JP2016155799A - インフルエンザ処置用の組換え型ヒトｃｃ１０タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【課題】肺のウイルス力価を低減し、それによりインフルエンザ感染、特にＡ型インフルエンザ感染、とりわけＨ１Ｎ１株インフルエンザ感染を処置、治療又は予防方法の提供。【解決手段】患者の組織におけるウイルス力価、特に肺組織におけるインフルエンザ力価を低下させるための、組換えヒトウテログロビンとしても知られる組換えヒトＣＣ１０（ｒｈＣＣ１０）を使用する方法。ｒｈＣＣ１０は、ウイルス感染、特にインフルエンザ感染の処置、治療、又は予防の医薬として用いられうる。とりわけ、ｒｈＣＣ１０の用量の臨界範囲、静脈内又は鼻腔内投与を広く含む、インフルエンザ感染の処置、治療、又は予防のために投与する方法。更に、上記方法及びヒトへのｒｈＣＣ１０の投与に有用な組成物。【選択図】なし
Description
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００９年１０月１５日出願の米国仮出願第６１／２５２，０２８号に基づく優先権を主張するＰＣＴ国際出願であり、その開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２００９年１０月１５日出願の米国仮出願第６１／２５２，０２８号に基づく優先権を主張するＰＣＴ国際出願であり、その開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、生体内でのウイルス力価を低減し、患者のウイルス性呼吸器感染を処置する方法に関する。本発明の実施形態は、Ａ型インフルエンザ、特にＨ１Ｎ１インフルエンザを含むインフルエンザ感染を処置する方法にも関する。さらに本発明の実施形態は、鼻腔内投与される及び／又は静脈内投与される、及び／又は吸入される組換え型ヒトＣＣ１０を使用して上記を処置する方法にも関する。
クララ細胞「１０ｋＤａ」タンパク質（ＣＣ１０）又はウテログロビン（ＵＧ）は、幾つかの粘膜上皮及び上皮起源の他の器官によって産生される小さいホモ二量体分泌タンパク質である（Mukherjee,1999）。ＣＣ１０は７０アミノ酸残基の２つの等しいサブユニットで構成され、それぞれが「４つのヘリックスバンドル」である二次構造モチーフを有し、システイン３と６９’、３’と６９の間の２つのジスルフィド結合によって逆平行方向に結合される（Matthews,1994;Morize,1997）。ＣＣ１０は同じ二次、三次及び四次構造を共有して、同様の機能を媒介すると考えられる小球状タンパク質（small globular proteins）の新興ファミリー（emerging family）の第１のメンバーである。２つのジスルフィド結合を含むホモ二量体はその一次形態で出現する。人体では、肺がＣＣ１０生成の主要部位であるが、幾つかの他の器官がこのタンパク質をコードするｍＲＮＡをこれより少ない量合成している（Singh,1987;Sandmoller,1994）。ＣＣ１０は、他のタンパク質、受容体及び細胞のタイプとの様々な相互作用に関して特徴付けられている抗炎症性及び免疫調節性タンパク質である（Mukherjee,1999及びPilon,2000で考察）。肺炎などのある程度の炎症を特徴とする幾つかの臨床状態で、より低レベルのＣＣ１０タンパク質又はｍＲＮＡが様々な組織及び流体サンプル内で検出されている（Nomori,1995）。
様々なタイプの肺感染におけるＣＣ１０タンパク質の生理学的性質が、１系統のＣＣ１０ノックアウトマウスで研究されている。ＣＣ１０ノックアウトマウスと野生型マウスをそれぞれ、２つの一般的なヒトの呼吸器系病原体である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）又はアデノウイルスに感染させる２つの研究で、野生型マウスの方が病原体のクリアランスは迅速であり、先天性免疫系により病原体を多く死滅させ、ウイルス及び細菌感染中のＣＣ１０欠乏に対する利点を示唆している（Hayashida,1999;Harrod,1998）。これは、ＣＣ１０が免疫抑制剤であると報告した過去の見解（Dierynck,1995;1996）と一致し、ＣＣ１０が細菌であれウイルスであれ、インフルエンザなどの感染に対する自然の免疫反応を抑制することを示す。したがって、ウイルス性又は細菌性の呼吸器感染がある状態でＣＣ１０を投与することが患者の利益となり得るとは考えられない。その後、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染する前に組換え型ヒトＣＣ１０タンパク質（ｒｈＣＣ１０）を使用してＣＣ１０の機能を回復させると、未処置のノックアウトマウスよりも迅速に感染のクリアランスを行うことができることが報告された（Wang,2003）。しかし、最近の研究によると、樹状細胞が抗原に曝露されるのと同時に存在した場合、ｒｈＣＣ１０は後天性免疫、特に抗原特異的Ｔ細胞の発現を防止することができ（Johansson,2007）、このことも、ｒｈＣＣ１０の投与が感染した患者を利することができないことを示す。このように、呼吸器感染中のｒｈＣＣ１０処置の潜在的な危険又は利点に関するこれまでの知見には矛盾があり、様々なタイプの呼吸器感染の処置に対するＣＣ１０の安全及び／又は有効な使用に関して結論を出すことはできない。インフルエンザ感染に対するＣＣ１０の効果に関する情報はない。本明細書は、Ａ型インフルエンザに対するin vivoにおけるｒｈＣＣ１０の効果の直接的検証、細胞レベルにおけるＣＣ１０の抗ウイルス効果の直接的検証、その作用のメカニズム、及びウイルス感染、及び特にインフルエンザ感染の処置及び／又は予防におけるその使用可能性について報告する。
インフルエンザはこの１２０年間に４回大発生し（１８８９年、１９１８年、１９５７年及び１９６８年）、世界中で推定５０００万人から１億人が死亡した。インフルエンザはオルトミクソウイルス、つまりエアロゾルによって、また汚染した表面と鼻粘膜との直接接触によって伝染し、呼吸器の上皮細胞を標的とするＲＮＡウイルスである。インフルエンザ感染は、発熱、咽頭炎及び筋肉痛、倦怠感、体重の減少、呼吸器鬱血、及び時には呼吸不全及び死亡などの重篤な症状を引き起こすことがある。インフルエンザは、健康な標準的個体において通常は１〜２週間で感染をクリアランスする後天性免疫反応（細胞傷害性Ｔ細胞及び抗体）を誘発する。トリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）、季節性インフルエンザＨ３Ｎ２、及びブタインフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）などのヒトに感染するインフルエンザの幾つかの亜型は、ノイラミニダーゼ阻害剤のような抗ウイルス薬で処置することができる。しかし、インフルエンザは急速に突然変異して、薬剤耐性株を発現させ（Moscona,2009）、したがって予防及び／又は処置に抗ウイルス薬を広く使用すると、これらの薬剤に対する耐性の発現を加速させることになる。したがって、インフルエンザ感染を処置し、治療して、予防するために、新しい処置薬が必要である。同様に、気道及び他の身体器官系におけるウイルス感染の大半に対して承認された治療法はない。
上記は、本発明の実施形態によって達成される目的の非限定的なリストを提供するものである。
本発明の実施形態の目的は、肺のウイルス力価を低減し、それによりインフルエンザ感染、特にＡ型インフルエンザ感染、とりわけＨ１Ｎ１株インフルエンザ感染を処置、治療又は予防することである。
本発明の実施形態のさらなる目的は、静脈内経路、吸入経路、又は鼻腔内経路によって（ＰＣＴ２００９による）、又は経路の組合せによってＣＣ１０を投与することにより肺のウイルス力価を低減して、インフルエンザ感染を処置、治療、又は予防することである。
本発明の実施形態の別の目的は、静脈内経路、吸入経路、又は鼻腔内経路、口腔経路、膣内経路によって、又は経路の組合せによってＣＣ１０を投与することによりウイルス力価を低減して、ウイルス感染を処置、治療、又は予防することである。
本発明の実施形態のさらに別の目的は、ＣＣ１０又はセクレトグロビンファミリーの他のメンバーを使用して細胞レベルでウイルス複製を阻害することである。
上記及び他の目的、特徴及び利点は、ウイルス力価を低減して、ウイルス感染を処置、治療又は予防するために、適切な間隔で与えられる用量の範囲で、又は１回分の用量でｒｈＣＣ１０を投与することによって、本発明の実施形態により達成される。
上記及び他の目的、特徴及び利点はまた、患者が、特定のウイルスに特徴的な症状によって、及び／又は標準的方法を使用したウイルスの培養、ウイルスの免疫学的検出及び／又はウイルス核酸の検出を通して患者サンプル中のウイルスを検出することによってウイルス感染を診断された場合に、適切な間隔で与えられる用量の範囲で、又は１回分の用量でＣＣ１０を投与することによって本発明の実施形態により達成される。
上記及び他の目的、特徴及び利点はまた、患者が、発熱、筋肉痛、及び鬱血の症状によって、及び／又は標準的方法を使用したウイルスの培養、ウイルスの免疫学的検出、及び／又はウイルス核酸の検出を通して患者サンプル（鼻洗浄、血液又は唾液サンプル）中のインフルエンザウイルスを検出することによって、インフルエンザ感染を診断された場合に、適切な間隔で与えられる用量の範囲で、又は１回分の用量でＣＣ１０を投与することによって、本発明の実施形態により達成される。
本発明の特定の態様では、肺のウイルス力価を低減して、インフルエンザ感染を処置、治療又は予防するために、ＣＣ１０が１日に体重１キログラム当たり１．５マイクログラムから１．５ミリグラムの範囲で各鼻孔にほぼ等しく分割された用量で、又は合計すると１日単位でこの用量の範囲を達成する複数の用量で、鼻腔内に投与される。
別の態様では、インフルエンザ感染を処置、治療又は予防するために、ＣＣ１０が１日に体重１キログラム当たり最大１０ミリグラムの用量で、又は合計すると１日単位でこの用量の範囲を達成する複数の用量で静脈内に投与される。
別の態様では、患者が、特定のウイルスに特徴的な症状によって、及び／又は標準的方法を使用したウイルスの培養、ウイルスの免疫学的検出及び／又はウイルス核酸の検出を通して患者サンプル中のウイルスを検出することによってウイルス感染を診断された場合、非ヒトＣＣ１０タンパク質が適切な間隔で与えられる用量の範囲で、又は１回分の用量で投与される。
さらに別の態様では、患者が、特定のウイルスに特徴的な症状によって、及び／又は標準的方法を使用したウイルスの培養、ウイルスの免疫学的検出及び／又はウイルス核酸の検出を通して患者サンプル中のウイルスを検出することによって、ウイルス感染を診断された場合、セクレトグロビンとの総称で知られているタンパク質のＣＣ１０ファミリーの別のメンバーが、適切な間隔で与えられる用量の範囲で、又は１回分の用量で投与される。
本発明の実施形態は、肺のウイルス力価を低減して、インフルエンザ感染を処置、治療又は予防するためのＣＣ１０の使用に関する。ＣＣ１０は、それぞれ添付書類Ａ及びＢとして本明細書に添付され、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３０２０７７９５号及びＰＣＴ／ＵＳ０９／４３６１３号に記載されたプロセスによって、又は医薬品グレードのｒｈＣＣ１０を産生する任意の他のプロセスを介して得られた組換え型ヒトＣＣ１０タンパク質（ｒｈＣＣ１０）であることが好ましい。本発明の実施形態のｒｈＣＣ１０は、他の経鼻、経肺、又は全身治療と一緒に、又はその治療なしで、又はその治療前に、又はその治療後に投与することができる。
用量
インフルエンザ感染の処置又は予防において、ｒｈＣＣ１０は、鼻腔内で各鼻孔に１日１〜３回で７〜１４日間、その後は１日おきにさらに１４日間、及びその後は、必要に応じて投与することが好ましい。ｒｈＣＣ１０は、患者が発熱、筋肉痛及び鬱血を経験し始める、又はインフルエンザと診断されるとすぐに投与することがさらに好ましい。
インフルエンザ感染の処置又は予防において、ｒｈＣＣ１０は、鼻腔内で各鼻孔に１日１〜３回で７〜１４日間、その後は１日おきにさらに１４日間、及びその後は、必要に応じて投与することが好ましい。ｒｈＣＣ１０は、患者が発熱、筋肉痛及び鬱血を経験し始める、又はインフルエンザと診断されるとすぐに投与することがさらに好ましい。
以下でさらに説明する所望の結果を実現するために、以下の実施形態で説明する投与方法に言及する。
１つの実施形態では、１日に体重１キログラム当たり約１．５マイクログラムから約５ミリグラムの範囲の用量に等しい鼻腔内ｒｈＣＣ１０を、１回分の用量又は複数の用量で投与することができる。別の実施形態では、当該用量の範囲でｒｈＣＣ１０を毎日投与することができる。さらに別の実施形態では、当該用量の範囲で少なくとも７日間毎日継続して、ｒｈＣＣ１０を投与することができる。さらなる実施形態では、当該用量の範囲で少なくとも１４日間毎日継続して、ｒｈＣＣ１０を投与することができる。さらに別の実施形態では、当該用量の範囲で１日おきに連続して３０日間、ｒｈＣＣ１０を投与することができる。また別の実施形態では、漸減する用量で毎日１０日間連続的に、ｒｈＣＣ１０を投与することができ、上記漸減用量は、最初の３日間の各投与は高用量、次の３日間は各投与に中程度の用量、及び最後の４日間の各投与は低用量を含むものとする。またさらに別の実施形態では、上記用量の範囲又は漸減用量で１日最大３回、約８時間おきにｒｈＣＣ１０を投与することができる。
別の実施形態では、上記用量のｒｈＣＣ１０をエアロゾルとして、鼻腔内噴霧又は洗浄によって、又はゲル又はクリームの塗布によって、又は鼻孔への滴下注入などの他の方法で患者の鼻腔内に投与することができる。
別の実施形態では、上記用量のｒｈＣＣ１０をエアロゾルとして、ネブライザ又は計量吸入器によって、又は肺又は気道に直接適用するなど他の方法で、患者に吸入させて投与することができる。
別の実施形態では、インフルエンザ感染の処置又は予防において、ｒｈＣＣ１０を体重１キログラム当たり１５マイクログラムから２０ミリグラムの用量で１日１〜３回を７〜１４日間、及びその後は１日おきにさらに１４日間、及びその後は、必要に応じて静脈内投与する。また別の実施形態では、１日単位で漸減する用量で連続１０日間、ｒｈＣＣ１０を投与することができ、上記漸減用量は、最初の３日間は投与毎に高い用量、２番目の３日間は投与毎に中位の用量、及び最後の４日間は投与毎に低い用量を含む。またさらに別の実施形態では、投与範囲又は漸減用量で１日最大３回、約８時間おきにｒｈＣＣ１０を投与することができる。
別の実施形態では、上記用量のｒｈＣＣ１０を、経鼻、吸入、及び静脈内経路を組み合わせて使用して患者に投与することができる。さらなる実施形態では、ｒｈＣＣ１０を上記方法に従い、抗ウイルス療法、抗生物質療法、鬱血除去薬、抗ヒスタミン薬、粘膜溶解薬、去痰薬、粘液抑制剤、界面活性剤、気管支拡張薬、血管収縮薬、副鼻洞痛鎮痛薬による、又は他の典型的な療法の前、療法の実施中、又は療法の後に投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を上記方法に従い投与して、肺のウイルス力価を低減して、インフルエンザ感染を処置、治療又は予防することができる。
上記ｒｈＣＣ１０の用量及び適用方法は、処置しているインフルエンザ感染の重症度、患者の全体的な健康状態、及び基礎疾患が存在するか否かに応じて、毎日、１日複数回、１日３回、１日おき、又は漸減的に投与することができる。例えば、感染が重症になるほど、それを効果的に処置するために大量のｒｈＣＣ１０が必要になる。医者は、患者の症状及び処置に対する反応に基づき、本発明の実施形態で述べるパラメータ及び用量の範囲内で、用量、製剤、及び適用方法をモニターし、調節できることが理解される。
製剤
ｒｈＣＣ１０を鼻腔内投与することができる鼻腔内製剤、装置、及び方法が、ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３６１３号に記載されており、それは参照により全体が本明細書に組み込まれる添付書類Ｂに再現されている。ｒｈＣＣ１０の静脈内製剤は、０．９％生理食塩水中の５．５ｍｇ／ｍｌ溶液で構成され、米国特許出願公開第２００３０２０７７９５号に記載され、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる添付書類Ａに再現されている。
ｒｈＣＣ１０を鼻腔内投与することができる鼻腔内製剤、装置、及び方法が、ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３６１３号に記載されており、それは参照により全体が本明細書に組み込まれる添付書類Ｂに再現されている。ｒｈＣＣ１０の静脈内製剤は、０．９％生理食塩水中の５．５ｍｇ／ｍｌ溶液で構成され、米国特許出願公開第２００３０２０７７９５号に記載され、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる添付書類Ａに再現されている。
実施例１
インフルエンザウイルスの増殖及び力価の測定
American Type Culture Collection（米国バージニア州マナッサス）から購入し、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザＡウイルスのストック（Ｈ１Ｎ１）を準備した。６０％コンフルエントの細胞単層（１５０ｃｍ２のフラスコ）に感染多重度（ＭＯＩ）０．０１のインフルエンザウイルスを感染させて、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣカタログ＃ＣＣＬ−３４）中でインフルエンザウイルスを増殖させる。３〜４日後、細胞変性効果が生じて、細胞の大部分が培養容器から離れたら、細胞及び上清を回収する。細胞を遠心分離（８００ｇ）で取り出し、上清を濾過して（０．４５μｍ）、４℃で２時間遠心分離し（１８０００ｇ）、ウイルスをペレットにする。ウイルスペレットをＤＭＥＭ培地中に再懸濁し、アリコートにして−１５０℃で保存する。０．１％のウシ血清アルブミン及びトリプシンが存在する状態で培養した９６穴プレート中で、０．１ｍｌの連続希釈したウイルスのストックをＭＤＣＫ細胞単層に加えることにより、インフルエンザウイルス力価を測定する。３日後、細胞変性効果を評点し、Kaerberの方法を使用して５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ５０）を測定した。
ウイルス負荷分析のための肺組織の処理
感染させたマウス及びコトンラットの肺の左葉及び右葉の切片を無菌状態で取り出し、計量して、Tissue Tearor装置（モデル＃９８５−３７０、Biopspec Products Inc.）を使用して、１ｍｌのＤＭＥＭ培地中で４５秒間ホモジナイズする。ホモジネートを３０００ｇで２０分間遠心分離する。清澄上清を採集し、使用するまで−１５０℃で凍結状態で保存する。
ウイルス力価の測定
増幅したウイルスのストック及び肺のホモジェネート中のウイルス力価は、連続希釈した後、プラーク形成アッセイ（ＰＦＡ）又はフォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によって測定した。研究開始前に、原サンプル１ミリリットル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）及びフォーカス形成単位（ＦＦＵ）を計算した。ＰＦＡ及びＦＦＡを実行するのに十分な１セットのインフルエンザサンプルを保存し、研究終了後にＰＦＵ及びＦＦＵを測定した。培養ウイルスの連続希釈溶液は、浄化培地（１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）中で１０１から１０８の希釈範囲にわたって準備した。各希釈溶液をプラーク形成アッセイ（ＰＦＡ）及びフォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）で評価する。培養力価は通常、インフルエンザで１０７〜１０９ｐｆｕ／ｍｌになる。
インフルエンザウイルスの増殖及び力価の測定
American Type Culture Collection（米国バージニア州マナッサス）から購入し、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザＡウイルスのストック（Ｈ１Ｎ１）を準備した。６０％コンフルエントの細胞単層（１５０ｃｍ２のフラスコ）に感染多重度（ＭＯＩ）０．０１のインフルエンザウイルスを感染させて、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣカタログ＃ＣＣＬ−３４）中でインフルエンザウイルスを増殖させる。３〜４日後、細胞変性効果が生じて、細胞の大部分が培養容器から離れたら、細胞及び上清を回収する。細胞を遠心分離（８００ｇ）で取り出し、上清を濾過して（０．４５μｍ）、４℃で２時間遠心分離し（１８０００ｇ）、ウイルスをペレットにする。ウイルスペレットをＤＭＥＭ培地中に再懸濁し、アリコートにして−１５０℃で保存する。０．１％のウシ血清アルブミン及びトリプシンが存在する状態で培養した９６穴プレート中で、０．１ｍｌの連続希釈したウイルスのストックをＭＤＣＫ細胞単層に加えることにより、インフルエンザウイルス力価を測定する。３日後、細胞変性効果を評点し、Kaerberの方法を使用して５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ５０）を測定した。
ウイルス負荷分析のための肺組織の処理
感染させたマウス及びコトンラットの肺の左葉及び右葉の切片を無菌状態で取り出し、計量して、Tissue Tearor装置（モデル＃９８５−３７０、Biopspec Products Inc.）を使用して、１ｍｌのＤＭＥＭ培地中で４５秒間ホモジナイズする。ホモジネートを３０００ｇで２０分間遠心分離する。清澄上清を採集し、使用するまで−１５０℃で凍結状態で保存する。
ウイルス力価の測定
増幅したウイルスのストック及び肺のホモジェネート中のウイルス力価は、連続希釈した後、プラーク形成アッセイ（ＰＦＡ）又はフォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によって測定した。研究開始前に、原サンプル１ミリリットル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）及びフォーカス形成単位（ＦＦＵ）を計算した。ＰＦＡ及びＦＦＡを実行するのに十分な１セットのインフルエンザサンプルを保存し、研究終了後にＰＦＵ及びＦＦＵを測定した。培養ウイルスの連続希釈溶液は、浄化培地（１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）中で１０１から１０８の希釈範囲にわたって準備した。各希釈溶液をプラーク形成アッセイ（ＰＦＡ）及びフォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）で評価する。培養力価は通常、インフルエンザで１０７〜１０９ｐｆｕ／ｍｌになる。
実施例２
肺のインフルエンザウイルス力価を低減するためのｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
ハタネズミの一種であるコトンラット（S.hispidus）は、インフルエンザが自己複製して軽度の呼吸器感染を生じる動物モデルである（Ottolini,2005）。インフルエンザウイルスを鼻腔内接種して動物に感染させると、肺のウイルス力価は接種後２日（約４８時間）でピークに達する。このモデルを使用して、in vivoでのインフルエンザ自己複製を阻害する化合物をスクリーニングする。
病原体フリーのコトンラットは、Virion Systems,Inc.（メリーランド州ロックビル）から購入した。ラット毎に体積０．１ｍｌの１０７のＴＣＩＤ５０を使用して鼻腔内接種することにより、合計１８匹のコトンラット（S.hispidus、６〜８週齢）をＡ型インフルエンザ（Ａ／ＰＲ／８／３４）株Ｈ１Ｎ１に感染させた。ウイルス接種の２時間前に鼻腔内滴下注入により、６匹はプラセボ（０．９％のＮａＣｌ）を受け、６匹は０．５ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受け、６匹は５．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受けた。動物は、ウイルス力価が通常は最高になる感染後２日で犠牲にし、肺組織でウイルス負荷を測定した。図１は、両方のｒｃＣＣ１０用量グループで観察された肺組織のウイルス力価の低減を示す。肺のウイルス力価は、組織１グラム当たりの（×１０７）ＴＣＩＤ５０で表す。
肺のインフルエンザウイルス力価を低減するためのｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
ハタネズミの一種であるコトンラット（S.hispidus）は、インフルエンザが自己複製して軽度の呼吸器感染を生じる動物モデルである（Ottolini,2005）。インフルエンザウイルスを鼻腔内接種して動物に感染させると、肺のウイルス力価は接種後２日（約４８時間）でピークに達する。このモデルを使用して、in vivoでのインフルエンザ自己複製を阻害する化合物をスクリーニングする。
病原体フリーのコトンラットは、Virion Systems,Inc.（メリーランド州ロックビル）から購入した。ラット毎に体積０．１ｍｌの１０７のＴＣＩＤ５０を使用して鼻腔内接種することにより、合計１８匹のコトンラット（S.hispidus、６〜８週齢）をＡ型インフルエンザ（Ａ／ＰＲ／８／３４）株Ｈ１Ｎ１に感染させた。ウイルス接種の２時間前に鼻腔内滴下注入により、６匹はプラセボ（０．９％のＮａＣｌ）を受け、６匹は０．５ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受け、６匹は５．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受けた。動物は、ウイルス力価が通常は最高になる感染後２日で犠牲にし、肺組織でウイルス負荷を測定した。図１は、両方のｒｃＣＣ１０用量グループで観察された肺組織のウイルス力価の低減を示す。肺のウイルス力価は、組織１グラム当たりの（×１０７）ＴＣＩＤ５０で表す。
実施例３
肺のインフルエンザウイルス力価を低減するｒｈＣＣ１０の全身投与
ラット毎に体積０．１ｍｌの１０７のＴＣＩＤ５０を使用して鼻腔内接種することにより、合計１８匹のコトンラット（S.hispidus、６〜８週齢）をＡ型インフルエンザ（Ａ／ＰＲ／８／３４）株Ｈ１Ｎ１に感染させた。腹腔内注射（ＩＰ）により、６匹は生理食塩水プラセボを受け、６匹は０．５ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受け、６匹は５．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受けた。ＩＰ経路の結果、循環するｒｈＣＣ１０が大量になり、ヒトへの静脈内投与を模倣する。各動物は、プラセボ又はｒｈＣＣ１０を約１２時間おきに合計６回受けた。これは感染前日に２回（午前及び午後）、感染日に２回、及び感染翌日に２回（感染前に３回、感染後に３回）を含む。動物は、ウイルス力価が通常は最高になる感染後２日で犠牲にし、肺組織でウイルス負荷を測定した。図２は、ｒｈＣＣ１０用量５ｍｇ／ｋｇのグループで観察された肺組織におけるウイルス力価の統計学的に有意な低下（ｐ＜０．０１）と、用量０．５ｍｇ／ｋｇのグループでウイルス力価がより低くなる傾向とを示す。肺のウイルス力価は、組織１グラム当たりの（×１０７）ＴＣＩＤ５０で表す。
肺のインフルエンザウイルス力価を低減するｒｈＣＣ１０の全身投与
ラット毎に体積０．１ｍｌの１０７のＴＣＩＤ５０を使用して鼻腔内接種することにより、合計１８匹のコトンラット（S.hispidus、６〜８週齢）をＡ型インフルエンザ（Ａ／ＰＲ／８／３４）株Ｈ１Ｎ１に感染させた。腹腔内注射（ＩＰ）により、６匹は生理食塩水プラセボを受け、６匹は０．５ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受け、６匹は５．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＣＣ１０を受けた。ＩＰ経路の結果、循環するｒｈＣＣ１０が大量になり、ヒトへの静脈内投与を模倣する。各動物は、プラセボ又はｒｈＣＣ１０を約１２時間おきに合計６回受けた。これは感染前日に２回（午前及び午後）、感染日に２回、及び感染翌日に２回（感染前に３回、感染後に３回）を含む。動物は、ウイルス力価が通常は最高になる感染後２日で犠牲にし、肺組織でウイルス負荷を測定した。図２は、ｒｈＣＣ１０用量５ｍｇ／ｋｇのグループで観察された肺組織におけるウイルス力価の統計学的に有意な低下（ｐ＜０．０１）と、用量０．５ｍｇ／ｋｇのグループでウイルス力価がより低くなる傾向とを示す。肺のウイルス力価は、組織１グラム当たりの（×１０７）ＴＣＩＤ５０で表す。
以上に基づき、ｒｈＣＣ１０は呼吸器感染のウイルス力価を低下させることが判明し、ｒｈＣＣ１０を使用するとインフルエンザ感染を処置、治療及び／又は予防することを示された。したがって、本発明の実施形態は、インフルエンザ感染の処置、治療又は予防に効果的な経鼻及び経静脈、又は組み合わせのｒｈＣＣ１０療法を提供する。
実施例４
細胞レベルにおけるウイルス自己複製のＣＣ１０媒介性阻害
ＨＥｐ２細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）を使用してＲＳＶ株Ａ−２（Advanced Biotechnologies,Inc.、メリーランド州コロンビア）を増殖させ、ウイルスのストックを生成した。４８穴プレートに１穴当たり５０，０００個の細胞を平板培養し、１０％ＦＢＳを加えたＭＥＭ中で約８０％コンフルエントまで増殖させた。細胞は、０．５ｍｌのＭＥＭ中のＣＣ１０で４時間、前処理した。次に培地を変え、１００ｍｍのＴＣ皿毎に１×１０６のＴＣＩＤ５０を使用して、ＲＳＶ感染を１時間実行した。非吸着ウイルスを洗浄して除去し、２％のＦＢＳ、４ｍＭのＬグルタミン、及びｒｈＣＣ１０を含む０．５ｍｌのＭＥＭを添加した。感染後４日目で上清を回収し、ウイルスを滴定した。図３は、１ｍｇ／ｍｌのＣＣ１０がＲＳＶ生成を実質的に排除する一方、１００及び３００マイクログラム／ｍｌでは約１／３の低減を示したことを示す。
細胞レベルにおけるウイルス自己複製のＣＣ１０媒介性阻害
ＨＥｐ２細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）を使用してＲＳＶ株Ａ−２（Advanced Biotechnologies,Inc.、メリーランド州コロンビア）を増殖させ、ウイルスのストックを生成した。４８穴プレートに１穴当たり５０，０００個の細胞を平板培養し、１０％ＦＢＳを加えたＭＥＭ中で約８０％コンフルエントまで増殖させた。細胞は、０．５ｍｌのＭＥＭ中のＣＣ１０で４時間、前処理した。次に培地を変え、１００ｍｍのＴＣ皿毎に１×１０６のＴＣＩＤ５０を使用して、ＲＳＶ感染を１時間実行した。非吸着ウイルスを洗浄して除去し、２％のＦＢＳ、４ｍＭのＬグルタミン、及びｒｈＣＣ１０を含む０．５ｍｌのＭＥＭを添加した。感染後４日目で上清を回収し、ウイルスを滴定した。図３は、１ｍｇ／ｍｌのＣＣ１０がＲＳＶ生成を実質的に排除する一方、１００及び３００マイクログラム／ｍｌでは約１／３の低減を示したことを示す。
ＣＣ１０は、感染から１、２４、及び４８時間後に与えると、細胞中のウイルス自己複製も阻止した。図４は、ｒｈＣＣ１０が、感染前に加える場合ばかりでなく、感染後に加える場合にもウイルス力価の低減に効果的であることを示す。これは、細胞レベルにおけるＣＣ１０の直接的な抗ウイルス作用に関する最初の報告であり、曝露後処置のための抗ウイルス療法としてｒｈＣＣ１０の潜在的有用性を示す。
実施例５
ＣＣ１０抗ウイルス作用メカニズム
ＣＣ１０ノックアウトマウスの気道上皮細胞の表現型は、ＣＣ１０がないと細胞内小器官の分布が異常になり、異常な積層膜構造が存在して、細胞による他のタンパク質の分泌が妨害されることを示す。この表現型は、ＣＣ１０が細胞のゴルジ体から原形質膜への分泌胞の移動に積極的な役割を果たすことを意味していると推測される。ＣＣ１０は、抗原提示細胞における取込み及びプロセシングも調節する。これらの観察結果は、ＣＣ１０が多様な細胞における物質の出入りの両方に重要な要素であることを意味すると解釈される。したがって、ＣＣ１０は、細胞におけるウイルスの移動を妨害することによって、ウイルスの自己複製を阻害すると推論される。すべてのウイルスは、細胞への侵入と自己複製を細胞輸送プロセスに依存しているので、ＣＣ１０は、全ウイルスの自己複製を阻害すると予想される。同じく、ＣＣ１０と同様の構造を共有する他のセクレトグロビンも、細胞レベルでウイルスの自己複製を阻害すると予想することができる。同様に、ＣＣ１０及び細胞輸送プロセスを調整する他のセクレトグロビンに由来するペプチドも、ウイルスの自己複製を阻害すると予想することができる。
ＣＣ１０抗ウイルス作用メカニズム
ＣＣ１０ノックアウトマウスの気道上皮細胞の表現型は、ＣＣ１０がないと細胞内小器官の分布が異常になり、異常な積層膜構造が存在して、細胞による他のタンパク質の分泌が妨害されることを示す。この表現型は、ＣＣ１０が細胞のゴルジ体から原形質膜への分泌胞の移動に積極的な役割を果たすことを意味していると推測される。ＣＣ１０は、抗原提示細胞における取込み及びプロセシングも調節する。これらの観察結果は、ＣＣ１０が多様な細胞における物質の出入りの両方に重要な要素であることを意味すると解釈される。したがって、ＣＣ１０は、細胞におけるウイルスの移動を妨害することによって、ウイルスの自己複製を阻害すると推論される。すべてのウイルスは、細胞への侵入と自己複製を細胞輸送プロセスに依存しているので、ＣＣ１０は、全ウイルスの自己複製を阻害すると予想される。同じく、ＣＣ１０と同様の構造を共有する他のセクレトグロビンも、細胞レベルでウイルスの自己複製を阻害すると予想することができる。同様に、ＣＣ１０及び細胞輸送プロセスを調整する他のセクレトグロビンに由来するペプチドも、ウイルスの自己複製を阻害すると予想することができる。
添付書類Ａ
米国特許出願公開第２００３０２０７７９５号
（１９）米国
（１２）特許出願公開
ピロン(アプリーレL.)ら
（１０）公開番号：US2003/0207795
（４３）公開日：2003年11月6日
（５４）炎症性及び繊維症の状態の治療用の精製された組換え型ヒトuteroglobinの生産のための方法
（７６）発明者:
ピロン(アプリーレL)。
(ゲーサーズバーグとMD);
ウェルチ(リチャードW)。
(ゲーサーズバーグとMD)
連絡先
バリー・エヴァンス、Esq
クレイマー・レビンNaftalis &フランケルLLP
919 3番目の通りニューヨークNY10022米国
（２１）出願番号：10/187498
（２２）出願日：2002年7月2日
（６３）関連する米国出願データ
1997年5月28日に出願された出願番号08/864357（現特許第6255281号）の部分継続出願である2001年7月2日に出願された部分継続出願番号No.09/898616
（５１）国際特許分類
A61K 038/41;
G01N 033/554;
G01N 033/569;
C07H 021/04;
C12P 021/04;
C12N 015/74;
C12N 001/21
（５２）U.S. Cl.
