JP2016158541A

JP2016158541A - 香気成分を高める方法

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Publication number: JP2016158541A
Application number: JP2015039124A
Authority: JP
Inventors: 美佐落合; Misa Ochiai
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2016-09-05
Anticipated expiration: 2035-02-27
Also published as: JP6558917B2

Abstract

【課題】短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの新たな生成方法が求められていた。
【解決手段】本発明は、酵母由来の酵素ＹＭＲ２１０ｗもしくはＥＨＴ１またはその変異体を用いて、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成する方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、香気成分を高める方法に関する。

ビールには、ホップ由来の成分から生成する香気成分がいくつか存在することが知られている（非特許文献１）。そのような香気成分のうち、分岐脂肪酸のエチルエステルである以下の成分（１）〜（３）は、ホップや麦汁中にはわずかしか存在しないが、発酵させることで大きく増加することが知られており（非特許文献１）、酵母によりホップに含まれる分岐脂肪酸が変換することで以下の成分（１）〜（３）が生成されるものと推定される。

（１）イソ酪酸エチル（ｅｔｈｙｌｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ：ＣＡＳ番号：９７−６２−１）（明細書中、「ＥＩＢ」と記載する場合がある。）；
（２）ＤＬ−２−メチル酪酸エチル（ｅｔｈｙｌＤＬ−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ：ＣＡＳ番号：７４５２−７９−１）（明細書中、「Ｅ２ＭＢ」という場合がある。）；および
（３）イソ吉草酸エチル（ｅｔｈｙｌｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ：ＣＡＳ番号：１０８−６４−５）（明細書中、「Ｅ３ＭＢ」という場合がある。）

また、イソ吉草酸エチルは、発酵焙煎コーヒー豆にも含まれ、コーヒーの香り成分としても重要である（特許文献１）。発酵処理をしていないコーヒー生豆やそれを焙煎したコーヒー豆には、イソ吉草酸エチルが含まれるものは見出されないことから、イソ吉草酸エチルは発酵処理を施すことによって特異的に生成される化合物であると考えられている。以上のことから、上記の（１）〜（３）は、ビールやコーヒーに限らず広く発酵食品において発酵工程を経て生成する香気成分であると考えられる。

しかしながら、この反応に関与する遺伝子は同定されていなかった。

酵母では、アシルＣｏＡ：エタノールＯ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子として、ＥＨＴ１（ＹＢＲ１７７ｃ）とＥＥＢ１（ＹＰＬ０９５ｃ）が知られており、そのホモログとして、ＹＭＲ２１０ｗも知られている。

ＥＨＴ１はヘキサン酸（Ｃ６）エチルやオクタン酸（Ｃ８）エチルの生合成に関与しており、またＥＥＢ１はＣ４〜Ｃ１０の直鎖脂肪酸エチル（ブタン酸（Ｃ４）エチル、ヘキサン酸（Ｃ６）エチル、オクタン酸（Ｃ８）エチル、デカン酸（Ｃ１０）エチル）の生合成に関与しており、両者は、特にヘキサン酸エチルの生合成に関与していることが知られている。一方、ＹＭＲ２１０ｗは少なくとも直鎖の短鎖〜中鎖脂肪酸エチルエステルの生合成には関与していない可能性が示唆されており（非特許文献２、非特許文献３）、その機能は未知であった。

さらに、酵母では、アルコールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ１とＡＴＦ２）がアルコールとアセチルＣｏＡからアセテートエステルを生成することが知られているが、これらを高発現させることで、各種アセテートエステル以外にもヘキサン酸エチルが増加することが知られている（非特許文献３）。

