測定した。また励起極大で励起した時のＰＬ量子収率を絶対法で見積もった。

＜実施例４＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃〜１２５０℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で８０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。次にナノ結晶のトルエン分散液をプルロニック分散液と混合した。プルロニックにはＦ１２７を用い、酸水溶液（水：ＨＣｌ＝１０：１）中に溶媒和させることでプルロニック分散液を得た。１時間混合した後にトルエン相を除去した。透析により未反応のプルロニックおよび塩化水素を取り除いた。生成物を乾燥後に、無蛍光水に再分散させた。蛍光分光光度計を用いてフォトルミネッセンス（ＰＬ）スペクトルと励起スペクトルを測定した。

＜比較例２＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１５０℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で８０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。当該ナノ結晶を乾燥後、無蛍光ジクロロメタンに再分散させた。蛍光分光光度計を用いてフォトルミネッセンス（ＰＬ）スペクトルと励起スペクトルを測定した。また励起極大で光励起した時のＰＬ量子収率を絶対法で見積もった。

＜比較例３＞
本発明で作製したサンプルの蛍光量子収率は絶対法により測定した。同一の装置を使用し、２種類の蛍光色素を絶対法で見積もった。Ｃｙ７（商品コード１５０２０，フナコシ株式会社）を測定したところ蛍光量子収率は３０．３％、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ７５０，Ａｍｉｎｅ（商品コード８１２６７，フナコシ株式会社）の蛍光量子収率は１０．８%と見積もられた。これらの値は、それぞれの色素の販売会社が公開している蛍光量子収率３０％および１２％とほぼ一致した。

＜実施例２、３、４と比較例２、３との比較・検討＞
実施例２で得たサンプルは純水中に容易に分散したが、ジクロロメタンやアルカン系溶媒には分散しなかった。一方で、比較例２で得たサンプルはジクロロメタンやアルカン系溶媒には容易に分散したが、純水には分散しなかった。この違いは目視で容易に判別できた。これらの結果から比較例２で作製されたサンプルは、オクタデカンで終端されたＳｉナノ結晶であり、オクタデカン単分子膜の存在により油溶性を示した。実施例２で作製したサンプルは、オクタデカン単分子で終端されたＳｉナノ結晶をブロック共重合体で被覆することで、親水基が外に配設されたナノ構造を有していると考えられた。図３にこれら２つのサンプルの典型的な透過型電子顕微鏡像を示す。いずれのナノ結晶を見てもナノ結晶間距離が一定である。そして、ナノ結晶同士が結合した領域がない。以上より、オクタデカン単分子膜の被覆密度は高いと考えられる。また、ブロック共重合体の一つであるプルロニック水溶液中で処理したサンプルの透過型電子顕微鏡では、単一ナノ結晶で存在している粒子、複数個のナノ結晶が凝集している粒子、数十個のナノ結晶が凝集している粒子がそれぞれ観察された。オクタデカン単分子膜の存在ゆえに、各凝集体を構成するナノ結晶は互いに一定のナノ結晶間距離を保っていた。それゆえ、本発明の水溶性蛍光標識材は図１に示すようなナノ構造で構成されていると考えられる。具体的には、コアは１個以上のＳｉナノ結晶で構成されている。各ナノ結晶表面は炭化水素鎖で終端されており、当該炭化水素膜の分子密度は高い。１個以上のナノ結晶から構成される油溶性ナノ粒子はブロック共重合体で覆われている。本発明ではプルロニックをブロック共重合体の一例として用いた。炭化水素膜で修飾されたナノ結晶表面へはプルロニック分子の低親水性ブロックが疎水性相互作用を通じて化学吸着し、一方プルロニック分子の親水性ブロックが外側に向くことで水溶性を与えている。

プルロニックで保護された水溶性ナノ粒子は、純水だけでなく、生理的塩溶液、りん酸緩衝食塩液にも容易に分散し、目視する限りにおいて半年以上の長期にわたって分散性に変化はなかった。また、ＰＬスペクトルにも変化のないことから、光学特性を決定するコアを内殻及び外殻が廃れることなく被覆した結果、発光機能が劣化しないと結論できる。