514/6;
435/69.6;
435/252.3;
435/472;
536/23.5;
435/7.32
（５７）アブストラクト
現在の発明は、使用のために組換え型ヒトuteroglobin(rhUG)の生産に一般に関係があります、として、1つの、炎症と線維症の治療において治療。
より詳しくは、その発明は、現在の医薬品最適製造基準(cGMP)によるrhUGのスケールアップした生産のために、細菌発現とタンパク質精製のステップを広く含むプロセスを提供します。
その発明は、スケールアップしたcGMPプロセスによって生産されたrhUGの生体内の生物活動の相対的強弱度を評価するためにさらに分析的な分析を提供します。
炎症性及び繊維症の状態の治療用の精製された組換え型ヒトuteroglobinの生産のための方法
[0001] この申請は2001年7月2日に提出されて、米国シリアル番号09/898,616の一部継続出願です、それは1997年5月28日にファイルされて、米国シリアル番号08/864,357の一部継続出願です。
発明のフィールド
[0002] 現在の発明は、使用をしている組換え型ヒトuteroglobin(rhUG)の生産に一般に関係があります、として、1つの、炎症と線維症の治療において治療、免疫修飾物質の効果があり、平滑筋収縮を規制する。
より詳しくは、その発明は、現在の医薬品最適製造基準(cGMP)によるrhUGのスケールアップした生産のために、細菌発現とタンパク質精製のステップを広く含むプロセスを提供します。
その発明は、スケールアップしたcGMPプロセスによって生産されたrhUGの生体内の生物活動の相対的強弱度を評価するためにさらに分析的な分析を提供します。
発明の背景
[0003] 組換えのUteroglobinの治療用途
[0004] 線維症と同様に炎症性のことの治療用の改善された治療薬の捜索も、近年多くの考慮をされました。
新生児性呼吸促迫症候群(RDS)(肺表面活性剤欠乏症)は、それが未熟児の中の死の主な原因のうちの1つであることに特別に興味のある状態です。
界面活性剤治療の導入は劇的にRDS患者の生存を改善していますが、この患者集団の重要な割合中の慢性炎症性・線維症の開発は、大問題です。
同様に、糸球体のネフロパシーおよび腎線維症は患者の腎臓が閉鎖されるようになり、もはや血液をろ過しない場合に、段階腎不全を終了するためにリードします。
糸球体のネフロパシーおよび腎線維症の多くの形式、フィブロネクチン預金が特徴です。
両方の疾病では、フィブロネクチンおよびコラーゲン沈着および繊維症は器官を機能を持たなくします、そして生命を維持することができずに、結局。
したがって、これらの患者は長期血液透析または腎臓移植を要求します。
[0005] 組換えの人間UGは、いくつかの臨床の表示での治療薬として開発中である、有益抗炎症剤、反繊維症、抗腫瘍、呼吸・免疫調節性を備えたタンパク質です。
組換え型ヒトUGはUGの欠乏が特徴だった状態の治療に役立ちます。
それは、特に肺の炎症状態(例えば新生児性呼吸促迫症候群、気管支肺異形成症(BPD))(RDS)の治療に適しています;
成人のRDS(ARDS)、敗血症、膵臓炎、コラーゲン脈管疾患、関節リウマチ、急性腎不全および自己免疫のぶどう膜炎のようなローカルの血清PLA.sub.2活動の向上が特徴だった状態の治療のために;
新生児のRDS/BPD、ARDS、関節リウマチ、喘息、腹膜炎、遺伝的なFn預金糸球体腎炎を含む糸球体症および自己免疫のぶどう膜炎のようなPLA.sub.2活動中のローカルの高台が特徴だった状態の治療のために;
繊維症の状態の治療のために、フィブロネクチンの沈着が病原体(例えば特発性肺線維症、ブレオマイシン肺、嚢胞性繊維症、糸球体のネフロパシー、特に家族性のglomeruleropathy)である場合、腎臓中のFn預金が特徴だった、どれ、結局、腎不全への鉛、さらに外生のUGで扱うことができる;
そして補う量のrhUGの処理により、内部成長的な機能的なUGの欠乏が特徴だった炎症性か繊維症の状態を治療するか防ぐ方法に。
[0006] RhUGはフィブロネクチンへのセルの付着を禁じるのに役立ち、既に置かれていたフィブロネクチン上の炎症細胞および線維芽細胞遊走を禁じて、細胞(膜結合タンパク)と細胞外基質タンパク質の間の相互作用を禁じます。
さらに、RhUGは、肺機能、肺コンプライアンス、血液酸素化および(または)血液pHを改善しかつ/または標準化するのに特に役立ちます。
RhUGは、呼吸器、消化器系、循環系、生殖システムおよび泌尿器系を含む様々な臓器系中の平滑筋集中の規則に特に役立ちます。
RhUGも、血管透過性を規制するか縮小し、血管内皮細胞と血管形成の移動のを禁じて、血管形成を防ぐために同様に使用されてもよい。
リンパ球生成を増加させるかつ、または長期での多形核白血球増殖を減少させるために、気管内のrhUGは、幹細胞刺激因子として使用されてもよい。
RhUGは、多形核白血球増殖を循環させる集中を減少させる間にリンパ細胞および(または)細胞障害性T細胞を循環させる集中を増加させます。それは自己免疫疾患かアレルギーに苦しむ患者に特に役立ちます。
静脈内のrhUGは、リンパ細胞を循環させる際にATP新陳代謝を抑えて、かつ短期での活性化された好中球、単球、マクロファージおよびNK細胞中のATP新陳代謝を増加させるために同様に使用されてもよい。
[0007] 組換え型ヒトUteroglobinの生産のための先行技術方法
[0008] 研究用(Mantile、1993年; Miele、1992年; シン、1987年; ジャクソン、1989年; アンダーソン、1994年; Umland、1994年; 青木、1996年)のためのミリグラム量へのマイクログラムで、rhUGおよび在来か組換えのuteroglobinあるいは尿中タンパク-1のいずれかの精製を表現する、いくつかの公表された方法があります。
これらの方法は全く変えられます。しかし、どれも、よくタンパク質の大規模生産に適しません。また、どれも、調合薬の生産のプロセスに要求される規制問題に取り組みません。
更に、これらの様々な準備の生物活動は必ずしも等価ではありません。
例えば、Nieto(1997)は、在来のウサギuteroglobinが凍結乾燥上のそのプロゲステロン活動のうちのいくらかを失い、その一方でMieleとMantileがそれらの精製工程の間に集中ステップとして繰り返された体積排除クロマトグラフィー・ステップおよび多数の凍結乾燥を使用している、と報告しました。
しかしながら、エンドユーザは、両方の凍結乾燥を備えたrhUG増加の総計のパーセンテージ以来凍結乾燥された製品上に使用する準備ができている製品を非常に好み、凍結を繰り返しました、サイクルを溶かします。
ハイ・レベルの集合は生物活動に悪影響を及ぼすことができます。あるいは、そのハイ・レベルのは免疫性を変更するか、最終製剤の性能を変更することができます。
好ましくない人物総計が不潔に任命するFDAのガイドラインの下では、製剤の全ロットは製剤内のハイ・レベルの総計に基づいて拒絶されるかもしれません。
[0009] 組換えの治療学の開発での問題
[0010] 組換え型タンパク質に基づいた製剤原料の生産は、現在の医薬品最適製造基準(cGMP)と呼ばれた、アメリカ食品医薬品局(FDA)によって述べられたガイドラインを厳守するいくつかのプロセスの開発を含んでいます。
FDAのcGMPガイドラインを厳守するプロセスはcGMPに準拠です。
米国と他のどこかで製薬の構成か製剤を売るために、cGMPプロセスを使用して、製剤を生産することが必要です。
[0011] タンパク薬物の販売および使用と同様に製剤原料としての組換え型タンパク質の臨床開発も、その製剤原料の詳細な特性記述と同様に製剤原料用のよく特徴づけられ複製可能な生産工程も要求します。
[0012] それらの活動がアミノ酸組成だけでなくタンパク質の構成にも依存するので、組換え型タンパク質は特別の挑戦を表わします。
タンパク質の構成は、4レベルで特徴づけられるかもしれないタンパク質の全面的な三次元構造です。
最初のレベルはその一次構造かアミノ酸配列です。
第2のレベルはタンパク質の二次構造で、アルファ・ヘリックス、ベータシートおよびオメガ・ループのような地方の安定した構造の地方を形成する、タンパク質の中で約6-30のアミノ酸の短い伸張に関連した構成のパターンです。
3番目のレベル、三次構造は、タンパク質またはペプチドのモノマーを表わして、アミノ酸の単一の接触する伸張内のユニットか領域の中への二次構造のグループ分けから成ります。
4つの螺旋形の束あるいはフィブロネクチン・タイプIII繰り返しは三次構造の例です。
4番目のレベル、四次構造は存在します、いつ、2つ以上の個々のペプチドあるいはタンパク質モノマー結合、単一の機能ユニットを形成するために共有結合であるいは非共有結合で。
[0013] さらに、活動が形に加えて、チャージおよび恐水の性格が組換え型タンパク質が特に生理環境中の他の生物学および化学物質と対話する能力に著しく寄与する表面特性に依存するので、組換え型タンパク質は一層の挑戦を示します。
タンパク質のアイソフォームは、構成、表面電荷および(または)恐水の性格における小さな変化から成ります。
これらの変化は、温度の変化に、周囲の環境中の化学薬品、塩類あるいは他の生物分子(例えばタンパク質、炭水化物、脂質、核酸など)との相互作用に、あるいは(タンパク質中の)実際の化学修飾から個々のアミノ酸まで起因するかもしれません。
タンパク質の異なるアイソフォームは、疎水的相互作用HPLC、質量分析、キャピラリー電気泳動、ペプチド・マッピング、等電点電気泳動および二次元電気泳動のような高解像度分析手法によって検知することができます。
[0014] 例えば、組換え型タンパク質薬の物理的形状および構成は、強くそれが製剤原料として使用のために精製されるプロセスと同様にそれが生産される表現システムによっても影響を受ける場合があります。
同様に、組換え型タンパク質製品の生じるアイソフォームかアイソフォームも、強くそれが生産される表現システムおよびプロセスによって影響を受ける場合があります。
タンパク質の生物活動は、その化学合成品だけでなくその構成およびアイソフォームに大きく依存します。
例えば、タンパク質の本性は、高いか低温への接触によって部分的にあるいは完全に奪われるかもしれません。また、そのタンパク質は生物学上不活発にされるかもしれません。しかし、それは、まだアミノ酸の同じシーケンスを保持します。
したがって、組換え型タンパク質の生物活動は、その化学合成品だけでなくそれが表現され精製され、公式化され、さらにパッケージにされるプロセスにも依存します。
[0015] 製剤原料または製品は、しばしば生物活性化合物およびその乗り物か、キャリアーに加えて余分なコンポーネントを持っています。
これらのコンポーネントは、薬が生産された原料あるいは精製、公式化あるいは最終のパッケージング・プロセスの一部として導入された材料に由来します。
製剤が製剤原料(例えば患者の中で使用される製品。)の最終のパッケージにされた公式化である間、製剤原料は精製されたバルク製剤の最終形態として定義されます。
単独であるいは薬自体と結合して、製剤原料か製品のこれらの余分なコンポーネントは不純物または汚染物質と考えられ、それら自身の意図しないか不適当な生物活動をしているかもしれません。
汚染物質は、不純物が薬自体(例えば破片、変化、アイソフォーム、対掌体、総計など)のある要素を含んでいるコンポーネントとして定義されているかもしれない一方、薬自体に由来しないコンポーネントとして定義されるかもしれません。
したがって、それが薬自体の特性を決定するのでだけでなく、それが製剤原料と製剤中の汚染物質および不純物のレベルおよび自然を決定するので、薬生産工程は重要です。
それは注意深く生体内で、一貫して複製可能な生物活動を維持するためにプロセスを定義するためにしたがって不可欠です、製剤原料、製剤あるいは製薬の構成の。
したがって、それが薬剤生産に応じることができるように、組換え型タンパク質薬が生産されるプロセスは十分によく特徴づけられるべきです、規定するガイドライン、ノンコンプライアンスが売ることができないか、U.Sの中で、および他のところに使用することができない製品に帰着するので、商業ベースにのったこと
[0016] さらに、生物薬剤の生産工程は商業ベースにのったのに十分に効率的で経済的であるに違いありません。
研究用のための少量のタンパク質を生産するために研究所の中で使用される精製法は、生物薬剤の生産に典型的に適していません。
例えば、クロマトグラフィー・マトリックスが数グラムさえのタンパク質の精製に必要なカラムのサイズ中のそれ自身の重量の下で砕かれるので、体積排除クロマトグラフィーのような小規模方法は多くの場合より大規模生産には実際的ではありません。
更に、体積排除クロマトグラフィーは、プロセスの次のステップに先立って集中されなければならないそれほど扱いやすくない高いボリューム精製中間物に帰着して、サンプルのボリュームを常に増加させます。
したがって、生物薬剤の生産工程中の体積排除クロマトグラフィーの使用を回避することは高度に望ましい。
安定形のタンパク質製剤代理人を保存するために頻繁に使用された別の技術は、凍結乾燥です。
このプロセスは、それをそれが生物活動を失わずに、多くの月に備えて典型的に蓄えることができる、それが低下に典型的に弱い液体の形式から乾燥粉末形式に変換して、タンパク質の同時の真空凍結乾燥を含んでいます。
しかしながら、繰り返された凍結/雪解けサイクルは、rhUGの総計のパーセンテージを増加させます。それは生物活動の重要な変化に帰着するかもしれません。
発明の目的
[0017] 発明は、rhUGの生産のために細菌発現システムを提供することを主な目的とします。
[0018] 発明は、rhUGの生産のために方法を提供し、医薬用原料として使用に適している物質のために人間のuteroglobinの精製に提供することをもう一つの目的とします。
[0019] 発明は、cGMP基準に従うrhUGのスケールアップした生産を提供することをまだもう一つの目的とします。
[0020] 1つの、さらに、また、発明は、人間のUGの生物活動を生体外で測定する方法を提供することを関連オブジェクトとします。
[0021] 発明は、商業ベースにのった人間のuteroglobinの医薬品を提供することをまだもう一つの目的とします。
[0022] 一層のAおよび発明の関連オブジェクトは、rhUG研究種子銀行、マスターセルバンクおよび生産セル・バンクを生産する方法を提供する予定です。
発明の要約
[0023] その発明は、人間のUG(そこでは合成遺伝子は以下IDを含む)のためにコード化する合成遺伝子を含むrhUGの生産のために細菌発現システムを提供します。
番号1-4。
その発明は、さらに遺伝子がシーケンスのN-終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む人間のUGのためにコード化する人間のシーDNAシーケンスを含むrhUGの生産のために細菌発現システムを提供します。
[0024] その発明は、次のものを含むrhUG研究種子銀行を生産する方法をさらに提供します:
(a) 成長培地上にrhUG表現システムを含むバクテリア株の少なくとも1つの植民地に接種すること;
(b) 静止期まで接種を受けた成長培地をかえすことは到達します;
(c)接種を受けた成長培地にグリセリンを加えること;
(d)割り切れる部分中の文化を凍結すること;
そして約-50C未満の温度で(e)冷凍の割り切れる部分を格納すること。
[0025] その発明は、さらにrhUGマスターセルバンクを含むことを生産する方法を提供します:
(a) rhUG研究種子銀行の割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁への接種;
(b) 接種を受けた煮出し汁をかえすこと;
(c)加えること、1つの、凍結保存された解決を形成するかえされた煮出し汁にcryopreservative;
(d) cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
そして約-60C未満の温度で(e)cryovialを格納すること。
[0026] その発明は、さらに次のものを含むrhUG生産セル・バンクを生産する方法を提供します:
(a) rhUGマスターセルバンクの部分を備えた適切なかえる煮出し汁への接種;
(b) 接種を受けた煮出し汁をかえすこと;
(c)加えること、1つの、凍結保存された解決を形成するかえされた煮出し汁にcryopreservative;
(d) cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
そして約-60C未満の温度で(e)cryovialを格納すること。
[0027] その発明は、さらに次のもののステップを含むrhUGを表現する方法を提供します:
(a)rhUGを表現することができる発現ベクターを含む生産種子セル・バンク文化を提供すること;
(b) 接種原を形成するために生産種子セル・バンク文化を備えた肉汁培地に接種すること;
(c) ステップbの中で形成された接種原をかえすこと;
(d) 発酵培養を形成するためにステップ(c)の中で形成された接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
(e) 大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
(f)発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
そしてステップ(f)の後に(g)発酵培養を収穫すること。
[0028] その発明は、次のもののステップを含むrhUGを表現する方法をさらに提供します:
(a) 発酵培養を形成するためにrhUGを表現することができる発現ベクターを含む接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
(b) 大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
(c)発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
そして(d)発酵培養を収穫すること。
[0029] その発明は、次のもののステップを含むrhUGを精製する方法をさらに提供します:
(a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを提供すること;
(b)上澄みを形成するために細菌細胞ペーストを溶解すること;
(c) 1位を形成するために薄膜から(NMWCO)カットされた最初の名目上の分子量によってステップbの中で形成された上澄みのろ過、浸透する;
(d) 1番目の集中、1位を形成する別のNMWCO薄膜の使用によってステップ(c)の中で形成されて、浸透する、集中する;
(e) 濃縮もののロード、最初の溶離液を形成するために陰イオン交換カラム上にステップ(d)の中で形成されて浸透する;
(O) 別の濃縮物を形成する3番めのNMWCO薄膜の使用によってステップ(e)の中で形成された最初の溶離液の集中;
(g) 第2のロード、別の溶離液を形成するためにハイドロキシアパタイト(HA)カラム上にステップ(f)の中で形成されて浸透する;
(h) 精製されたrhUGを提供するためにステップ(g)の中で形成された第2の溶離液中のrhUGからホストを派生したタンパク質を分けること;
そして(i)ステップ(h)で形成された、精製されたrhUGを回復すること。
[0030] その発明は、さらに次のもののステップを含むrhUGを精製する方法を提供します:
(a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を提供すること;
(b)上澄みを形成するために細菌細胞を溶解すること;
(c) 薄膜から(NMWCO)カットされた分子量によって液体をろ過すること;
(d) 交換柱に液体を載せること;
(e) rhUGから精製されたrhUGを提供するためにホストを派生したタンパク質を分けること;
そして(f)精製されたrhUGを回復すること。
[0031] その発明は、次のもののステップを含む製薬の等級rhUG製剤原料を生産する方法を提供します:
(a)rhUGを表現することができる細菌発現システムを提供すること;
(b) 発酵培養を形成するために細菌発現システムを含む接種原を備えた発酵槽への接種;
(c)発酵培養に細菌発現システムによるrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
(d) ステップ(c)で表現されたrhUGの収穫;
そして(e)ステップ(d)で収穫されたrhUGを精製すること。そこでは精製するステップは、少なくとも1枚のフィルタおよび少なくとも1 exhangeカラムの使用を含みます。
[0032] その発明は、次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)、前述のサンプルへの放射性同位体で識別された基板の導入、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)分裂の決定するレベル。
[0033] その発明は、次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2酵素の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することを生体外で測定する方法をさらに提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入する放射性同位体で識別された基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0034] その発明は、さらに次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによって分泌のphopsholipase A.sub.2活動の抑制のために分析する分析方法を提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入する放射性同位体で識別された基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0035] その発明は、さらに次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を提供します:
(a) ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいるサンプルと連絡をとって、(b)flourescentlyに導入することは、flourescenceによって前述のサンプルへの基板、(c)サンプルからの分離する裂かれていない基板および(d)決定する量の裂かれた基板にラベルを付けました。
[0036] その発明は、次のものを含んで、フィブロネクチンへの組換え型ヒトuteroglobinの結合を生体外で測定する方法を提供します:
(a) 組換えの人間CC10-HRP共役を備えた人間のフィブロネクチンの組換えの破片との接触、フィブロネクチン破片への組換え型ヒトuteroglobinの結合を決定するために(b)分析を視覚化すること
[0037] その発明は、さらに精製された組換え型ヒトuteroglobin、薬学的に受理可能なキャリアーあるいは希釈剤を含む製薬の構成を提供します。
図面の簡潔な記述
[0038] その発明は、今、どれに、添付図面に関して、より詳細に述べられるでしょう:
[0039] 図1は、rhUGのための合成バクテリア遺伝子の構築を示します。
[0040] 図2は、合成バクテリア遺伝子を使用して、rhUGの表現を示します:
SDS-PAGE分析。
[0041] 10-20%のTricineゲル:
レーンは左から右までです:
レーン1:
サイズ標準レーン2:
引き起こされていないバクテリアの溶解物(レーン3):
バクテリアの溶解物を引き起こしました。
[0042] 図3は、プラスミドpCG12の遺伝子地図を示します。
[0043] 図4は、マスターおよび生産種子セル銀行業務プロセスのフローチャートを示します。
[0044] 図5は、マスターと生産の種子セル・バンクが由来した細菌培養の成長曲線を示します。
[0045] 光学濃度はマスター(1)およびプロダクション(n)種子の両方のために600nmで細胞増殖に続きました。
[0046] 図6は、rhUG表現のための発酵工程のフローチャートを示します。
[0047] 図7は、発酵培養の成長曲線を示します。
[0048] ODは600nm(O)で文化成長に続きました。溶存酸素調査は通気(DO、.circle-solid.)に続き、rpmの機能として動揺(。箱固体。)に続きました。
[0049] 図8は、発酵中にrhUG表現のSDSページ分析を示します。
[0050] 10-20%のTricineゲル。
レーンは左から右、レーン、虹標準1までです;
誘導後で、示された時に得られた発酵サンプル:
レーン、3.8時間2;
レーン4.0時間;
レーン、4.2時間4;
レーン、4.5時間5;
レーン、5.0時間6;
レーン、5.6時間7;
またレーン8と6時間
[0051] 図9aおよびbは、精製スキームのフローチャートおよびその小さな変化を示します。
[0052] 図10は、最初のTFFおよびdiafiltrationの詳細フロー図形を示します。
[0053] 図11aは、マクロのQ陰イオン交換クロマトグラフィー・ステップの詳細フロー図形を示します。
[0054] 図11bは、マクロのQ陰イオン交換クロマトグラフィー・ステップの代表的なクロマトグラムを示します。
[0055] 図12は、第2の集中/diafiltrationステップの詳細フロー図形を示します。
[0056] 図13aは、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー・ステップの詳細フロー図形を示します。
[0057] 図13bは、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー・ステップの代表的なクロマトグラムを示します。
[0058] 図14aは、銅のキレート化クロマトグラフィー・ステップの詳細フロー図形を示します。
[0059] 図14bは、銅のキレート化クロマトグラフィー・ステップの代表的なクロマトグラムを示します。
[0060] 図15は、Sartobind Qおよび3番目の集中/diafiltrationステップの詳細フロー図形を示します。
[0061] 図16は、最終diafiltrationおよび公式化の詳細フロー図形を示します。
[0062] 図17は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってrhUGの精製を示します。
[0063] 図18は、HICクロマトグラフィーによってrhUGの精製を示します。
[0064] 図19は、UGのための競争率の高いELISAのための標準曲線を示します。
[0065] 図20は、SPLA2分析のクロマトグラムを示します。
[0066] 図21は、フィブロネクチン結合分析用の標準曲線を示します。
[0067] SDS-PAGEによる精製法の図22aショー評価。
[0068] 10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
レーン2(天然のままの溶解物);
レーン3(100 K Retentate);
レーン4および5 K浸水;
レーン、#1、マクロのQ通り道5;
レーン6(マクロのQ洗濯I#1);
レーン7(マクロのQ洗濯I#2);
レーン8(マクロのQ洗濯1#3);
またレーン9(マクロのQ溶離液)。
[0069] 図22b:
SDS-PAGEによる精製法の評価。
[0070] 10-20%のTriceneゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
レーン2(ハイドロキシアパタイト通り道);
レーン3(ハイドロキシアパタイト洗濯I);
レーン4(ハイドロキシアパタイト溶離液);
レーン5(銅のCSFF通り道);
レーン6(Sartobind Q通り道);
レーン7、rhCC10バルクを精製しました。
[0071] 図23は、製剤原料の清浄のSDS-PAGE分析を示します。
[0072] 10-20%のTricineゲル:
サンプルは左から右レーン、虹標準1まであります;
レーン3と5.mu.g 0726;
レーン5と5.mu.gは0726を縮小しました;
レーン7と10.mu.g 0726;
レーン9と10.mu.gは0726を縮小しました;
レーン11と55.mu.g 0726．
レーン2、4、6、8、10および12は、満たされないでおかれました。
[0073] 図24は、反UGポリクローナル抗体を使用して、製剤原料のウェスタンブロットを示します。
[0074] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
[0075] レーン2(rhCC10(ロット0726));
レーン、rhCC10(ロット0728)レーン、虹標準4 3;
レーン、縮小されたrhCC10(ロット0726)5;
レーン、縮小されたrhCC10(ロット0728)6。
[0076] 図25は、反Eを使用して、製剤原料のウェスタンブロットを示します。
大腸菌溶解物ポリクローナル抗体。
[0077] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン、スタンダード、BL21(DE3)からの大腸菌細胞溶解物1;
レーン2(虹標準);
レーン3(rhCC10(ロット0726));
レーン4(rhCC10(ロット0728))。
矢は、レーン3および4中の大腸菌不潔の位置を示します。
[0078] 図26は、rhUG製剤原料の等電点電気泳動PAGEゲルを示します。
[0079] サンプルは左から右まであります:
レーン、標準1;
rhCC10ロット0726のレーン2と55.mu.g;
rhCC10ロットのレーン3と55.mu.g、rhCC10/。
[0080] 図27は、rhUG十分プロセスのフローチャートを示します。
[0081] 図28は、製剤の清浄のSDS-PAGE分析を示します。
[0082] 10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
レーン3と5図0728;
レーン5と5.mu.gは0728を縮小しました;
レーン7と10.mu.g 0728;
レーン9と10.mu.gは0728を縮小しました;
レーン11と10.mu.gは研究コントロール、rhCC10/7を縮小しました。
レーン2、4、6、8、10および12は、満たされないでおかれました。
[0083] 図29は、反UGポリクローナル抗体を使用して、製剤のウェスタンブロットを示します。
[0084] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
[0085] レーン2(rhCC10(ロット0726));
レーン3(rhCC10(ロット0728));
レーン4(虹標準);
レーン5(rhCC10(ロット0726));
レーン、縮小されたrhCC10(ロット0728)6。
[0086] 図30は、反Eを使用して、製剤のウェスタンブロットを示します。
大腸菌溶解物ポリクローナル抗体。
[0087] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン、スタンダード、BL21(DE3)からの大腸菌細胞溶解物1;
レーン2(虹標準);
レーン3(rhCC10(ロット0726));
レーン4(rhCC10(ロット0728))。
矢は、レーン3および4中の40 kDでバンドの位置を示します。
[0088] 図31は、rhUG製剤の等電点電気泳動PAGEゲルを示します。
[0089] サンプルは左から右、レーン、標準1まであります;
rhCC10ロット0728のレーン2と55.mu.g;
rhCC10ロットrhCC10/7のレーン3と55.mu.g。
[0090] 図32は、cCG12(SEQ。ID NO。9)のためのヌクレオチド配列を示します。
[0091] 図33は、rhUG(SEQ。ID NO。10)のためのアミノ酸配列を示します。
発明の詳細な記述
[0092] 同時係属出願サービス中の開示
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026(WO 98/53846);
PCT/US99/16312(WO______);
PCT/US00/09979(WO______);
そしてPCT/US01/12126(WO______)これによって参照によって組込まれます。
[0093] 定義
ここに使用されるような[0094]「純粋なrhUG」他のタンパク質が検知できない手段1)、反Eを備えた、SDS-PAGEウェスタンブロットあるいは免疫沈殿によるrhUG準備。
大腸菌抗体、あるいは分析的なHPLCによって;
細菌内毒素が検知できない2)、LALテスト;
バクテリアの核酸が検知できない3)、サザンブロット(DNAハイブリダイゼーション)。
ここに使用されるような[0095]「精製されたrhUG」は、ここに定義されるような清浄に関係のある仕様書すべてに会ったrhUGを意味します。
ここに定義されるような[0096]「製薬の等級rhUG」手段rhUG、どれ、清浄、物理的な仕様書およびここに定義され、適用サービスに述べられているような生物活動仕様書すべてに会ったとして
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
ここに使用されるような[0097]「アイソフォーム」は、物理的か化学の手段によって識別することができ、異なる構成、翻訳後修飾に起因するアミノ酸の化学合成品における小さな変化あるいは精製と処理における変化を含む異なる生物活動を所有するタンパク質の選択方式を指します。
ここに使用されるような[0098]「コンフォーメーション」は、それが折り重ねられる方法、表面電荷および疎水性分配を含むタンパク質の三次元構造を指します。
所定のタンパク質も、他のタンパク質(化学薬品とセル)と同様に周囲の環境とのその相互作用に影響することができるいくつかの構成を持っているかもしれません。
ここに使用されるような[0099]「総計」は、単一タンパク質の多数の個々のユニットから構成された複合体を指します。
[0100] ここに使用されるような「不潔」は薬以外の最終生産物の中に慣例的にあるか、興味のあることに生物学である合成物を指し、補形薬を要求しました;
不純物は一方の製品になりえます。あるいは、プロセスは関係がありました。
ここに使用されるような[0101]「汚染物質」は、慣例的に現在でない合成物あるいは最終生産物の中にある材料を指します。
ここに使用されるような[0102]「仕様書」は、生物活動および抗原同一性と同様に物理的および化学的パラメータに関して製薬の等級タンパク質、製剤原料および製剤を定義する1セットの基準も指します。
ここに使用されるような[0103]「効力検定」は、タンパク濃度のような物理的パラメータに生物活動を関連づけて、与えられた薬の異なる準備を互いと比較する目的のために、製剤原料または製剤の生物活動を測定するために使用され、薬の生物活動の強さを生体内で測定するために使用される特定のテストを指します。
ここに使用されるような[0104]「イミュノアッセイ」は、抗原を識別するために使用されるテストをこの場合指します、ELISA(酵素免疫吸着法)を含む1つ以上の抗体の使用によるuteroglobin。
ここに使用されるような[0105]「公式化」は、特定の補形薬と生物学上活性製剤原料を含んでいる特定の製薬の構成を指します。
ここに使用されるような[0106]「プロセス中間物」はサンプルを含むことを指すか、あるいはプロセスの各ステップの製品に由来しました。
[0107] 「バルク製剤--」(製剤原料」を参照)--
ここに使用されるような[0108]「製剤原料」は、最終の薬コンテナーの中への最終公式化および十分に先立って、精製された薬(つまりrhUG)を指します。
ここに使用されるような[0109]「製剤」は、患者集団での使用をその最終形態の薬を指します。
ここに使用されるような[0110]「RhUG製剤原料」ここに述べられた仕様書に会うrhUGの手段の製薬の等級準備、また活動を調停する、ここに適用サービスの中で記述した。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
ここに使用されるような[0111]「RhUG製剤」ここに述べられた仕様書に会うrhUGの手段の製薬の等級準備、また活動を調停する、ここに適用サービスの中で記述した。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
ここに使用されるような[0112]「標準処理手順」は、cGMPガイドラインの下の特別のタスクの実行のための定義された手続きを意味します。
ここに使用されるような[0113]「リサーチ種子銀行」は、GLP状態の下で作られた種子銀行を意味します。
ここに使用されるような[0114]「マスター種子銀行」は、cGMP状態の下で作られた種子銀行を意味します、種子銀行の目的は、プロダクション種子銀行の生産、および長期貯蔵のための出所として働くことです。
ここに使用されるような[0115]「プロダクション種子銀行」は、cGMP発酵を始めるために使用されるcGMP状態の下で作られた種子銀行を意味します。
ここに使用されるような[0116]「cGMP」は現在の医薬品最適製造基準を意味します。
ここに使用されるような[0117]「cGMP生産工程」は、FDAによって定義されるようなcGMPの下で生じる生産工程を意味します。
ここに使用されるような[0118]「安定した製剤原料/プロダクト」は、生物学および物理的安定性を示す一連のあらかじめ定義された基準を満たす製剤原料/製品を意味します。
[0119] ここに使用されるような「生物学上アクティブなrhUG」は、PLA.sub.2の活動を抑制することができ、組換え型ヒトフィブロネクチン破片に拘束することができるUG、および適用サービスに述べられていた活動を意味します。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
好ましい具体化の記述
[0120] その発明は、rhUGの生産用の細菌発現システムを含んでいます。
1つの具体化では、細菌発現システムは、人間のUGのためにコード化する合成遺伝子を含みます。
別の具体化では、合成遺伝子は以下IDを含みます。
番号1-4。
その発明は、さらに遺伝子がシーケンスのN-終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む人間のUGのためにコード化する人間のシーDNAシーケンスを含むrhUGの生産のために細菌発現システムを提供します。
一層の具体化では、合成遺伝子は、さらに合成遺伝子のN終点でメット翼状突起翼状突起を含みます。
まだ別の具体化では、表現システムはさらにおよそ2.8kbのパーのシーケンスを含みます。
[0121] その発明は、さらにrhUG研究種子銀行を生産する方法を含んでいます。
1つの具体化では、rhUG研究種子銀行を生産する方法は、次のもののステップを含みます:
a) 成長培地上にrhUG表現システムを含むバクテリア株の少なくとも1つの植民地に接種すること;
b) 静止期まで接種を受けた成長培地をかえすことは到達します;
c)加えること、1つの、cryopreservative、例えば接種を受けた成長培地へのグリセリン;
d)割り切れる部分中の文化を凍結すること;
そしてできれば-50.程度から、約-50C未満の温度でe)冷凍の割り切れる部分を格納すること。
-100.程度へのC.。
C。
別の具体化では、rhUG研究種子銀行を生産する方法は550nmから660まで光学濃度(OD)によって成長をモニターして、接種を受けた成長培地をかえすことを含みます、1.5AUまで約0.8の吸光度ユニット(AU)の光学濃度が到達するまで、できれば600nmで走ります。
[0122] その発明は、さらに次のもののステップを含むrhUGマスターセルバンクを生産する方法を含んでいます:
a) 細菌培養を形成するためにrhUG研究種子銀行の割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁に接種すること;
b) 細菌培養をかえすこと;
c)加えること、1つの、凍結保存された解決を形成する細菌培養にcryopreservative;
d) cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
そしてできれば-50.程度から、約-60C未満の温度でe)cryovialを格納すること。
-100.程度に。
C。
1つの具体化では、rhUGマスターセルバンクを生産する方法は、約0.8AUから1.5AUの光学濃度が到達するまで、できれば600nmで、550nmから660nmまで光学濃度(OD)によって成長をモニターして、細菌培養をかえすことを含みます。
[0123] マスターセルバンクの一部からrhUG生産セル・バンクを生産するメソッドも示されます。
[0124] 現在の発明は、rhUGを表現する方法を含んでいます。
1つの具体化では、rhUGを表現する方法は、次のもののステップを含みます:
a)rhUGを表現することができる発現ベクターを含む生産シード・セル・バンク文化を提供すること;
b) 接種原を形成するために生産シード・セル・バンク文化を備えた肉汁培地に接種すること;
c) ステップbの中で形成された接種原をかえすこと;
d) 発酵培養を形成するためにステップ(c)の中で形成された接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
e) 大規模発酵槽内のステップ(d)の中で形成された発酵培養をかえすこと;
f)rhUGの表現を引き起こすためにステップ(e)の中で形成された発酵培養に誘導代理人を加えること;
また発酵培養を収穫すること。
[0125] 1つの具体化では、rhUGを表現する方法は、以下ID番号1-4を含む発現ベクターを使用します。
別の具体化では、接種原は、28.程度に関して温度で約12時間と約24時間の間の期間の間間に培養されます。
C.、そして36.程度に関して。
C。
まだ別の具体化では、ステップ(e)の孵化は2つの吸光度ユニットに、できれば600nmで、660nmから550nmの範囲の中で、最小のODまで継続されます、到達します。
[0126] 誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)かもしれません。(。)