ホップにおいて分岐脂肪酸は、α酸、β酸の前駆体として生成することが知られている。すなわち、分岐アミノ酸であるバリン、イソロイシン、およびロイシンの分解により、分岐脂肪酸として、それぞれ、イソ酪酸（ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ：ＣＡＳ番号：７９−３１−２）（明細書中、「ＩＢ」という場合がある）、ＤＬ−２−メチル酪酸（ＤＬ−２−Ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ：ＣＡＳ番号：１１６−５３−０）（明細書中、「２ＭＢ」という場合がある）、およびイソ吉草酸（ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃａｃｉｄ：ＣＡＳ番号：１１６−５３−０）（明細書中、「３ＭＢ」という場合がある）が生成され、これらの短鎖分岐脂肪酸がＣｏＡ−型でホップのトリコームに蓄積していることが知られている（非特許文献４）。

ＷＯ２０１１／０９６２８３

Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，５４（２３），８８５５−８８６１（２００６）Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２８１（７），４４４６−４４５６（２００６）ＭｉｃｒｏｂｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１６５−１７７，（２０１０）ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，１３，１２（２０１３）

上記のような状況の下、香気成分である短鎖分枝脂肪酸エチルエステルの新たな生成方法が求められていた。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、酵母由来の酵素ＹＭＲ２１０ｗおよびＥＨＴ１が、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を用いて、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成する方法。
（ａ）配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［２］前記ポリヌクレオチドが、配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記［１］に記載の方法。
［３］前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、上記［１］に記載の方法。
［４］前記短鎖分岐脂肪酸が、ＤＬ−２−メチル酪酸、イソ酪酸、またはイソ吉草酸である、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが、ＤＬ−２−メチル酪酸エチル、イソ酪酸エチル、またはイソ吉草酸エチルである、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記発現ベクターが形質転換酵母に導入されたものである、上記［６］に記載の方法。
［８］前記短鎖脂肪酸エステルが、飲食品内に生成される、上記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］前記飲食品が発酵過程を経て製造される飲食品である、上記［８］に記載の方法。
［１０］前記飲食品が、酒類である、上記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］前記酒類が、麦芽使用飲料である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］短鎖分岐脂肪酸を生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生産方法。
（ａ）配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［１３］前記ポリヌクレオチドが、配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記［１２］に記載の方法。
［１４］前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、上記［１２］に記載の方法。
［１５］前記短鎖分岐脂肪酸がＤＬ−２−メチル酪酸であり、ＤＬ−２−メチル酪酸がエチルエステル化され、ＤＬ−２−メチル酪酸エチルが生産される、上記［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］前記形質転換体が、形質転換酵母または形質転換植物である、上記［１２］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法。

本発明により、香気成分である短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの新たな生成方法が提供される。本発明の好ましい態様の生成方法によれば、香気成分である短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを効率よく生成することができる。

各酵素のＥ２ＭＢ生成能を評価した結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。

「ＹＭＲ２１０ｗ」は、酵母由来の酵素であり、そのｃＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、および配列番号２に示される。

「ＥＨＴ１」は、酵母由来の酵素であり、そのｃＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３、および配列番号４に示される。

これらのポリヌクレオチドおよび酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。

１．短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生成方法
本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という場合がある）にコードされるタンパク質を用いて、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成する方法（以下、「本発明の短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生成方法」）を提供する。

（ａ）配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

「短鎖分岐脂肪酸」とは、炭素数４〜１０の分岐脂肪酸であり、イソ酪酸、ＤＬ−２−メチル酪酸、イソ吉草酸、２−メチルペンタン酸、２−メチルヘキサン酸、２−エチルヘキサン酸、２−メチルヘプタン酸、２−エチルオクタン酸などが挙げられる。本発明における「短鎖分岐脂肪酸」は、好ましくは、イソ酪酸、ＤＬ−２−メチル酪酸、およびイソ吉草酸からなる群から選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、イソ酪酸、ＤＬ−２−メチル酪酸、またはイソ吉草酸であり、さらに好ましくは、ＤＬ−２−メチル酪酸である。

「短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化」することには、短鎖分岐脂肪酸が、先ず、別の酵素によってＣｏＡとエステル結合した短鎖分岐脂肪酸（以下、「ＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸」という）になり、ＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸と本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が反応して、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが生成することが含まれてよい。この場合、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の基質は、ＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸となる。

「ＣｏＡとエステル結合した短鎖分岐脂肪酸」または「ＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸」とは、ＣｏＡ（補酵素Ａ）がその末端のチオール基で上記短鎖分岐脂肪酸とチオエステル結合を形成したものである。

「短鎖分岐脂肪酸エチルエステル」とは、炭素数４〜１０の分岐脂肪酸のエチルエステルであり、上記した短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化して得られる化合物が挙げられる。「短鎖分岐脂肪酸エチルエステル」は、好ましくは、香気成分となる短鎖分岐脂肪酸エチルエステルであり、より好ましくは、イソ酪酸エチル、ＤＬ−２−メチル酪酸エチル、およびイソ吉草酸エチルからなる群から選択される少なくとも１つであり、さらに好ましくは、ＤＬ−２−メチル酪酸エチル、イソ酪酸エチル、またはイソ吉草酸エチルであり、特に好ましくは、ＤＬ−２−メチル酪酸エチルである。

「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。

配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。

「配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、例えば、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。

「１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜４５個のアミノ酸配列中の位置において、１〜４５個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。

Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。

また、このようなタンパク質としては、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。

「配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。

ここで、「短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性」とは、短鎖分岐脂肪酸から、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成する反応を触媒する活性を意味する。例えば、短鎖分岐脂肪酸が、先ず、別の酵素によってＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸になり、ＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸と本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が反応して、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが生成される場合には、前記活性は、ＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸を反応基質とする触媒活性でもよい。

短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性は、酵素剤となり得るタンパク質を、短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸と接触させて、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成し、得られた短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを精製し、精製したものをガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）や液体クロマトグラフィー（ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。「接触」とは、酵素剤となり得るタンパク質を、短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸と同一の反応系に存在させることを意味する。

「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２または４のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＶｏｌ．４，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ２０１２”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。

「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓＤｉｒｅｃｔＬａｂｅｌｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。

上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１または３の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。

なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７２２６４−２２６８，１９９０；ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

本発明の好ましい態様のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。本発明の別の好ましい態様のポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。

上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。

本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。本発明のポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」という。

適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。

本発明の発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。

ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主細胞の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５ＳＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５ＳＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。

発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ、URA3、TRP1、HIS3、LEU2、LYS2）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。

本発明の発現ベクターは、好ましくは、適切な宿主細胞に導入されたものである。本発明の発現ベクターが導入された宿主細胞を、「本発明の形質転換細胞」という。
本発明の形質転換細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞としては、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、糸状菌（麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。本発明のいくつかの態様では、形質転換細胞は、非ヒト形質転換細胞である。形質転換細胞は、好ましくは、形質転換酵母である。

宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６６，ｐ．４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２９，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３，１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００Ｅｄｉｔｉｏｎ：ＡＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。

その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＶｏｌ．４，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ２０１２”、”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。

形質転換細胞が、形質転換酵母である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされる本発明のタンパク質が発現され得るように酵母中に導入することによって取得される。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、酵母で発現した本発明のタンパク質が、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化する反応を触媒し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが酵母の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。

本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を、「本発明のタンパク質」という。本発明のタンパク質は、これをコードする本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃＬＬＣ製、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＩｎｃ．製、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。

本発明の短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生成方法では、本発明のタンパク質を用いて、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化する。本発明のタンパク質を用いるとは、本発明のタンパク質自体、または本発明のタンパク質を発現する本発明の形質転換細胞を、酵素剤として用いることを意味する。具体的には、酵素剤を、エタノールの存在下、短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸と接触させる。「接触」とは、本発明のタンパク質と短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明のタンパク質を入れた容器に短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸を添加すること、短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸を入れた容器に本発明のタンパク質を添加すること、本発明のタンパク質と短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸とを混合すること、本発明の形質転換細胞の培養容器に短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸を添加すること、本発明の形質転換細胞と短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸とを混合すること、および本発明の形質転換細胞を短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸の存在下で培養することが含まれる。