実施例３で得たサンプルのＰＬスペクトル及び励起スペクトルを図４に示す。励起極大で光励起した時にＰＬ極大は９８５ｎｍに観察された。励起極大は３８６ｎｍに観察された。励起−発光間のストークスシフトは約６００ｎｍであった。このような大きなストークスシフトはダイヤモンド構造結晶をもつシリコンナノ結晶に特徴付けられる特性である。ＰＬスペクトルの半値幅は１６８ｎｍ（２２０ｍｅＶ）と見積もられた。蛍光量子収率は３１．３％であった。一方、比較例１で取得されたＰＬスペクトルの蛍光極大は９８５ｎｍにあった。ＰＬスペクトルの半値幅は１６７ｎｍ（２１８ｍｅＶ）であった。また、蛍光量子収率は３１．０％であった。０．３％は実験誤差に含まれることから、本発明において用いたブロック共重合体で構成される外殻は発光特性に影響を及ぼさないことが分かった。

実施例４を通じて作製された水溶性ナノ粒子の典型的なＰＬスペクトルを図５に示す。熱処理時間は３価のＳｉが、０価と４価のＳｉに不均化した際の０価Ｓｉナノ結晶のサイズを決定する。熱処理温度が高く時間が長い方が初期の結晶径が大きくなる。同条件で熱処理した各サンプルにおいて、フッ化水素酸水溶液中での撹拌時間が長いほどシリコン結晶もエッチングされ、粒子径が小さくなる。結果として、撹拌時間が長くなるに従い、ナノ結晶からのＰＬスペクトルは短波長側へシフトする。１．９〜６．１ｎｍの範囲で粒子径を制御することで７００〜１０００ｎｍの波長範囲でＰＬスペクトルを連続的に制御できる。Ｓｉのナノ結晶において粒度分布とＰＬスペクトルの半値幅は相関するので、作製されたＳｉナノ結晶を遠心分離およびカラムクロマトグラフィープロセスを通じて分級することで単分散性を上げることでＰＬスペクトル半値幅の小さいものが得られる。図５に典型的なＰＬスペクトル特性を示す。発光の量子収率は３０％より高く、スペクトルの半価幅は、図７に示す通り、全てのＰＬスペクトルにおいて１５０〜３００ｍｅＶの範囲であった。なお、図７には蛍光極大波長が１０５０ｎｍ付近までしかプロットされていないが、１０５０〜１１００ｎｍの範囲でも１０５０ｎｍ付近とほぼ同じであった。

［実験例３］
本発明の蛍光標識材が従来のシングルシェル構造に比べ水溶系溶媒中で高い安定性を示すことを実証するために、ｐＨ依存性を調べた。各ｐＨにおける水溶性粒子の安定性は、励起光として３６５ｎｍのＵＶ光を照射しながら蛍光を目視で観察することで判断した。

＜実施例５＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で１００分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。次にナノ結晶のトルエン分散液をプルロニック分散液と混合した。プルロニックにはＦ１２７を用い、酸水溶液（水：ＨＣｌ＝１０：１）中に溶媒和させることでプルロニック分散液を得た。１時間混合した後にトルエン相を除去した。透析により未反応のプルロニックおよび塩化水素を取り除いた。生成物を乾燥後に超純水に再分散させた後に、石英セルへ封入した。３６５ｎｍのＵＶ光で励起したところ赤色発光を得た。

＜比較例４＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で１００分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気したアクリル酸を含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、カルボキシル基で終端されたＳｉナノ結晶を得た。超純水に再分散させた後に、石英セルに封入した。３６５ｎｍのＵＶ光で励起したところ赤色発光を得た。

＜比較例５＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で１００分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気したアリルアミンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、カルボキシル基で終端されたＳｉナノ結晶を得た。超純水に再分散させた後に、石英セルに封入した。３６５ｎｍのＵＶ光で励起したところ赤色フォトルミネッセンスを示さなかった。