まだ1〜4時間に関する別の具体化の中で、誘導ステップと収穫するステップの間に経過します。
まだ発酵培養を収穫する別の具体化の中で、遠心分離を利用します。
[0127] 現在の発明は、次のもののステップを含むrhUGを表現するさらなる方法を提供します:
a) 発酵培養を形成するためにrhUGを表現することができる発現ベクターを含む接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
b) rhUGの表現を引き起こすために発酵培養に誘導代理人を加える大規模な発酵槽c)の内の発酵培養をかえすこと;
そしてd)発酵培養を収穫すること。
[0128] rhUGを表現するための1つの具体化では、発現ベクターは以下ID番号1-4を含みます。
発明は、大規模発酵槽に少なくともある別の具体化の中で提供します、300リットルのキャパシティー。
まだ別の具体化では、ステップbの孵化は、約2.0AUに、550nmから660nmまで最小の光学濃度までむしろ600nm継続されます、達成されます。
まだ別の具体化では、誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含みます。
1〜約4時間に関する一層の具体化の中で、ステップcおよびステップdの間に経過します。
発酵培養を収穫する一層の具体化の中で、遠心分離を含みます。
[0129] その発明は、rhUGを精製する方法をさらに含んでいます。
1つの具体化の中で、次のもののステップを含むrhUGを精製する方法:
a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを提供すること;
b)上澄みを形成するために細菌細胞ペーストを溶解すること;
c) 1位を形成するために薄膜から(NMWCO)カットされた最初の名目上の分子量によって上澄みをろ過すること、浸透する;
d)、1番目の集中、1位を形成する別のNMWCO薄膜の使用によって浸透する、集中する;
e) 濃縮もののロード、最初の溶離液を形成するために陰イオン交換カラム上にステップ(d)の中で形成されて浸透する;
f) 別の濃縮物を形成する3番めのNMWCO薄膜の使用によってステップ(e)の中で形成された最初の溶離液の集中;
(g) ハイドロキシアパタイト(HA)カラムに別の溶離液を形成するために第2の濃縮物を載せること;
h) 精製されたrhUGを提供するrhUGから、第2の溶離液中のホストを派生したタンパク質を分けること;
そしてi)精製されたrhUGを回復すること。
[0130] 1つの具体化の中で、rhUGを精製する方法は、以下ID番号1-4を含む細菌細胞を利用します。
細菌細胞ペーストを溶解する別の具体化の中で、刈ることによって達成されます。
まだ別の具体化細胞残屑の中で、ステップ(b)の間の遠心分離によって削除される、そして(c)。
まだ別の具体化では、ステップ(b)の薄膜が30K〜100KのNMWCO薄膜に関係しています。
[0131] 別の具体化では、ステップ(c)のフィルタリングは、接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含みます。
別の具体化では、ステップdの薄膜が5つkの遮断薄膜に関係しています。
まだ別の具体化では、陰イオン交換カラムはマクロのQ陰イオン交換カラムです。
まだ別の具体化では、ホストを派生したタンパク質は、キレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムで分離されます。
1つの具体化では、CSFF樹脂カラムは銅を含みます。
まだ別の具体化では、ホストを派生したタンパク質は、30 KのNMWCO薄膜によってrhUGをろ過することにより、rhUGから分けられます。
[0132] 別の具体化の中で、1つの、確かに、荷電膜は、パスを形成するCSFFカラムに下流に通り抜けて本質的に置かれます、ホスト誘導蛋白質がない
1つの具体化では、この確かに強烈な薄膜はSartobind Q TFF薄膜です。
まだ別の具体化の中で、パス、によって、5つKのNMWCO薄膜に関してdiafilteredされます。
別の具体化では、ステップiの中で回復されたrhUGは、総計が本質的にありません。
[0133] 現在の発明は、rhUGを精製するさらなる方法を提供します。
これらのさらなる方法のうちの1つは、次のもののステップを含みます:
a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を提供すること;
b)上澄みを形成するために細菌細胞を溶解すること;
c) 薄膜から(NMWCO)カットされた分子量によって液体をろ過すること;
d) 交換柱に液体を載せること;
e) rhUGから精製されたrhUGを提供するためにホストを派生したタンパク質を分けること;
そしてf)精製されたrhUGを回復すること。
[0134] 別の具体化では、ステップcのフィルタリングは、接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含みます。
まだ別の具体化では、陰イオン交換カラムはマクロのQ陰イオン交換カラムです。
まだ別の具体化では、ホストを派生したタンパク質は、キレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムで分離されます。
別の具体化では、回復されたrhUGは、総計が本質的にありません。
[0135] 現在の発明は、さらに次のもののステップを含む製薬の等級rhUG製剤原料を生産する方法を提供します:
a)rhUGを表現することができる細菌発現システムを提供すること;
b) 発酵培養を形成するために細菌発現システムを含む接種原を備えた発酵槽への接種;
c)発酵培養に細菌発現システムによるrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
d) ステップcで表現されたrhUGの収穫;
そしてe)ステップdの中で収穫されたrhUGを精製すること。そこでは精製するステップは、少なくとも1枚のフィルタおよび少なくとも1 exhangeカラムの使用を含みます。
[0136] その発明は、さらに次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を含んでいます:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)、前述のサンプルへのラベルが付けられた基板の導入、また(c)サンプルからの分離する製品、また(d)分裂の決定するレベル。
1つの具体化では、分析は標準ラベルが.sup.14Cに付けられた分析と共に使用されます。
1-stearoyl-2-[1-.sup.14C]arachidonyl発明の別の実施例では、ラベルが付けられた基板はフォスファチジルコリンです。
一層の具体化では、組換え型ヒトホスホリパーゼA.sub.2は終末濃度に加えられます、2 nMからステップ(a)で200 nMまで
発明の別の実施例では、ステップ(a)のサンプルは15分から30分まで前培養されます、で、30.程度から。
40.程度へのC.。
C。
まだ発明の別の実施例では、ステップ(b)に加えられた、ラベルが付けられた基板は、終末濃度に加えられます、0.5.mu.g/mlから50.mu.g/mlまで
[0137] 発明の実施例では、ステップ(b)の中の反応は後に解決を止める有機相の追加によって5分から30分まで止められます。
解決を止める有機相の1つの例はドールの試薬および純水(84:16)を備えた7.7の稀釈液です。
発明の実施例では、ステップ(c)の中のサンプルは攪拌と遠心分離により分離されます。また、ステップ(c)の製品はアラキドン酸です。それはステップ(c)で液体の液体の分離によってサンプルから分けられます。
[0138] 発明の実施例では、サンプルは、ステップ(d)で分裂のレベルを決定するために数えるひらめきのために分離されます。また、最上層が削除されます。
分離は渦と遠心分離によって遂行されるかもしれません。
[0139] 現在の発明は、さらに次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2酵素の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することを生体外で測定する方法を提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0140] 現在の発明は、次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによって分泌のphopsholipase A.sub.2活動の抑制のために分析する分析方法をさらに提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0141] 現在の発明は、次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を提供します:
(a) ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいるサンプルと連絡をとって、(b)flourescentlyに導入することは、flourescenceによって前述のサンプルへの基板、(c)サンプルからの分離する裂かれていない基板および(d)決定する量の裂かれた基板にラベルを付けました。
[0142] 発明の実施例では、ステップ(a)の中の組換え型ヒトuteroglobinのサンプルは、34.mu.m.に対して34 nMの終末濃度をしています。
発明の別の実施例では、ステップ(a)のサンプルは30-40.程度で15-30分間前培養されます。
C。
[0143] 発明の一層の実施例では、flourescentlyにラベルが付けられた基板は2-デカノイル-1-(O-(11-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a--です(ジアザ-s-indacene-3propionyl)アミノ)ウンデシル)-sn-glycero-3-phosphotidylcholin-)(e。)。
まだ発明の別の実施例では、ステップ(b)に加えられた基板は、0.5-50.mu.g/mlの終末濃度に加えられます。
[0144] 発明の実施例では、ステップ(b)の中の反応は、解決を止める有機相の1〜5つの稀釈液の追加によって5-30分の後に止められます。
2-プロパノール:nヘキサン発明の別の実施例では、解決を止める有機相があります(8:3)。
発明の別の実施例では、止められた分析の100.mu.Lへの1.mu.Lが、ステップ(c)で珪酸正常相HPLCカラムに直接載せられます。
発明の一層の実施例では、ステップ(d)のflourescenceは、505nmから550nmで460nmから505nmの興奮およびemmisionを持っています。
[0145] 現在の発明は、次のものを含んで、フィブロネクチンへの組換え型ヒトuteroglobinの結合を生体外で測定する方法を提供します:
(a) 組換えの人間CC10-HRP共役を備えた人間のフィブロネクチンの組換えの破片と接触しフィブロネクチン破片への組換え型ヒトuteroglobinの結合を決定するために(b)分析を視覚化すること。
[0146] 現在の発明は、さらに含む組換え型ヒトuteroglobinの清浄、(a)クレームのプロセス内の各ステップの中間物のとるサンプルおよび(b)プロセス中間物を分析することを決定する方法を提供します。
[0147] 発明の実施例では、プロセス中間物はステップ(b)でSDS-PAGEによって分析されます。
発明の別の実施例では、プロセス中間物はステップ(b)でrhUG ELISAによって分析されます。
発明の一層の実施例では、プロセス中間物はステップ(b)でLALによって分析されます。
まだ発明の別の実施例では、中間物はステップ(b)で蛋白質含有量のために分析されます。
[0148] 現在の発明は、現在の発明の精製された組換え型ヒトuteroglobinを含む製薬の構成を提供します。
現在の発明は、さらに精製された組換え型ヒトuteroglobin、薬学的に受理可能なキャリアーあるいは希釈剤を含む製薬の構成を提供します。
[0149] 発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは、組換え型ヒトuteroglobinの5%未満の総計を含んでいます。
発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinには95%以下の清浄があります。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinの中の菌体内毒素のレベルは5未満のEU/mg rhUGを含みます。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは塩化ナトリウム解決中です。
[0150] 発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも4か月の間のC.。
発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも6か月の間のC.。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも9か月の間のC.。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも12か月の間のC.。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも15か月の間のC.。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも18か月の間のC.。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも1か月のC.および60%の部屋湿度。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも2か月の間のC.および60%の部屋湿度。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも4か月の間のC.および60%の部屋湿度。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも7か月の間のC.および60%の部屋湿度。
[0151] 発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは哺乳動物に処理するのに安全です。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinは人間に処理するのに安全です。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは気管内のチューブによって処理するのに安全です。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは未熟児に処理するのに安全です。
発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは人工界面活性剤を受け取る患者に処理するのに安全です。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinは呼吸困難中の患者に処理するのに安全です。
[0152] 組換えの人間UGは下記に述べられた手続きによって生産されました。
rhUGは、適用サービスに述べられていた発明によれば、それが使用されてもよいように97%を超過する清浄のレベルをとりわけ持っていました。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
また炎症を禁じて、かつ繊維症および無秩序な細胞増殖を生体外で生体内で軽減するか、防ぐために免疫反応を調整するPCT/US01/12126。
ある具体化では、清浄のレベルは99%以上でした。
[0153] rhUGを表現するエピソームおよびバクテリアのrhUGを生産する負荷の準備
[0154] 2つのタイプの新しい細菌発現システムは組換え型ヒトUGの生産のために開発されました。
1つは、細菌タンパク質合成のために最適化されたコドンを使用して、人間のUGのための新しい合成遺伝子の構築を含んでいました。
他方は、抗生物質選択がない状態での安定したプラスミド継承を与えるバクテリアの遺伝要素の使用に備えます。
両方のアプローチは効率的なUG過剰発現に有能なバクテリアの宿主・ベクター系を産出しました。
[0155] rhUGのための合成バクテリア遺伝子の構築
[0156] 細菌の発現を向上させるために、ヒトＵＧの合成した細菌遺伝子配列が設計され、合成オリゴヌクレオチドから集合した。成熟した天然ＵＧがそのＮ−末端にグルタミン酸残基を有するので、細菌ｍＲＮＡからペプチド合成（翻訳）の開始を可能にする開始メチオニンをＮ−末端に付加する必要がある。最も頻繁に使用される細菌コドン（Anderssen and Kurland, 1990）を蛋白質コード配列に組み込むことにより、細菌の発現のためにコドン使用頻度（codon usage）を最適化した。同様に、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及び他の非霊長類哺乳動物において、最適化発現のためにコドン使用頻度を調整することにより、組換えヒトＵＧの発現のための合成遺伝子を組み立てることができる。コドン使用頻度の最適化は、より高い翻訳効率及び蛋白質の発現レベルをもたらす。また、細菌に好ましいコドンの使用は、まれなチャージされたｔＲＮＡの消費により生じる代謝負担に対するストレス応答を減少することができる。特定の理論に拘束されずに、細菌のチャージされたｔＲＮＡの不均衡による当該ストレス応答が、翻訳パターンを変え、細胞内の蛋白質分解を増大し、細胞の代謝を変えると考えられる。全てのこれらの因子は、蛋白質産物を発現する発酵培養における再現性問題を提起し得る。生産培養における変異は、新しい細菌蛋白質がプロセスの異なる工程で出現する下流精製において大きな問題を引き起こし得る。
EXAMPLE I
合成バクテリア遺伝子の会議
[0157] rhUGのための合成バクテリア遺伝子は表1に示されるようなオリゴヌクレオチドから組み立てられました。
(合成オリゴヌクレオチドはBioserveバイオテクノロジーズインクから得られました。)オリゴヌクレオチド1-4(SEQ。ID NOS。1-4)はそれぞれ、暗号鎖を表わします。また、5-8(SEQ。ID NOS。5-8)はそれぞれ、相補鎖を表わします。
両方のセットは、5'〜3'までそれぞれ整っていて、図1に示されるような標準方法を使用して、アニール化されることおよび結紮により組み立てられました。
結紮混合は表2に下に示されるような適切な旋律に転換されました。また、プラスミドベクターを運ぶ植民地は、適切な抗生物質で選択されました。
形質転換体は、挿入物サイズを決定するために細菌集落上で直接行われた迅速なPCR分析で最初に遮られました。
その後、.about.234 bp rhUG挿入物を運ぶ植民地は、一層の検査のために二次培養されました。
rhUGの表現のために適切に引き起こされて、およそ10 kDaの誘導タンパク質バンドの表現が全体の細胞の求められた(図2を参照)サンプルである場合、第2のスクリーンはPCR陽性のクローンからの10mlの細菌培養上で終わりました、直接2.times.SDS-PAGEゲル・ローディングバッファーの中で溶解されました。
サンプルは、ミニゲル装置(Novex)中の16%のトリスグリシンSDS-PAGEゲル上で実行されました。
検査手続きはピロン(1997)に参照によってここに組込まれたように詳細に述べられていた通りでした。
誘致可能なUGバンドを過剰表現したクローンからのプラスミドDNAは準備されました。また、rhUGコーディング領域のDNA塩基配列は再び確認されました。
バクテリアのプラスミドDNAおよび単一コロニーの両方は分離します、その後、クローンが-20.程度で保存用に下へ凍って陽性のことの筋から。
C.および-80.程度。
C。
［表１］Syntheの構築の中で使用されるオリゴヌクレオチド -バクテリア遺伝子
[0158] 5つ'および3'まで同族のオリゴヌクレオチド、合成遺伝子の終了、また、その後、NcoIとBamHIの制限部位を備えた側面に位置する結合物を含むことは、それぞれ、PCRによって合成バクテリア遺伝子を増幅し、かつpKK223-3(ファルマシアから得られた)へそれのクローンを作るために使用されました。
pKK233-3の中の合成遺伝子のDNA塩基配列が確認されました。
このクローンからの貧弱なrhUG表現は、rhUG発現量を増加させるために開始者メチオニン(ピーターら、1989)に加えて、N-終点で余分なアミノ酸残基が必要だろうということを示唆しました。
したがって、長さを変えるNターミナル追加分を備えた1セットの合成のバクテリアのrhUG遺伝子はバクテリア中のrhUG表現用の最適な長さを評価するために構築されました。
これらの余分なアミノ酸は、細菌リボソームと細胞質中の発生期のペプチドを安定させるのを支援するかもしれません。
これらが小さな側鎖を持っており、課され、高度に恐水で、高度になく、したがって、生まれつきの名人を折り重ねることおよびUGモノマーおよび二量体の会議を恐らく分裂させないので、余分なアミノ酸はグリシンとセリンを交互にすることから成りました。
上に記述されるように、コドン使用頻度と結合物は使用されました。また、遺伝子はpKK223-3へクローンを作られました。
各遺伝子のDNA塩基配列が確認されました。
rhUGの正確なrhUGコード配列および誘致可能な表現に選ばれたクローンは、50mlの煮出し汁の中への固形培地上の植民地から接種を受けて、夜通し振られました。
このスタータ・カルチャーは振盪フラスコ中の250mlの豊富なメディアを含んでいる抗生物質に接種するために使用されます。
600nmで0.5の光学濃度に達するまで、これらの文化は適切な状態の下で成長しました。
その後、rhUGの表現は各クローンのために引き起こされました(表2を参照)。
文化はさらに2-4時間振られました。
細胞は遠心分離によって収穫され、再保留され、SDS-PAGEによってrhUG表現のために分析されました。
各遺伝子からのrhUG発現量は比較されました。また、最多のタンパク質を生産した遺伝子は一層のホスト/ベクター系最適化に選ばれました。
最多のタンパク質を生産する遺伝子は、人間のuteroglobinシーケンスに加えて3つの余分なアミノ酸残基を含んでいるN-終点を持っており、MGS遺伝子と呼ばれます。
[0159] pKK223-3の使用に関連した著しい損失があります。
最初に、pKK223-3は生産に適していません、1つの、それが親から娘細菌細胞まで安定したプラスミド継承のためのアンピシリン選択を必要とするので、アメリカにおいて生物薬剤。
米国の人口のおよそ20%はペニシリンとその派生語に対してアレルギーです。そのうちの1つはアンピシリンです。
この理由で、FDAは、組換えの生物薬剤のタンパク質を生成するために使用されるプロセスでのアンピシリンの使用を妨げました。
アンピシリンがない状態で、親細胞が分割し、プラスミドを含んでいる娘細胞が選択されていないとともに、プラスミドは文化の中で細胞から失われる場合があります。
プラスミドDNA複製は細菌細胞に重要な代謝負担を表わします。
抗生物質がない状態で、プラスミドを欠く娘細胞は、まだプラスミドを含んでおり、急速に文化を引き継ぐ娘細胞上に競争上の優位を持つでしょう。
[0160] 次に、合成遺伝子の転写は、ラクトース・プロモータ要素に拘束し、下流タンパク質の引き起こされていない表現を防ぐラック・リプレッサー・タンパク質によって抑制されます。
したがって、pKK223-3の高いコピー番号は、細胞にはラック・リプレッサー・タンパク質があるより多くの推進者要素に帰着し、その結果「漏る」タンパク質表現を引き起こすかもしれません。
ラクトース・プロモータの遺伝子下流の転写は、ラック・リプレッサー・タンパク質に結合し、その結果ラクトース・プロモータDNAをそれに手放させる化学薬品(イソプロピル・チオ-ガラクトシド、「IPTG」)を加えることにより実際につけられます。
その後、バクテリアのRNAポリメラーゼは推進者に拘束し、転写を始めます。
推進者のde-抑制はこのようにmRNA転写およびタンパク質表現を引き起こします。
漏るタンパク質表現が生じます、いつ、下流タンパク質、この場合、rhUGは引き起こされていない文化の中で合成されます。
pKK223-3からの漏るrhUG表現が観察されました。
例II
プラスミドベクターの試験は、e-大腸菌の菌株を中へ構築します
[0161] その後、レプリコン、推進者、筆写の抑圧者および抗生物質選択のMGS合成遺伝子および異なるコンビネーションを含んでいるいくつかの異なるプラスミドベクター構成物は、大腸菌のいくつかの異なる菌株の中でテストされました。
これらのホスト/ベクター・システムのいくつかのものは表2に示されます。
MAAを備えた合成遺伝子のバージョン-N-終点で、さらに作られ、これらの宿主・ベクター系のうちのいくつかの中でテストした。
pRK248cItsの中への合成遺伝子のサブクローニングは、pKK223-3クローンからのrhUG合成遺伝子を含んでいるBamHI破片を使用して行われました。
pGEL101とpGELACの中へのサブクローニングはpKK223-3に遺伝子を含んでいるNcoI-BamHI破片を使用して行われました。
［表２］大腸菌負荷rhUGの中の最適なrhUGエクスプレッションのために生成された2TABLE 2コンビネーション-ID N-終点ベクター5'RE-3'RE Selection.sup.1誘導プロモーター宿主株、ソースCG1 M -pKK223-3 Nco1-BamH1 Ampicillin.sup.2 IPTG.sup.5ラックDH5.alpha.F'I.sup.qライフ・テクノロジーズインク、CG3 FLAG(-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG5 MGSGS -、-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG8 MGSGSGS -、-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG60 MGS -、-pGEL101 Nco1-BamH1 -)-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'I.sup.qライフ・テクノロジーCG4 MGS -
アンピシリンIPTG T7 RNA政治家BL21/DE3 Novagenインク
CG73 MGS - pRK248cIts-A.sup.7 BamH1-BamH1 Tetracycline.sup.3 Heat.sup.6.lambda.PL DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG74 MGS、pRK248cIts-A BamH1-BamH1テトラサイクリンIPTG T5/lacO hyb DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG77、MAA -pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTG T5/lacO hyb DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG78、MGS -pRK248cIts-B BamH1-BamH1テトラサイクリン熱.lambda.PL DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG82 MAA -pGELAC Nco1-BamH1 Ampicillin.sup.4 IPTG T5/lacO hyb DH5.alpha.F'Iqライフ、テクノロジーCG86 MGS(-pGELAC Nco1-BamH1アンピシリンIPTG T5/lacO -)-pRK248cIts-B BamH1-BamH1テトラサイクリンIPTG T5/lacO hyb W3110F'Iq ATCC CG98 MAA -
hyb DH1 ATCC表2 - .sup.1Antibioticな選択が必要なフットノートは、プラスミドを含んでいるバクテリアの形質転換体を選択しますが、プラスミド・メンテナンス(例えばプラスミドの安定した継承)に必要ではありませんかもしれません。
.sup.2Ampicillin選択は、固体または液体培地の1ミリリッター当たり100マイクログラムで終っています。
pRK248cItsのための.sup.3Tetracycline選択は、固体または液体培地の1ミリリッター当たり20マイクログラムです。
テトラサイクリン選択は引き起こさない状態の下のpRK248cItsの安定した継承に必要ではありませんが、rhUG合成が引き起こされる場合、必要です。
.sup.4Ampicillin選択はpGELACの安定した継承に必要ではありません。
rhUG表現を引き起こすために使用されるIPTGの.sup.5The集中は0.5 mMでした。
.lambda.P.sub.Lからの.sup.6Transcriptionは、32.程度からの文化の温度中の急変によって引き起こされます。
42.程度へのC.。
C。
温度変化は、pRK248cItsベクター(それは.lambda.P.sub.L推進者を拘束することをできなくする)から絞られて、ラムダ・リプレッサー・タンパク質中の構造変化を引き起こします。
バクテリアのRNAポリメラーゼはそのとき推進者を認識し、転写を始めることができます。
.sup.7The「A」は、rhUG遺伝子が1つのオリエンテーション中で、その一方で「B」が、それが同じBamH1サイトで、反対のオリエンテーション中であることを示していることを示します。
[0162] pRK248cItsを使用するという重要な1つの利点は、それがRP4に由来した非常に安定した複製起点を備えたoligo-コピー数プラスミドであるということです。
ほとんどの高いコピー数ベクトルは、引き起こされていない状態の「漏る」タンパク質表現を許可し、より低いコピー数プラスミドほど本質的に安定していません。
pRK248cItsは娘細胞のプラスミドのメンテナンスおよび安定した継承のための選択を要求しませんが、それはアンピシリンとテトラサイクリン用抗生物質抵抗性遺伝子を運びます。
これらの抗生物質は、クローニングの間にバクテリアの形質転換体の便利な選択に使用することができます。
しかしながら、プラスミド上でコード化された組換え型タンパク質の高いレベル表現が引き起こされる場合、プラスミド安定はしばしば害されます。
抗生物質が組換え型タンパク質の表現の間にプラスミドを維持するために必要な場合、生物薬剤の生産の中でテトラサイクリンを使用することができるかもしれません。それはFDAによって許されます。
[0163] 合成遺伝子もpGEL101(Mantile、1993年)およびpGELAC(Mantile、2000年)に挿入されました。
合成遺伝子対これらのプラスミド中の人間のシーDNAシーケンスからの表現からのrhUGの表現は比較されました。また、合成バクテリア遺伝子は優れた結果を産出しました。
[0164] プラスミド継承を安定させるパーのシーケンス(広宿主範囲R要因RP4に由来した2.8kbのシーケンス)の使用は、ケモスタットの下で記述されました、基準として抗生物質がない状態の中で成長の長期間の後にアンピシリン選択を安定(Mantile、2000年)に使用して状態付けます。
しかしながら、発明のプロセスは、ケモスタット状態の使用を含んでいません。
代わりに、生産菌株(ホスト/ベクター系)は、凍結融解サイクルが後続するアンピシリンがない状態に成長を含んで、一連のシード銀行業務プロセスを経験するように要求されます。
その後、最大のタンパク質レベルが達成されるように、安定した継承が維持されるに違いないタンパク質表現の誘導の前に大型細胞バイオマスに達するために、ホスト/ベクター系は、一連の発酵によってアンピシリン選択がない状態で安定しているままでなければなりません。
[0165] 生産菌株CG12は、大腸菌負荷BL21/DE3の点でpGELACに似ているプラスミドを含んでいるホスト/ベクター系です。
この負荷は、アンピシリン選択がない状態での遺伝子安定性(DNA塩基配列のレベルの)およびプラスミド安定の両方に関してテストされました。
次の例は、生産菌株CG12の中のホスト/ベクター系がシード銀行業務から大規模な引き起こされた発酵培養の最終収穫まで生産工程の全体にわたるすべての点で安定していることを実証します。
個別宿主・ベクター系の構築
[0166] UGタンパク質コード配列の源は人間の肺mRNAから生成されたシーDNAでした。
組換え型ヒトUGのためのcGMP表現システムは、Mantileら(Mantile、2000年; Mantile、1993年、Miele、1990年)に述べられていたそれに似ています。
タンパク質は、T7プロモーターおよびT7 DNA依存のRNAポリメラーゼを使用して、pCG12と呼ばれるプラスミドから絞られます。それは、BL21/DE3宿主株のゲノム中のIPTG誘致可能なラクトース・プロモータにコントロールされます。
発現ベクター、pCG12、在来の人間のタンパク質(2つのアラニンが後続する開始者メチオニン)に関するそのN-終点での3つの追加のアミノ酸を備えたタンパク質のためのコード。
これらがバクテリア中の効率的な翻訳に必要な間、メチオニンはN-終点で2つの追加のアラニンを備えたUGタンパク質を含む製品に帰着して、発酵工程の間に裂けられます。
[0167] pCG12発現ベクターはいくつかの理由で製造するcGMPに適しています。
最初に、それは、発酵中に抗生物質選択用の要求を欠きます。
アンピシリンを使用して、pCG12を選択することができますが、抗生物質は細菌細胞成長および宣伝中に安定したプラスミド継承を維持するようには要求されません。
抗生物質なしの安定したプラスミド継承はパーと呼ばれるプラスミド安定化シーケンスの使用を通じて達成されました。
パーのシーケンスは、広宿主範囲R因子、RP4(Gerlitz、1990年)に由来する2.8キロベースのシーケンスです。
パーはプラスミド分割を修正し、プラスミド安定を著しく増強します。
このシーケンスは、抗生物質選択(Mantile、2000年ら)がない状態での250以上世代の間、ケモスタット状態の下の長期間安定性を与えます。
次に、pCG12は、薬生産工程によって遺伝学的に安定しています。
そのDNA塩基配列は、DNAを壊すことができる凍結融解ステップを含んでいる細胞銀行業務にもかかわらず変わりません。
第3に、二次培養して、細胞銀行業務プロセスを通じて、パーのシーケンスがアンピシリン選択がない状態でのプラスミド安定を与えることは示されました、そして回分発酵で。
[0168] 図3は、pCG12の中で遺伝要素の配置を示します。
この発現ベクターはpGELAC(Mantile(2000年): ジーン・バンク登録番号HSU01102)に似ています。
rhUGの表現のためのバクテリアの宿主株はBL21/DE3(ATCC#47092)です。
2.8キロベースのパーのシーケンスは広宿主範囲R因子(RP4)に由来します、それはプラスミド安定を増強する分割する機能を与える、また、細胞銀行業務から大規模発酵まで生産工程の全体にわたってそれがプラスミド安定を与えることが示されました。
例III
研究シード・セル・バンクの準備
[0169] 研究種培養は、50マイクログラム/mlのアンピシリンを含んでいるLB天草上で育てられたpCG12を含んでいるBL21/DE3の単一コロニーから接種を受けました。
研究種子銀行は、32.程度で育てられた50mlの研究種培養から生成されました。
抗生物質選択を含んでいないLBメディア中のC.。
文化は初期の静止期に育てられました。また、グリセリンは20%の終末濃度に加えられました。
その後、文化は1mlの部分標本の中で凍結され、-75.程度で格納されました。
その後、この研究シードのC.アリクォートは発酵開発に使用されました、マスターとワーキングセルバンクを生成することと同様に。
[0170] DNA塩基配列がrhUG製剤原料を生産するのに必要な操作によって変わらないように、pCG12ベクターは遺伝学的に安定しています。
pCG12プラスミド全体は、クローニングの後に、および研究種子銀行(SEQ。ID NO。9)の生成に先立って順番に並べられました。
pCG12は抗生物質がない状態で安定していますが、それはそのバクテリアのホストにアンピシリン抵抗を授けます。
発酵生産文化から回復されたpCG12プラスミドのDNA塩基配列は、研究シードからのプラスミド・シーケンスと同一です。
例IV
修士と生産のシード・セル・バンクの準備
[0171] マスターセルバンクは負荷CG12の研究シードから準備されました。
マスターとプロダクションの細胞銀行業務が処理する両方を概説するフローチャートは、図4に示されます。
マスターとプロダクションのシードの製造の中で使用される化学薬品と材料のリストは、表3に提供されます。
化学薬品および材料はすべてcGMPに従って、USP等級でした。
［表３］原料と化学薬品はマスターとプロダクションのシード・セル・バンクのプロダクションの中で使用しました。
資料/化学薬品メーカー等級グリセリンJ.T.ベーカーUSP/FCC、酵母エキスDifco N/A Tryptone Difco N/A塩化ナトリウムJ.、インジェクションWRAIR USPリサーチ・セル・バンクClaragen cGLP(マスター採種用の)マスターセルバンクのためのT.ベーカーUSP/FCC水、WRAIR cGMP(プロダクション採種用の)
[0172] CG12研究シードの部分標本は、ルリア煮出し汁(「LB」)を含んでおり、32.程度で維持された振盪フラスコに加えられました。
できれば600nmで、550nmから660nmまで光学濃度(OD)によって成長をモニターして震動することを備えたC.。
抗生物質は使用されませんでした。
煮出し汁のサンプルは、およそ1時間の間隔で振盪フラスコから続いて得られました。また、0.8〜1.5AUのOD.sub.600が到達するまで、各々の吸光度は測定され、記録されました。
その後、100ミリリッターの文化は20mlと結合しました、cryopreservative(グリセリン)また、サンプルは、文化の中にあるバクテリアの同一性および清浄を確認するために汚れるグラムで保持されました。
1ミリリッターの文化は、各々の90のラベルが付けられたcryovialsに無菌的に転送されました。それは各々30個のガラス瓶を含んでいる、3つのラベルが付けられた箱に入れられました。
2箱が-80.程度で維持された冷凍装置に転送されました。
C.および1箱は記憶装置用液体窒素に転送されました。
[0173] その後、生産セル・バンクはマスターセルバンクから準備されました。
生産セル・バンクを準備する過程は、研究シードの代わりの文化を始めるために、マスターセルバンクからのガラス瓶が使用された以外は、マスターセルバンクを準備するのに使用されるそれと同一でした。
各々1ミリリッターの文化を含んでいる90のcryovialsが準備され、各々30個のガラス瓶を含んでいる3つの箱に入れられました。
2箱が、-80.程度で維持された冷凍装置に転送されました。
C.および1箱は記憶装置用液体窒素に転送されました。
[0174] 文化およびセル・バンクはそれぞれ広範囲にテストされました。また、結果はcGMPガイドラインに準拠すると文書で証明されました。
時間の関数として600nmで吸光度を示すマスターおよび生産種子銀行文化の成長曲線は、図5に示されます。
両方の文化は数時間内に対数増殖に達して、中央の対数増殖の中で採取されました。
最初の実行可能性のためのサンプルはこの時期に得られました。
シード・ガラス瓶が冷凍だった1週間後、各銀行の実行可能性をテストするサンプルが得られました。
cGMPの資格を銀行に与える、他のテストおよび分析が下記に述べられます。
マスターとプロダクションのシード(それぞれロット0644および0645)のためのこれらの分析の結果は、表4および5にそれぞれ述べられます。
マスターとプロダクションの両方のシードは仕様書をすべてパスしました。
細胞の生存率の5〜10パーセントの負けは、細胞の結氷から期待されました。
[0175] 次の分析は、マスター・シード・セル・バンク、プロダクション・シード・セル・バンクおよび発酵の特性記述の中で使用されました。
[0176] 清浄。
LBプレートは無菌の技術を使用して、縞があり、37.程度で培養されました。
C.コロニーは24〜36時間の後に検査されました。
[0177] 実行可能性。
細胞の生存率は、アンピシリンで、あるいはアンピシリンなしでLB寒天プレート上の細胞培養の連続希釈法にめっきすることにより決定されました。
その後、植民地は数えられました。また、結果は記録しました。
[0178] グラムを汚すこと。
テストされる少量の文化はスライドに転送されました。また、スライドは固定した熱である前に乾燥した空気に許可されました。
その後、固定細胞はグラム・ヨウ素が後続するクリスタルバイオレットで汚されました。
その後、細胞は1000.時に油浸レンズの下で検査されました..
コントロール有機体は黄色ブドウ球菌と大腸菌です。
[0179] コロニー形態。
記述されるようにSOPに述べられており、かえされたように、LBプレートは縞がありました。
植民地は24〜36時間の後に検査されました。
[0180] コロニー・アピアランス。
LBプレートは無菌の技術を使用し、37.程度でかえされて縞がありました。
C.コロニーは24〜36時間の後に検査されました。
[0181] 光学濃度。
文化の細胞密度は、LKB分光測光器を使用して、600nmで550nmから660nmまで吸光度によって優先的に決定されました。
[0182] SDSページ。
発酵用のSDS-PAGEのためのサンプル、と同様に、のために、精製のためのプロセス・サンプルの中で、10-20%のTricineゲル(Novex)上で実行されました。
サンプルは2.times.Tricine SDS-PAGEローディングバッファー(Novex)で1:1(v:v)を調合され、染料正面がゲルの底からおよそ1cmであるまで、走ります。
高いマーカーか低分子量範囲サイズ・マーカー(アマシャム)は標準として使用されました。
ゲルは少なくとも85.程度に熱くなることにより固定しました。
ピアス・ケミカル社からのゲル・コード青変病で汚れることが後続する10%の酢酸/30%メタノールが存在する状態での5分のC.