本発明の短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生成方法において、出発物質となる短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸は、公知の方法またはそれに準ずる方法によって調製してもよい。あるいは、出発物質となる短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸は、市販のものでもよい。短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸は、精製されたものを用いてもよいし、あるいは、短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸を生成する微生物（例えば納豆菌やビフィズス菌のような消化管内微生物）や植物（例えば、ホップ、コーヒー果実など）をそのまま用いてもよい。

イソ酪酸、ＤＬ−２−メチル酪酸、およびイソ吉草酸を、エチルエステル化すると、それぞれ、香気成分である、イソ酪酸エチル、ＤＬ−２−メチル酪酸エチル、およびイソ吉草酸エチルが生成される。本発明の好ましい態様では、ＤＬ−２−メチル酪酸をエチルエステル化してＤＬ−２−メチル酪酸エチルを生成する。

生成された短鎖分岐脂肪酸エチルエステルは、適切な溶媒（水等の水性溶媒、または、ジクロロメタン、アルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ（Ｈｉｇｈ）ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。

上述した本発明の発現ベクターを製造対象となる飲食品の製造に適した宿主細胞に導入し、その形質転換細胞を用いることによって、所望の飲食品で、かつ短鎖分岐脂肪酸エチルエステル含量が増加し、香味に優れた飲食品を製造することもできる。したがって、本発明の短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生成方法は、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが飲食品内に生成される方法も包含する。飲食品は、酒類、非アルコール飲料、食品およびこれらの原料をいい、好ましくは、発酵過程を経て製造される飲食品である。

酒類としては、例えば、ビール等の麦芽使用飲料（例えば、ビール、発泡酒などのアルコール飲料）、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。発酵過程を経て製造される非アルコール飲料としては、ビールテイスト飲料や茶飲料、乳酸発酵飲料、コーヒー飲料、豆乳飲料などが挙げられる。発酵過程を経て製造される食品としては、大豆発酵食品（しょうゆ、味噌、納豆など）、調味料（みりん、食酢、魚醤など）、乳製品（チーズ、ヨーグルトなど）、パン、その他動植物由来原料の発酵過程を経て得られる食品（漬物類、キムチ、ピクルス、ザワークラフト、鰹節など）が挙げられるが、それらは特に限定されるものではない。このような発酵食品の製造に用いられる原料としては、各種農産物、例えば、ホップ、麦芽、ブドウ、米、大麦、小麦、コーヒー豆（好ましくはコーヒー果実に対して酵母などを利用して発酵に基づく加工をして得られる発酵コーヒー豆）、茶葉や、水産物、畜産物などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

例えば、これらの飲食品を製造する場合は、親株の代わりに本発明の形質転換細胞、好ましくは形質転換酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。

２．非ヒト形質転換体を用いた短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生産方法
本発明のポリヌクレオチドを、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を細胞外に発現させ、本発明のタンパク質と、短鎖分岐脂肪酸またはＣｏＡ型短鎖分岐脂肪酸を接触させることにより短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成することができる。あるいは、宿主によっては、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成することもできる。

そこで、本発明は、短鎖分岐脂肪酸を生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）が導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生産方法を提供する。

「ポリヌクレオチド」は、前述の通りである。
配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。

「配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。

「配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。

「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、前述の通りである。

本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。

本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。適切な発現ベクターは、前述の通りである。

本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主は、特に限定されるものではなく、例えば、乳酸菌やビフィズス菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の細菌、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅなどの酵母、麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅなどの糸状菌、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、形質転換酵母または形質転換植物である。

宿主細胞の形質転換方法、その他一般的な分子生物学的な手法に関しては、前述の通りである。

形質転換体が、酵母である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように酵母中に導入することによって取得される。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、酵母で発現した本発明のタンパク質が、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化する反応を触媒し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが酵母の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
形質転換体が、植物である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように植物中に導入することによって取得される。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、分岐脂肪酸を生成する植物であれば特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、本発明のタンパク質が、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化する反応を触媒し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが植物中に生成される。