＜実施例５と比較例４、５との比較・検討＞
実施例５から得た水溶性ナノ粒子は、ｐＨ１．５〜１２の範囲で変化させても蛍光赤色は石英セルに封入された溶液全面から均一に放射されており、ｐＨの変化に依存せず安定に分散していると確かめられた。比較例４から得たカルボキシル基で終端されたＳｉナノ結晶は、図６に示す通りｐＨ１．７〜９．２の範囲では溶液全面から均一に蛍光が放射されたが、ｐＨ１０を超えると粒子の凝集が始まり、ｐＨ１２を超えると粒子は沈澱し溶液からの蛍光は見られなくなった。比較例５から得たアミノ基で終端されたＳｉナノ結晶は赤色蛍光を示さなかった。これは、アミノ基の窒素のローンペアが最表面Ｓｉ原子と相互作用することで形成する分子軌道がＳｉナノ構造中に形成したエネルギー準位間に形成されたためであると考えられる。それゆえ、光励起により発生した電子―ホール対は、Ｓｉのナノ構造で規定されるＨＯＭＯ−ＬＵＭＯ遷移ではなく、新たに形成された界面準位を経由して起こると考えられる。実証の一つとして、消光したと考えられたＰＬは８５０ｎｍへレッドシフトしていた。

［実験例４］
内殻を形成する炭化水素単分子膜の酸化抑制効果を調べるために、水素終端Ｓｉナノ結晶とオクタデセン終端Ｓｉナノ結晶の乾燥粉末を大気に暴露して、酸素に対する反応性を調べた。結晶相の同定は粉末Ｘ線回折法から調べた。

＜実施例６＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で９０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。２週間大気放置した後に粉末Ｘ線回折で分析したところ回折図形に変化はなかった。

＜比較例６＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で９０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。２週間大気放置した後に粉末Ｘ線回折で分析したところ、Ｓｉの結晶相を示す回折は見受けられず、代わりに、２１°附近に酸化シリコンの形成を示すブロードなピークが見られた。

＜実施例６と比較例６との比較・検討＞
実施例６で作製したオクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶は、２週間の大気暴露下においても粉末Ｘ線回折図形に変化無く、それゆえ、シェラーの式から見積もることのできる結晶サイズにも変化無かった。これは、図３に示す透過型電子顕微鏡像から議論された通り、オクタデカン分子の末端炭素がナノ結晶最表面のＳｉと共有結合で強く結びつき、さらに、オクタデカン単分子膜内では炭化水素間で発生する疎水性相互作用を通じて高い密度のオクタデカン分子が結晶表面を覆っているために、酸素の侵入が阻害されたと考えられる。一方、比較例６の水素終端Ｓｉナノ結晶では容易に酸化が進んだ。水素原子はケイ素原子に比べると小さく、大気中に存在する酸素種の中でも特に反応性の高い活性酸素は容易にナノ結晶最表面まで接近できケイ素と反応、その後結晶内部へ拡散することで酸化が進んだと考えられる。通常、大気中に置かれた水素終端化Ｓｉの酸化はバルク結晶のウェハーでも起きる。酸化膜の厚さは季節によって多少の差があるが、室温下では１．７〜２．１ｎｍであるので、蛍光発光特性を示すＳｉナノ粒子であれば酸化されて酸化シリコンナノ粒子になるのは納得できる。

［実験例５］
本発明の蛍光標識材の細胞毒性を調べた。本発明で記載のナノ構造を用いた場合に高い細胞生存率が達成されることを示す。また二光子励起によるバイオイメージングを行った。

＜実施例７＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で８０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。次にナノ結晶のトルエン分散液をプルロニック分散液と混合した。プルロニックにはＦ１２７を用い、酸水溶液（水：ＨＣｌ＝１０：１）中に溶媒和させることでプルロニック分散液を得た。１時間混合した後にトルエン相を除去した。透析により未反応のプルロニックおよび塩化水素を取り除いた。当該水溶性蛍光標識材の細胞毒性試験は、Cell Counting Kit-8を用いておこなった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の懸濁液をDulbecco's Modified Eagle Medium（通称：ＤＭＥＭ）培地へ分配した。尚、培地には、１０％の fetal bovine serum、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンが添加された。これを３７℃、５％二酸化炭素を含む加湿空気中で１日インキュベート後に、蛍光標識材を所定量添加して３７℃、５％二酸化炭素を含む加湿空気中で１日インキュベートした。これに１０μＬのＣＣＫ−８溶液を添加し、２４時間インキュベート後に、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度から細胞生存率を調べた。水溶性蛍光標識材の濃度を２５〜５００μｇ／ｍＬまで増加させた時、３００μｇ／ｍＬまではＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率はほぼ１００％、５００μｇ／ｍＬの高濃度下においても９５％以上の生存率を示した。