汚れを除くことはピアスによって記述されるような純水の中で行なわれました。
その後、ゲルは撮影され乾かされました。
［表４］マスター・シード・ロット用総括表を少しもなく分析してください。
0644は結果清浄最終文化をアッセイします、マスターセルバンク-LB 230枚の.times.10.sup.6 CFU/mlプレートの汚染の最初の実行可能性はない、マスターセルバンク-LB 420の.times.10.sup.6 CFU/mlプレート+アンピシリン・グラム染色の最初の実行可能性、85枚の.times.10.sup.6 CFU/mlマスターセルバンク-LBプレートの実行可能性を1週製造する汚染1週のポストのないグラム(-)棒、67の.times.10.sup.6 CFU/mlマスターセルバンク-LB+アンピシリン・プレートの実行可能性を製造するポスト、コロニー形態-LB+プレート乳白色単一滑らかな植民地コロニーMorphology-LB
単一のプレートの滑らかな植民地コロニー・アピアランス-LBがかぶせる+アンピシリン乳白色、乳白色コロニー・アピアランス-LB+アンピシリン乳白色はCFU=コロニー形成単位にかぶせます。
[0183]
［表５］プロダクション・シード・ロット用総括表を少しもなく分析してください。
0645は結果清浄最終文化をアッセイします、プロダクション・セル・バンクの汚染の最初の実行可能性はない、プロダクション・セル・バンクの270枚の.times.10.sup.6 CFU/ml LBプレートの最初の実行可能性-290の.times.10.sup.6 CFU/ml LBプレート+アンピシリン、77枚の.times.10.sup.6 CFU/mlプロダクション・セル・バンク-LBプレートの実行可能性を1週製造する汚染1週ポストのないグラム染色グラム(-)棒、50の.times.10.sup.6 CFU/mlプロダクション・セル・バンク-LB+アンピシリンの実行可能性を製造するポスト、プレート・コロニー形態-LBプレート乳白色単一滑らかな植民地コロニー
単一のプレートの滑らかな植民地コロニー・アピアランス-LBがかぶせる形態論-LB+アンピシリン乳白色、乳白色コロニー・アピアランス-LB+アンピシリン乳白色はCFU=コロニー形成単位にかぶせます。
[0184] プロダクション種子セル・バンクはrhUGの生産のために発酵に接種するために使用されます。また、マスター種子セル・バンクはそれらが使い果たされるとともに、新作種子セル・バンクを作成するために使用されます。
これらの2つの銀行は、どれが製薬の等級rhUGを精製するかから、原料(例えば細菌細胞ペースト)の長期的な資格のある源に備えます。
例V
発酵
[0185] 化学薬品のリスト、および発酵の中で使用される設備は、表6および7にそれぞれ提供されます。
［表６］大腸菌発酵の中でrhUGの化学のメーカー等級のプロダクションに使用された化学薬品は、Difco N/AグリセリンJ.T.ベーカーUSP/FCCとAPSスーパー煮出し汁を選択します、イソプロピル-.beta.-D-thiogalactopyranosideシグマN/A塩化ナトリウムJ.T.ベーカーUSP/FCC、マーツーDF 204大杯の化学のN/A
[0186]
［表７］Equipment used in E. coli Fermentation for the Production of rhUG Equipment Manufacturer Model 400 L Fermenter System New Brunswick Scientific IF-400 Biological Safety Cabinet Baker B60-ATS Continuous Feed Centrifuge Sharples AS-Z6SP Shaker-Incubator New Brunswick Scientific Innova 4330 pH meter Orion 420 Spectrophotometer LKB N/A Peristaltic pump Cole-Parmer 07523-40 Overhead Mixer Lightnin MSV-1500
[0187] 発酵工程を概説するフローチャートは、図6に示されます。
発酵工程を始めるために、プロダクション種子セル・バンクのガラス瓶は室温で溶かされました。
その後、100マイクロリットルの生産種子は6つの各々に接種するために使用されました、1リットルを含んでいるfernbachフラスコ、各々の無菌のスーパー肉汁培地(ベクトン・ディキンソン、APSスーパー煮出し汁、グリセリンおよびWFIを選択する)。
その後、6個のフラスコ中の文化は32.程度でかえされました。
およそ20時間の動揺(300rpm)を備えたニューブランズウィック・シェーカーふ卵器の中のC.。
その後、6個のフラスコ中の文化は400リットルのニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック・ファーメンター・システム(モデルIF-400)での300リットルのSuperbrothに接種するために使用されました。
[0188] 接種に先立った発酵槽の準備は以下のとおりでした:
発酵槽は標準処理手順によって清潔になり殺菌され、次に、100kgのWFIの責任を負いました。
最高の肉汁培地(ベクトン・ディキンソン選択したAPSスーパー煮出し汁、グリセリンおよびWFI)は、発酵槽に加えられました。また、補足WFIは決勝(300kgのネットウェイト)に進出するために付け加えられました。
発酵槽はそのとき122.程度でテストされ殺菌された圧力でした。
標準処理手順による30分のC.。
泡止め(マーツーDF 204)は求められるような発酵に加えられました。
発酵用のセットポイント・パラメーターは表8の中で定義されています。
［表８］(.+。)発酵セットポイント・パラメーター・パラメーターは直接弾道距離の実際のセットポイント動揺150をセットしました。
(.+。)10rpmの150温度32。
2Cの31.9気流300.+。
2l/minの299.8l/minの圧力3.+。
1標準平方インチ当たり1ポンド1標準平方インチ当たり2.4ポンド溶存酸素NA.gtoreq.20%
[0189] その後、振盪フラスコ接種原は発酵槽に加えられます。また、文化は25.程度で成長します。
40.程度へのC.。
C.は600nmの2.0の最小の光学濃度までに到達しました。
2.0の最小のOD.sub.600に達するとすぐに、rhUGの表現は、10 mMへの0.1 mMの終末濃度への発酵培養にイソプロピル-.beta.-D-thiogalactopyranoside(IPTG)の追加によって引き起こされます。
発酵は少なくとも1時間、できれば2時間のポスト誘導維持されました。
細菌培養はSharpleの連続的な材料遠心分離機を備えた遠心分離によって収穫されます。
セル・ペーストは-80.程度で冷凍で、分割され格納されます。
後の精製用のC.。
[0190] 示された例において、発酵槽の接種に使用された6つの振盪フラスコ文化は、14と半時間の後の2.8の平均のOD.sub.600および1ミリリッター当たりの穏やかな210.times.10.sup.6コロニー形成単位に達しました。
発酵へ3〜4時間の間の増加したセル新陳代謝およびバイオマスに応じて減少した発酵溶存酸素レベルの間。
動揺範囲は20%の最低水準で溶存酸素を維持するのに十分でした。
発酵培養中のrhUGの表現は、4.2時間(2.7のOD.sub.600および40.times.10.sup.6 CFU/mlの細胞数を備えた)の後に引き起こされました。
少し時間ポスト誘導上に対数期割合で継続された成長、セルはおよそ6時間の発酵(図7)の後に収穫されました。
サンプルは発酵の後に文化から得られ、その後SDS-PAGE(図8)によって分析されました。
他のすべての発酵データは表9に記録されます。
発酵は仕様書をすべて通りました。
［表9］rhUGロット0708番のプロダクションのための結果および大腸菌発酵をアッセイします、結果不毛をアッセイする、LB 160.times.10.sup.6 CFU/mlの上のレファレンス最終実行可能性に匹敵する成長グラム染色グラム(-)棒SDS-PAGEをチェックしない、LBの上の最終実行可能性-最終サンプルの110の.times.10.sup.6 CFU/mlアンピシリン清浄、汚染最終コロニー形態はない、クリーミー、均質、Noncontaminatedした、単一コロニーCFU=コロニー形成単位
例VI
rhUGの精製
[0191] rhUGの精製の中で使用された化学薬品、物資および設備は、表10および11に示されます。
［表１０］rhUG精製工程化学薬品/供給メーカー等級エタノール中の10TABLE 10化学薬品および貯蔵品消費高、USP-200スペクトルUSPトリス、基礎(ヒドロキシメチル)-aminome-土地保有自由民スペクトルUSP/NFリン酸ナトリウム、一塩基、J.T.ベイカーUSP/NFF一水化物塩化ナトリウムJ.T.、ベイカーUSP/NFF水酸化ナトリウム(小球)スペクトルNF/FCC塩酸(集中された)J.T.、ベイカーUSP/NFF Edetate、ジナトリウム、二水和物スペクトルUSP/NF硫酸銅、
ペンタハイドレードJ.T.ベーカーUSPのマクロのQ 50 BioRad N/Aタイプ、私、ハイドロキシアパタイト(20.ミュー)。
Sepharose速いフロー・ファルマシアN/Aと結合してキレート環を作るBiorad N/A、100 Kの限外濾過カートリッジ、ミリポアN/A 5 K限外濾過カートリッジ、ミリポア、N/A Sartobind QカートリッジSartoriousなN/Aサイズ15、24および73シリコーン管材料Sanitech N/Aサイズ、73、Pharmed管材料コール=パーマーN/Aサイズ、191、Bioprene管材料ワトソン・マーローN/A Millipak、20、60の、100および200無菌のミリポアN/A 20.ミュー。
フィルタ大腸菌セル・ペーストWRAIR cGMP SP Sepharose速いフロー・アマシャムN/Aフェニル基を含むSepharose、速く、アマシャムN/Aフロー/最高値代用
[0192]
［表１１］機器を備えます、そしてrhUG精製工程アイテム・サプライヤー型番Pelliconの中で使用される設備、2本のカセット、ミリポアPellicon 2ステンレス鋼ホルダー研究所をフィルターする、SIミキサーLightnin N/Aスペクトロフォトメーター島津製作所のUVをマスターする、160のバンテージ、カラム、アミコン18.0.times.50cmのバンテージAカラム、アミコン13.0.times.50cmのバランス縫工筋、14800pの可変速度蠕動ポンプおよびI/PミリポアXX80EL000 Masterflex l/sポンプ、コール=パーマーG-07523-20蠕動ポンプ・ワトソン・マーロー701 S/R、スーパー・スピード遠心分離機Sorvall RC-5B/RC-5C高速ローターPTI
14C流動化装置Microfluidics M-110F、142mmのステンレス鋼ホルダー縫工筋16276-3 UVモニター・ファルマシア、Uvicord SIIチャート式記録計ファルマシアRec、Iつの導電率計オリオン162 pHメーター・システム・オリオン、620
[0193] 共通の生物活動および物理的・化学の仕様書をしているrhUGのバッチは、同じプロセスの小さな変化によって精製されました、それらのうちの2は、薬剤生産用のcGMPガイドラインに従いました。
プロセスのうちの2つ、cGMP精製工程のうちの1つ、および動物実験用のrhUGの生産に使用された1つのプロセス、図11に概説されます。
これらのプロセス、および両方のcGMPプロセスおよびrhUGの生産の中で動物実験に使用されたいくつかの変化の記述は、以下のとおりです。
図11bの中で概説されたcGMPプロセスについては、1キログラムの細菌細胞ペーストは大ばさみ、および遠心分離によって削除された細胞残屑によって溶解されました。
その後、溶解物(上澄み)は、接線のフローろ過(TFF)システムでの薄膜から(NMWCO)カットされた100 Kの名目上の分子量を使用して処理されました。
100 Kステップからのpermeateは、5つKのNMWCO薄膜を使用し、マクロのQ陰イオン交換カラムに載せられて、TFFによって集中されました。
陰イオン交換カラムからの溶離液はタイプに載せられる前に5つKのNMWCO薄膜を使用して、TFFによって集中されdiafilteredされました、私、ハイドロキシアパタイト(HA)カラム。
その後、HAカラムからの溶離液は、カラムに直接載せられました、キレート化合物として銅を備えたキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂でパックしました。
rhUG、カラムを通して渡された、一方、カラムへのHA溶離液境界の中にあるホストを派生したタンパク質。
菌体内毒素の最高額が最終バルク材から取り除かれたことを保証するために、確かに強烈なSartobind Q TFF薄膜も、銅のCSFFカラムの後にflowstreamに入れられました。
Sartobind Qからの通り道は集中され、次に、置換バッファーとして食塩水を備えた5つKのNMWCO薄膜を注入(SFI)に使用して、広範囲にdiafilteredされました、適切に最終バルク材を公式化すると同様に残余の銅を削除する両方。
[0194] このプロセスおよびその小さな変化は両方とも個別のcGMPに使用されました、臨床のロット、ロットと同様に、動物試験に使用しました。
これらの変化は次のものを含んでいます:
1)他のタンパク質からのrhUGの分離用の100 KのNMWCO薄膜の代わりの30 KのNMWCO薄膜あるいは50 KのNMWCO薄膜のいずれかの使用、の中で、明確にされた、バクテリアの溶解物;
2)銅の境界CSFFカラム・クロマトグラフィによって処理することではなく30 KのNMWCO TFF薄膜によるHA溶離液のろ過;
そして3)銅の境界CSFFカラム・クロマトグラフィの後のSartoBind Q薄膜の除去。
5つKのNMWCO薄膜を使用する食塩水に対する5〜20のボリュームdiafiltrationの精製の最終ステップは、すべての場合の中で使用されました。
[0195] これらの方法は、比較可能な物理的特性を備えたrhUGを生産し、必要状態、および動物実験でのrhUGの使用用の必要状態を製造するFDAのcGMPに会うのに十分です。
このプロセスによってなされたrhUG準備、およびその小さな変化、すべての点で比較可能である:
明白なサイズ、分子量、チャージ、N末端アミノ酸シーケンス、シスチン・シスチン契約、ELISAのような免疫学的認識技術およびウェスタンブロットの正確な構成を示す自由なチオールの量および生物活動。
銅のCSFFカラムを使用して精製されたタンパク質は、誘導結合プラズマ(QTIインクによる)によって銅の存在に関してテストされました。
銅は検知されませんでした。また、分析の検出限界は0.5ppm.でした。
これは、2mlの服用量当たり1.mu.gの極量に形を変えます。それは、幼児(Olivares、1996年)のための1日当たり600.mu.gの評価された安全で適切な毎日の食事摂取よりかなり下にあります。
[0196] カラムは、標準処理手順を使用し、カラムおよび樹脂メーカーの推薦へ一致してパックされました。
充填塔はすべて最小30分の0.5Mの水酸化ナトリウムで清潔になり、使用までそれぞれのストレージ・ソリューションに入れられました。
接線のフローろ過のための薄膜は45で0.5Mの水酸化ナトリウムで清潔になり発熱性物質を除かれました。+-.5.degree。
使用に先立った最小1時間のC.。
Sartobind Q薄膜は使用に先立って最小30分の1.0NのNaOHで清潔になり発熱性物質を除かれました。
[0197] 精製工程の具体化のステップを示すフローチャートは、図10〜16に示されます。
発酵からの1キログラムの凍ったセル・ペーストは、室温で溶かされ、どちらかを使用して、大ばさみによって溶解されました、Microfluidizer.TM。
(Microfluidics)あるいは同様の大ばさみ装置。
生じる天然のままの溶解物は、15,000.times.gで遠心分離によって明確にされました。
明確にされた細胞溶解物は、100 KのNMWCO細胞膜を使用して、25のmMトリス/40 mM NaCl pH 7.0の中の一定容積diafiltrationによって精製されました。
100 K TFFステップからのpermeateは集められ集中されました、5つKのNMWCO薄膜の使用、で。
100 Kの集中の後に、5.times.constantボリュームdiafiltrationに浸透する、低分子量不純物を削除し、かつ5つKを生産するマクロのQ陰イオン交換平衡バッファーと、100 KのTFFバッファーを交換するために25のmMトリス/40 mM NaCl pH 8.5で行なわれた#1(図10)を水につけます。
その後、これは3リットルのマクロのQ陰イオン交換カラムに載せられました。
非境界および弱い境界タンパク質はカラムから洗い流されました。また、rhUGを含んでいる分数は、25人のmMトリス(150のmM塩化ナトリウム、pH 8.5(図11aおよび11b))と溶出されました。
マクロのQカラムからの溶離液は集中されました。また、バッファーは、5つKの浸水を生産するために5つKのNMWCO薄膜を使用して、平衡バッファーでHAカラムと同時に交換されました。
#2(図12)。
5つKの浸水。
#2は3リットルのタイプのIの陶器のハイドロキシアパタイト・カラムに載せられました。
非境界タンパク質は10のmMリン酸ナトリウムpH 7.0でカラムから洗い流されました。また、rhUGを含んでいる分数は、75のmMリン酸ナトリウム、pH 7.0(図13aおよび13b)で溶出されました。
HAカラムからの溶離液は、銅で満たされた、1リットルのキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)カラムに直接載せられました。
rhUGは銅のCSFFカラムへ拘束せず、flowthrough(図14aおよび14b)の中で検索されました。
その後、銅のCSFFカラムからのflowthroughは、WFIで1対1で薄められ、最終の菌体内毒素削除ステップ(図15)としてSartobind Qフィルタを通して渡されました。
Sartobind Q薄膜からの通り道は5つKのNMWCO TFF薄膜を使用して集中されました。
集中の後に、20.times.constantボリュームdiafiltrationは置換バッファー(図16)としてインジェクション用食塩水で行なわれました。
diafilteredされた資料はそのときさらにありました、5.5mg/mlの集中目標にインジェクション(SFI; 0.9%のNaCl)用食塩水でろ過され薄められて、7.5mg/mlの最小のタンパク濃度に集中しました。
精製されたrhUGバルク製剤を生成するためにろ過されて、そのときrhUGは無菌でした。
[0198] 追加の2つの精製法はrhUGの生物薬剤の製品の質を改善するために使用することができます。
最初の方法は陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップの追加によってさらにrhUGを精製することを含んでいます。
このカラム・クロマトグラフィ方法は選択的に残余の大腸菌タンパク質を削除するために特に最終生産物からプロセスの中で様々なポイントで使用することができます。
例えば、図17では、rhUG(さらにrhCC1Oとして知られている)はNaClのステップ勾配を使用して、SPSFFカラム上で精製されます。
バッファーは酢酸ナトリウムpH 4.0です。
ハイドロキシアパタイト・カラムからのrhUG準備は4.0のpHに調節され、SP Sepharose速いフロー(SPSFF)陽イオン交換カラム(アマシャム。)に突き通されました。
RhUGだけ、図17に示されるような塩化ナトリウム・ステップ勾配を備えたカラムから溶出された、一方、以前にその後溶出された大腸菌タンパク質。
したがって、陽イオン交換ステップの追加、あるいはハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーあるいは他のクロマトグラフィー・ステップに対する陽イオン交換の代用は、著しく最終のrhUGの生物薬剤の製品の清浄を改善する場合があります。
[0199] 精製の改良のための第2の方法は、残余の大腸菌タンパク質および残余を削除する疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)の使用およびタンパク質rhUGの他の誤折り重ねられた形式を含んでいます。
例えば、銅のIMAC(Cu-IMAC)カラムからのrhUG資料は、アマシャムからフェニル基を含むSepharose速いフロー/最高値代用(PSFF/HS)カラムに載せられます。
PSFF/HSカラムへのrhUGの特定の結合を増加させるために、硫安は銅のIMACカラムからrhUG準備に加えられます。
望ましいrhUG(反並列のhomodimer)はカラムを通り抜けて、流水式のものの中で回復されます。
残余の大腸菌タンパク質、rhUG総計、rhUGの他の誤折り重ねられた形式あるいは誤って調整された形式は、図18に示されるような移動相中の硫安の減少によってカラムから溶出されます。
この例において、rhCC10として知られている反並列のrhUGは、硫安のステップ勾配を使用して、PSFF/HSカラム上で精製されます。
バッファーはリン酸ナトリウムpH 7.0です。
Cu-IMACカラムからのrhUGの分析は、並列のオリエンテーション(望ましくない汚染物質)のhomodimersの存在を示しました。
これらのデータは表12に示されます。それは、EndoproteonaseリースCを備えたrhUG準備の消化から生成されたペプチドのLC/MS分析を示します。
反並列の形式は優勢型(>90%)ですが、並列・反並列のオリエンテーションに由来したペプチドはHICステップで処理されていないrhUG準備の中にあります。
したがって、疎水性相互作用クロマトグラフィーの追加、あるいは精製工程の別のステップに対するHICの代用は、著しく反並列のrhUGの生物薬剤の製品の均質を改善する場合があります。
[0200] 表12では、ペプチド断片は、リジン残基の後に裂けるEndoproteonaseリースCによるrhUGの消化によって得られました。
その後、ペプチドはRP-HPLCを使用して、分離されました。また、破片は、214nmの吸光度、およびプラスイオン・エレクトロスプレイ質量分析による分析によって分析されました。
下記の資料はCu-IMACの流水式の資料のサンプルから得られました。
［表１２］EndoproteonaseリースCによるrhUGの消化によって得られた破片は、多量がタイプする破片を予期しました、1つの(1)-K(44)4888.307モノマーK(45)-K(45)146.105モノマーL(46)-K(53)912.528モノマーP(54)-K(60)841.502モノマーL(61)-K(64)519.273モノマー、私(65)-N(1つの-K(44)当たり(1)720 834.390モノマー - S-S-A(1)-K(44))
9776.1 ダイマー(平行)1つの(1)-K(44)(S-S--I(65)-N(72))5722.70、よりかすか(反平行)私(65)-N(72)(S-S--I(65)-N(72))1668.78、かすか(平行)1つの(1)-K(45)-S-S-A(1)-K(44)9922.72、よりかすか(平行)(1)-K(45)-S-S-I(65)-N(72)
5868.80 ダイマー(反平行)1つの(1)-K(45)-S-S-A(1)-K(45)10068.82、よりかすか(平行)。
[0201] 並列の二量体のレベルは、生物薬剤の公式化で望まれた反並列の形式からの誤って調整された平行形式の十分か部分的な除去を示すPSFF/HSカラムを通り抜けた資料の中で下がったか除去されました。
これらの結果は同様の結果を備えたフェニル基を含むSepharoseに加えて他のいくつかのタイプのHICメディアで繰り返されました。
この種のカラムに使用する、小説および分離のための予期しない手段を以前に提供する、rhUGの未知の形式。
[0202] プロセス分析では、特性記述が分析し、リリースが、生産工程、および製剤原料と製剤のために分析するとともに、次の分析は確立されました。
適切なところで、rhUG製剤原料および製剤は標準研究ロットrhUG/7と比較されました。
[0203] ウェスタンブロット。
2つのウェスタンブロットが行なわれました、-rhUG抗体を備えた一つおよび.alpha.を備えた一つ
大腸菌溶解物抗体(両方ともDako、アメリカからの)。
.alpha.-rhUGウェスタンは、二次抗体としてDAKOから結合したヤギ.alpha.-ウサギIgGHRPを備えた人間のUGへのウサギ・ポリクローナル抗体を使用して行なわれました。
.alpha.
西洋の大腸菌、ウサギ.alpha.で行なわれた。
二次抗体としてヤギ.alpha.-ウサギIgGHRP共役が後続する大腸菌溶解物ポリクローナル抗体、.alpha.のための両方の抗体
大腸菌分析、DAKOから得られました。
検知はECL.TMを使用して行なわれました。
アマシャムからのキット。
[0204] バクテリアの核酸。
rhUG製剤原料および製剤の1つの服用量当たりのバクテリアのDNA内容は、汚された濃縮rhUGサンプル(チャールズ研究所モールヴァン川)に交雑が後続する、放射性同位体で識別されたバクテリアのDNAを使用して、サザンブロットによって決定されました。
[0205] 質量分光法。
分子量はM-スキャンインクによるエレクトロスプレーイオン化分光測定によって決定されました。
理論的な分子量は、PAWS(スイスのプロによって得られた平均分子量の決定のためのシェアウェア・プログラム)によって決定されました。
16110.6daの値はPAWSプログラムによって決定されました。
同じ値はrhUGのcGMPバッチのために見つかり、コントロール(断固とした分子量16110.6da)として標準研究ロットrhUG/7のMSの分析によって確認されました。
[0206] Nターミナル期間分析。
N-終点のシーケンスは、アプライドBiosystems(ABI)477A自動プロテインシークエンサー上で順番に並べるパルス過程Nターミナルを使用して実行されました。
その分析はM-スキャンインクによって行なわれました。
翼状突起翼状突起-Glu-Ileのシーケンスは、コントロールとして標準研究ロットrhUG/7を備えたrhUGのcGMPバッチのために確認されました。
[0207] pH。
3ポイントの測定(4.0、7.0、10.0)はメーカーの指示によって行なわれます。
電極の測定の後、サンプルのpHは決定されます。
[0208] 等電点電気泳動。
pIは3〜7のpH範囲を備えたゲルを使用して、等電点電気泳動によって決定されました。
ゲルはNovexから得られ、メーカーによって記述されるような状態の下で実行されました。
サンプルは、シグマからの標準およびrhUGコントロール(研究ロットrhUG/7)に対して実行されました。
ゲルは、ピアスからのゲル・コード青変病で汚れることが後続する10%の酢酸/30%メタノールが存在する状態で1分間電子レンジの中で熱くなることにより固定しました。
汚れを除くことはピアスによって記述されるような純水の中で行なわれました。
[0209] 自由なチオール。
自由なチオールの存在は感度を増加させるために修正済のproticolを使用して、ピアスからエルマンの試薬を備えた反応によって決定されました。
エルマンの試薬が存在する状態での孵化の後、サンプルの吸光度は412nmで分光測光器の中で決定されました。
14150のM.sup.-1cm-.sup.1の減衰係数は臼歯の量の自由なチオールを決定するために使用されました。
自由なチオール(システイン)の標準曲線は反応の線形性をモニターするために使用されました。
[0210] ラル。
rhUGプロセス中間物、製剤原料および製剤中の細菌内毒素の存在は、米国薬局方(USP)アッセイ85番に述べられているようなリムルスameobocyte溶解物分析によってテストされました。
キットはケープコッドの仲間から得られました。
[0211] カラー、アピアランス、均質。
バルク製剤製品は、明瞭さ、色および可視の粒子状物質の有無を視覚的に調査されました。
[0212] 免疫反応性。
競争率の高いELISAは、捕獲試薬、およびサンプルでrhUGと競争するのに結合したrhUG-HRP(ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ)として尿(DAKO、.alpha.-尿中タンパク-1)から分離された在来の人間UGに上げられた抗体を使用して行なわれました。
抗体は、微小滴定井戸(100マイクロリットル/井戸)上に2,500の稀釈液でpH 9.5の0.1Mの炭酸塩/重炭酸ソーダ・バッファーに夜通し覆われました。
井戸は乾かされ、4.程度で格納されました。
使用までC.。
rhUG-HRP共役はピアスからのキットを使用して作られました。
250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)において結合したおよそ250ナノグラムのrhUG-HRPは、よく使用されました。
各サンプル一式の標準曲線は、0-500ナノグラム/ml(図19に示される)から変動するrhUG口径測定器(研究ロットrhUG/7)を使用して、実行でした。
口径測定器および試験サンプルはすべて複製して実行されました。
サンプル中のUGは、井戸中の抗体結合部位には結合したrhUG-HRPと競争します。
したがって、分析信号はサンプル中の増加する量のUGとともに減少します。
結果はピアスによるo-フェニルジアミン・ジヒドロクロリド(OPD)HRP分析によって視覚化されました。
プレートはBiotek EL-80マイクロプレート・リーダを使用して、490nmで読まれました。また、データはBiotek KC4ソフトウェアを使用して分析されました。
[0213] 清浄およびアイデンティティー:
SDS PAGEの縮小。
rhUG製剤原料および製剤は、両方縮小することおよびメーカーによって記述されるような縮小しない状態のの下のNovex 10-20%のTricine SDS-PAGEゲル上で実行されました。
低分子量サイズ基準はアマシャムから得られました。
ゲルは、10%の酢酸/30%メタノールの混合物で1分間電子レンジの中で熱くなることにより固定し、ブリリアント・ブルーR250(0.5%およびw/v)で汚されました。
汚れは、メーカーによって記述されるようなNovexのゲル明瞭な汚れを除く解決でゲルから除かれました。
その後、ゲルはNovexゲル乾燥系を使用して、乾かされました。また、純度パーセントは、ゲル(ヒューレット・パッカード・スキャナ・モデル5100C)の走査により決定されました。また、濃度学はNIHからの若枝イメージ・シェアウェアを使用して行なわれました。
[0214] アグリゲーション・アッセイ。
製剤は、Superose 12あるいはセファデックス75体積排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(アマシャム/ファルマシア)のいずれかの上のクロマトグラフィーによって総計の存在のために分析されました。
カラムはBioRadの生物学のシステムを使用して、メーカーの指示によって実行されました。また、ピーク面積はさらにBioRadから、EZLogicクロマトグラフィー解析ソフトウェアを使用して決定されました。
パーセント集合は、主なUGピークに先立って溶出するピークのすべてのピーク対エリアの総面積の比較により決定されました。
[0215] 菌体内毒素。
菌体内毒素レベルは、米国の軽く叩くことに述べられているようなウサギ発熱性分析によってテストされました。
151番．
一回の人間服用量と等価なrhUGの量は、10分の期間の間静脈内に投与されました。
基線前服用量温度に関する体温増加は3時間の間にモニターされました。
受理可能な結果は、0.5.程度と、あるいはその程度を超えて等しい温度上昇から成りません。
基線結果に関するC.。
[0216] 蛋白質含有量。
プロセス中間物、製剤原料および製品の蛋白質含有量は、島津製作所120およびMantileら(Mantile、1993年)によって決定されるような2070年のM.sup.-1 cm.sup.-1の減衰係数を使用して、280nmで吸光度によって決定されました。
[0217] 不毛。
米国の軽く叩くことに述べられているように、不毛分析が行なわれました。
71番．
サンプルは流動性のチオグリコレート培地(FTM)およびTripticase醤油煮出し汁(TSB)へかえされました。
TSBメディア用ポジティブコントロールは白体、黒色コウジ菌および枯草菌でした。
FTMのためのポジティブコントロールは黄色ブドウ球菌、P.aeruginusa、C.sporogenesでした。
[0218] 効力検定。
人間のタンパク質およびその哺乳類相同体上の文学の全体にわたるUGに起因するいくつかの生物活動があります。
記述された生産工程によって準備されている、人間のrhUGの準備に関係している生物活動は、ここに米国のサービスの中で記述されます。
番号08/864,357、09/087,210、09/120,264および09/549,926。
[0219] UGのある生物活動は、利用可能な試薬で生体外で測定することができ、ある疾病の治療に適切です。
これらの活動のうちの2つはここに記述されるようなUGのために確認されました。
1番目は、rhUGによる分泌ホスホリパーゼA.sub.2酵素(sPLA.sub.2s)の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することです。
私たちは、rhUGが人間のsPLA.sub.2酵素を著しく生体外で特に禁じることを確認しました、マクロファージによって生産されたタイプIIa酵素と同様に膵臓と肺で見つかったタイプIb酵素も、また人間のリューマチの滑液に見つけました。
rhUGによるsPLA.sub.2-Ib活動の抑制のための新しい蛍光に基づいたHPLC分析は開発され、より標準のラベルが.sup.14Cに付けられた分析と共に使用されました。
rhUGのための別の生物活動は、不適当な堆積物を防ぐフィブロネクチンに結び付けるその能力、およびUG欠乏(チャン、1997年)の遺伝子組換えのノックアウトマウス・モデル中の繊維症支持の細胞外マトリックスの後の構成です。
小説、生体外で、rhUGのこの活動を測定するために人間のフィブロネクチンを使用するELISAタイプ分析は開発されました。
[0220] これらの2つの効力検定はrhUGの将来のバッチの生体内の生物活動の相対的強弱度を測定するために使用することができます。
生産工程が、化学か生物学かにかかわらず、本質的に可変であるので、効力検定は潜在的な安全性および効能の評価において不可欠です。
生物活動の相対的強弱度は効力検定によって決定されるかもしれません。
[0221] 分泌のPLA.sub.2の抑制 -- Ibをタイプします。
[0222] 効力検定はrhCC10の追加によってrhPLA.sub.2活動の抑制に基づきます。
RhPLA.sub.2は、L-3-ホスファチジルコリンの2つの位置でエステルの分裂を触媒します。
異なる2つの分析がこの活動を測定するために使用されました;
[1-.sup.14C]アラキドン酸(プロダクト)を生産するために、1つは基板(1-stearoyl-2-[1-.sup.14C]arachidonyl phosphotidylコリン(アマシャム))として使用します、その後、それは流動の流動の分離によって分離された、またひらめきを数えること(PLA.sub.2、1番をアッセイする)により決定された分裂のレベル。
第2は蛍光性にラベルが付けられた基板を使用して、行なわれました、2-デカノイル-1-(O-(11-(4,4-difluor-o-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-indacene-3-プロピオニル)アミノ)ウンデシル)-sn--glycero-3-phosphocholine(分子プローブ)。
図18に示されるように、uncleavedされた基板は正常相HPLCを使用して、裂かれた基板から分けられました、計量は並んだ蛍光検出器(PLA.sub.2アッセイ2番)を使用して行なわれました。
両方の分析は、100.mu.L.の最終の分析ボリューム中の1つのmM CaCl.sub.2を備えたハンク・バランス食塩水の中で行なわれました。
RhPLA.sub.2は、ウォンHwa Cho博士のイリノイ大学シカゴの研究所から得られました。
新しいPLA.sub.2アッセイ1番、分析する、以下のように行なわれました。
RhPLA.sub.2は200 nMの終末濃度へのすべてのチューブに加えられます。
阻害試験については、rhCC10はおよそ34 uMの終末濃度に加えられました、HBSSの等容積はコントロール・チューブに加えられました。
チューブはすべて37.程度で20分間前培養されました。
Cおよび分析は、5.mu.g/mlの終末濃度への放射性同位体で識別されたphosphotidylcholineの追加によって始められました。
その後、15分が7.7の追加によってドールの試薬および純水(84:16)の稀釈を折り重ねた後、その反応は止められました。
チューブはすべて疎水性の層および親水性の層を分離するために攪拌され、次に、遠心分離機にかけられました。
その後、最上層は削除され、15mgのシリカゲルを含んでいるEppendorfチューブを増しました、メッシュ、60〜200、およびひらめきを数えるためのヘキサンの800.mu.lを分類します。
[0223] 新しいPLA.sub.2アッセイ2番は以下のように行なわれました。
RhPLA.sub.2は200 nMの終末濃度へのすべてのチューブに加えられました。
阻害試験については、rhCC10はおよそ34 uMの終末濃度に加えられました、等容積、塩性、コントロール・チューブに加えられました。
チューブはすべて37.程度で20分間前培養されました。
Cおよび分析は、5.mu.g/mlの終末濃度への蛍光性のラベルが付けられたphosphotidylcholineの追加によって始められました。
その反応は、2-プロパノール:nヘキサン(8:3)の1〜5つの稀釈液の追加によって15分の後に止められました。
止められた分析の100.mu.lが、珪酸正常相HPLCカラムに直接載せられました。
システム用の移動相は2-プロパノール:nヘキサン:水(8:3:2)です。
裂かれた基板の量は517nmで480の縁での興奮およびemmisionを備えた蛍光によって決定されました。
[0224] 各分析のパーセント抑制は次のように定義されました:
［表１３］rhUG RhUGロット番号の異なるロットによるsPLA2の抑制、CC10/6 CC10/7 CC10/8 0728 PLA.sub.2阻害試験1番をアッセイする:
48%の38%の54%の58%の放射性同位体アッセイPLA.sub.2阻害試験2番:
59%の56%の69%の76%の蛍光測定
[0225] 人間フィブロネクチンに拘束すること
[0226] rhCC10のための別の生物活動はフィブロネクチンに結び付けるその能力です。それは不適当な堆積物、およびCC10欠乏(チャン、1997年)の遺伝子組換えのノックアウトマウス・モデル中の繊維症支持の細胞外マトリックスの後の構成を防ぎます。
小説、生体外で、ELISAタイプ分析はこの活動を測定するために人間のフィブロネクチン(「rhFn」と呼ばれた破片-III.sub.1Cとして知られているFn III.1)の組換えの7個のkDa破片を使用して、開発されました。また、この分析はrhCC10の生物活動をモニターするために使用されました。
マイクロプレートは、フィブロネクチン破片で夜通し覆われました。また、rhCC10の結合はrhCC10-HRP(西洋わさびペルオキシダーゼ)共役を備えた競争によって検知されました。
RhCC10-HRP共役はプレートに加えられ、室温で1時間かえることを許されました。
共役は標準かサンプルを、あるいは標準なしで加えられるかもしれません。
PBSは負の対照として使用されました。
プレートは、4回気音に発音され洗われました。
分析はピアスからo-フェニルジアミン・ジヒドロクロリド(OPD)HRP分析によって視覚化されました。
プレートはBiotek EL-80マイクロプレート・リーダを使用して、490nmで読まれました。また、データはBiotek KC4ソフトウェアを使用して分析されました。
図21は、この分析用の典型的な標準曲線を示します。
rhUGのすべての研究およびcGMPロットのためのこの分析の結果は、フィブロネクチン破片にrhUGを拘束することには陽性でした。
[0227] 製剤原料と製剤の広範囲な試験および特性記述に加えて、精製に続き、かつ各ステップの効率を決定するために、中間物のサンプルは、プロセスの全体にわたって得られました。
プロセス中間物はSDS-PAGEによって分析されました、rhUG ELISA、LAL、そして蛋白質含有量のために。
蛋白質含有量は標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ピアスからBCA分析で決定されました。
バッファーはすべてLAL分析によって菌体内毒素内容のために分析されました。
菌体内毒素はバッファーに検知されませんでした。
[0228] 精製工程は両方のために分析されました、全面的なステップ回復(表14)。
全面的な精製は、100 Kのバルクから決定されたとともに、51.9パーセントでした。
比放射能によって記述されるような清浄も検討されました(表15)。
比放射能は、定義されたサンプル用のBCAタンパク質測定に見合う価値で割られたUG ELISAに見合う価値として定義されます。
削除された最大の量の不純物が、100 K diafiltrationステップ、および後のマクロのQ、陰イオン交換ステップで生じます。
これは、SDS-PAGE結果(図22aおよび22b)からのデータによって確認されます。
速いフロー・カラムが必要なハイドロキシアパタイトおよび銅をキレート化するSepharoseは、最終の大腸菌タンパク質不純物を削除します。
1.00を超過する100パーセントおよび比放射能を超過する回復は分析内の変わりやすさにより、異なる標準に使用しました。
[0229] LAL分析は精製の全体にわたって菌体内毒素レベルに続きました。
菌体内毒素は、5KのRetentate#1の中の2400 EU/ml(総量は11.times.10.sup.6 EUでした)でした。
資料がマクロのQカラム上でさらに精製された後、内毒素濃度は、680 EUの合計のために5KのRetentate#2(ボリューム=4000ml)に0.17 EU/mlに落ちました。
これは、菌体内毒素レベルの16,000倍の減少を表わします。
菌体内毒素レベルは精製の残りの全体にわたって検出できませんでした。
［表１４］精製ロット0726からのRhUGの回復、合計の全面的なステップ・ボリュームRhUG rhUG Recov - 回復ステップ(ml)(mg/ml)(mg)ery(%)。(%)
sup.1上澄みは3990 6.45 25700 100N/Aのセル5を溶解しました、K、浸水#1 4780 4.67 22300(86.7)86.7のマクロのQ溶離液10000 2.10 21000(81.6)94.1のハイドロキシアパタイト溶離液4000 4.37 17500(67.9)83.2のキレート化するSepharose 4250 3.57 15200 58.9(86.8)Sartobind Qパス9200 2.20(20200)によるパス、精製されたrhUGバルク2474 5.40 78.6 134〜13400(51.9)66.0の.sup.1Step回復が各ステップの回復として定義されます。
[0230]
［表１５］
ロット0726 rhUGプロテインからのrhUGの比放射能、特定のステップ(mg/ml)(mg/ml)活動表面に浮かぶ溶解細胞6.45 22.1 0.292 5 K浸水。
#1 4.67 4.94 0.945、マクロのQ溶離液2.10 1.19 1.77ハイドロキシアパタイト溶離液、2.20 0.89によって3.57 2.23 1.60 Sartobind Qパスを通じてSepharoseパスと結合してキレート環を作る4.37 2.41 1.81、2.48の精製されたrhUG、5.40 3.08 1.75を大きくする。
[0231] 最終の無菌のろ過された原薬は表16に示されるような基準をすべて通りました。
［表１６］(.+。)rhUG製剤原料ロット0726試験仕様書結果用の仕様書および結果は、明瞭で無色の明瞭で無色のアピアランスに色をつけます、混濁はない、混濁均質がない均質の均質の免疫反応性陽性反応陽性反応清浄.gtoreq.95% 98.3、ウサギによる%アグリゲーション.ltoreq.5% 0.18%の菌体内毒素、満足な満足な発熱性蛋白質含有量5.5。
rhUGと一致するrhUGと一致するポジティブなウェスタンブロット.alpha.-rhUGが、SDS-PAGEに起因して肯定的な無菌の無菌の生物活動が、SDS-PAGE.alpha.に起因する0.5mg/mlの5.5mg/mlの不毛
バクテリアの.about.40 kDの.about.40 k 1明帯の大腸菌1明帯、nucleic<100 pg/服用量<7.5のpg DNA/服用量酸質量分光法アプ、16110 16111.9 kDa PH(6.30)5-8、等電点電気泳動アプ4.7 4.7、自由なメルカプト基を含む検知できない<10%。(w/w)。
LAL<5つのEU/mg、AAe-I AAe-I1.sup.1Both MAAEIを順番に並べる<0.01のEU/mgのNターミナル、およびAEI形式は、合計の0.062%未満でした。
[0232] rhUGの構造により、二量体とモノマーの両方は、シーケンス分子量(図23)によって予言されるよりSDS-PAGEの上の低い分子量に飛びかかります。
タンパク質の別の特性は、残余の二量体の存在にクマシに汚されたSDS-PAGEゲル(図23)のレーン5および9、および.alpha.のレーン5で見ることができるとともに、還元剤が存在する状態でのモノマーの中への二量体の分離が完了していないということです。
UGは西洋です(図24)。
rhUGが.alpha.-rhUGのレーン5の二量体とモノマーの両方の位置で明白な間、西洋(図24)、モノマーあるいは.alpha.のレーン3中のよりかすかな位置のいずれかにおいて検知できる大腸菌タンパク質はありませんでした。
大腸菌は西洋です(図25)。
.alpha.のレーン3中のただ一つの可視帯
大腸菌ウェスタンにはおよそ40 kD(図25)の明白な分子量があります。
[0233] より高い分子量バンドが.alpha.-rhUGウェスタン(図24)のレーン2中のより高い分子量バンドによく一致したところで、クマシに汚されたゲル(図23)のレーン11において明白なように、rhUGの別の特性は小さな量の総計の構成です。
二量体と総計の両方は、モノマー(UG ELISAの開発の間になされた観察と一致している)より.alpha.-rhUG抗体でより強く反応するように見えます。
全面的な量の二量体(表16)と比較して、214nmの総計の分析は、体積排除クロマトグラフィーによってrhUG総計の最小の構成を示します。
[0234] rhUGのための等電点はIEFゲル(図26)を使用して、4.7であるとわかりました。
結果は、スイスのプロ(www.expasy.ch)へのアミノ酸配列のサブミッションによって確認されました。計算されたpI(4.7)は観察されたpIと同じでした。
例VII
製剤原料の安定
[0235] 典型的な製剤原料および典型的な製剤は、同じ集中に、および同じ定式(つまり、補形薬は加えられません)にあります。
安定は製剤上でテストされました。
[0236] 製剤の公式化およびパッケージング
[0237] 典型的な製剤の最終十分の中で使用される材料、化学薬品および設備はすべて、表17〜19にリストされます。