本発明のいくつかの態様の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの含有量が高く、その抽出物または培養液には、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを含む培養上清を得ることができる。

このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。

このようにして得られた短鎖分岐脂肪酸エチルエステルは、常法に従って、例えば、飲食品に使用することができる。このような使用によれば、発酵食品に限らず、広く飲食品などの香りを向上させることができる。また、このようにして得られた短鎖分岐脂肪酸エチルエステルは、常法に従って、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。

なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。

以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。

実施例１：酵母のゲノムＤＮＡの抽出
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ株（以下、「Ｓ２８８Ｃ」という）をＹＰＤ液体培地（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、およびグルコース２％）に植菌し、３０℃で１日間振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、Ｇｅｎとるくん（酵母用）ＨｉｇｈＲｅｃａｖｅｒｙ（タカラバイオ）でＤＮＡを回収した。

実施例２：候補遺伝子のクローン化
アルコール：アセチルトランスフェラーゼ遺伝子として、ＡＴＦ１とＡＴＦ２を、また、アシルＣｏＡ：エタノールＯ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子およびそのホモログとして、ＥＥＢ１、ＥＨＴ１およびＹＭＲ２１０ｗをそれぞれ、Ｓ２８８Ｃから調製したＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーの組み合わせで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）でＰＣＲにより増幅し、得られた断片をＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯＰＣＲクローニングキットを用いてクローン化した。

プライマー
Ｘｂａ−ＡＴＦ１−Ｆ２：５’−AATCTAGATGAATGAAATCGATGAGAAAAATCAGG−３’（配列番号１１）
Ｘｂａ−ＡＴＦ１−Ｒ２：５’−GGTCTAGATCTAAGGGCCTAAAAGGAGAGCTTT−３’（配列番号１２）

Ｘｂａ−ＡＴＦ２−Ｆ２：５’−AATCTAGATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATC−３’（配列番号１３）
Ｘｂａ−ＡＴＦ２−Ｒ２：５’−TATCTAGATTAAAGCGACGCAAATTCGCC−３’（配列番号１４）

ＳｃＥＥＢ１−Ｆ：５’−ATGTTTCGCTCGGGTTACTATCCAAC−３’（配列番号１５）
ＳｃＥＥＢ１−Ｒ：５’−TTATAAAACTAACTCATCAAAGCTGCCCAA−３’（配列番号１６）

Ｓａｃ−ＳｃＥＨＴ１−Ｆ：５’−AAGAGCTCATGTCAGAAGTTTCCAAATGGCC−３’（配列番号１７）
Ｂａｍ−ＳｃＥＨＴ１−Ｒ：５’−TCGGATCCTCATACGACTAATTCATCAAACTTAGTGAA−３’（配列番号１８）

ＹＭＲ２１０ｗ−Ｆ：５’−ATGCGTCTAAAAGAATTGTTACCTAATTTTTTG−３’（配列番号１９）
ＹＭＲ２１０ｗ−Ｒ：５’−CTAATTCGCGCGAAAGGTTGTG−３’（配列番号２０）

ＹＭＲ２１０ｗ、ＥＨＴ１、ＥＥＢ１、ＡＴＦ１、およびＡＴＦ２のｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９に示す。また、ＹＭＲ２１０ｗ、ＥＨＴ１、ＥＥＢ１、ＡＴＦ１、およびＡＴＦ２のｃＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０に示す。

実施例３：酵母発現ベクターの構築
酵母用の発現ベクターとしては、ＹＣｐ型の酵母ベクターであるｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８を用いた。このベクターでは酵母で構成的高発現する遺伝子であるＴＰＩ１遺伝子のプロモーターとターミネーターの間にＸｂａＩサイトがあり、ここに目的遺伝子を導入することで、目的遺伝子を構成的に高発現できることが期待できる。