＜実施例８＞
トリエトキシシランを加水分解することで得たＨＳｉＯ_１．５を真空下、１１００℃で不均化することで、Ｓｉナノ結晶を内包するＳｉＯ_２を得た。フッ化水素酸水溶液中で８０分撹拌することで、ＳｉＯ_２を除去し、水素終端化されたＳｉナノ結晶（Ｈ−Ｓｉ）を得た。Ｈ−Ｓｉナノ結晶を予め脱気した１−オクタデセンを含むメシチレン中で１５０℃熱処理することで、オクタデカン単分子膜で終端されたＳｉナノ結晶を得た。次にナノ結晶のトルエン分散液をプルロニック分散液と混合した。プルロニックにはＦ１２７を用い、酸水溶液（水：ＨＣｌ＝１０：１）中に溶媒和させることでプルロニック分散液を得た。１時間混合した後にトルエン相を除去した。透析により未反応のプルロニックおよび塩化水素を取り除いた。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１ｍＬあたり１０^５個の細胞を含むように調製し、所定のガラス基板上へ配設した。これに１００μｇ／ｍＬの７８０ｎｍに発光極大をもつ水溶性Ｓｉナノ粒子を作用させ、２４時間インキュベートした。リン酸バッファーで数回洗浄したあとに、パラフォルムアルデヒドで固定化することで蛍光イメージング用試料とした。

蛍光イメージングは二光子励起法を用いた。波長７９０ｎｍのフェムト秒チタンサファイアレーザパルスを励起光源とし、二光子励起発光をダイクロイックミラー、フィルターによって分離し、試料を３９５ｎｍに相当するフォトンエネルギーで励起したところ、蛍光コントラストの高いＮＩＨ３Ｔ３細胞のイメージング像を獲た。

＜比較例７＞
近年の水溶性Ｓｉナノ粒子の細胞毒性試験の結果を記載することで比較例とする。
・リン脂質のミセルで保護されたＳｉナノ粒子の膵臓がん細胞毒性をMTT試験で評価したところ、ナノ粒子濃度が４μｇ／ｍＬを超えると細胞生存率は単調に減少を始め１０μｇ／ｍＬで８０％、１２μｇ／ｍＬで６０％を下回る（非特許文献９）
・リシンで修飾されたＳｉナノ粒子の膵臓がん細胞毒性をＭＴＳ試験で評価したところ、ナノ粒子濃度が２００μｇ／ｍＬまでは細胞生存率１００％であったが、５００μｇ／ｍＬでは６０％まで減少した（非特許文献１０）。
・エポキシ基、アミノ基、ジオール基で終端されたＳｉナノ粒子のＡ５４９細胞およびＨｅｐＧ２ヒト肝癌由来細胞に対する細胞毒性をＭＴＴ試験で評価したところ、５０μｇ／ｍＬまでは、ほぼ細胞生存率１００％であったが、１００μｇ／ｍＬを超えると生存率が５０〜６０％まで減少し、２００μｇ／ｍＬを超えると２０％以下になった（非特許文献１１）。
・アミノ基、カルボキシル基で終端されたＳｉナノ粒子のＨｅｌｌａ細胞毒性をＭＴＴ試験で評価したところ、ナノ粒子濃度が６０μｇ／ｍＬを超えると生存率が８０％まで減少した（非特許文献１２）。
・カルボキシ基で終端されたＳｉナノ粒子を分子量の高いポリエチレングリコールのミセルに封入した水溶性蛍光標識の膵臓がん細胞毒性をＭＴＳ試験で評価したところ、ナノ粒子濃度が２００μｇ／ｍＬまでは細胞生存率１００％であったが、５００μｇ／ｍＬでは６０％以下になった（非特許文献１３）。