［表１７］製剤アイテム・メーカー2mlのガラス瓶ホイートンV-35のファイナル十分の中で13mm使用される材料は、ウェスト13mmのアルミニウムひだシーラー・ホイートンに2mm栓をします、管材料アセンブリー・ホイートン・ピンセット- 6"のN/AアルミホイルN/A 600mlのビーカーKimax
[0238]
［表１８］化学薬品は、製剤の化学のメーカー・バルクrhUG WRAIRの最終十分の中で無菌の70%のイソプロピルアルコールVeltrekを使用しました。
[0239]
［表１９］製剤機器製造業者バランス縫工筋Omnispenseホイートン・クリンパKebbyの最終十分の中で使用される設備
[0240] 製剤の典型的な具体化の構成は次のとおりです:
5.5mg/mlのrhUGおよび0.9%(w/v)で塩化ナトリウム。
埋立作業はすべてクラス100環境室で行なわれました。
十分用の部屋およびオペレーションの両方はオペレーターによって有効になりました。
Omnispenseポンプは、火薬が詰められ、2.0gの重量に充満する準備ができて、2mmの管材料でセット・アップされました。+.5%(1.90-2.10ml)。
十分プロセスを概説するフローチャートは、図27に示されます。
2mlのガラス瓶は風袋を計られました。また、大量のrhUGはガラス瓶へ分配されました。
充満後に、ガラス瓶の重量は記録されました。
この手続きは、2回繰り返されました。
3個のガラス瓶の十分重量が指定範囲内にすべてあった場合、ガラス瓶がすべて満たされました。
ガラス瓶が指定範囲から落ちた場合、ディスペンサー・ボリュームは調節されました。また、プロセスが繰り返されました。
充満後に、ガラス瓶に栓が手動で付けられました。また、アルミニウム・クリンプ・シールはガラス瓶上に置かれました。
ガラス瓶はKebbyパワーひだを使用して縮れました。
その後、ラベルはガラス瓶に視覚的に付けられ検査されました。
このように生産されたrhUG製剤は明瞭で無色の解決策に可視の微粒子を供給します。
[0241] 製剤の物理的および化学的特性の要約
[0242] RhUGは、アミノ酸配列から計算され、エレクトロスプレイ質量分光法によって確認されるような16110 kilodaltonsの分子量を備えた二量体タンパク質です。
タンパク質は、2つのシスチン契約によって互いに結び付けられた2つのサブユニットからなります。
相対的なサブユニット分子量およびシスチン契約の存在は、縮小し縮小しない状態の下のSDS-PAGEによって決定されました。
エドマン分解によるタンパク質のN-終点のアミノ酸配列があったように、バクテリア株(CG12)のDNA塩基配列が確認されました。
N-終点のシーケンスは予言される(SEQ。ID NO。10)ような翼状突起翼状突起-Glu-Ileでした。
システインは、固有の化学により、およびシステインが硫黄ボンディングに関係するという事実にこの方法によって容易に検知されません。
[0243] 表２０に示されたように、最後のバイアルされたｒｈＵＧ製剤が全ての特性を満たした。
[0244] 製剤原料のために記述されたように、二量体および製剤のモノマーの両方は、シーケンス分子量(図28)によって予言されるよりSDS-PAGEの上の低い分子量に走ります。
クマシ・ゲル(図28)のレーン5、9および11、および-rhUGのレーン6中の残余の二量体の存在によって実証されるように、還元剤が存在する状態での製剤のモノマーの中への二量体の分離は完了していませんでした、西洋(図29)。
rhUGが.alpha.-rhUGのレーン6の二量体とモノマーの両方の位置で明白な間、西洋(図29)、モノマーあるいは.alpha.のレーン4中のよりかすかな位置のいずれかに検知された大腸菌タンパク質はありませんでした。
大腸菌は西洋です(図30)。
.alpha.のレーン4において可視のバンドはありませんでした。
大腸菌は西洋です(図30)。
[0245] さらに、総計は、.alpha.-rhUGウェスタン(図29)のレーン3において明白でした。
二量体と総計の両方は、.alpha.でより強く反応するように見えます。
モノマーよりUG抗体;
これもUG ELISAの開発で観察されました。
全面的な量の二量体(表20)と比較して、214nmの総計の分析は、体積排除クロマトグラフィーによってrhUG総計の最小の構成を示します。
[0246] rhUGのための等電点はIEFゲル(図31)を使用して、4.7であるとわかりました。
結果はスイスのプロへのアミノ酸配列のサブミッションによって確認されました。計算されたpIは観察されたpIと同じでした。
[0247] 動物試験のために作られた前臨床開発ロットはすべてcGMPロットのために使用されるような同様の技術を使用して分析されました。
rhCC10のための臨界パラメータのための範囲は表21に示されます。pI、分子量、Nターミナル終了シーケンスおよび自由なチオールのような他の臨界パラメータは、rhUGのすべてのロットには本質的に同一でした。
［表２１］開発ロットrhCC10/6、rhCC10/7、rhCC10/8、cGMPロット0728および0853のための範囲。
57.7%のPLA.sub.2抑制(蛍光性の分析)への>99.5%アグリゲーション0.13%から3.4% PLA.sub.2 37.5抑制(放射性の分析)%に結果清浄の範囲を97.4% 56.0%から86.0%分析します。
[0248] 最終製剤は放出基準をすべて通り、動物実験の中で使用される資料と同一で、米国FDAによるフェーズのI/IIの人間の臨床試験で使用するには受理可能でしょう。
[0249] rhUG準備の安定
[0250] 精製したrhUG製剤、発展的なロット(GLP資料; 2-8.程度で格納されたロット番号rhUG/7。C。)、および製薬の等級生産ロット(2-8.程度で格納された製剤ロット番号0728。C。)に関する長期間安定性研究、製薬の等級生産ロット(25.程度で格納された製剤ロット番号0728。C.および60%の相対湿度)の加速テストのために18および15か月の間、それぞれ7か月の間実行されました。
規定時間では、各々のガラス瓶は2-8.程度で記憶装置から取り除かれました。
C.、またテストしました。
分析は表22に述べられています。
［表２２］安定性評価3Testスペシフィケーション清浄(縮小されたSDS PAGE).gtoreq.95%アグリゲーション.ltoreq.5のために行なわれた分析%生物活動のポジティブな等電点電気泳動アプ、自由なメルカプト基を含む4.7<10%
[0251] 研究ロットのための分析のための結果は表23に示されます。また、cGMPロットのための分析結果は、表24(2-8.程度。C。)および表25(25.程度。C.および60%のRH)に示されます。
［表２３］開発ロット時間上の安定性試験の結果、何か月も、テスト・スペック0 1 2(3)4 5 6 9 12(15)18清浄.gtoreq.95%>99.5%.sup.1>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%アグリゲーション.ltoreq.5%(2.7)0.6、0.3 1.2 0.42 0.1 1.30(0.30)0.14 0.078 0.065のPLA2(14 C)+ANA.sup.2 ANA ANA ANA、ANA ANA ANA 42 57%.sup.3% 28% 33%のPLA2(HPLC)+
ANA ANA ANA ANA ANA ANA ANA ANA、ANA 57%の57フィブロネクチン+na na na+na++++++(破片)等電のアプ4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)4.7 4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)4.7自由なメルカプト基を含む.ltoreq.10%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%を集中させること.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%これらの分析用計量の.sup.1Limit。
.sup.2Meansアッセイはその時間ポイントで利用可能ではありませんでした。
分析の開発での.sup.3RangesはrhUGのこのロットのために21%から57%でした。
[0252]
［表２４］4.程度でcGMPロット上の安定性試験の結果。
C.時間、何か月も、テスト・スペック0 1 2(3)6 9 12 15清浄.gtoreq.95% 97.4% 99.4% 98.6% 99.1%>99.5% 99.3%>99% 99.2%アグリゲーション.ltoreq.5 2.2%% 1.7% 3.0% 1.2% 1.2% 0.5% 0.5% 0.6% PLA2(14 C)+ANA.sup.1 ANA ANA、39% 39% 66% 69% 76%のPLA2(HPLC)+ANA ANA ANA ANA、ANA ANA 87% 76%フィブロネクチン++na+++++
+(破片)等電点電気泳動アプ4.7 4.7(4.7)4.7 4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)自由なメルカプト基を含む.ltoreq.10%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.sup.1meansはアッセイします、その時間ポイントで利用可能でなかった。
[0253]
［表２５］25.程度でcGMPロット上の安定性試験の結果。
C.および60% RH時間、何か月も、テスト・スペック1 2 4(7)清浄.gtoreq.95% 99.1% 96.3%>99% 98.9%アグリゲーション.ltoreq.5 0.53%% 0.25% 0.12% 0.34% PLA2(14C+56% 68% 60% 65% PLA2 HPLC)+73 ANA % 88% 76%フィブロネクチン+++++(破片)等電のアプ4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)自由なメルカプト基を含む.ltoreq.10%を<1%<1%<1%集中させる(<1%)こと
[0254] 示されるように、それらがもとは生産されvialedしたので、開発ロットおよびrhUGのcGMPロットの両方は18および15か月間以上それぞれ安定していました。
これらのrhUG準備は、2つの効力検定での生物活動に関しても多くの物理的および化学的特性に関してもテストされました。
これらのデータに基づいて、これらの準備が同じことを生体内で、互い、およびそれらのオリジナルの強さおよびここに記述されるような生物活動のタイプに関して、および適用サービスの中で行なうと予想することができます。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
[0255] 従って、現在の発明は商業ベースにのった製薬の構成および公式化と同様にrhUGに商業ベースにのった生産工程を供給します。
参照
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クレーム
要求されるものは次のとおりです:
1. 人間のUG(そこでは合成遺伝子は以下IDを含む)のためにコード化する合成遺伝子を含むrhUGの生産用の細菌発現システム。
番号1-4。
2. クレーム1の表現システム(そこでは合成遺伝子は合成遺伝子のN終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む)。
3. 遺伝子がシーケンスのN-終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む人間のUGのためにコード化する人間のシーDNAシーケンスを含むrhUGの生産用の細菌発現システム。
4. クレーム3の表現システム(そこでは表現システムはおよそ2.8kbのパーのシーケンスをさらに含む)。
5. 次のものを含むrhUG研究種子銀行を生産する方法:
a。
成長培地上にrhUG表現システムを含むバクテリア株の少なくとも1つの植民地に接種すること;
b。
静止期まで接種を受けた成長培地をかえすことは到達します;
c。
接種を受けた成長培地にグリセリンを加えること;
d。
割り切れる部分中の文化の凍結;
またe。
約-50C未満の温度で冷凍の割り切れる部分を格納すること。
6. クレーム5の方法、光学濃度が約0.8AUから1.5AUの550nmから660nmの間に測定するまで、接種を受けた成長培地はどこでかえされるか、到達します。
7. クレーム5の方法(そこではcryopreservativeなものはグリセリンを含む)。
8. クレーム5の方法(そこでは割り切れる部分は約1mlである)。
9. クレーム5の方法(そこでは貯蔵温度は約-70の間に、および-90.程度ぐらいある)。
C。
10. rhUGマスターセルバンクを含むことを生産する方法:
a。
細菌培養を形成するためにrhUG研究種子銀行の割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁に接種すること;
b。
細菌培養をかえすこと;
c。
加えること、1つの、凍結保存された解決を形成する細菌培養にcryopreservative;
d。
cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
またe。
約-60C未満の温度でcryovialを格納すること。
11. クレーム10の方法(到達して、光学濃度が約0.8AUから1.5AUの550nmから660nmの間に測定するまで、そこでは、文化はかえされる)。
12. クレーム10の方法(そこではcryopreservativeなものはグリセリンを含む)。
13. クレーム10の方法(そこではcryovialに転送された部分は約1mlである)。
14. クレーム10の方法(そこでは貯蔵温度は約-70と約-90Cの間にある)。
15. 次のものを含むrhUG生産セル・バンクを生産する方法:
a。
細菌培養を形成するためにrhUGマスターセルバンクの割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁に接種すること;
b。
細菌培養をかえすこと;
c。
加えること、1つの、凍結保存された解決を形成する細菌培養にcryopreservative;
d。
cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
またe。
約-60C未満の温度でcryovialを格納すること。
16. クレーム15の方法、光学濃度が約0.8AUから1.5AUの550nmから660nmの間に測定するまで、細菌培養はどこでかえされるか、到達します。
17. クレーム15の方法(そこではcryopreservativeなものはグリセリンを含む)。
18. クレーム15の方法(そこではcryovialに転送された部分は約1mlである)。
19. クレーム15の方法(そこでは貯蔵温度は約-70と約-90Cの間にある)。
20. 次のもののステップを含むrhUGを表現する方法:
a。
rhUGを表現することができる発現ベクターを含む生産シード・セル・バンク文化の提供;
b。
接種原を形成するために生産シード・セル・バンク文化を備えた肉汁培地に接種すること;
c。
ステップbの中で形成された細菌培養をかえすこと;
d。
発酵培養を形成するためにステップcで形成された接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
e。
大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
f。
発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
またg。
ステップfの後に発酵培養を収穫すること。
21. クレーム20の方法(そこでは発現ベクターは以下ID番号1-4を含む)。
22. クレーム20の方法(そこでは28.程度に関して温度で約12時間と約24時間の間の期間の間接種原は間に培養される)。
C.、そして36.程度に関して。
C。
23. クレーム20の方法(そこでは大規模発酵槽に少なくとも300リットルのキャパシティーがある)。
24. クレーム20の方法(光学濃度550nmから660nmが2.0AUの最小のODまで到達するまで、そこでは、ステップeの孵化は継続される)。
25. クレーム20の方法(そこでは誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含む)。
26. クレーム20の方法、そこで、約1〜約4時間の、ステップfおよびステップgの間に経過します。
27. クレーム20の方法(そこでは発酵培養の収穫は遠心分離を含む)。
28. 次のもののステップを含むrhUGを表現する方法:
a。
発酵培養を形成するためにrhUGを表現することができる発現ベクターを含む接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
b。
大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
c。
発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
またd。
発酵培養の収穫。
29. クレーム28の方法(そこでは発現ベクターは以下ID番号1-4を含む)。
30. クレーム28の方法(そこでは大規模発酵槽に少なくとも300リットルのキャパシティーがある)。
31. クレーム28の方法(光学濃度550nmから660nmが2.0AUの最小のODまで到達するまで、そこでは、ステップbの孵化は継続される)。
32. クレーム28の方法(そこでは誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含む)。
33. クレーム28の方法、そこで、約1〜約4時間の、ステップcおよびステップdの間に経過します。
34. クレーム28の方法(そこでは発酵培養の収穫は遠心分離を含む)。
35. 次のもののステップを含むrhUGを精製する方法:
a。
過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を含む細菌細胞ペーストの提供;
b。
上澄みを形成するために細菌細胞ペーストを溶解すること;
c。
1位を形成するために薄膜から(NMWCO)カットされた最初の名目上の分子量によってステップbの中で形成された上澄みのろ過、浸透する;
d。
1番目の集中、別のNMWCO薄膜の使用によってステップcで形成されて浸透する;
e。
濃縮もののロード、最初の溶離液を形成するために陰イオン交換カラム上にステップdの中で形成されて浸透する;
f。
別の濃縮物を形成する3番めのNMWCO薄膜の使用によってステップeの中で形成された最初の溶離液の集中;
g。
別の溶離液を形成するためにハイドロキシアパタイト(HA)カラム上にステップfで形成された第2の濃縮物のロード;
精製されたrhUGを提供するためにステップgで形成された第2の溶離液中のrhUGからホストを派生したタンパク質を分けるh;
またi。
ステップhで形成された、精製されたrhUGの回復
36. クレーム35の方法(そこでは細菌細胞の中で発現した合成遺伝子は以下ID番号1-4を含む)。
37. クレーム35の方法(そこでは溶解は刈ることを含む)。
38. クレーム35の方法(ステップbおよびステップcの間で、そこでは細胞残屑は遠心分離によって削除される)。
39. クレーム35の方法(そこではステップbの薄膜は30K〜100KのNMWCO薄膜に関係している)。
40. クレーム39の方法(そこではステップcのフィルタリングは接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含む)。
41. クレーム35の方法(そこではステップdの薄膜は5つKのNMWCO薄膜に関係している)。
42. クレーム35の方法、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップを含むこと
43. クレーム42の方法(そこでは陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップはハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー・ステップの代わりに用いられる)。
44. クレーム42の方法(そこではSP Sepharose速いフロー(SPSFF)陽イオン交換カラムは使用される)。
45. クレーム35の方法、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィー・ステップを含むこと
46. クレーム45の方法(そこでは疎水性相互作用クロマトグラフィー・ステップは別のクロマトグラフィー・ステップの代わりに用いられる)。
47. クレーム46の方法(そこではフェニル基を含むSepharose速いフロー/最高値代用(PSFFHS)カラムは使用される)。
48. クレーム41の方法(そこではステップeの陰イオン交換カラムはマクロのQ陰イオン交換カラムである)。
49. クレーム41の方法(そこではキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムでステップhのホストを派生したタンパク質は分離される)。
50. クレーム49の方法(そこではCSFF樹脂カラムは銅を含む)。
51. クレーム50の方法、そこで、ステップhの後に、1つの、確かに、荷電膜は、パスを形成するCSFFカラムに下流に通り抜けて本質的に置かれます、ホスト誘導蛋白質がない
52. クレーム51の方法、そこで、確かに、荷電膜はSartobind Q TFF薄膜です。
53. クレーム35の方法(そこでは第2の溶離液は30KのNMWCO薄膜に関してdiafilteredされる)。
54. クレーム35の方法、rhUGは、どこでステップiの中で回復したか、総計が本質的にありません。
55. 次のもののステップを含むrhUGを精製する方法:
a。
過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞の提供;
b。
上澄みを形成するために細菌細胞を溶解すること;
c。
薄膜から(NMWCO)カットされた分子量によって液体をろ過すること;
d。
交換柱に液体を載せること;
e。
rhUGから精製されたrhUGを提供するためにホストを派生したタンパク質を分けること;
またf。
精製されたrhUGの回復。
56. クレーム55の方法(そこでは細菌細胞の中で発現した合成遺伝子は以下ID番号1-4を含む)。
57. クレーム55の方法(そこではステップcのフィルタリングは接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含む)。
58. クレーム55の方法(そこではステップdの交換柱はマクロのQ陰イオン交換カラムである)。
59. クレーム55の方法(そこではキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムでステップeのホストを派生したタンパク質は分離される)。
60. クレーム55の方法、rhUGは、どこでステップfで回復したか、総計が本質的にありません。
61. 次のもののステップを含む製薬の等級rhUG製剤原料を生産する方法:
a。
rhUGを表現することができる細菌発現システムの提供;
b。
発酵培養を形成するために細菌発現システムを含む接種原を備えた発酵槽への接種;
c。
発酵培養に細菌発現システムによるrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
d。
ステップcで表現されたrhUGの収穫;
またe。
rhUGの精製はステップdの中で収穫しました。そこでは精製するステップは、少なくとも1つのろ過段階および少なくとも1 exhangeカラムの使用を含みます。
62. 次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)、前述のサンプルへのラベルが付けられた基板の導入、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)分裂の決定するレベル。
63. クレーム62の方法、分析は、どこで使用されるか、1つの、標準、ラベルは.sup.14C付けられた、分析します。
64. クレーム62の方法(そこでは放射性同位体で識別された基板は1-stearoyl-2-[.sup.14C]arachidonyl phosphotidylコリンである)。
65. クレーム62の方法(そこでは200 nMへの2 nMの終末濃度に組換えの人間uteroglobinホスホリパーゼA.sub.2は加えられる)。
66. クレーム62の方法(そこではステップ(a)のサンプルは30.程度で15分から30分間前培養される)。
40.程度へのC.。
C。
67. クレーム62の方法(そこではステップ(b)の中の反応は解決を止める有機相の追加によって止められる)。
68. クレーム62の方法(そこでは攪拌と遠心分離により、ステップ(c)の中のサンプルは分離される)。
69. クレーム62の方法(そこではステップ(c)の製品は液体の液体の分離によってサンプルから分けられる)。
70. クレーム62の方法(そこではひらめきを数えることにより、ステップ(d)の中の分裂のレベルは決定される)。
71. 次のものを含む組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2酵素の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することを生体外で測定する方法:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
72. 次のものを含む組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2活動の抑制のための分析する分析方法:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
73. 次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法:
(a) ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいるサンプルと連絡をとって、(b)flourescentlyに導入することは、flourescenceによって前述のサンプルへの基板、(c)サンプルからの分離する裂かれていない基板および(d)決定する量の裂かれた基板にラベルを付けました。
74. クレーム73の方法(そこでは34.mu.M.に対してステップ(a)の中の組換え型ヒトuteroglobinのサンプルは34 nMの終末濃度をしている)。
75. クレーム73の方法(そこではステップ(a)のサンプルは40.程度に約30で約15〜30分間前培養される)。
C。
76. クレーム73の方法(そこではラベルがflourescentlyに付けられた基板は2-デカノイル-1-(O-(11-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-indac-である)(エン-3propionyl)アミノ)ウンデシル)-sn-glycero-3-phosphotidylcholine)(。)
77. クレーム73の方法(そこではステップ(b)の中の反応は解決を止める有機相の追加によって止められる)。
78. クレーム73の方法(100までステップ(c)1.mu.Lでは、そこでは止められた分析の.mu.Lは珪酸正常相HPLCカラムに直接載せられる)。
79. 次のものを含むフィブロネクチンへの組換え型ヒトuteroglobinの結合を生体外で測定する方法:
(a) 組換えの人間CC10-HRP共役を備えた人間のフィブロネクチンの組換えの破片との接触、フィブロネクチン破片への組換え型ヒトuteroglobinの結合を決定するために(b)分析を視覚化すること
80. 含む組換え型ヒトuteroglobinの清浄、(a)クレーム35のプロセス内の各ステップの中間物のとるサンプルおよび(b)プロセス中間物を分析することを決定する方法。
81. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物はSDS-PAGEによって分析される)。
82. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物はrhUG ELISAによって分析される)。
83. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物はLALによって分析される)。
84. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物は蛋白質含有量のために分析される)。
85. クレーム35の精製された組換え型ヒトuteroglobinを含む製薬の構成。
86. 精製された組換え型ヒトuteroglobin、薬学的に受理可能なキャリアーあるいは希釈剤を含む製薬の構成。
87. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが組換え型ヒトuteroglobinの5%未満の総計を含んでいる、クレーム86の製薬の構成。
88. 前述の組換え型ヒトuteroglobinに95%以下の清浄がある、クレーム86の製薬の構成。
89. 前述の組換え型ヒトuteroglobinの内の菌体内毒素レベルが5未満のEU/mg rhUGを含む、クレーム86の製薬の構成。
90. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが塩化ナトリウム解決中である、クレーム86の製薬の構成。
91. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも4か月の間のC.。
92. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも6か月の間のC.。
93. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも9か月の間のC.。
94. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも12か月の間のC.。
95. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも15か月の間のC.。
96. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも18か月の間のC.。
97. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも1か月のC.および60%の部屋湿度。
98. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも2か月の間のC.および60%の部屋湿度。
99. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも4か月の間のC.および60%の部屋湿度。
100. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも7か月の間のC.および60%の部屋湿度。
101. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが哺乳動物に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
102. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが人間に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
103. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが気管内のチューブによって処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
104. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが未熟児に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
105. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが人工界面活性剤を受け取る患者に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
106. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが呼吸困難中の患者に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
米国特許出願公開第２００３０２０７７９５号
（１９）米国
（１２）特許出願公開
ピロン(アプリーレL.)ら
（１０）公開番号：US2003/0207795
（４３）公開日：2003年11月6日
（５４）炎症性及び繊維症の状態の治療用の精製された組換え型ヒトuteroglobinの生産のための方法
（７６）発明者:
ピロン(アプリーレL)。
(ゲーサーズバーグとMD);
ウェルチ(リチャードW)。
(ゲーサーズバーグとMD)
連絡先
バリー・エヴァンス、Esq
クレイマー・レビンNaftalis &フランケルLLP
919 3番目の通りニューヨークNY10022米国
（２１）出願番号：10/187498
（２２）出願日：2002年7月2日
（６３）関連する米国出願データ
1997年5月28日に出願された出願番号08/864357（現特許第6255281号）の部分継続出願である2001年7月2日に出願された部分継続出願番号No.09/898616
（５１）国際特許分類
A61K 038/41;
G01N 033/554;
G01N 033/569;
C07H 021/04;
C12P 021/04;
C12N 015/74;
C12N 001/21
（５２）U.S. Cl.
514/6;
435/69.6;
435/252.3;
435/472;
536/23.5;
435/7.32
（５７）アブストラクト
現在の発明は、使用のために組換え型ヒトuteroglobin(rhUG)の生産に一般に関係があります、として、1つの、炎症と線維症の治療において治療。
より詳しくは、その発明は、現在の医薬品最適製造基準(cGMP)によるrhUGのスケールアップした生産のために、細菌発現とタンパク質精製のステップを広く含むプロセスを提供します。
その発明は、スケールアップしたcGMPプロセスによって生産されたrhUGの生体内の生物活動の相対的強弱度を評価するためにさらに分析的な分析を提供します。
炎症性及び繊維症の状態の治療用の精製された組換え型ヒトuteroglobinの生産のための方法
[0001] この申請は2001年7月2日に提出されて、米国シリアル番号09/898,616の一部継続出願です、それは1997年5月28日にファイルされて、米国シリアル番号08/864,357の一部継続出願です。
発明のフィールド
[0002] 現在の発明は、使用をしている組換え型ヒトuteroglobin(rhUG)の生産に一般に関係があります、として、1つの、炎症と線維症の治療において治療、免疫修飾物質の効果があり、平滑筋収縮を規制する。
より詳しくは、その発明は、現在の医薬品最適製造基準(cGMP)によるrhUGのスケールアップした生産のために、細菌発現とタンパク質精製のステップを広く含むプロセスを提供します。
その発明は、スケールアップしたcGMPプロセスによって生産されたrhUGの生体内の生物活動の相対的強弱度を評価するためにさらに分析的な分析を提供します。
発明の背景
[0003] 組換えのUteroglobinの治療用途
[0004] 線維症と同様に炎症性のことの治療用の改善された治療薬の捜索も、近年多くの考慮をされました。
新生児性呼吸促迫症候群(RDS)(肺表面活性剤欠乏症)は、それが未熟児の中の死の主な原因のうちの1つであることに特別に興味のある状態です。
界面活性剤治療の導入は劇的にRDS患者の生存を改善していますが、この患者集団の重要な割合中の慢性炎症性・線維症の開発は、大問題です。
同様に、糸球体のネフロパシーおよび腎線維症は患者の腎臓が閉鎖されるようになり、もはや血液をろ過しない場合に、段階腎不全を終了するためにリードします。
糸球体のネフロパシーおよび腎線維症の多くの形式、フィブロネクチン預金が特徴です。
両方の疾病では、フィブロネクチンおよびコラーゲン沈着および繊維症は器官を機能を持たなくします、そして生命を維持することができずに、結局。
したがって、これらの患者は長期血液透析または腎臓移植を要求します。
[0005] 組換えの人間UGは、いくつかの臨床の表示での治療薬として開発中である、有益抗炎症剤、反繊維症、抗腫瘍、呼吸・免疫調節性を備えたタンパク質です。
組換え型ヒトUGはUGの欠乏が特徴だった状態の治療に役立ちます。
それは、特に肺の炎症状態(例えば新生児性呼吸促迫症候群、気管支肺異形成症(BPD))(RDS)の治療に適しています;
成人のRDS(ARDS)、敗血症、膵臓炎、コラーゲン脈管疾患、関節リウマチ、急性腎不全および自己免疫のぶどう膜炎のようなローカルの血清PLA.sub.2活動の向上が特徴だった状態の治療のために;
新生児のRDS/BPD、ARDS、関節リウマチ、喘息、腹膜炎、遺伝的なFn預金糸球体腎炎を含む糸球体症および自己免疫のぶどう膜炎のようなPLA.sub.2活動中のローカルの高台が特徴だった状態の治療のために;
繊維症の状態の治療のために、フィブロネクチンの沈着が病原体(例えば特発性肺線維症、ブレオマイシン肺、嚢胞性繊維症、糸球体のネフロパシー、特に家族性のglomeruleropathy)である場合、腎臓中のFn預金が特徴だった、どれ、結局、腎不全への鉛、さらに外生のUGで扱うことができる;
そして補う量のrhUGの処理により、内部成長的な機能的なUGの欠乏が特徴だった炎症性か繊維症の状態を治療するか防ぐ方法に。
[0006] RhUGはフィブロネクチンへのセルの付着を禁じるのに役立ち、既に置かれていたフィブロネクチン上の炎症細胞および線維芽細胞遊走を禁じて、細胞(膜結合タンパク)と細胞外基質タンパク質の間の相互作用を禁じます。
さらに、RhUGは、肺機能、肺コンプライアンス、血液酸素化および(または)血液pHを改善しかつ/または標準化するのに特に役立ちます。
RhUGは、呼吸器、消化器系、循環系、生殖システムおよび泌尿器系を含む様々な臓器系中の平滑筋集中の規則に特に役立ちます。
RhUGも、血管透過性を規制するか縮小し、血管内皮細胞と血管形成の移動のを禁じて、血管形成を防ぐために同様に使用されてもよい。
リンパ球生成を増加させるかつ、または長期での多形核白血球増殖を減少させるために、気管内のrhUGは、幹細胞刺激因子として使用されてもよい。
RhUGは、多形核白血球増殖を循環させる集中を減少させる間にリンパ細胞および(または)細胞障害性T細胞を循環させる集中を増加させます。それは自己免疫疾患かアレルギーに苦しむ患者に特に役立ちます。
静脈内のrhUGは、リンパ細胞を循環させる際にATP新陳代謝を抑えて、かつ短期での活性化された好中球、単球、マクロファージおよびNK細胞中のATP新陳代謝を増加させるために同様に使用されてもよい。
[0007] 組換え型ヒトUteroglobinの生産のための先行技術方法
[0008] 研究用(Mantile、1993年; Miele、1992年; シン、1987年; ジャクソン、1989年; アンダーソン、1994年; Umland、1994年; 青木、1996年)のためのミリグラム量へのマイクログラムで、rhUGおよび在来か組換えのuteroglobinあるいは尿中タンパク-1のいずれかの精製を表現する、いくつかの公表された方法があります。
これらの方法は全く変えられます。しかし、どれも、よくタンパク質の大規模生産に適しません。また、どれも、調合薬の生産のプロセスに要求される規制問題に取り組みません。
更に、これらの様々な準備の生物活動は必ずしも等価ではありません。
例えば、Nieto(1997)は、在来のウサギuteroglobinが凍結乾燥上のそのプロゲステロン活動のうちのいくらかを失い、その一方でMieleとMantileがそれらの精製工程の間に集中ステップとして繰り返された体積排除クロマトグラフィー・ステップおよび多数の凍結乾燥を使用している、と報告しました。
しかしながら、エンドユーザは、両方の凍結乾燥を備えたrhUG増加の総計のパーセンテージ以来凍結乾燥された製品上に使用する準備ができている製品を非常に好み、凍結を繰り返しました、サイクルを溶かします。
ハイ・レベルの集合は生物活動に悪影響を及ぼすことができます。あるいは、そのハイ・レベルのは免疫性を変更するか、最終製剤の性能を変更することができます。
好ましくない人物総計が不潔に任命するFDAのガイドラインの下では、製剤の全ロットは製剤内のハイ・レベルの総計に基づいて拒絶されるかもしれません。
[0009] 組換えの治療学の開発での問題
[0010] 組換え型タンパク質に基づいた製剤原料の生産は、現在の医薬品最適製造基準(cGMP)と呼ばれた、アメリカ食品医薬品局(FDA)によって述べられたガイドラインを厳守するいくつかのプロセスの開発を含んでいます。
FDAのcGMPガイドラインを厳守するプロセスはcGMPに準拠です。
米国と他のどこかで製薬の構成か製剤を売るために、cGMPプロセスを使用して、製剤を生産することが必要です。
[0011] タンパク薬物の販売および使用と同様に製剤原料としての組換え型タンパク質の臨床開発も、その製剤原料の詳細な特性記述と同様に製剤原料用のよく特徴づけられ複製可能な生産工程も要求します。
[0012] それらの活動がアミノ酸組成だけでなくタンパク質の構成にも依存するので、組換え型タンパク質は特別の挑戦を表わします。
タンパク質の構成は、4レベルで特徴づけられるかもしれないタンパク質の全面的な三次元構造です。
最初のレベルはその一次構造かアミノ酸配列です。
第2のレベルはタンパク質の二次構造で、アルファ・ヘリックス、ベータシートおよびオメガ・ループのような地方の安定した構造の地方を形成する、タンパク質の中で約6-30のアミノ酸の短い伸張に関連した構成のパターンです。
3番目のレベル、三次構造は、タンパク質またはペプチドのモノマーを表わして、アミノ酸の単一の接触する伸張内のユニットか領域の中への二次構造のグループ分けから成ります。
4つの螺旋形の束あるいはフィブロネクチン・タイプIII繰り返しは三次構造の例です。
4番目のレベル、四次構造は存在します、いつ、2つ以上の個々のペプチドあるいはタンパク質モノマー結合、単一の機能ユニットを形成するために共有結合であるいは非共有結合で。
[0013] さらに、活動が形に加えて、チャージおよび恐水の性格が組換え型タンパク質が特に生理環境中の他の生物学および化学物質と対話する能力に著しく寄与する表面特性に依存するので、組換え型タンパク質は一層の挑戦を示します。
タンパク質のアイソフォームは、構成、表面電荷および(または)恐水の性格における小さな変化から成ります。
これらの変化は、温度の変化に、周囲の環境中の化学薬品、塩類あるいは他の生物分子(例えばタンパク質、炭水化物、脂質、核酸など)との相互作用に、あるいは(タンパク質中の)実際の化学修飾から個々のアミノ酸まで起因するかもしれません。
タンパク質の異なるアイソフォームは、疎水的相互作用HPLC、質量分析、キャピラリー電気泳動、ペプチド・マッピング、等電点電気泳動および二次元電気泳動のような高解像度分析手法によって検知することができます。
[0014] 例えば、組換え型タンパク質薬の物理的形状および構成は、強くそれが製剤原料として使用のために精製されるプロセスと同様にそれが生産される表現システムによっても影響を受ける場合があります。
同様に、組換え型タンパク質製品の生じるアイソフォームかアイソフォームも、強くそれが生産される表現システムおよびプロセスによって影響を受ける場合があります。
タンパク質の生物活動は、その化学合成品だけでなくその構成およびアイソフォームに大きく依存します。
例えば、タンパク質の本性は、高いか低温への接触によって部分的にあるいは完全に奪われるかもしれません。また、そのタンパク質は生物学上不活発にされるかもしれません。しかし、それは、まだアミノ酸の同じシーケンスを保持します。
したがって、組換え型タンパク質の生物活動は、その化学合成品だけでなくそれが表現され精製され、公式化され、さらにパッケージにされるプロセスにも依存します。
[0015] 製剤原料または製品は、しばしば生物活性化合物およびその乗り物か、キャリアーに加えて余分なコンポーネントを持っています。
これらのコンポーネントは、薬が生産された原料あるいは精製、公式化あるいは最終のパッケージング・プロセスの一部として導入された材料に由来します。
製剤が製剤原料(例えば患者の中で使用される製品。)の最終のパッケージにされた公式化である間、製剤原料は精製されたバルク製剤の最終形態として定義されます。
単独であるいは薬自体と結合して、製剤原料か製品のこれらの余分なコンポーネントは不純物または汚染物質と考えられ、それら自身の意図しないか不適当な生物活動をしているかもしれません。
汚染物質は、不純物が薬自体(例えば破片、変化、アイソフォーム、対掌体、総計など)のある要素を含んでいるコンポーネントとして定義されているかもしれない一方、薬自体に由来しないコンポーネントとして定義されるかもしれません。
したがって、それが薬自体の特性を決定するのでだけでなく、それが製剤原料と製剤中の汚染物質および不純物のレベルおよび自然を決定するので、薬生産工程は重要です。
それは注意深く生体内で、一貫して複製可能な生物活動を維持するためにプロセスを定義するためにしたがって不可欠です、製剤原料、製剤あるいは製薬の構成の。
したがって、それが薬剤生産に応じることができるように、組換え型タンパク質薬が生産されるプロセスは十分によく特徴づけられるべきです、規定するガイドライン、ノンコンプライアンスが売ることができないか、U.Sの中で、および他のところに使用することができない製品に帰着するので、商業ベースにのったこと
[0016] さらに、生物薬剤の生産工程は商業ベースにのったのに十分に効率的で経済的であるに違いありません。
研究用のための少量のタンパク質を生産するために研究所の中で使用される精製法は、生物薬剤の生産に典型的に適していません。
例えば、クロマトグラフィー・マトリックスが数グラムさえのタンパク質の精製に必要なカラムのサイズ中のそれ自身の重量の下で砕かれるので、体積排除クロマトグラフィーのような小規模方法は多くの場合より大規模生産には実際的ではありません。
更に、体積排除クロマトグラフィーは、プロセスの次のステップに先立って集中されなければならないそれほど扱いやすくない高いボリューム精製中間物に帰着して、サンプルのボリュームを常に増加させます。
したがって、生物薬剤の生産工程中の体積排除クロマトグラフィーの使用を回避することは高度に望ましい。
安定形のタンパク質製剤代理人を保存するために頻繁に使用された別の技術は、凍結乾燥です。
このプロセスは、それをそれが生物活動を失わずに、多くの月に備えて典型的に蓄えることができる、それが低下に典型的に弱い液体の形式から乾燥粉末形式に変換して、タンパク質の同時の真空凍結乾燥を含んでいます。
しかしながら、繰り返された凍結/雪解けサイクルは、rhUGの総計のパーセンテージを増加させます。それは生物活動の重要な変化に帰着するかもしれません。
発明の目的
[0017] 発明は、rhUGの生産のために細菌発現システムを提供することを主な目的とします。
[0018] 発明は、rhUGの生産のために方法を提供し、医薬用原料として使用に適している物質のために人間のuteroglobinの精製に提供することをもう一つの目的とします。