ＡＴＦ１発現ベクターとして、クローン化したＡＴＦ１遺伝子を制限酵素ＸｂａＩとＳｐｅＩで切り出して得られた１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８のＸｂａＩサイトに挿入し、ベクターのＴＰＩ１プロモーターから当該遺伝子が発現される向きに挿入されたものを選抜し、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８−ＡＴＦ１とした。

ＡＴＦ２発現ベクターとして、クローン化したＡＴＦ２遺伝子を制限酵素ＸｂａＩで切り出して得られた１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８のＸｂａＩサイトに挿入し、ベクターのＴＰＩ１プロモーターから当該遺伝子が発現される向きに挿入されたものを選抜し、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８−ＡＴＦ２とした。

ＥＥＢ１発現ベクターとして、クローン化したＥＥＢ１遺伝子を制限酵素ＳｐｅＩとＮｏｔＩで切り出して得られた１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を末端平滑化して、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８をＸｂａＩで切断したあと、末端平滑化したものに挿入し、ベクターのＴＰＩ１プロモーターから当該遺伝子が発現される向きに挿入されたものを選抜し、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８−ＥＥＢ１とした。

ＥＨＴ１発現ベクターとして、クローン化したＥＨＴ１遺伝子を制限酵素ＳａｃＩとＢａｍＨＩで切り出して得られた１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を末端平滑化して、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８をＸｂａＩで切断したあと、末端平滑化したものに挿入し、ベクターのＴＰＩ１プロモーターから当該遺伝子が発現される向きに挿入されたものを選抜し、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８−ＥＨＴ１とした。

ＹＭＲ２１０ｗ発現ベクターとして、クローン化したＹＭＲ２１０ｗ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出して得られた１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を末端平滑化して、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８をＸｂａＩで切断したあと、末端平滑化したものに挿入し、ベクターのＴＰＩ１プロモーターから当該遺伝子が発現される向きに挿入されたものを選抜し、ｐＪＨＸＳＢ−Ｇ４１８−ＹＭＲ２１０ｗとした。

実施例４：酵母形質転換株の取得
宿主株としてはＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｌｙｓ２−８０１＿ａｍｂｅｒａｄｅ２−１０１＿ｏｃｈｒｅｔｒｐ１−Δ６３ｈｉｓ３−Δ２００ｌｅｕ２−Δ１）を使用し、酢酸リチウム法で形質転換を行った。

Ｇ４１８を８００ｍｇ／Ｌ添加したＹＰＤ寒天培地で生育できるものを形質転換株として選抜した。

実施例５：Ｅ２ＭＢ生成能の評価
得られた形質転換株を、Ｇ４１８を８００ｍｇ／Ｌ添加したＹＰＤ液体培地１０ｍＬに植菌し３０℃にて１日振とう培養した。遠心分離により菌体を全量回収した。Ｇ４１８を８００ｍｇ／Ｌ添加したＹＰＤ１０（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、およびグルコース１０％）液体培地に２ＭＢを２０μｇ／ｍＬになるように添加した培地に、回収した全量植菌し、３０℃にて５日間静置培養した。続いて、遠心分離により上清を回収した。培養上清１５ｍＬに、内部標準としてデカン酸メチルを添加した。ジクロロメタン１０ｍＬを添加したあと激しく撹拌し、遠心分離した。下層のジクロロメタン層を回収した後、残った上層にさらにジクロロメタン５ｍＬを添加し、同様にして下層を回収した。ジクロロメタン層を合わせて、適量の硫酸ナトリウムを添加して脱水し、スピードバックで１ｍＬ程度まで濃縮した後、５０℃の温浴で温めておよそ１００μＬにまで濃縮した。