＜実施例７、８と比較例７との比較・検討＞
細胞毒性はこれまで単分子膜で構成されるシングルシェル形成により水溶性化したＳｉナノ粒子において研究されてきた。従来、Ｓｉナノ粒子を対象にした細胞毒性は、表面官能基に強く依存されると報告され、チオール基は細胞毒性を増加させ、アミノ基やエステル基などは低細胞毒性基と考えられてきた。ところが、比較例７から、ナノ粒子の高濃度環境下では、アミノ基やエステル基なども細胞毒性が高いことが明らかになった。生体親和性の高いことで知られ他のナノ粒子においても表面保護材に使われるポリエチレングリコールを高分子量で保護しても、本発明の蛍光標識材に比べると毒性がある。さらにリン脂質などの生体親和性の高い表面保護層を用いても本発明の水溶性蛍光標識材と比較すると細胞毒性が高いと言える。プルロニック系界面活性剤の生体親和性はよく知られているが、細胞毒性の低さはプルロニックのもつ分子化学的な性質だけに依存するのではなく、内殻の存在により外殻の薄膜構造が自己組織化的に制御され、その結果として緻密親水膜を粒子最表面へ露出できたことによると考えられる。

実施例８において、二光子励起によって細胞の蛍光イメージングを行った。入射光は７９０ｎｍであるので、３９５ｎｍに相当するフォトンエネルギーで蛍光体を励起したことになる。図３より３９５ｎｍは励起極大に非常に近い波長であることから、蛍光体を効率良く励起したことになる。蛍光体には７８０ｎｍに蛍光極大をもつナノ粒子であることから、本イメージングは生体分光窓に相当する波長範囲で行われたことを意味している。重要な点は、フェムト秒レーザーのなかでもっとも汎用される波長７９０ｎｍは、本発明ナノ粒子全てを効率良く光励起できる波長に相当することである。たとえば、実施例８で使用したナノ粒子は、図５に記載の通り、励起極大で光励起することで、絶対蛍光量子収率４０％を超える効率で発光するため、励起強度が微弱で済み、コントラスの高い蛍光イメージングを提供できた。

以上説明したように、本発明によれば、発光効率が良くまた安定して発光するシリコンナノ粒子が得られ、これを例えば生体の蛍光イメージングのための蛍光標識材に応用できるため、産業上の利用可能性は大きいものがある。

特開２００６-７７１２４号公報 特開２００９−２２７７０３号公報 特開２００９−２５６５３０号公報 特開２０１３−２２７２５３号公報 特開２０１３−５６９１６号公報 特表２０１３−５０４６９２号公報

Small,2011,7,199. https://www.env.go.jp/kijun/wt1.html ACS Nano 2011, 5, 413. Physical Chemistry Chemical Physics 2011, 13, 7284. Science and Technology of Advanced Materials, 2014, 15,014207. ACS Nano 2011, 5, 413. Journal of Physical Chemistry Letters 4 (2013) 402. 日本油化学会誌 ４９（２００）１０７１：プルロニック系界面活性剤の総説 ACS Nano, 2008, 2, 873-878. Bioconjugate Chemistry, 2011, 22, 1081-1088. J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 248-253. Langmuir 2014, 30, 5209-5216. ACS Nano 2011, 5, 413-423.

Claims (9)

1. ダイヤモンド構造を有する一つまたは複数のシリコンナノ結晶と、
   前記シリコンナノ結晶のそれぞれの表面を覆う炭化水素膜と、
   前記表面が炭化水素膜で覆われた一つまたは複数のシリコンナノ結晶を覆うブロック共重合体と
   を設けた水溶性であり、励起光の照射により近赤外域で発光するシリコンナノ粒子。
2. 励起光の照射により７００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のピーク波長で発光する、請求項１に記載のシリコンナノ粒子。
3. 前記発光のスペクトルの半値幅は１５０ｍｅＶ〜３００ｍｅＶである、請求項２に記載のシリコンナノ粒子。
4. 発光量子収率が３０％以上である、請求項１から３の何れかに記載のシリコンナノ粒子。
5. 前記一つまたは複数のシリコンナノ結晶はサイズが１．９ｎｍ〜６．１ｎｍの範囲である、
   請求項１から４の何れかに記載のシリコンナノ粒子。
6. 前記シリコンナノ結晶は単分散粒子である、請求項１から５の何れかに記載のシリコンナノ粒子。
7. 近紫外域の励起光の照射による二光子吸収に基づいて近赤外域で発光する、請求項１から６の何れかに記載のシリコンナノ粒子。
8. 前記ブロック重合体がプルロニック系界面活性剤である、請求項１から７の何れかに記載のシリコンナノ粒子。
9. 請求項１から８の何れかに記載のシリコンナノ粒子を有する蛍光標識材。