[0019] 発明は、cGMP基準に従うrhUGのスケールアップした生産を提供することをまだもう一つの目的とします。
[0020] 1つの、さらに、また、発明は、人間のUGの生物活動を生体外で測定する方法を提供することを関連オブジェクトとします。
[0021] 発明は、商業ベースにのった人間のuteroglobinの医薬品を提供することをまだもう一つの目的とします。
[0022] 一層のAおよび発明の関連オブジェクトは、rhUG研究種子銀行、マスターセルバンクおよび生産セル・バンクを生産する方法を提供する予定です。
発明の要約
[0023] その発明は、人間のUG(そこでは合成遺伝子は以下IDを含む)のためにコード化する合成遺伝子を含むrhUGの生産のために細菌発現システムを提供します。
番号1-4。
その発明は、さらに遺伝子がシーケンスのN-終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む人間のUGのためにコード化する人間のシーDNAシーケンスを含むrhUGの生産のために細菌発現システムを提供します。
[0024] その発明は、次のものを含むrhUG研究種子銀行を生産する方法をさらに提供します:
(a) 成長培地上にrhUG表現システムを含むバクテリア株の少なくとも1つの植民地に接種すること;
(b) 静止期まで接種を受けた成長培地をかえすことは到達します;
(c)接種を受けた成長培地にグリセリンを加えること;
(d)割り切れる部分中の文化を凍結すること;
そして約-50C未満の温度で(e)冷凍の割り切れる部分を格納すること。
[0025] その発明は、さらにrhUGマスターセルバンクを含むことを生産する方法を提供します:
(a) rhUG研究種子銀行の割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁への接種;
(b) 接種を受けた煮出し汁をかえすこと;
(c)加えること、1つの、凍結保存された解決を形成するかえされた煮出し汁にcryopreservative;
(d) cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
そして約-60C未満の温度で(e)cryovialを格納すること。
[0026] その発明は、さらに次のものを含むrhUG生産セル・バンクを生産する方法を提供します:
(a) rhUGマスターセルバンクの部分を備えた適切なかえる煮出し汁への接種;
(b) 接種を受けた煮出し汁をかえすこと;
(c)加えること、1つの、凍結保存された解決を形成するかえされた煮出し汁にcryopreservative;
(d) cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
そして約-60C未満の温度で(e)cryovialを格納すること。
[0027] その発明は、さらに次のもののステップを含むrhUGを表現する方法を提供します:
(a)rhUGを表現することができる発現ベクターを含む生産種子セル・バンク文化を提供すること;
(b) 接種原を形成するために生産種子セル・バンク文化を備えた肉汁培地に接種すること;
(c) ステップbの中で形成された接種原をかえすこと;
(d) 発酵培養を形成するためにステップ(c)の中で形成された接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
(e) 大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
(f)発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
そしてステップ(f)の後に(g)発酵培養を収穫すること。
[0028] その発明は、次のもののステップを含むrhUGを表現する方法をさらに提供します:
(a) 発酵培養を形成するためにrhUGを表現することができる発現ベクターを含む接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
(b) 大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
(c)発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
そして(d)発酵培養を収穫すること。
[0029] その発明は、次のもののステップを含むrhUGを精製する方法をさらに提供します:
(a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを提供すること;
(b)上澄みを形成するために細菌細胞ペーストを溶解すること;
(c) 1位を形成するために薄膜から(NMWCO)カットされた最初の名目上の分子量によってステップbの中で形成された上澄みのろ過、浸透する;
(d) 1番目の集中、1位を形成する別のNMWCO薄膜の使用によってステップ(c)の中で形成されて、浸透する、集中する;
(e) 濃縮もののロード、最初の溶離液を形成するために陰イオン交換カラム上にステップ(d)の中で形成されて浸透する;
(O) 別の濃縮物を形成する3番めのNMWCO薄膜の使用によってステップ(e)の中で形成された最初の溶離液の集中;
(g) 第2のロード、別の溶離液を形成するためにハイドロキシアパタイト(HA)カラム上にステップ(f)の中で形成されて浸透する;
(h) 精製されたrhUGを提供するためにステップ(g)の中で形成された第2の溶離液中のrhUGからホストを派生したタンパク質を分けること;
そして(i)ステップ(h)で形成された、精製されたrhUGを回復すること。
[0030] その発明は、さらに次のもののステップを含むrhUGを精製する方法を提供します:
(a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を提供すること;
(b)上澄みを形成するために細菌細胞を溶解すること;
(c) 薄膜から(NMWCO)カットされた分子量によって液体をろ過すること;
(d) 交換柱に液体を載せること;
(e) rhUGから精製されたrhUGを提供するためにホストを派生したタンパク質を分けること;
そして(f)精製されたrhUGを回復すること。
[0031] その発明は、次のもののステップを含む製薬の等級rhUG製剤原料を生産する方法を提供します:
(a)rhUGを表現することができる細菌発現システムを提供すること;
(b) 発酵培養を形成するために細菌発現システムを含む接種原を備えた発酵槽への接種;
(c)発酵培養に細菌発現システムによるrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
(d) ステップ(c)で表現されたrhUGの収穫;
そして(e)ステップ(d)で収穫されたrhUGを精製すること。そこでは精製するステップは、少なくとも1枚のフィルタおよび少なくとも1 exhangeカラムの使用を含みます。
[0032] その発明は、次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)、前述のサンプルへの放射性同位体で識別された基板の導入、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)分裂の決定するレベル。
[0033] その発明は、次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2酵素の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することを生体外で測定する方法をさらに提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入する放射性同位体で識別された基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0034] その発明は、さらに次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによって分泌のphopsholipase A.sub.2活動の抑制のために分析する分析方法を提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入する放射性同位体で識別された基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0035] その発明は、さらに次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を提供します:
(a) ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいるサンプルと連絡をとって、(b)flourescentlyに導入することは、flourescenceによって前述のサンプルへの基板、(c)サンプルからの分離する裂かれていない基板および(d)決定する量の裂かれた基板にラベルを付けました。
[0036] その発明は、次のものを含んで、フィブロネクチンへの組換え型ヒトuteroglobinの結合を生体外で測定する方法を提供します:
(a) 組換えの人間CC10-HRP共役を備えた人間のフィブロネクチンの組換えの破片との接触、フィブロネクチン破片への組換え型ヒトuteroglobinの結合を決定するために(b)分析を視覚化すること
[0037] その発明は、さらに精製された組換え型ヒトuteroglobin、薬学的に受理可能なキャリアーあるいは希釈剤を含む製薬の構成を提供します。
図面の簡潔な記述
[0038] その発明は、今、どれに、添付図面に関して、より詳細に述べられるでしょう:
[0039] 図1は、rhUGのための合成バクテリア遺伝子の構築を示します。
[0040] 図2は、合成バクテリア遺伝子を使用して、rhUGの表現を示します:
SDS-PAGE分析。
[0041] 10-20%のTricineゲル:
レーンは左から右までです:
レーン1:
サイズ標準レーン2:
引き起こされていないバクテリアの溶解物(レーン3):
バクテリアの溶解物を引き起こしました。
[0042] 図3は、プラスミドpCG12の遺伝子地図を示します。
[0043] 図4は、マスターおよび生産種子セル銀行業務プロセスのフローチャートを示します。
[0044] 図5は、マスターと生産の種子セル・バンクが由来した細菌培養の成長曲線を示します。
[0045] 光学濃度はマスター(1)およびプロダクション(n)種子の両方のために600nmで細胞増殖に続きました。
[0046] 図6は、rhUG表現のための発酵工程のフローチャートを示します。
[0047] 図7は、発酵培養の成長曲線を示します。
[0048] ODは600nm(O)で文化成長に続きました。溶存酸素調査は通気(DO、.circle-solid.)に続き、rpmの機能として動揺(。箱固体。)に続きました。
[0049] 図8は、発酵中にrhUG表現のSDSページ分析を示します。
[0050] 10-20%のTricineゲル。
レーンは左から右、レーン、虹標準1までです;
誘導後で、示された時に得られた発酵サンプル:
レーン、3.8時間2;
レーン4.0時間;
レーン、4.2時間4;
レーン、4.5時間5;
レーン、5.0時間6;
レーン、5.6時間7;
またレーン8と6時間
[0051] 図9aおよびbは、精製スキームのフローチャートおよびその小さな変化を示します。
[0052] 図10は、最初のTFFおよびdiafiltrationの詳細フロー図形を示します。
[0053] 図11aは、マクロのQ陰イオン交換クロマトグラフィー・ステップの詳細フロー図形を示します。
[0054] 図11bは、マクロのQ陰イオン交換クロマトグラフィー・ステップの代表的なクロマトグラムを示します。
[0055] 図12は、第2の集中/diafiltrationステップの詳細フロー図形を示します。
[0056] 図13aは、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー・ステップの詳細フロー図形を示します。
[0057] 図13bは、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー・ステップの代表的なクロマトグラムを示します。
[0058] 図14aは、銅のキレート化クロマトグラフィー・ステップの詳細フロー図形を示します。
[0059] 図14bは、銅のキレート化クロマトグラフィー・ステップの代表的なクロマトグラムを示します。
[0060] 図15は、Sartobind Qおよび3番目の集中/diafiltrationステップの詳細フロー図形を示します。
[0061] 図16は、最終diafiltrationおよび公式化の詳細フロー図形を示します。
[0062] 図17は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってrhUGの精製を示します。
[0063] 図18は、HICクロマトグラフィーによってrhUGの精製を示します。
[0064] 図19は、UGのための競争率の高いELISAのための標準曲線を示します。
[0065] 図20は、SPLA2分析のクロマトグラムを示します。
[0066] 図21は、フィブロネクチン結合分析用の標準曲線を示します。
[0067] SDS-PAGEによる精製法の図22aショー評価。
[0068] 10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
レーン2(天然のままの溶解物);
レーン3(100 K Retentate);
レーン4および5 K浸水;
レーン、#1、マクロのQ通り道5;
レーン6(マクロのQ洗濯I#1);
レーン7(マクロのQ洗濯I#2);
レーン8(マクロのQ洗濯1#3);
またレーン9(マクロのQ溶離液)。
[0069] 図22b:
SDS-PAGEによる精製法の評価。
[0070] 10-20%のTriceneゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
レーン2(ハイドロキシアパタイト通り道);
レーン3(ハイドロキシアパタイト洗濯I);
レーン4(ハイドロキシアパタイト溶離液);
レーン5(銅のCSFF通り道);
レーン6(Sartobind Q通り道);
レーン7、rhCC10バルクを精製しました。
[0071] 図23は、製剤原料の清浄のSDS-PAGE分析を示します。
[0072] 10-20%のTricineゲル:
サンプルは左から右レーン、虹標準1まであります;
レーン3と5.mu.g 0726;
レーン5と5.mu.gは0726を縮小しました;
レーン7と10.mu.g 0726;
レーン9と10.mu.gは0726を縮小しました;
レーン11と55.mu.g 0726．
レーン2、4、6、8、10および12は、満たされないでおかれました。
[0073] 図24は、反UGポリクローナル抗体を使用して、製剤原料のウェスタンブロットを示します。
[0074] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
[0075] レーン2(rhCC10(ロット0726));
レーン、rhCC10(ロット0728)レーン、虹標準4 3;
レーン、縮小されたrhCC10(ロット0726)5;
レーン、縮小されたrhCC10(ロット0728)6。
[0076] 図25は、反Eを使用して、製剤原料のウェスタンブロットを示します。
大腸菌溶解物ポリクローナル抗体。
[0077] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン、スタンダード、BL21(DE3)からの大腸菌細胞溶解物1;
レーン2(虹標準);
レーン3(rhCC10(ロット0726));
レーン4(rhCC10(ロット0728))。
矢は、レーン3および4中の大腸菌不潔の位置を示します。
[0078] 図26は、rhUG製剤原料の等電点電気泳動PAGEゲルを示します。
[0079] サンプルは左から右まであります:
レーン、標準1;
rhCC10ロット0726のレーン2と55.mu.g;
rhCC10ロットのレーン3と55.mu.g、rhCC10/。
[0080] 図27は、rhUG十分プロセスのフローチャートを示します。
[0081] 図28は、製剤の清浄のSDS-PAGE分析を示します。
[0082] 10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
レーン3と5図0728;
レーン5と5.mu.gは0728を縮小しました;
レーン7と10.mu.g 0728;
レーン9と10.mu.gは0728を縮小しました;
レーン11と10.mu.gは研究コントロール、rhCC10/7を縮小しました。
レーン2、4、6、8、10および12は、満たされないでおかれました。
[0083] 図29は、反UGポリクローナル抗体を使用して、製剤のウェスタンブロットを示します。
[0084] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン1(虹標準);
[0085] レーン2(rhCC10(ロット0726));
レーン3(rhCC10(ロット0728));
レーン4(虹標準);
レーン5(rhCC10(ロット0726));
レーン、縮小されたrhCC10(ロット0728)6。
[0086] 図30は、反Eを使用して、製剤のウェスタンブロットを示します。
大腸菌溶解物ポリクローナル抗体。
[0087] HybondP PVDFトランスファー薄膜に転送された10-20%のTricineゲル、サンプルは左から右まであります:
レーン、スタンダード、BL21(DE3)からの大腸菌細胞溶解物1;
レーン2(虹標準);
レーン3(rhCC10(ロット0726));
レーン4(rhCC10(ロット0728))。
矢は、レーン3および4中の40 kDでバンドの位置を示します。
[0088] 図31は、rhUG製剤の等電点電気泳動PAGEゲルを示します。
[0089] サンプルは左から右、レーン、標準1まであります;
rhCC10ロット0728のレーン2と55.mu.g;
rhCC10ロットrhCC10/7のレーン3と55.mu.g。
[0090] 図32は、cCG12(SEQ。ID NO。9)のためのヌクレオチド配列を示します。
[0091] 図33は、rhUG(SEQ。ID NO。10)のためのアミノ酸配列を示します。
発明の詳細な記述
[0092] 同時係属出願サービス中の開示
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026(WO 98/53846);
PCT/US99/16312(WO______);
PCT/US00/09979(WO______);
そしてPCT/US01/12126(WO______)これによって参照によって組込まれます。
[0093] 定義
ここに使用されるような[0094]「純粋なrhUG」他のタンパク質が検知できない手段1)、反Eを備えた、SDS-PAGEウェスタンブロットあるいは免疫沈殿によるrhUG準備。
大腸菌抗体、あるいは分析的なHPLCによって;
細菌内毒素が検知できない2)、LALテスト;
バクテリアの核酸が検知できない3)、サザンブロット(DNAハイブリダイゼーション)。
ここに使用されるような[0095]「精製されたrhUG」は、ここに定義されるような清浄に関係のある仕様書すべてに会ったrhUGを意味します。
ここに定義されるような[0096]「製薬の等級rhUG」手段rhUG、どれ、清浄、物理的な仕様書およびここに定義され、適用サービスに述べられているような生物活動仕様書すべてに会ったとして
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
ここに使用されるような[0097]「アイソフォーム」は、物理的か化学の手段によって識別することができ、異なる構成、翻訳後修飾に起因するアミノ酸の化学合成品における小さな変化あるいは精製と処理における変化を含む異なる生物活動を所有するタンパク質の選択方式を指します。
ここに使用されるような[0098]「コンフォーメーション」は、それが折り重ねられる方法、表面電荷および疎水性分配を含むタンパク質の三次元構造を指します。
所定のタンパク質も、他のタンパク質(化学薬品とセル)と同様に周囲の環境とのその相互作用に影響することができるいくつかの構成を持っているかもしれません。
ここに使用されるような[0099]「総計」は、単一タンパク質の多数の個々のユニットから構成された複合体を指します。
[0100] ここに使用されるような「不潔」は薬以外の最終生産物の中に慣例的にあるか、興味のあることに生物学である合成物を指し、補形薬を要求しました;
不純物は一方の製品になりえます。あるいは、プロセスは関係がありました。
ここに使用されるような[0101]「汚染物質」は、慣例的に現在でない合成物あるいは最終生産物の中にある材料を指します。
ここに使用されるような[0102]「仕様書」は、生物活動および抗原同一性と同様に物理的および化学的パラメータに関して製薬の等級タンパク質、製剤原料および製剤を定義する1セットの基準も指します。
ここに使用されるような[0103]「効力検定」は、タンパク濃度のような物理的パラメータに生物活動を関連づけて、与えられた薬の異なる準備を互いと比較する目的のために、製剤原料または製剤の生物活動を測定するために使用され、薬の生物活動の強さを生体内で測定するために使用される特定のテストを指します。
ここに使用されるような[0104]「イミュノアッセイ」は、抗原を識別するために使用されるテストをこの場合指します、ELISA(酵素免疫吸着法)を含む1つ以上の抗体の使用によるuteroglobin。
ここに使用されるような[0105]「公式化」は、特定の補形薬と生物学上活性製剤原料を含んでいる特定の製薬の構成を指します。
ここに使用されるような[0106]「プロセス中間物」はサンプルを含むことを指すか、あるいはプロセスの各ステップの製品に由来しました。
[0107] 「バルク製剤--」(製剤原料」を参照)--
ここに使用されるような[0108]「製剤原料」は、最終の薬コンテナーの中への最終公式化および十分に先立って、精製された薬(つまりrhUG)を指します。
ここに使用されるような[0109]「製剤」は、患者集団での使用をその最終形態の薬を指します。
ここに使用されるような[0110]「RhUG製剤原料」ここに述べられた仕様書に会うrhUGの手段の製薬の等級準備、また活動を調停する、ここに適用サービスの中で記述した。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
ここに使用されるような[0111]「RhUG製剤」ここに述べられた仕様書に会うrhUGの手段の製薬の等級準備、また活動を調停する、ここに適用サービスの中で記述した。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
ここに使用されるような[0112]「標準処理手順」は、cGMPガイドラインの下の特別のタスクの実行のための定義された手続きを意味します。
ここに使用されるような[0113]「リサーチ種子銀行」は、GLP状態の下で作られた種子銀行を意味します。
ここに使用されるような[0114]「マスター種子銀行」は、cGMP状態の下で作られた種子銀行を意味します、種子銀行の目的は、プロダクション種子銀行の生産、および長期貯蔵のための出所として働くことです。
ここに使用されるような[0115]「プロダクション種子銀行」は、cGMP発酵を始めるために使用されるcGMP状態の下で作られた種子銀行を意味します。
ここに使用されるような[0116]「cGMP」は現在の医薬品最適製造基準を意味します。
ここに使用されるような[0117]「cGMP生産工程」は、FDAによって定義されるようなcGMPの下で生じる生産工程を意味します。
ここに使用されるような[0118]「安定した製剤原料/プロダクト」は、生物学および物理的安定性を示す一連のあらかじめ定義された基準を満たす製剤原料/製品を意味します。
[0119] ここに使用されるような「生物学上アクティブなrhUG」は、PLA.sub.2の活動を抑制することができ、組換え型ヒトフィブロネクチン破片に拘束することができるUG、および適用サービスに述べられていた活動を意味します。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
好ましい具体化の記述
[0120] その発明は、rhUGの生産用の細菌発現システムを含んでいます。
1つの具体化では、細菌発現システムは、人間のUGのためにコード化する合成遺伝子を含みます。
別の具体化では、合成遺伝子は以下IDを含みます。
番号1-4。
その発明は、さらに遺伝子がシーケンスのN-終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む人間のUGのためにコード化する人間のシーDNAシーケンスを含むrhUGの生産のために細菌発現システムを提供します。
一層の具体化では、合成遺伝子は、さらに合成遺伝子のN終点でメット翼状突起翼状突起を含みます。
まだ別の具体化では、表現システムはさらにおよそ2.8kbのパーのシーケンスを含みます。
[0121] その発明は、さらにrhUG研究種子銀行を生産する方法を含んでいます。
1つの具体化では、rhUG研究種子銀行を生産する方法は、次のもののステップを含みます:
a) 成長培地上にrhUG表現システムを含むバクテリア株の少なくとも1つの植民地に接種すること;
b) 静止期まで接種を受けた成長培地をかえすことは到達します;
c)加えること、1つの、cryopreservative、例えば接種を受けた成長培地へのグリセリン;
d)割り切れる部分中の文化を凍結すること;
そしてできれば-50.程度から、約-50C未満の温度でe)冷凍の割り切れる部分を格納すること。
-100.程度へのC.。
C。
別の具体化では、rhUG研究種子銀行を生産する方法は550nmから660まで光学濃度(OD)によって成長をモニターして、接種を受けた成長培地をかえすことを含みます、1.5AUまで約0.8の吸光度ユニット(AU)の光学濃度が到達するまで、できれば600nmで走ります。
[0122] その発明は、さらに次のもののステップを含むrhUGマスターセルバンクを生産する方法を含んでいます:
a) 細菌培養を形成するためにrhUG研究種子銀行の割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁に接種すること;
b) 細菌培養をかえすこと;
c)加えること、1つの、凍結保存された解決を形成する細菌培養にcryopreservative;
d) cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
そしてできれば-50.程度から、約-60C未満の温度でe)cryovialを格納すること。
-100.程度に。
C。
1つの具体化では、rhUGマスターセルバンクを生産する方法は、約0.8AUから1.5AUの光学濃度が到達するまで、できれば600nmで、550nmから660nmまで光学濃度(OD)によって成長をモニターして、細菌培養をかえすことを含みます。
[0123] マスターセルバンクの一部からrhUG生産セル・バンクを生産するメソッドも示されます。
[0124] 現在の発明は、rhUGを表現する方法を含んでいます。
1つの具体化では、rhUGを表現する方法は、次のもののステップを含みます:
a)rhUGを表現することができる発現ベクターを含む生産シード・セル・バンク文化を提供すること;
b) 接種原を形成するために生産シード・セル・バンク文化を備えた肉汁培地に接種すること;
c) ステップbの中で形成された接種原をかえすこと;
d) 発酵培養を形成するためにステップ(c)の中で形成された接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
e) 大規模発酵槽内のステップ(d)の中で形成された発酵培養をかえすこと;
f)rhUGの表現を引き起こすためにステップ(e)の中で形成された発酵培養に誘導代理人を加えること;
また発酵培養を収穫すること。
[0125] 1つの具体化では、rhUGを表現する方法は、以下ID番号1-4を含む発現ベクターを使用します。
別の具体化では、接種原は、28.程度に関して温度で約12時間と約24時間の間の期間の間間に培養されます。
C.、そして36.程度に関して。
C。
まだ別の具体化では、ステップ(e)の孵化は2つの吸光度ユニットに、できれば600nmで、660nmから550nmの範囲の中で、最小のODまで継続されます、到達します。
[0126] 誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)かもしれません。(。)
まだ1〜4時間に関する別の具体化の中で、誘導ステップと収穫するステップの間に経過します。
まだ発酵培養を収穫する別の具体化の中で、遠心分離を利用します。
[0127] 現在の発明は、次のもののステップを含むrhUGを表現するさらなる方法を提供します:
a) 発酵培養を形成するためにrhUGを表現することができる発現ベクターを含む接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
b) rhUGの表現を引き起こすために発酵培養に誘導代理人を加える大規模な発酵槽c)の内の発酵培養をかえすこと;
そしてd)発酵培養を収穫すること。
[0128] rhUGを表現するための1つの具体化では、発現ベクターは以下ID番号1-4を含みます。
発明は、大規模発酵槽に少なくともある別の具体化の中で提供します、300リットルのキャパシティー。
まだ別の具体化では、ステップbの孵化は、約2.0AUに、550nmから660nmまで最小の光学濃度までむしろ600nm継続されます、達成されます。
まだ別の具体化では、誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含みます。
1〜約4時間に関する一層の具体化の中で、ステップcおよびステップdの間に経過します。
発酵培養を収穫する一層の具体化の中で、遠心分離を含みます。
[0129] その発明は、rhUGを精製する方法をさらに含んでいます。
1つの具体化の中で、次のもののステップを含むrhUGを精製する方法:
a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを提供すること;
b)上澄みを形成するために細菌細胞ペーストを溶解すること;
c) 1位を形成するために薄膜から(NMWCO)カットされた最初の名目上の分子量によって上澄みをろ過すること、浸透する;
d)、1番目の集中、1位を形成する別のNMWCO薄膜の使用によって浸透する、集中する;
e) 濃縮もののロード、最初の溶離液を形成するために陰イオン交換カラム上にステップ(d)の中で形成されて浸透する;
f) 別の濃縮物を形成する3番めのNMWCO薄膜の使用によってステップ(e)の中で形成された最初の溶離液の集中;
(g) ハイドロキシアパタイト(HA)カラムに別の溶離液を形成するために第2の濃縮物を載せること;
h) 精製されたrhUGを提供するrhUGから、第2の溶離液中のホストを派生したタンパク質を分けること;
そしてi)精製されたrhUGを回復すること。
[0130] 1つの具体化の中で、rhUGを精製する方法は、以下ID番号1-4を含む細菌細胞を利用します。
細菌細胞ペーストを溶解する別の具体化の中で、刈ることによって達成されます。
まだ別の具体化細胞残屑の中で、ステップ(b)の間の遠心分離によって削除される、そして(c)。
まだ別の具体化では、ステップ(b)の薄膜が30K〜100KのNMWCO薄膜に関係しています。
[0131] 別の具体化では、ステップ(c)のフィルタリングは、接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含みます。
別の具体化では、ステップdの薄膜が5つkの遮断薄膜に関係しています。
まだ別の具体化では、陰イオン交換カラムはマクロのQ陰イオン交換カラムです。
まだ別の具体化では、ホストを派生したタンパク質は、キレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムで分離されます。
1つの具体化では、CSFF樹脂カラムは銅を含みます。
まだ別の具体化では、ホストを派生したタンパク質は、30 KのNMWCO薄膜によってrhUGをろ過することにより、rhUGから分けられます。
[0132] 別の具体化の中で、1つの、確かに、荷電膜は、パスを形成するCSFFカラムに下流に通り抜けて本質的に置かれます、ホスト誘導蛋白質がない
1つの具体化では、この確かに強烈な薄膜はSartobind Q TFF薄膜です。
まだ別の具体化の中で、パス、によって、5つKのNMWCO薄膜に関してdiafilteredされます。
別の具体化では、ステップiの中で回復されたrhUGは、総計が本質的にありません。
[0133] 現在の発明は、rhUGを精製するさらなる方法を提供します。
これらのさらなる方法のうちの1つは、次のもののステップを含みます:
a)過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を提供すること;
b)上澄みを形成するために細菌細胞を溶解すること;
c) 薄膜から(NMWCO)カットされた分子量によって液体をろ過すること;
d) 交換柱に液体を載せること;
e) rhUGから精製されたrhUGを提供するためにホストを派生したタンパク質を分けること;
そしてf)精製されたrhUGを回復すること。
[0134] 別の具体化では、ステップcのフィルタリングは、接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含みます。
まだ別の具体化では、陰イオン交換カラムはマクロのQ陰イオン交換カラムです。
まだ別の具体化では、ホストを派生したタンパク質は、キレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムで分離されます。
別の具体化では、回復されたrhUGは、総計が本質的にありません。
[0135] 現在の発明は、さらに次のもののステップを含む製薬の等級rhUG製剤原料を生産する方法を提供します:
a)rhUGを表現することができる細菌発現システムを提供すること;
b) 発酵培養を形成するために細菌発現システムを含む接種原を備えた発酵槽への接種;
c)発酵培養に細菌発現システムによるrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
d) ステップcで表現されたrhUGの収穫;
そしてe)ステップdの中で収穫されたrhUGを精製すること。そこでは精製するステップは、少なくとも1枚のフィルタおよび少なくとも1 exhangeカラムの使用を含みます。
[0136] その発明は、さらに次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を含んでいます:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)、前述のサンプルへのラベルが付けられた基板の導入、また(c)サンプルからの分離する製品、また(d)分裂の決定するレベル。
1つの具体化では、分析は標準ラベルが.sup.14Cに付けられた分析と共に使用されます。
1-stearoyl-2-[1-.sup.14C]arachidonyl発明の別の実施例では、ラベルが付けられた基板はフォスファチジルコリンです。
一層の具体化では、組換え型ヒトホスホリパーゼA.sub.2は終末濃度に加えられます、2 nMからステップ(a)で200 nMまで
発明の別の実施例では、ステップ(a)のサンプルは15分から30分まで前培養されます、で、30.程度から。
40.程度へのC.。
C。
まだ発明の別の実施例では、ステップ(b)に加えられた、ラベルが付けられた基板は、終末濃度に加えられます、0.5.mu.g/mlから50.mu.g/mlまで
[0137] 発明の実施例では、ステップ(b)の中の反応は後に解決を止める有機相の追加によって5分から30分まで止められます。
解決を止める有機相の1つの例はドールの試薬および純水(84:16)を備えた7.7の稀釈液です。
発明の実施例では、ステップ(c)の中のサンプルは攪拌と遠心分離により分離されます。また、ステップ(c)の製品はアラキドン酸です。それはステップ(c)で液体の液体の分離によってサンプルから分けられます。
[0138] 発明の実施例では、サンプルは、ステップ(d)で分裂のレベルを決定するために数えるひらめきのために分離されます。また、最上層が削除されます。
分離は渦と遠心分離によって遂行されるかもしれません。
[0139] 現在の発明は、さらに次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2酵素の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することを生体外で測定する方法を提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0140] 現在の発明は、次のものを含んで、組換え型ヒトuteroglobinによって分泌のphopsholipase A.sub.2活動の抑制のために分析する分析方法をさらに提供します:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
[0141] 現在の発明は、次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法を提供します:
(a) ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいるサンプルと連絡をとって、(b)flourescentlyに導入することは、flourescenceによって前述のサンプルへの基板、(c)サンプルからの分離する裂かれていない基板および(d)決定する量の裂かれた基板にラベルを付けました。
[0142] 発明の実施例では、ステップ(a)の中の組換え型ヒトuteroglobinのサンプルは、34.mu.m.に対して34 nMの終末濃度をしています。
発明の別の実施例では、ステップ(a)のサンプルは30-40.程度で15-30分間前培養されます。
C。
[0143] 発明の一層の実施例では、flourescentlyにラベルが付けられた基板は2-デカノイル-1-(O-(11-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a--です(ジアザ-s-indacene-3propionyl)アミノ)ウンデシル)-sn-glycero-3-phosphotidylcholin-)(e。)。
まだ発明の別の実施例では、ステップ(b)に加えられた基板は、0.5-50.mu.g/mlの終末濃度に加えられます。
[0144] 発明の実施例では、ステップ(b)の中の反応は、解決を止める有機相の1〜5つの稀釈液の追加によって5-30分の後に止められます。
2-プロパノール:nヘキサン発明の別の実施例では、解決を止める有機相があります(8:3)。
発明の別の実施例では、止められた分析の100.mu.Lへの1.mu.Lが、ステップ(c)で珪酸正常相HPLCカラムに直接載せられます。
発明の一層の実施例では、ステップ(d)のflourescenceは、505nmから550nmで460nmから505nmの興奮およびemmisionを持っています。
[0145] 現在の発明は、次のものを含んで、フィブロネクチンへの組換え型ヒトuteroglobinの結合を生体外で測定する方法を提供します:
(a) 組換えの人間CC10-HRP共役を備えた人間のフィブロネクチンの組換えの破片と接触しフィブロネクチン破片への組換え型ヒトuteroglobinの結合を決定するために(b)分析を視覚化すること。
[0146] 現在の発明は、さらに含む組換え型ヒトuteroglobinの清浄、(a)クレームのプロセス内の各ステップの中間物のとるサンプルおよび(b)プロセス中間物を分析することを決定する方法を提供します。
[0147] 発明の実施例では、プロセス中間物はステップ(b)でSDS-PAGEによって分析されます。
発明の別の実施例では、プロセス中間物はステップ(b)でrhUG ELISAによって分析されます。
発明の一層の実施例では、プロセス中間物はステップ(b)でLALによって分析されます。
まだ発明の別の実施例では、中間物はステップ(b)で蛋白質含有量のために分析されます。
[0148] 現在の発明は、現在の発明の精製された組換え型ヒトuteroglobinを含む製薬の構成を提供します。
現在の発明は、さらに精製された組換え型ヒトuteroglobin、薬学的に受理可能なキャリアーあるいは希釈剤を含む製薬の構成を提供します。
[0149] 発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは、組換え型ヒトuteroglobinの5%未満の総計を含んでいます。
発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinには95%以下の清浄があります。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinの中の菌体内毒素のレベルは5未満のEU/mg rhUGを含みます。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは塩化ナトリウム解決中です。
[0150] 発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも4か月の間のC.。
発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも6か月の間のC.。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも9か月の間のC.。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも12か月の間のC.。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも15か月の間のC.。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは4.程度で解決において安定しています。
少なくとも18か月の間のC.。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも1か月のC.および60%の部屋湿度。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも2か月の間のC.および60%の部屋湿度。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも4か月の間のC.および60%の部屋湿度。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは25.程度で解決において安定しています。
少なくとも7か月の間のC.および60%の部屋湿度。
[0151] 発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは哺乳動物に処理するのに安全です。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinは人間に処理するのに安全です。
まだ発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは気管内のチューブによって処理するのに安全です。
発明の実施例では、組換えの人間uteroglobinは未熟児に処理するのに安全です。
発明の別の実施例では、組換えの人間uteroglobinは人工界面活性剤を受け取る患者に処理するのに安全です。
発明の一層の実施例では、組換えの人間uteroglobinは呼吸困難中の患者に処理するのに安全です。
[0152] 組換えの人間UGは下記に述べられた手続きによって生産されました。
rhUGは、適用サービスに述べられていた発明によれば、それが使用されてもよいように97%を超過する清浄のレベルをとりわけ持っていました。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
また炎症を禁じて、かつ繊維症および無秩序な細胞増殖を生体外で生体内で軽減するか、防ぐために免疫反応を調整するPCT/US01/12126。
ある具体化では、清浄のレベルは99%以上でした。
[0153] rhUGを表現するエピソームおよびバクテリアのrhUGを生産する負荷の準備
[0154] 2つのタイプの新しい細菌発現システムは組換え型ヒトUGの生産のために開発されました。
1つは、細菌タンパク質合成のために最適化されたコドンを使用して、人間のUGのための新しい合成遺伝子の構築を含んでいました。
他方は、抗生物質選択がない状態での安定したプラスミド継承を与えるバクテリアの遺伝要素の使用に備えます。
両方のアプローチは効率的なUG過剰発現に有能なバクテリアの宿主・ベクター系を産出しました。
[0155] rhUGのための合成バクテリア遺伝子の構築
[0156] 細菌の発現を向上させるために、ヒトＵＧの合成した細菌遺伝子配列が設計され、合成オリゴヌクレオチドから集合した。成熟した天然ＵＧがそのＮ−末端にグルタミン酸残基を有するので、細菌ｍＲＮＡからペプチド合成（翻訳）の開始を可能にする開始メチオニンをＮ−末端に付加する必要がある。最も頻繁に使用される細菌コドン（Anderssen and Kurland, 1990）を蛋白質コード配列に組み込むことにより、細菌の発現のためにコドン使用頻度（codon usage）を最適化した。同様に、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及び他の非霊長類哺乳動物において、最適化発現のためにコドン使用頻度を調整することにより、組換えヒトＵＧの発現のための合成遺伝子を組み立てることができる。コドン使用頻度の最適化は、より高い翻訳効率及び蛋白質の発現レベルをもたらす。また、細菌に好ましいコドンの使用は、まれなチャージされたｔＲＮＡの消費により生じる代謝負担に対するストレス応答を減少することができる。特定の理論に拘束されずに、細菌のチャージされたｔＲＮＡの不均衡による当該ストレス応答が、翻訳パターンを変え、細胞内の蛋白質分解を増大し、細胞の代謝を変えると考えられる。全てのこれらの因子は、蛋白質産物を発現する発酵培養における再現性問題を提起し得る。生産培養における変異は、新しい細菌蛋白質がプロセスの異なる工程で出現する下流精製において大きな問題を引き起こし得る。
EXAMPLE I
合成バクテリア遺伝子の会議
[0157] rhUGのための合成バクテリア遺伝子は表1に示されるようなオリゴヌクレオチドから組み立てられました。
(合成オリゴヌクレオチドはBioserveバイオテクノロジーズインクから得られました。)オリゴヌクレオチド1-4(SEQ。ID NOS。1-4)はそれぞれ、暗号鎖を表わします。また、5-8(SEQ。ID NOS。5-8)はそれぞれ、相補鎖を表わします。
両方のセットは、5'〜3'までそれぞれ整っていて、図1に示されるような標準方法を使用して、アニール化されることおよび結紮により組み立てられました。
結紮混合は表2に下に示されるような適切な旋律に転換されました。また、プラスミドベクターを運ぶ植民地は、適切な抗生物質で選択されました。
形質転換体は、挿入物サイズを決定するために細菌集落上で直接行われた迅速なPCR分析で最初に遮られました。
その後、.about.234 bp rhUG挿入物を運ぶ植民地は、一層の検査のために二次培養されました。