ＧＣ−ＭＳ（アジレントテクノロジー５９９７Ａ）で以下の条件で分析し、内部標準法により定量した。
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ内径０．２５ｍｍ、長さ６０ｍ、膜厚０．２５μｍ
注入量：１μＬ
オーブン温度：３０℃、２分→５℃／分、２２０℃→２２０℃、３０分
スプリットレス
選択イオン検出（ＳＩＭ）モード：１０２１１５１３０（Ｅ２ＭＢ）、７１８８１１６（ＥＩＢ）、１０２１１５１３０（Ｅ３ＭＢ）

その結果を図１に示す。
コントロール株をはじめ、すべての株でＥ２ＭＢの生成を確認できた。Ｅ２ＭＢの生成量は、ＹＭＲ２１０ｗを高発現させた株ではコントロールに比べて１．８倍程度増加しており、ＥＨＴ１を高発現させた株では１．２倍程度、それぞれコントロールに比べて増加していた。これらのことから、培地中の２ＭＢが酵母によりＥ２ＭＢに変換されること、および、ＹＭＲ２１０ｗやＥＨＴ１が２ＭＢからＥ２ＭＢへの変換に関与していることが強く示唆された。

［配列番号１］ＹＭＲ２１０ｗのｃＤＮＡ配列である。
［配列番号２］ＹＭＲ２１０ｗのアミノ酸配列である。
［配列番号３］ＥＨＴ１のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号４］ＥＨＴ１のアミノ酸配列である。
［配列番号５］ＥＥＢ１のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号６］ＥＥＢ１のアミノ酸配列である。
［配列番号７］ＡＴＦ１のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号８］ＡＴＦ１のアミノ酸配列である。
［配列番号９］ＡＴＦ２のｃＤＮＡ配列である。
［配列番号１０］ＡＴＦ２のアミノ酸配列である。
［配列番号１１］実施例で用いたプライマーである（Ｘｂａ−ＡＴＦ１−Ｆ２）。
［配列番号１２］実施例で用いたプライマーである（Ｘｂａ−ＡＴＦ１−Ｒ２）。
［配列番号１３］実施例で用いたプライマーである（Ｘｂａ−ＡＴＦ２−Ｆ２）。
［配列番号１４］実施例で用いたプライマーである（Ｘｂａ−ＡＴＦ２−Ｒ２）。
［配列番号１５］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＥＥＢ１−Ｆ）。
［配列番号１６］実施例で用いたプライマーである（ＳｃＥＥＢ１−Ｒ）。
［配列番号１７］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（Ｓａｃ−ＳｃＥＨＴ１−Ｆ）。
［配列番号１８］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（Ｂａｍ−ＳｃＥＨＴ１−Ｒ）。
［配列番号１９］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（ＹＭＲ２１０ｗ−Ｆ）。
［配列番号２０］実施例で用いたオリゴＤＮＡである（ＹＭＲ２１０ｗ−Ｒ）。

Claims

以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を用いて、短鎖分岐脂肪酸をエチルエステル化し、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルを生成する方法。
（ａ）配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
前記短鎖分岐脂肪酸がＤＬ−２−メチル酪酸、イソ酪酸、またはイソ吉草酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記短鎖分岐脂肪酸エチルエステルが、ＤＬ−２−メチル酪酸エチル、イソ酪酸エチル、またはイソ吉草酸エチルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記発現ベクターが形質転換酵母に導入されたものである、請求項６に記載の方法。
前記短鎖脂肪酸エステルが、飲食品内に生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記飲食品が、発酵過程を経て製造される飲食品である、請求項８に記載の方法。
前記飲食品が、酒類である、請求項８または９に記載の方法。
前記酒類が、麦芽使用飲料である、請求項１０に記載の方法。
短鎖分岐脂肪酸を生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、短鎖分岐脂肪酸エチルエステルの生産方法。
（ａ）配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１または配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ短鎖分岐脂肪酸のエチルエステル化を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１または配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
前記短鎖分岐脂肪酸がＤＬ−２−メチル酪酸であり、ＤＬ−２−メチル酪酸がエチルエステル化され、ＤＬ−２−メチル酪酸エチルが生産される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記形質転換体が、形質転換酵母または形質転換植物である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。