rhUGの表現のために適切に引き起こされて、およそ10 kDaの誘導タンパク質バンドの表現が全体の細胞の求められた(図2を参照)サンプルである場合、第2のスクリーンはPCR陽性のクローンからの10mlの細菌培養上で終わりました、直接2.times.SDS-PAGEゲル・ローディングバッファーの中で溶解されました。
サンプルは、ミニゲル装置(Novex)中の16%のトリスグリシンSDS-PAGEゲル上で実行されました。
検査手続きはピロン(1997)に参照によってここに組込まれたように詳細に述べられていた通りでした。
誘致可能なUGバンドを過剰表現したクローンからのプラスミドDNAは準備されました。また、rhUGコーディング領域のDNA塩基配列は再び確認されました。
バクテリアのプラスミドDNAおよび単一コロニーの両方は分離します、その後、クローンが-20.程度で保存用に下へ凍って陽性のことの筋から。
C.および-80.程度。
C。
［表１］Syntheの構築の中で使用されるオリゴヌクレオチド -バクテリア遺伝子
[0158] 5つ'および3'まで同族のオリゴヌクレオチド、合成遺伝子の終了、また、その後、NcoIとBamHIの制限部位を備えた側面に位置する結合物を含むことは、それぞれ、PCRによって合成バクテリア遺伝子を増幅し、かつpKK223-3(ファルマシアから得られた)へそれのクローンを作るために使用されました。
pKK233-3の中の合成遺伝子のDNA塩基配列が確認されました。
このクローンからの貧弱なrhUG表現は、rhUG発現量を増加させるために開始者メチオニン(ピーターら、1989)に加えて、N-終点で余分なアミノ酸残基が必要だろうということを示唆しました。
したがって、長さを変えるNターミナル追加分を備えた1セットの合成のバクテリアのrhUG遺伝子はバクテリア中のrhUG表現用の最適な長さを評価するために構築されました。
これらの余分なアミノ酸は、細菌リボソームと細胞質中の発生期のペプチドを安定させるのを支援するかもしれません。
これらが小さな側鎖を持っており、課され、高度に恐水で、高度になく、したがって、生まれつきの名人を折り重ねることおよびUGモノマーおよび二量体の会議を恐らく分裂させないので、余分なアミノ酸はグリシンとセリンを交互にすることから成りました。
上に記述されるように、コドン使用頻度と結合物は使用されました。また、遺伝子はpKK223-3へクローンを作られました。
各遺伝子のDNA塩基配列が確認されました。
rhUGの正確なrhUGコード配列および誘致可能な表現に選ばれたクローンは、50mlの煮出し汁の中への固形培地上の植民地から接種を受けて、夜通し振られました。
このスタータ・カルチャーは振盪フラスコ中の250mlの豊富なメディアを含んでいる抗生物質に接種するために使用されます。
600nmで0.5の光学濃度に達するまで、これらの文化は適切な状態の下で成長しました。
その後、rhUGの表現は各クローンのために引き起こされました(表2を参照)。
文化はさらに2-4時間振られました。
細胞は遠心分離によって収穫され、再保留され、SDS-PAGEによってrhUG表現のために分析されました。
各遺伝子からのrhUG発現量は比較されました。また、最多のタンパク質を生産した遺伝子は一層のホスト/ベクター系最適化に選ばれました。
最多のタンパク質を生産する遺伝子は、人間のuteroglobinシーケンスに加えて3つの余分なアミノ酸残基を含んでいるN-終点を持っており、MGS遺伝子と呼ばれます。
[0159] pKK223-3の使用に関連した著しい損失があります。
最初に、pKK223-3は生産に適していません、1つの、それが親から娘細菌細胞まで安定したプラスミド継承のためのアンピシリン選択を必要とするので、アメリカにおいて生物薬剤。
米国の人口のおよそ20%はペニシリンとその派生語に対してアレルギーです。そのうちの1つはアンピシリンです。
この理由で、FDAは、組換えの生物薬剤のタンパク質を生成するために使用されるプロセスでのアンピシリンの使用を妨げました。
アンピシリンがない状態で、親細胞が分割し、プラスミドを含んでいる娘細胞が選択されていないとともに、プラスミドは文化の中で細胞から失われる場合があります。
プラスミドDNA複製は細菌細胞に重要な代謝負担を表わします。
抗生物質がない状態で、プラスミドを欠く娘細胞は、まだプラスミドを含んでおり、急速に文化を引き継ぐ娘細胞上に競争上の優位を持つでしょう。
[0160] 次に、合成遺伝子の転写は、ラクトース・プロモータ要素に拘束し、下流タンパク質の引き起こされていない表現を防ぐラック・リプレッサー・タンパク質によって抑制されます。
したがって、pKK223-3の高いコピー番号は、細胞にはラック・リプレッサー・タンパク質があるより多くの推進者要素に帰着し、その結果「漏る」タンパク質表現を引き起こすかもしれません。
ラクトース・プロモータの遺伝子下流の転写は、ラック・リプレッサー・タンパク質に結合し、その結果ラクトース・プロモータDNAをそれに手放させる化学薬品(イソプロピル・チオ-ガラクトシド、「IPTG」)を加えることにより実際につけられます。
その後、バクテリアのRNAポリメラーゼは推進者に拘束し、転写を始めます。
推進者のde-抑制はこのようにmRNA転写およびタンパク質表現を引き起こします。
漏るタンパク質表現が生じます、いつ、下流タンパク質、この場合、rhUGは引き起こされていない文化の中で合成されます。
pKK223-3からの漏るrhUG表現が観察されました。
例II
プラスミドベクターの試験は、e-大腸菌の菌株を中へ構築します
[0161] その後、レプリコン、推進者、筆写の抑圧者および抗生物質選択のMGS合成遺伝子および異なるコンビネーションを含んでいるいくつかの異なるプラスミドベクター構成物は、大腸菌のいくつかの異なる菌株の中でテストされました。
これらのホスト/ベクター・システムのいくつかのものは表2に示されます。
MAAを備えた合成遺伝子のバージョン-N-終点で、さらに作られ、これらの宿主・ベクター系のうちのいくつかの中でテストした。
pRK248cItsの中への合成遺伝子のサブクローニングは、pKK223-3クローンからのrhUG合成遺伝子を含んでいるBamHI破片を使用して行われました。
pGEL101とpGELACの中へのサブクローニングはpKK223-3に遺伝子を含んでいるNcoI-BamHI破片を使用して行われました。
［表２］大腸菌負荷rhUGの中の最適なrhUGエクスプレッションのために生成された2TABLE 2コンビネーション-ID N-終点ベクター5'RE-3'RE Selection.sup.1誘導プロモーター宿主株、ソースCG1 M -pKK223-3 Nco1-BamH1 Ampicillin.sup.2 IPTG.sup.5ラックDH5.alpha.F'I.sup.qライフ・テクノロジーズインク、CG3 FLAG(-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG5 MGSGS -、-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG8 MGSGSGS -、-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG60 MGS -、-pGEL101 Nco1-BamH1 -)-pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTGラックDH5.alpha.F'I.sup.qライフ・テクノロジーCG4 MGS -
アンピシリンIPTG T7 RNA政治家BL21/DE3 Novagenインク
CG73 MGS - pRK248cIts-A.sup.7 BamH1-BamH1 Tetracycline.sup.3 Heat.sup.6.lambda.PL DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG74 MGS、pRK248cIts-A BamH1-BamH1テトラサイクリンIPTG T5/lacO hyb DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG77、MAA -pKK223-3 Nco1-BamH1アンピシリンIPTG T5/lacO hyb DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG78、MGS -pRK248cIts-B BamH1-BamH1テトラサイクリン熱.lambda.PL DH5.alpha.F'Iqライフ・テクノロジーCG82 MAA -pGELAC Nco1-BamH1 Ampicillin.sup.4 IPTG T5/lacO hyb DH5.alpha.F'Iqライフ、テクノロジーCG86 MGS(-pGELAC Nco1-BamH1アンピシリンIPTG T5/lacO -)-pRK248cIts-B BamH1-BamH1テトラサイクリンIPTG T5/lacO hyb W3110F'Iq ATCC CG98 MAA -
hyb DH1 ATCC表2 - .sup.1Antibioticな選択が必要なフットノートは、プラスミドを含んでいるバクテリアの形質転換体を選択しますが、プラスミド・メンテナンス(例えばプラスミドの安定した継承)に必要ではありませんかもしれません。
.sup.2Ampicillin選択は、固体または液体培地の1ミリリッター当たり100マイクログラムで終っています。
pRK248cItsのための.sup.3Tetracycline選択は、固体または液体培地の1ミリリッター当たり20マイクログラムです。
テトラサイクリン選択は引き起こさない状態の下のpRK248cItsの安定した継承に必要ではありませんが、rhUG合成が引き起こされる場合、必要です。
.sup.4Ampicillin選択はpGELACの安定した継承に必要ではありません。
rhUG表現を引き起こすために使用されるIPTGの.sup.5The集中は0.5 mMでした。
.lambda.P.sub.Lからの.sup.6Transcriptionは、32.程度からの文化の温度中の急変によって引き起こされます。
42.程度へのC.。
C。
温度変化は、pRK248cItsベクター(それは.lambda.P.sub.L推進者を拘束することをできなくする)から絞られて、ラムダ・リプレッサー・タンパク質中の構造変化を引き起こします。
バクテリアのRNAポリメラーゼはそのとき推進者を認識し、転写を始めることができます。
.sup.7The「A」は、rhUG遺伝子が1つのオリエンテーション中で、その一方で「B」が、それが同じBamH1サイトで、反対のオリエンテーション中であることを示していることを示します。
[0162] pRK248cItsを使用するという重要な1つの利点は、それがRP4に由来した非常に安定した複製起点を備えたoligo-コピー数プラスミドであるということです。
ほとんどの高いコピー数ベクトルは、引き起こされていない状態の「漏る」タンパク質表現を許可し、より低いコピー数プラスミドほど本質的に安定していません。
pRK248cItsは娘細胞のプラスミドのメンテナンスおよび安定した継承のための選択を要求しませんが、それはアンピシリンとテトラサイクリン用抗生物質抵抗性遺伝子を運びます。
これらの抗生物質は、クローニングの間にバクテリアの形質転換体の便利な選択に使用することができます。
しかしながら、プラスミド上でコード化された組換え型タンパク質の高いレベル表現が引き起こされる場合、プラスミド安定はしばしば害されます。
抗生物質が組換え型タンパク質の表現の間にプラスミドを維持するために必要な場合、生物薬剤の生産の中でテトラサイクリンを使用することができるかもしれません。それはFDAによって許されます。
[0163] 合成遺伝子もpGEL101(Mantile、1993年)およびpGELAC(Mantile、2000年)に挿入されました。
合成遺伝子対これらのプラスミド中の人間のシーDNAシーケンスからの表現からのrhUGの表現は比較されました。また、合成バクテリア遺伝子は優れた結果を産出しました。
[0164] プラスミド継承を安定させるパーのシーケンス(広宿主範囲R要因RP4に由来した2.8kbのシーケンス)の使用は、ケモスタットの下で記述されました、基準として抗生物質がない状態の中で成長の長期間の後にアンピシリン選択を安定(Mantile、2000年)に使用して状態付けます。
しかしながら、発明のプロセスは、ケモスタット状態の使用を含んでいません。
代わりに、生産菌株(ホスト/ベクター系)は、凍結融解サイクルが後続するアンピシリンがない状態に成長を含んで、一連のシード銀行業務プロセスを経験するように要求されます。
その後、最大のタンパク質レベルが達成されるように、安定した継承が維持されるに違いないタンパク質表現の誘導の前に大型細胞バイオマスに達するために、ホスト/ベクター系は、一連の発酵によってアンピシリン選択がない状態で安定しているままでなければなりません。
[0165] 生産菌株CG12は、大腸菌負荷BL21/DE3の点でpGELACに似ているプラスミドを含んでいるホスト/ベクター系です。
この負荷は、アンピシリン選択がない状態での遺伝子安定性(DNA塩基配列のレベルの)およびプラスミド安定の両方に関してテストされました。
次の例は、生産菌株CG12の中のホスト/ベクター系がシード銀行業務から大規模な引き起こされた発酵培養の最終収穫まで生産工程の全体にわたるすべての点で安定していることを実証します。
個別宿主・ベクター系の構築
[0166] UGタンパク質コード配列の源は人間の肺mRNAから生成されたシーDNAでした。
組換え型ヒトUGのためのcGMP表現システムは、Mantileら(Mantile、2000年; Mantile、1993年、Miele、1990年)に述べられていたそれに似ています。
タンパク質は、T7プロモーターおよびT7 DNA依存のRNAポリメラーゼを使用して、pCG12と呼ばれるプラスミドから絞られます。それは、BL21/DE3宿主株のゲノム中のIPTG誘致可能なラクトース・プロモータにコントロールされます。
発現ベクター、pCG12、在来の人間のタンパク質(2つのアラニンが後続する開始者メチオニン)に関するそのN-終点での3つの追加のアミノ酸を備えたタンパク質のためのコード。
これらがバクテリア中の効率的な翻訳に必要な間、メチオニンはN-終点で2つの追加のアラニンを備えたUGタンパク質を含む製品に帰着して、発酵工程の間に裂けられます。
[0167] pCG12発現ベクターはいくつかの理由で製造するcGMPに適しています。
最初に、それは、発酵中に抗生物質選択用の要求を欠きます。
アンピシリンを使用して、pCG12を選択することができますが、抗生物質は細菌細胞成長および宣伝中に安定したプラスミド継承を維持するようには要求されません。
抗生物質なしの安定したプラスミド継承はパーと呼ばれるプラスミド安定化シーケンスの使用を通じて達成されました。
パーのシーケンスは、広宿主範囲R因子、RP4(Gerlitz、1990年)に由来する2.8キロベースのシーケンスです。
パーはプラスミド分割を修正し、プラスミド安定を著しく増強します。
このシーケンスは、抗生物質選択(Mantile、2000年ら)がない状態での250以上世代の間、ケモスタット状態の下の長期間安定性を与えます。
次に、pCG12は、薬生産工程によって遺伝学的に安定しています。
そのDNA塩基配列は、DNAを壊すことができる凍結融解ステップを含んでいる細胞銀行業務にもかかわらず変わりません。
第3に、二次培養して、細胞銀行業務プロセスを通じて、パーのシーケンスがアンピシリン選択がない状態でのプラスミド安定を与えることは示されました、そして回分発酵で。
[0168] 図3は、pCG12の中で遺伝要素の配置を示します。
この発現ベクターはpGELAC(Mantile(2000年): ジーン・バンク登録番号HSU01102)に似ています。
rhUGの表現のためのバクテリアの宿主株はBL21/DE3(ATCC#47092)です。
2.8キロベースのパーのシーケンスは広宿主範囲R因子(RP4)に由来します、それはプラスミド安定を増強する分割する機能を与える、また、細胞銀行業務から大規模発酵まで生産工程の全体にわたってそれがプラスミド安定を与えることが示されました。
例III
研究シード・セル・バンクの準備
[0169] 研究種培養は、50マイクログラム/mlのアンピシリンを含んでいるLB天草上で育てられたpCG12を含んでいるBL21/DE3の単一コロニーから接種を受けました。
研究種子銀行は、32.程度で育てられた50mlの研究種培養から生成されました。
抗生物質選択を含んでいないLBメディア中のC.。
文化は初期の静止期に育てられました。また、グリセリンは20%の終末濃度に加えられました。
その後、文化は1mlの部分標本の中で凍結され、-75.程度で格納されました。
その後、この研究シードのC.アリクォートは発酵開発に使用されました、マスターとワーキングセルバンクを生成することと同様に。
[0170] DNA塩基配列がrhUG製剤原料を生産するのに必要な操作によって変わらないように、pCG12ベクターは遺伝学的に安定しています。
pCG12プラスミド全体は、クローニングの後に、および研究種子銀行(SEQ。ID NO。9)の生成に先立って順番に並べられました。
pCG12は抗生物質がない状態で安定していますが、それはそのバクテリアのホストにアンピシリン抵抗を授けます。
発酵生産文化から回復されたpCG12プラスミドのDNA塩基配列は、研究シードからのプラスミド・シーケンスと同一です。
例IV
修士と生産のシード・セル・バンクの準備
[0171] マスターセルバンクは負荷CG12の研究シードから準備されました。
マスターとプロダクションの細胞銀行業務が処理する両方を概説するフローチャートは、図4に示されます。
マスターとプロダクションのシードの製造の中で使用される化学薬品と材料のリストは、表3に提供されます。
化学薬品および材料はすべてcGMPに従って、USP等級でした。
［表３］原料と化学薬品はマスターとプロダクションのシード・セル・バンクのプロダクションの中で使用しました。
資料/化学薬品メーカー等級グリセリンJ.T.ベーカーUSP/FCC、酵母エキスDifco N/A Tryptone Difco N/A塩化ナトリウムJ.、インジェクションWRAIR USPリサーチ・セル・バンクClaragen cGLP(マスター採種用の)マスターセルバンクのためのT.ベーカーUSP/FCC水、WRAIR cGMP(プロダクション採種用の)
[0172] CG12研究シードの部分標本は、ルリア煮出し汁(「LB」)を含んでおり、32.程度で維持された振盪フラスコに加えられました。
できれば600nmで、550nmから660nmまで光学濃度(OD)によって成長をモニターして震動することを備えたC.。
抗生物質は使用されませんでした。
煮出し汁のサンプルは、およそ1時間の間隔で振盪フラスコから続いて得られました。また、0.8〜1.5AUのOD.sub.600が到達するまで、各々の吸光度は測定され、記録されました。
その後、100ミリリッターの文化は20mlと結合しました、cryopreservative(グリセリン)また、サンプルは、文化の中にあるバクテリアの同一性および清浄を確認するために汚れるグラムで保持されました。
1ミリリッターの文化は、各々の90のラベルが付けられたcryovialsに無菌的に転送されました。それは各々30個のガラス瓶を含んでいる、3つのラベルが付けられた箱に入れられました。
2箱が-80.程度で維持された冷凍装置に転送されました。
C.および1箱は記憶装置用液体窒素に転送されました。
[0173] その後、生産セル・バンクはマスターセルバンクから準備されました。
生産セル・バンクを準備する過程は、研究シードの代わりの文化を始めるために、マスターセルバンクからのガラス瓶が使用された以外は、マスターセルバンクを準備するのに使用されるそれと同一でした。
各々1ミリリッターの文化を含んでいる90のcryovialsが準備され、各々30個のガラス瓶を含んでいる3つの箱に入れられました。
2箱が、-80.程度で維持された冷凍装置に転送されました。
C.および1箱は記憶装置用液体窒素に転送されました。
[0174] 文化およびセル・バンクはそれぞれ広範囲にテストされました。また、結果はcGMPガイドラインに準拠すると文書で証明されました。
時間の関数として600nmで吸光度を示すマスターおよび生産種子銀行文化の成長曲線は、図5に示されます。
両方の文化は数時間内に対数増殖に達して、中央の対数増殖の中で採取されました。
最初の実行可能性のためのサンプルはこの時期に得られました。
シード・ガラス瓶が冷凍だった1週間後、各銀行の実行可能性をテストするサンプルが得られました。
cGMPの資格を銀行に与える、他のテストおよび分析が下記に述べられます。
マスターとプロダクションのシード(それぞれロット0644および0645)のためのこれらの分析の結果は、表4および5にそれぞれ述べられます。
マスターとプロダクションの両方のシードは仕様書をすべてパスしました。
細胞の生存率の5〜10パーセントの負けは、細胞の結氷から期待されました。
[0175] 次の分析は、マスター・シード・セル・バンク、プロダクション・シード・セル・バンクおよび発酵の特性記述の中で使用されました。
[0176] 清浄。
LBプレートは無菌の技術を使用して、縞があり、37.程度で培養されました。
C.コロニーは24〜36時間の後に検査されました。
[0177] 実行可能性。
細胞の生存率は、アンピシリンで、あるいはアンピシリンなしでLB寒天プレート上の細胞培養の連続希釈法にめっきすることにより決定されました。
その後、植民地は数えられました。また、結果は記録しました。
[0178] グラムを汚すこと。
テストされる少量の文化はスライドに転送されました。また、スライドは固定した熱である前に乾燥した空気に許可されました。
その後、固定細胞はグラム・ヨウ素が後続するクリスタルバイオレットで汚されました。
その後、細胞は1000.時に油浸レンズの下で検査されました..
コントロール有機体は黄色ブドウ球菌と大腸菌です。
[0179] コロニー形態。
記述されるようにSOPに述べられており、かえされたように、LBプレートは縞がありました。
植民地は24〜36時間の後に検査されました。
[0180] コロニー・アピアランス。
LBプレートは無菌の技術を使用し、37.程度でかえされて縞がありました。
C.コロニーは24〜36時間の後に検査されました。
[0181] 光学濃度。
文化の細胞密度は、LKB分光測光器を使用して、600nmで550nmから660nmまで吸光度によって優先的に決定されました。
[0182] SDSページ。
発酵用のSDS-PAGEのためのサンプル、と同様に、のために、精製のためのプロセス・サンプルの中で、10-20%のTricineゲル(Novex)上で実行されました。
サンプルは2.times.Tricine SDS-PAGEローディングバッファー(Novex)で1:1(v:v)を調合され、染料正面がゲルの底からおよそ1cmであるまで、走ります。
高いマーカーか低分子量範囲サイズ・マーカー(アマシャム)は標準として使用されました。
ゲルは少なくとも85.程度に熱くなることにより固定しました。
ピアス・ケミカル社からのゲル・コード青変病で汚れることが後続する10%の酢酸/30%メタノールが存在する状態での5分のC.
汚れを除くことはピアスによって記述されるような純水の中で行なわれました。
その後、ゲルは撮影され乾かされました。
［表４］マスター・シード・ロット用総括表を少しもなく分析してください。
0644は結果清浄最終文化をアッセイします、マスターセルバンク-LB 230枚の.times.10.sup.6 CFU/mlプレートの汚染の最初の実行可能性はない、マスターセルバンク-LB 420の.times.10.sup.6 CFU/mlプレート+アンピシリン・グラム染色の最初の実行可能性、85枚の.times.10.sup.6 CFU/mlマスターセルバンク-LBプレートの実行可能性を1週製造する汚染1週のポストのないグラム(-)棒、67の.times.10.sup.6 CFU/mlマスターセルバンク-LB+アンピシリン・プレートの実行可能性を製造するポスト、コロニー形態-LB+プレート乳白色単一滑らかな植民地コロニーMorphology-LB
単一のプレートの滑らかな植民地コロニー・アピアランス-LBがかぶせる+アンピシリン乳白色、乳白色コロニー・アピアランス-LB+アンピシリン乳白色はCFU=コロニー形成単位にかぶせます。
[0183]
［表５］プロダクション・シード・ロット用総括表を少しもなく分析してください。
0645は結果清浄最終文化をアッセイします、プロダクション・セル・バンクの汚染の最初の実行可能性はない、プロダクション・セル・バンクの270枚の.times.10.sup.6 CFU/ml LBプレートの最初の実行可能性-290の.times.10.sup.6 CFU/ml LBプレート+アンピシリン、77枚の.times.10.sup.6 CFU/mlプロダクション・セル・バンク-LBプレートの実行可能性を1週製造する汚染1週ポストのないグラム染色グラム(-)棒、50の.times.10.sup.6 CFU/mlプロダクション・セル・バンク-LB+アンピシリンの実行可能性を製造するポスト、プレート・コロニー形態-LBプレート乳白色単一滑らかな植民地コロニー
単一のプレートの滑らかな植民地コロニー・アピアランス-LBがかぶせる形態論-LB+アンピシリン乳白色、乳白色コロニー・アピアランス-LB+アンピシリン乳白色はCFU=コロニー形成単位にかぶせます。
[0184] プロダクション種子セル・バンクはrhUGの生産のために発酵に接種するために使用されます。また、マスター種子セル・バンクはそれらが使い果たされるとともに、新作種子セル・バンクを作成するために使用されます。
これらの2つの銀行は、どれが製薬の等級rhUGを精製するかから、原料(例えば細菌細胞ペースト)の長期的な資格のある源に備えます。
例V
発酵
[0185] 化学薬品のリスト、および発酵の中で使用される設備は、表6および7にそれぞれ提供されます。
［表６］大腸菌発酵の中でrhUGの化学のメーカー等級のプロダクションに使用された化学薬品は、Difco N/AグリセリンJ.T.ベーカーUSP/FCCとAPSスーパー煮出し汁を選択します、イソプロピル-.beta.-D-thiogalactopyranosideシグマN/A塩化ナトリウムJ.T.ベーカーUSP/FCC、マーツーDF 204大杯の化学のN/A
[0186]
［表７］Equipment used in E. coli Fermentation for the Production of rhUG Equipment Manufacturer Model 400 L Fermenter System New Brunswick Scientific IF-400 Biological Safety Cabinet Baker B60-ATS Continuous Feed Centrifuge Sharples AS-Z6SP Shaker-Incubator New Brunswick Scientific Innova 4330 pH meter Orion 420 Spectrophotometer LKB N/A Peristaltic pump Cole-Parmer 07523-40 Overhead Mixer Lightnin MSV-1500
[0187] 発酵工程を概説するフローチャートは、図6に示されます。
発酵工程を始めるために、プロダクション種子セル・バンクのガラス瓶は室温で溶かされました。
その後、100マイクロリットルの生産種子は6つの各々に接種するために使用されました、1リットルを含んでいるfernbachフラスコ、各々の無菌のスーパー肉汁培地(ベクトン・ディキンソン、APSスーパー煮出し汁、グリセリンおよびWFIを選択する)。
その後、6個のフラスコ中の文化は32.程度でかえされました。
およそ20時間の動揺(300rpm)を備えたニューブランズウィック・シェーカーふ卵器の中のC.。
その後、6個のフラスコ中の文化は400リットルのニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック・ファーメンター・システム(モデルIF-400)での300リットルのSuperbrothに接種するために使用されました。
[0188] 接種に先立った発酵槽の準備は以下のとおりでした:
発酵槽は標準処理手順によって清潔になり殺菌され、次に、100kgのWFIの責任を負いました。
最高の肉汁培地(ベクトン・ディキンソン選択したAPSスーパー煮出し汁、グリセリンおよびWFI)は、発酵槽に加えられました。また、補足WFIは決勝(300kgのネットウェイト)に進出するために付け加えられました。
発酵槽はそのとき122.程度でテストされ殺菌された圧力でした。
標準処理手順による30分のC.。
泡止め(マーツーDF 204)は求められるような発酵に加えられました。
発酵用のセットポイント・パラメーターは表8の中で定義されています。
［表８］(.+。)発酵セットポイント・パラメーター・パラメーターは直接弾道距離の実際のセットポイント動揺150をセットしました。
(.+。)10rpmの150温度32。
2Cの31.9気流300.+。
2l/minの299.8l/minの圧力3.+。
1標準平方インチ当たり1ポンド1標準平方インチ当たり2.4ポンド溶存酸素NA.gtoreq.20%
[0189] その後、振盪フラスコ接種原は発酵槽に加えられます。また、文化は25.程度で成長します。
40.程度へのC.。
C.は600nmの2.0の最小の光学濃度までに到達しました。
2.0の最小のOD.sub.600に達するとすぐに、rhUGの表現は、10 mMへの0.1 mMの終末濃度への発酵培養にイソプロピル-.beta.-D-thiogalactopyranoside(IPTG)の追加によって引き起こされます。
発酵は少なくとも1時間、できれば2時間のポスト誘導維持されました。
細菌培養はSharpleの連続的な材料遠心分離機を備えた遠心分離によって収穫されます。
セル・ペーストは-80.程度で冷凍で、分割され格納されます。
後の精製用のC.。
[0190] 示された例において、発酵槽の接種に使用された6つの振盪フラスコ文化は、14と半時間の後の2.8の平均のOD.sub.600および1ミリリッター当たりの穏やかな210.times.10.sup.6コロニー形成単位に達しました。
発酵へ3〜4時間の間の増加したセル新陳代謝およびバイオマスに応じて減少した発酵溶存酸素レベルの間。
動揺範囲は20%の最低水準で溶存酸素を維持するのに十分でした。
発酵培養中のrhUGの表現は、4.2時間(2.7のOD.sub.600および40.times.10.sup.6 CFU/mlの細胞数を備えた)の後に引き起こされました。
少し時間ポスト誘導上に対数期割合で継続された成長、セルはおよそ6時間の発酵(図7)の後に収穫されました。
サンプルは発酵の後に文化から得られ、その後SDS-PAGE(図8)によって分析されました。
他のすべての発酵データは表9に記録されます。
発酵は仕様書をすべて通りました。
［表9］rhUGロット0708番のプロダクションのための結果および大腸菌発酵をアッセイします、結果不毛をアッセイする、LB 160.times.10.sup.6 CFU/mlの上のレファレンス最終実行可能性に匹敵する成長グラム染色グラム(-)棒SDS-PAGEをチェックしない、LBの上の最終実行可能性-最終サンプルの110の.times.10.sup.6 CFU/mlアンピシリン清浄、汚染最終コロニー形態はない、クリーミー、均質、Noncontaminatedした、単一コロニーCFU=コロニー形成単位
例VI
rhUGの精製
[0191] rhUGの精製の中で使用された化学薬品、物資および設備は、表10および11に示されます。
［表１０］rhUG精製工程化学薬品/供給メーカー等級エタノール中の10TABLE 10化学薬品および貯蔵品消費高、USP-200スペクトルUSPトリス、基礎(ヒドロキシメチル)-aminome-土地保有自由民スペクトルUSP/NFリン酸ナトリウム、一塩基、J.T.ベイカーUSP/NFF一水化物塩化ナトリウムJ.T.、ベイカーUSP/NFF水酸化ナトリウム(小球)スペクトルNF/FCC塩酸(集中された)J.T.、ベイカーUSP/NFF Edetate、ジナトリウム、二水和物スペクトルUSP/NF硫酸銅、
ペンタハイドレードJ.T.ベーカーUSPのマクロのQ 50 BioRad N/Aタイプ、私、ハイドロキシアパタイト(20.ミュー)。
Sepharose速いフロー・ファルマシアN/Aと結合してキレート環を作るBiorad N/A、100 Kの限外濾過カートリッジ、ミリポアN/A 5 K限外濾過カートリッジ、ミリポア、N/A Sartobind QカートリッジSartoriousなN/Aサイズ15、24および73シリコーン管材料Sanitech N/Aサイズ、73、Pharmed管材料コール=パーマーN/Aサイズ、191、Bioprene管材料ワトソン・マーローN/A Millipak、20、60の、100および200無菌のミリポアN/A 20.ミュー。
フィルタ大腸菌セル・ペーストWRAIR cGMP SP Sepharose速いフロー・アマシャムN/Aフェニル基を含むSepharose、速く、アマシャムN/Aフロー/最高値代用
[0192]
［表１１］機器を備えます、そしてrhUG精製工程アイテム・サプライヤー型番Pelliconの中で使用される設備、2本のカセット、ミリポアPellicon 2ステンレス鋼ホルダー研究所をフィルターする、SIミキサーLightnin N/Aスペクトロフォトメーター島津製作所のUVをマスターする、160のバンテージ、カラム、アミコン18.0.times.50cmのバンテージAカラム、アミコン13.0.times.50cmのバランス縫工筋、14800pの可変速度蠕動ポンプおよびI/PミリポアXX80EL000 Masterflex l/sポンプ、コール=パーマーG-07523-20蠕動ポンプ・ワトソン・マーロー701 S/R、スーパー・スピード遠心分離機Sorvall RC-5B/RC-5C高速ローターPTI
14C流動化装置Microfluidics M-110F、142mmのステンレス鋼ホルダー縫工筋16276-3 UVモニター・ファルマシア、Uvicord SIIチャート式記録計ファルマシアRec、Iつの導電率計オリオン162 pHメーター・システム・オリオン、620
[0193] 共通の生物活動および物理的・化学の仕様書をしているrhUGのバッチは、同じプロセスの小さな変化によって精製されました、それらのうちの2は、薬剤生産用のcGMPガイドラインに従いました。
プロセスのうちの2つ、cGMP精製工程のうちの1つ、および動物実験用のrhUGの生産に使用された1つのプロセス、図11に概説されます。
これらのプロセス、および両方のcGMPプロセスおよびrhUGの生産の中で動物実験に使用されたいくつかの変化の記述は、以下のとおりです。
図11bの中で概説されたcGMPプロセスについては、1キログラムの細菌細胞ペーストは大ばさみ、および遠心分離によって削除された細胞残屑によって溶解されました。
その後、溶解物(上澄み)は、接線のフローろ過(TFF)システムでの薄膜から(NMWCO)カットされた100 Kの名目上の分子量を使用して処理されました。
100 Kステップからのpermeateは、5つKのNMWCO薄膜を使用し、マクロのQ陰イオン交換カラムに載せられて、TFFによって集中されました。
陰イオン交換カラムからの溶離液はタイプに載せられる前に5つKのNMWCO薄膜を使用して、TFFによって集中されdiafilteredされました、私、ハイドロキシアパタイト(HA)カラム。
その後、HAカラムからの溶離液は、カラムに直接載せられました、キレート化合物として銅を備えたキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂でパックしました。
rhUG、カラムを通して渡された、一方、カラムへのHA溶離液境界の中にあるホストを派生したタンパク質。
菌体内毒素の最高額が最終バルク材から取り除かれたことを保証するために、確かに強烈なSartobind Q TFF薄膜も、銅のCSFFカラムの後にflowstreamに入れられました。
Sartobind Qからの通り道は集中され、次に、置換バッファーとして食塩水を備えた5つKのNMWCO薄膜を注入(SFI)に使用して、広範囲にdiafilteredされました、適切に最終バルク材を公式化すると同様に残余の銅を削除する両方。
[0194] このプロセスおよびその小さな変化は両方とも個別のcGMPに使用されました、臨床のロット、ロットと同様に、動物試験に使用しました。
これらの変化は次のものを含んでいます:
1)他のタンパク質からのrhUGの分離用の100 KのNMWCO薄膜の代わりの30 KのNMWCO薄膜あるいは50 KのNMWCO薄膜のいずれかの使用、の中で、明確にされた、バクテリアの溶解物;
2)銅の境界CSFFカラム・クロマトグラフィによって処理することではなく30 KのNMWCO TFF薄膜によるHA溶離液のろ過;
そして3)銅の境界CSFFカラム・クロマトグラフィの後のSartoBind Q薄膜の除去。
5つKのNMWCO薄膜を使用する食塩水に対する5〜20のボリュームdiafiltrationの精製の最終ステップは、すべての場合の中で使用されました。
[0195] これらの方法は、比較可能な物理的特性を備えたrhUGを生産し、必要状態、および動物実験でのrhUGの使用用の必要状態を製造するFDAのcGMPに会うのに十分です。
このプロセスによってなされたrhUG準備、およびその小さな変化、すべての点で比較可能である:
明白なサイズ、分子量、チャージ、N末端アミノ酸シーケンス、シスチン・シスチン契約、ELISAのような免疫学的認識技術およびウェスタンブロットの正確な構成を示す自由なチオールの量および生物活動。
銅のCSFFカラムを使用して精製されたタンパク質は、誘導結合プラズマ(QTIインクによる)によって銅の存在に関してテストされました。
銅は検知されませんでした。また、分析の検出限界は0.5ppm.でした。
これは、2mlの服用量当たり1.mu.gの極量に形を変えます。それは、幼児(Olivares、1996年)のための1日当たり600.mu.gの評価された安全で適切な毎日の食事摂取よりかなり下にあります。
[0196] カラムは、標準処理手順を使用し、カラムおよび樹脂メーカーの推薦へ一致してパックされました。
充填塔はすべて最小30分の0.5Mの水酸化ナトリウムで清潔になり、使用までそれぞれのストレージ・ソリューションに入れられました。
接線のフローろ過のための薄膜は45で0.5Mの水酸化ナトリウムで清潔になり発熱性物質を除かれました。+-.5.degree。
使用に先立った最小1時間のC.。
Sartobind Q薄膜は使用に先立って最小30分の1.0NのNaOHで清潔になり発熱性物質を除かれました。
[0197] 精製工程の具体化のステップを示すフローチャートは、図10〜16に示されます。
発酵からの1キログラムの凍ったセル・ペーストは、室温で溶かされ、どちらかを使用して、大ばさみによって溶解されました、Microfluidizer.TM。
(Microfluidics)あるいは同様の大ばさみ装置。
生じる天然のままの溶解物は、15,000.times.gで遠心分離によって明確にされました。
明確にされた細胞溶解物は、100 KのNMWCO細胞膜を使用して、25のmMトリス/40 mM NaCl pH 7.0の中の一定容積diafiltrationによって精製されました。
100 K TFFステップからのpermeateは集められ集中されました、5つKのNMWCO薄膜の使用、で。
100 Kの集中の後に、5.times.constantボリュームdiafiltrationに浸透する、低分子量不純物を削除し、かつ5つKを生産するマクロのQ陰イオン交換平衡バッファーと、100 KのTFFバッファーを交換するために25のmMトリス/40 mM NaCl pH 8.5で行なわれた#1(図10)を水につけます。
その後、これは3リットルのマクロのQ陰イオン交換カラムに載せられました。
非境界および弱い境界タンパク質はカラムから洗い流されました。また、rhUGを含んでいる分数は、25人のmMトリス(150のmM塩化ナトリウム、pH 8.5(図11aおよび11b))と溶出されました。
マクロのQカラムからの溶離液は集中されました。また、バッファーは、5つKの浸水を生産するために5つKのNMWCO薄膜を使用して、平衡バッファーでHAカラムと同時に交換されました。
#2(図12)。
5つKの浸水。
#2は3リットルのタイプのIの陶器のハイドロキシアパタイト・カラムに載せられました。
非境界タンパク質は10のmMリン酸ナトリウムpH 7.0でカラムから洗い流されました。また、rhUGを含んでいる分数は、75のmMリン酸ナトリウム、pH 7.0(図13aおよび13b)で溶出されました。
HAカラムからの溶離液は、銅で満たされた、1リットルのキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)カラムに直接載せられました。
rhUGは銅のCSFFカラムへ拘束せず、flowthrough(図14aおよび14b)の中で検索されました。
その後、銅のCSFFカラムからのflowthroughは、WFIで1対1で薄められ、最終の菌体内毒素削除ステップ(図15)としてSartobind Qフィルタを通して渡されました。
Sartobind Q薄膜からの通り道は5つKのNMWCO TFF薄膜を使用して集中されました。
集中の後に、20.times.constantボリュームdiafiltrationは置換バッファー(図16)としてインジェクション用食塩水で行なわれました。
diafilteredされた資料はそのときさらにありました、5.5mg/mlの集中目標にインジェクション(SFI; 0.9%のNaCl)用食塩水でろ過され薄められて、7.5mg/mlの最小のタンパク濃度に集中しました。
精製されたrhUGバルク製剤を生成するためにろ過されて、そのときrhUGは無菌でした。
[0198] 追加の2つの精製法はrhUGの生物薬剤の製品の質を改善するために使用することができます。
最初の方法は陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップの追加によってさらにrhUGを精製することを含んでいます。
このカラム・クロマトグラフィ方法は選択的に残余の大腸菌タンパク質を削除するために特に最終生産物からプロセスの中で様々なポイントで使用することができます。
例えば、図17では、rhUG(さらにrhCC1Oとして知られている)はNaClのステップ勾配を使用して、SPSFFカラム上で精製されます。
バッファーは酢酸ナトリウムpH 4.0です。
ハイドロキシアパタイト・カラムからのrhUG準備は4.0のpHに調節され、SP Sepharose速いフロー(SPSFF)陽イオン交換カラム(アマシャム。)に突き通されました。
RhUGだけ、図17に示されるような塩化ナトリウム・ステップ勾配を備えたカラムから溶出された、一方、以前にその後溶出された大腸菌タンパク質。
したがって、陽イオン交換ステップの追加、あるいはハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーあるいは他のクロマトグラフィー・ステップに対する陽イオン交換の代用は、著しく最終のrhUGの生物薬剤の製品の清浄を改善する場合があります。
[0199] 精製の改良のための第2の方法は、残余の大腸菌タンパク質および残余を削除する疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)の使用およびタンパク質rhUGの他の誤折り重ねられた形式を含んでいます。
例えば、銅のIMAC(Cu-IMAC)カラムからのrhUG資料は、アマシャムからフェニル基を含むSepharose速いフロー/最高値代用(PSFF/HS)カラムに載せられます。
PSFF/HSカラムへのrhUGの特定の結合を増加させるために、硫安は銅のIMACカラムからrhUG準備に加えられます。
望ましいrhUG(反並列のhomodimer)はカラムを通り抜けて、流水式のものの中で回復されます。
残余の大腸菌タンパク質、rhUG総計、rhUGの他の誤折り重ねられた形式あるいは誤って調整された形式は、図18に示されるような移動相中の硫安の減少によってカラムから溶出されます。
この例において、rhCC10として知られている反並列のrhUGは、硫安のステップ勾配を使用して、PSFF/HSカラム上で精製されます。
バッファーはリン酸ナトリウムpH 7.0です。
Cu-IMACカラムからのrhUGの分析は、並列のオリエンテーション(望ましくない汚染物質)のhomodimersの存在を示しました。
これらのデータは表12に示されます。それは、EndoproteonaseリースCを備えたrhUG準備の消化から生成されたペプチドのLC/MS分析を示します。
反並列の形式は優勢型(>90%)ですが、並列・反並列のオリエンテーションに由来したペプチドはHICステップで処理されていないrhUG準備の中にあります。
したがって、疎水性相互作用クロマトグラフィーの追加、あるいは精製工程の別のステップに対するHICの代用は、著しく反並列のrhUGの生物薬剤の製品の均質を改善する場合があります。
[0200] 表12では、ペプチド断片は、リジン残基の後に裂けるEndoproteonaseリースCによるrhUGの消化によって得られました。
その後、ペプチドはRP-HPLCを使用して、分離されました。また、破片は、214nmの吸光度、およびプラスイオン・エレクトロスプレイ質量分析による分析によって分析されました。
下記の資料はCu-IMACの流水式の資料のサンプルから得られました。
［表１２］EndoproteonaseリースCによるrhUGの消化によって得られた破片は、多量がタイプする破片を予期しました、1つの(1)-K(44)4888.307モノマーK(45)-K(45)146.105モノマーL(46)-K(53)912.528モノマーP(54)-K(60)841.502モノマーL(61)-K(64)519.273モノマー、私(65)-N(1つの-K(44)当たり(1)720 834.390モノマー - S-S-A(1)-K(44))
9776.1 ダイマー(平行)1つの(1)-K(44)(S-S--I(65)-N(72))5722.70、よりかすか(反平行)私(65)-N(72)(S-S--I(65)-N(72))1668.78、かすか(平行)1つの(1)-K(45)-S-S-A(1)-K(44)9922.72、よりかすか(平行)(1)-K(45)-S-S-I(65)-N(72)
5868.80 ダイマー(反平行)1つの(1)-K(45)-S-S-A(1)-K(45)10068.82、よりかすか(平行)。
[0201] 並列の二量体のレベルは、生物薬剤の公式化で望まれた反並列の形式からの誤って調整された平行形式の十分か部分的な除去を示すPSFF/HSカラムを通り抜けた資料の中で下がったか除去されました。
これらの結果は同様の結果を備えたフェニル基を含むSepharoseに加えて他のいくつかのタイプのHICメディアで繰り返されました。
この種のカラムに使用する、小説および分離のための予期しない手段を以前に提供する、rhUGの未知の形式。
[0202] プロセス分析では、特性記述が分析し、リリースが、生産工程、および製剤原料と製剤のために分析するとともに、次の分析は確立されました。
適切なところで、rhUG製剤原料および製剤は標準研究ロットrhUG/7と比較されました。
[0203] ウェスタンブロット。
2つのウェスタンブロットが行なわれました、-rhUG抗体を備えた一つおよび.alpha.を備えた一つ
大腸菌溶解物抗体(両方ともDako、アメリカからの)。
.alpha.-rhUGウェスタンは、二次抗体としてDAKOから結合したヤギ.alpha.-ウサギIgGHRPを備えた人間のUGへのウサギ・ポリクローナル抗体を使用して行なわれました。
.alpha.
西洋の大腸菌、ウサギ.alpha.で行なわれた。
二次抗体としてヤギ.alpha.-ウサギIgGHRP共役が後続する大腸菌溶解物ポリクローナル抗体、.alpha.のための両方の抗体
大腸菌分析、DAKOから得られました。
検知はECL.TMを使用して行なわれました。
アマシャムからのキット。
[0204] バクテリアの核酸。
rhUG製剤原料および製剤の1つの服用量当たりのバクテリアのDNA内容は、汚された濃縮rhUGサンプル(チャールズ研究所モールヴァン川)に交雑が後続する、放射性同位体で識別されたバクテリアのDNAを使用して、サザンブロットによって決定されました。
[0205] 質量分光法。
分子量はM-スキャンインクによるエレクトロスプレーイオン化分光測定によって決定されました。
理論的な分子量は、PAWS(スイスのプロによって得られた平均分子量の決定のためのシェアウェア・プログラム)によって決定されました。
16110.6daの値はPAWSプログラムによって決定されました。
同じ値はrhUGのcGMPバッチのために見つかり、コントロール(断固とした分子量16110.6da)として標準研究ロットrhUG/7のMSの分析によって確認されました。
[0206] Nターミナル期間分析。
N-終点のシーケンスは、アプライドBiosystems(ABI)477A自動プロテインシークエンサー上で順番に並べるパルス過程Nターミナルを使用して実行されました。
その分析はM-スキャンインクによって行なわれました。
翼状突起翼状突起-Glu-Ileのシーケンスは、コントロールとして標準研究ロットrhUG/7を備えたrhUGのcGMPバッチのために確認されました。
[0207] pH。
3ポイントの測定(4.0、7.0、10.0)はメーカーの指示によって行なわれます。
電極の測定の後、サンプルのpHは決定されます。
[0208] 等電点電気泳動。
pIは3〜7のpH範囲を備えたゲルを使用して、等電点電気泳動によって決定されました。
ゲルはNovexから得られ、メーカーによって記述されるような状態の下で実行されました。
サンプルは、シグマからの標準およびrhUGコントロール(研究ロットrhUG/7)に対して実行されました。
ゲルは、ピアスからのゲル・コード青変病で汚れることが後続する10%の酢酸/30%メタノールが存在する状態で1分間電子レンジの中で熱くなることにより固定しました。
汚れを除くことはピアスによって記述されるような純水の中で行なわれました。
[0209] 自由なチオール。
自由なチオールの存在は感度を増加させるために修正済のproticolを使用して、ピアスからエルマンの試薬を備えた反応によって決定されました。
エルマンの試薬が存在する状態での孵化の後、サンプルの吸光度は412nmで分光測光器の中で決定されました。
14150のM.sup.-1cm-.sup.1の減衰係数は臼歯の量の自由なチオールを決定するために使用されました。
自由なチオール(システイン)の標準曲線は反応の線形性をモニターするために使用されました。
[0210] ラル。
rhUGプロセス中間物、製剤原料および製剤中の細菌内毒素の存在は、米国薬局方(USP)アッセイ85番に述べられているようなリムルスameobocyte溶解物分析によってテストされました。
キットはケープコッドの仲間から得られました。
[0211] カラー、アピアランス、均質。
バルク製剤製品は、明瞭さ、色および可視の粒子状物質の有無を視覚的に調査されました。
[0212] 免疫反応性。
競争率の高いELISAは、捕獲試薬、およびサンプルでrhUGと競争するのに結合したrhUG-HRP(ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ)として尿(DAKO、.alpha.-尿中タンパク-1)から分離された在来の人間UGに上げられた抗体を使用して行なわれました。
抗体は、微小滴定井戸(100マイクロリットル/井戸)上に2,500の稀釈液でpH 9.5の0.1Mの炭酸塩/重炭酸ソーダ・バッファーに夜通し覆われました。
井戸は乾かされ、4.程度で格納されました。
使用までC.。
rhUG-HRP共役はピアスからのキットを使用して作られました。
250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)において結合したおよそ250ナノグラムのrhUG-HRPは、よく使用されました。
各サンプル一式の標準曲線は、0-500ナノグラム/ml(図19に示される)から変動するrhUG口径測定器(研究ロットrhUG/7)を使用して、実行でした。
口径測定器および試験サンプルはすべて複製して実行されました。
サンプル中のUGは、井戸中の抗体結合部位には結合したrhUG-HRPと競争します。
したがって、分析信号はサンプル中の増加する量のUGとともに減少します。
結果はピアスによるo-フェニルジアミン・ジヒドロクロリド(OPD)HRP分析によって視覚化されました。
プレートはBiotek EL-80マイクロプレート・リーダを使用して、490nmで読まれました。また、データはBiotek KC4ソフトウェアを使用して分析されました。
[0213] 清浄およびアイデンティティー:
SDS PAGEの縮小。
rhUG製剤原料および製剤は、両方縮小することおよびメーカーによって記述されるような縮小しない状態のの下のNovex 10-20%のTricine SDS-PAGEゲル上で実行されました。
低分子量サイズ基準はアマシャムから得られました。
ゲルは、10%の酢酸/30%メタノールの混合物で1分間電子レンジの中で熱くなることにより固定し、ブリリアント・ブルーR250(0.5%およびw/v)で汚されました。
汚れは、メーカーによって記述されるようなNovexのゲル明瞭な汚れを除く解決でゲルから除かれました。
その後、ゲルはNovexゲル乾燥系を使用して、乾かされました。また、純度パーセントは、ゲル(ヒューレット・パッカード・スキャナ・モデル5100C)の走査により決定されました。また、濃度学はNIHからの若枝イメージ・シェアウェアを使用して行なわれました。
[0214] アグリゲーション・アッセイ。
製剤は、Superose 12あるいはセファデックス75体積排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(アマシャム/ファルマシア)のいずれかの上のクロマトグラフィーによって総計の存在のために分析されました。
カラムはBioRadの生物学のシステムを使用して、メーカーの指示によって実行されました。また、ピーク面積はさらにBioRadから、EZLogicクロマトグラフィー解析ソフトウェアを使用して決定されました。
パーセント集合は、主なUGピークに先立って溶出するピークのすべてのピーク対エリアの総面積の比較により決定されました。
[0215] 菌体内毒素。
菌体内毒素レベルは、米国の軽く叩くことに述べられているようなウサギ発熱性分析によってテストされました。
151番．
一回の人間服用量と等価なrhUGの量は、10分の期間の間静脈内に投与されました。
基線前服用量温度に関する体温増加は3時間の間にモニターされました。
受理可能な結果は、0.5.程度と、あるいはその程度を超えて等しい温度上昇から成りません。
基線結果に関するC.。
[0216] 蛋白質含有量。
プロセス中間物、製剤原料および製品の蛋白質含有量は、島津製作所120およびMantileら(Mantile、1993年)によって決定されるような2070年のM.sup.-1 cm.sup.-1の減衰係数を使用して、280nmで吸光度によって決定されました。
[0217] 不毛。
米国の軽く叩くことに述べられているように、不毛分析が行なわれました。
71番．
サンプルは流動性のチオグリコレート培地(FTM)およびTripticase醤油煮出し汁(TSB)へかえされました。
TSBメディア用ポジティブコントロールは白体、黒色コウジ菌および枯草菌でした。
FTMのためのポジティブコントロールは黄色ブドウ球菌、P.aeruginusa、C.sporogenesでした。
[0218] 効力検定。
人間のタンパク質およびその哺乳類相同体上の文学の全体にわたるUGに起因するいくつかの生物活動があります。
記述された生産工程によって準備されている、人間のrhUGの準備に関係している生物活動は、ここに米国のサービスの中で記述されます。
番号08/864,357、09/087,210、09/120,264および09/549,926。
[0219] UGのある生物活動は、利用可能な試薬で生体外で測定することができ、ある疾病の治療に適切です。
これらの活動のうちの2つはここに記述されるようなUGのために確認されました。
1番目は、rhUGによる分泌ホスホリパーゼA.sub.2酵素(sPLA.sub.2s)の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することです。
私たちは、rhUGが人間のsPLA.sub.2酵素を著しく生体外で特に禁じることを確認しました、マクロファージによって生産されたタイプIIa酵素と同様に膵臓と肺で見つかったタイプIb酵素も、また人間のリューマチの滑液に見つけました。
rhUGによるsPLA.sub.2-Ib活動の抑制のための新しい蛍光に基づいたHPLC分析は開発され、より標準のラベルが.sup.14Cに付けられた分析と共に使用されました。
rhUGのための別の生物活動は、不適当な堆積物を防ぐフィブロネクチンに結び付けるその能力、およびUG欠乏(チャン、1997年)の遺伝子組換えのノックアウトマウス・モデル中の繊維症支持の細胞外マトリックスの後の構成です。
小説、生体外で、rhUGのこの活動を測定するために人間のフィブロネクチンを使用するELISAタイプ分析は開発されました。
[0220] これらの2つの効力検定はrhUGの将来のバッチの生体内の生物活動の相対的強弱度を測定するために使用することができます。
生産工程が、化学か生物学かにかかわらず、本質的に可変であるので、効力検定は潜在的な安全性および効能の評価において不可欠です。
生物活動の相対的強弱度は効力検定によって決定されるかもしれません。
[0221] 分泌のPLA.sub.2の抑制 -- Ibをタイプします。
[0222] 効力検定はrhCC10の追加によってrhPLA.sub.2活動の抑制に基づきます。
RhPLA.sub.2は、L-3-ホスファチジルコリンの2つの位置でエステルの分裂を触媒します。
異なる2つの分析がこの活動を測定するために使用されました;
[1-.sup.14C]アラキドン酸(プロダクト)を生産するために、1つは基板(1-stearoyl-2-[1-.sup.14C]arachidonyl phosphotidylコリン(アマシャム))として使用します、その後、それは流動の流動の分離によって分離された、またひらめきを数えること(PLA.sub.2、1番をアッセイする)により決定された分裂のレベル。
第2は蛍光性にラベルが付けられた基板を使用して、行なわれました、2-デカノイル-1-(O-(11-(4,4-difluor-o-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-indacene-3-プロピオニル)アミノ)ウンデシル)-sn--glycero-3-phosphocholine(分子プローブ)。
図18に示されるように、uncleavedされた基板は正常相HPLCを使用して、裂かれた基板から分けられました、計量は並んだ蛍光検出器(PLA.sub.2アッセイ2番)を使用して行なわれました。
両方の分析は、100.mu.L.の最終の分析ボリューム中の1つのmM CaCl.sub.2を備えたハンク・バランス食塩水の中で行なわれました。
RhPLA.sub.2は、ウォンHwa Cho博士のイリノイ大学シカゴの研究所から得られました。
新しいPLA.sub.2アッセイ1番、分析する、以下のように行なわれました。
RhPLA.sub.2は200 nMの終末濃度へのすべてのチューブに加えられます。
阻害試験については、rhCC10はおよそ34 uMの終末濃度に加えられました、HBSSの等容積はコントロール・チューブに加えられました。
チューブはすべて37.程度で20分間前培養されました。
Cおよび分析は、5.mu.g/mlの終末濃度への放射性同位体で識別されたphosphotidylcholineの追加によって始められました。
その後、15分が7.7の追加によってドールの試薬および純水(84:16)の稀釈を折り重ねた後、その反応は止められました。
チューブはすべて疎水性の層および親水性の層を分離するために攪拌され、次に、遠心分離機にかけられました。
その後、最上層は削除され、15mgのシリカゲルを含んでいるEppendorfチューブを増しました、メッシュ、60〜200、およびひらめきを数えるためのヘキサンの800.mu.lを分類します。
[0223] 新しいPLA.sub.2アッセイ2番は以下のように行なわれました。
RhPLA.sub.2は200 nMの終末濃度へのすべてのチューブに加えられました。
阻害試験については、rhCC10はおよそ34 uMの終末濃度に加えられました、等容積、塩性、コントロール・チューブに加えられました。
チューブはすべて37.程度で20分間前培養されました。
Cおよび分析は、5.mu.g/mlの終末濃度への蛍光性のラベルが付けられたphosphotidylcholineの追加によって始められました。
その反応は、2-プロパノール:nヘキサン(8:3)の1〜5つの稀釈液の追加によって15分の後に止められました。
止められた分析の100.mu.lが、珪酸正常相HPLCカラムに直接載せられました。
システム用の移動相は2-プロパノール:nヘキサン:水(8:3:2)です。
裂かれた基板の量は517nmで480の縁での興奮およびemmisionを備えた蛍光によって決定されました。
[0224] 各分析のパーセント抑制は次のように定義されました:
［表１３］rhUG RhUGロット番号の異なるロットによるsPLA2の抑制、CC10/6 CC10/7 CC10/8 0728 PLA.sub.2阻害試験1番をアッセイする:
48%の38%の54%の58%の放射性同位体アッセイPLA.sub.2阻害試験2番:
59%の56%の69%の76%の蛍光測定
[0225] 人間フィブロネクチンに拘束すること
[0226] rhCC10のための別の生物活動はフィブロネクチンに結び付けるその能力です。それは不適当な堆積物、およびCC10欠乏(チャン、1997年)の遺伝子組換えのノックアウトマウス・モデル中の繊維症支持の細胞外マトリックスの後の構成を防ぎます。
小説、生体外で、ELISAタイプ分析はこの活動を測定するために人間のフィブロネクチン(「rhFn」と呼ばれた破片-III.sub.1Cとして知られているFn III.1)の組換えの7個のkDa破片を使用して、開発されました。また、この分析はrhCC10の生物活動をモニターするために使用されました。
マイクロプレートは、フィブロネクチン破片で夜通し覆われました。また、rhCC10の結合はrhCC10-HRP(西洋わさびペルオキシダーゼ)共役を備えた競争によって検知されました。
RhCC10-HRP共役はプレートに加えられ、室温で1時間かえることを許されました。
共役は標準かサンプルを、あるいは標準なしで加えられるかもしれません。
PBSは負の対照として使用されました。
プレートは、4回気音に発音され洗われました。
分析はピアスからo-フェニルジアミン・ジヒドロクロリド(OPD)HRP分析によって視覚化されました。
プレートはBiotek EL-80マイクロプレート・リーダを使用して、490nmで読まれました。また、データはBiotek KC4ソフトウェアを使用して分析されました。
図21は、この分析用の典型的な標準曲線を示します。
rhUGのすべての研究およびcGMPロットのためのこの分析の結果は、フィブロネクチン破片にrhUGを拘束することには陽性でした。
[0227] 製剤原料と製剤の広範囲な試験および特性記述に加えて、精製に続き、かつ各ステップの効率を決定するために、中間物のサンプルは、プロセスの全体にわたって得られました。
プロセス中間物はSDS-PAGEによって分析されました、rhUG ELISA、LAL、そして蛋白質含有量のために。
蛋白質含有量は標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ピアスからBCA分析で決定されました。
バッファーはすべてLAL分析によって菌体内毒素内容のために分析されました。
菌体内毒素はバッファーに検知されませんでした。
[0228] 精製工程は両方のために分析されました、全面的なステップ回復(表14)。
全面的な精製は、100 Kのバルクから決定されたとともに、51.9パーセントでした。
比放射能によって記述されるような清浄も検討されました(表15)。
比放射能は、定義されたサンプル用のBCAタンパク質測定に見合う価値で割られたUG ELISAに見合う価値として定義されます。
削除された最大の量の不純物が、100 K diafiltrationステップ、および後のマクロのQ、陰イオン交換ステップで生じます。
これは、SDS-PAGE結果(図22aおよび22b)からのデータによって確認されます。
速いフロー・カラムが必要なハイドロキシアパタイトおよび銅をキレート化するSepharoseは、最終の大腸菌タンパク質不純物を削除します。
1.00を超過する100パーセントおよび比放射能を超過する回復は分析内の変わりやすさにより、異なる標準に使用しました。
[0229] LAL分析は精製の全体にわたって菌体内毒素レベルに続きました。
菌体内毒素は、5KのRetentate#1の中の2400 EU/ml(総量は11.times.10.sup.6 EUでした)でした。
資料がマクロのQカラム上でさらに精製された後、内毒素濃度は、680 EUの合計のために5KのRetentate#2(ボリューム=4000ml)に0.17 EU/mlに落ちました。
これは、菌体内毒素レベルの16,000倍の減少を表わします。
菌体内毒素レベルは精製の残りの全体にわたって検出できませんでした。
［表１４］精製ロット0726からのRhUGの回復、合計の全面的なステップ・ボリュームRhUG rhUG Recov - 回復ステップ(ml)(mg/ml)(mg)ery(%)。(%)
sup.1上澄みは3990 6.45 25700 100N/Aのセル5を溶解しました、K、浸水#1 4780 4.67 22300(86.7)86.7のマクロのQ溶離液10000 2.10 21000(81.6)94.1のハイドロキシアパタイト溶離液4000 4.37 17500(67.9)83.2のキレート化するSepharose 4250 3.57 15200 58.9(86.8)Sartobind Qパス9200 2.20(20200)によるパス、精製されたrhUGバルク2474 5.40 78.6 134〜13400(51.9)66.0の.sup.1Step回復が各ステップの回復として定義されます。
[0230]
［表１５］
ロット0726 rhUGプロテインからのrhUGの比放射能、特定のステップ(mg/ml)(mg/ml)活動表面に浮かぶ溶解細胞6.45 22.1 0.292 5 K浸水。
#1 4.67 4.94 0.945、マクロのQ溶離液2.10 1.19 1.77ハイドロキシアパタイト溶離液、2.20 0.89によって3.57 2.23 1.60 Sartobind Qパスを通じてSepharoseパスと結合してキレート環を作る4.37 2.41 1.81、2.48の精製されたrhUG、5.40 3.08 1.75を大きくする。
[0231] 最終の無菌のろ過された原薬は表16に示されるような基準をすべて通りました。
［表１６］(.+。)rhUG製剤原料ロット0726試験仕様書結果用の仕様書および結果は、明瞭で無色の明瞭で無色のアピアランスに色をつけます、混濁はない、混濁均質がない均質の均質の免疫反応性陽性反応陽性反応清浄.gtoreq.95% 98.3、ウサギによる%アグリゲーション.ltoreq.5% 0.18%の菌体内毒素、満足な満足な発熱性蛋白質含有量5.5。
rhUGと一致するrhUGと一致するポジティブなウェスタンブロット.alpha.-rhUGが、SDS-PAGEに起因して肯定的な無菌の無菌の生物活動が、SDS-PAGE.alpha.に起因する0.5mg/mlの5.5mg/mlの不毛
バクテリアの.about.40 kDの.about.40 k 1明帯の大腸菌1明帯、nucleic<100 pg/服用量<7.5のpg DNA/服用量酸質量分光法アプ、16110 16111.9 kDa PH(6.30)5-8、等電点電気泳動アプ4.7 4.7、自由なメルカプト基を含む検知できない<10%。(w/w)。
LAL<5つのEU/mg、AAe-I AAe-I1.sup.1Both MAAEIを順番に並べる<0.01のEU/mgのNターミナル、およびAEI形式は、合計の0.062%未満でした。
[0232] rhUGの構造により、二量体とモノマーの両方は、シーケンス分子量(図23)によって予言されるよりSDS-PAGEの上の低い分子量に飛びかかります。
タンパク質の別の特性は、残余の二量体の存在にクマシに汚されたSDS-PAGEゲル(図23)のレーン5および9、および.alpha.のレーン5で見ることができるとともに、還元剤が存在する状態でのモノマーの中への二量体の分離が完了していないということです。
UGは西洋です(図24)。
rhUGが.alpha.-rhUGのレーン5の二量体とモノマーの両方の位置で明白な間、西洋(図24)、モノマーあるいは.alpha.のレーン3中のよりかすかな位置のいずれかにおいて検知できる大腸菌タンパク質はありませんでした。
大腸菌は西洋です(図25)。
.alpha.のレーン3中のただ一つの可視帯
大腸菌ウェスタンにはおよそ40 kD(図25)の明白な分子量があります。
[0233] より高い分子量バンドが.alpha.-rhUGウェスタン(図24)のレーン2中のより高い分子量バンドによく一致したところで、クマシに汚されたゲル(図23)のレーン11において明白なように、rhUGの別の特性は小さな量の総計の構成です。
二量体と総計の両方は、モノマー(UG ELISAの開発の間になされた観察と一致している)より.alpha.-rhUG抗体でより強く反応するように見えます。
全面的な量の二量体(表16)と比較して、214nmの総計の分析は、体積排除クロマトグラフィーによってrhUG総計の最小の構成を示します。
[0234] rhUGのための等電点はIEFゲル(図26)を使用して、4.7であるとわかりました。
結果は、スイスのプロ(www.expasy.ch)へのアミノ酸配列のサブミッションによって確認されました。計算されたpI(4.7)は観察されたpIと同じでした。
例VII
製剤原料の安定
[0235] 典型的な製剤原料および典型的な製剤は、同じ集中に、および同じ定式(つまり、補形薬は加えられません)にあります。
安定は製剤上でテストされました。
[0236] 製剤の公式化およびパッケージング
[0237] 典型的な製剤の最終十分の中で使用される材料、化学薬品および設備はすべて、表17〜19にリストされます。
［表１７］製剤アイテム・メーカー2mlのガラス瓶ホイートンV-35のファイナル十分の中で13mm使用される材料は、ウェスト13mmのアルミニウムひだシーラー・ホイートンに2mm栓をします、管材料アセンブリー・ホイートン・ピンセット- 6"のN/AアルミホイルN/A 600mlのビーカーKimax
[0238]
［表１８］化学薬品は、製剤の化学のメーカー・バルクrhUG WRAIRの最終十分の中で無菌の70%のイソプロピルアルコールVeltrekを使用しました。
[0239]
［表１９］製剤機器製造業者バランス縫工筋Omnispenseホイートン・クリンパKebbyの最終十分の中で使用される設備
[0240] 製剤の典型的な具体化の構成は次のとおりです:
5.5mg/mlのrhUGおよび0.9%(w/v)で塩化ナトリウム。
埋立作業はすべてクラス100環境室で行なわれました。
十分用の部屋およびオペレーションの両方はオペレーターによって有効になりました。
Omnispenseポンプは、火薬が詰められ、2.0gの重量に充満する準備ができて、2mmの管材料でセット・アップされました。+.5%(1.90-2.10ml)。
十分プロセスを概説するフローチャートは、図27に示されます。
2mlのガラス瓶は風袋を計られました。また、大量のrhUGはガラス瓶へ分配されました。
充満後に、ガラス瓶の重量は記録されました。
この手続きは、2回繰り返されました。
3個のガラス瓶の十分重量が指定範囲内にすべてあった場合、ガラス瓶がすべて満たされました。
ガラス瓶が指定範囲から落ちた場合、ディスペンサー・ボリュームは調節されました。また、プロセスが繰り返されました。
充満後に、ガラス瓶に栓が手動で付けられました。また、アルミニウム・クリンプ・シールはガラス瓶上に置かれました。
ガラス瓶はKebbyパワーひだを使用して縮れました。
その後、ラベルはガラス瓶に視覚的に付けられ検査されました。
このように生産されたrhUG製剤は明瞭で無色の解決策に可視の微粒子を供給します。
[0241] 製剤の物理的および化学的特性の要約
[0242] RhUGは、アミノ酸配列から計算され、エレクトロスプレイ質量分光法によって確認されるような16110 kilodaltonsの分子量を備えた二量体タンパク質です。
タンパク質は、2つのシスチン契約によって互いに結び付けられた2つのサブユニットからなります。
相対的なサブユニット分子量およびシスチン契約の存在は、縮小し縮小しない状態の下のSDS-PAGEによって決定されました。
エドマン分解によるタンパク質のN-終点のアミノ酸配列があったように、バクテリア株(CG12)のDNA塩基配列が確認されました。
N-終点のシーケンスは予言される(SEQ。ID NO。10)ような翼状突起翼状突起-Glu-Ileでした。
システインは、固有の化学により、およびシステインが硫黄ボンディングに関係するという事実にこの方法によって容易に検知されません。
[0243] 表２０に示されたように、最後のバイアルされたｒｈＵＧ製剤が全ての特性を満たした。
[0244] 製剤原料のために記述されたように、二量体および製剤のモノマーの両方は、シーケンス分子量(図28)によって予言されるよりSDS-PAGEの上の低い分子量に走ります。
クマシ・ゲル(図28)のレーン5、9および11、および-rhUGのレーン6中の残余の二量体の存在によって実証されるように、還元剤が存在する状態での製剤のモノマーの中への二量体の分離は完了していませんでした、西洋(図29)。
rhUGが.alpha.-rhUGのレーン6の二量体とモノマーの両方の位置で明白な間、西洋(図29)、モノマーあるいは.alpha.のレーン4中のよりかすかな位置のいずれかに検知された大腸菌タンパク質はありませんでした。
大腸菌は西洋です(図30)。
.alpha.のレーン4において可視のバンドはありませんでした。
大腸菌は西洋です(図30)。
[0245] さらに、総計は、.alpha.-rhUGウェスタン(図29)のレーン3において明白でした。
二量体と総計の両方は、.alpha.でより強く反応するように見えます。
モノマーよりUG抗体;
これもUG ELISAの開発で観察されました。
全面的な量の二量体(表20)と比較して、214nmの総計の分析は、体積排除クロマトグラフィーによってrhUG総計の最小の構成を示します。
[0246] rhUGのための等電点はIEFゲル(図31)を使用して、4.7であるとわかりました。
結果はスイスのプロへのアミノ酸配列のサブミッションによって確認されました。計算されたpIは観察されたpIと同じでした。
[0247] 動物試験のために作られた前臨床開発ロットはすべてcGMPロットのために使用されるような同様の技術を使用して分析されました。
rhCC10のための臨界パラメータのための範囲は表21に示されます。pI、分子量、Nターミナル終了シーケンスおよび自由なチオールのような他の臨界パラメータは、rhUGのすべてのロットには本質的に同一でした。
［表２１］開発ロットrhCC10/6、rhCC10/7、rhCC10/8、cGMPロット0728および0853のための範囲。
57.7%のPLA.sub.2抑制(蛍光性の分析)への>99.5%アグリゲーション0.13%から3.4% PLA.sub.2 37.5抑制(放射性の分析)%に結果清浄の範囲を97.4% 56.0%から86.0%分析します。
[0248] 最終製剤は放出基準をすべて通り、動物実験の中で使用される資料と同一で、米国FDAによるフェーズのI/IIの人間の臨床試験で使用するには受理可能でしょう。
[0249] rhUG準備の安定
[0250] 精製したrhUG製剤、発展的なロット(GLP資料; 2-8.程度で格納されたロット番号rhUG/7。C。)、および製薬の等級生産ロット(2-8.程度で格納された製剤ロット番号0728。C。)に関する長期間安定性研究、製薬の等級生産ロット(25.程度で格納された製剤ロット番号0728。C.および60%の相対湿度)の加速テストのために18および15か月の間、それぞれ7か月の間実行されました。
規定時間では、各々のガラス瓶は2-8.程度で記憶装置から取り除かれました。
C.、またテストしました。
分析は表22に述べられています。
［表２２］安定性評価3Testスペシフィケーション清浄(縮小されたSDS PAGE).gtoreq.95%アグリゲーション.ltoreq.5のために行なわれた分析%生物活動のポジティブな等電点電気泳動アプ、自由なメルカプト基を含む4.7<10%
[0251] 研究ロットのための分析のための結果は表23に示されます。また、cGMPロットのための分析結果は、表24(2-8.程度。C。)および表25(25.程度。C.および60%のRH)に示されます。
［表２３］開発ロット時間上の安定性試験の結果、何か月も、テスト・スペック0 1 2(3)4 5 6 9 12(15)18清浄.gtoreq.95%>99.5%.sup.1>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%>99.5%アグリゲーション.ltoreq.5%(2.7)0.6、0.3 1.2 0.42 0.1 1.30(0.30)0.14 0.078 0.065のPLA2(14 C)+ANA.sup.2 ANA ANA ANA、ANA ANA ANA 42 57%.sup.3% 28% 33%のPLA2(HPLC)+
ANA ANA ANA ANA ANA ANA ANA ANA、ANA 57%の57フィブロネクチン+na na na+na++++++(破片)等電のアプ4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)4.7 4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)4.7自由なメルカプト基を含む.ltoreq.10%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%を集中させること.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%これらの分析用計量の.sup.1Limit。
.sup.2Meansアッセイはその時間ポイントで利用可能ではありませんでした。
分析の開発での.sup.3RangesはrhUGのこのロットのために21%から57%でした。
[0252]
［表２４］4.程度でcGMPロット上の安定性試験の結果。
C.時間、何か月も、テスト・スペック0 1 2(3)6 9 12 15清浄.gtoreq.95% 97.4% 99.4% 98.6% 99.1%>99.5% 99.3%>99% 99.2%アグリゲーション.ltoreq.5 2.2%% 1.7% 3.0% 1.2% 1.2% 0.5% 0.5% 0.6% PLA2(14 C)+ANA.sup.1 ANA ANA、39% 39% 66% 69% 76%のPLA2(HPLC)+ANA ANA ANA ANA、ANA ANA 87% 76%フィブロネクチン++na+++++
+(破片)等電点電気泳動アプ4.7 4.7(4.7)4.7 4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)自由なメルカプト基を含む.ltoreq.10%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.ltoreq.1%.sup.1meansはアッセイします、その時間ポイントで利用可能でなかった。
[0253]
［表２５］25.程度でcGMPロット上の安定性試験の結果。
C.および60% RH時間、何か月も、テスト・スペック1 2 4(7)清浄.gtoreq.95% 99.1% 96.3%>99% 98.9%アグリゲーション.ltoreq.5 0.53%% 0.25% 0.12% 0.34% PLA2(14C+56% 68% 60% 65% PLA2 HPLC)+73 ANA % 88% 76%フィブロネクチン+++++(破片)等電のアプ4.7 4.7 4.7 4.7(4.7)自由なメルカプト基を含む.ltoreq.10%を<1%<1%<1%集中させる(<1%)こと
[0254] 示されるように、それらがもとは生産されvialedしたので、開発ロットおよびrhUGのcGMPロットの両方は18および15か月間以上それぞれ安定していました。
これらのrhUG準備は、2つの効力検定での生物活動に関しても多くの物理的および化学的特性に関してもテストされました。
これらのデータに基づいて、これらの準備が同じことを生体内で、互い、およびそれらのオリジナルの強さおよびここに記述されるような生物活動のタイプに関して、および適用サービスの中で行なうと予想することができます。
番号08/864,357;
09/087,210;
09/120,264;
09/549,926;
09/861,688;
PCT/US98/11026;
PCT/US99/16312;
PCT/US00/09979;
またPCT/US01/12126。
[0255] 従って、現在の発明は商業ベースにのった製薬の構成および公式化と同様にrhUGに商業ベースにのった生産工程を供給します。
参照
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クレーム
要求されるものは次のとおりです:
1. 人間のUG(そこでは合成遺伝子は以下IDを含む)のためにコード化する合成遺伝子を含むrhUGの生産用の細菌発現システム。
番号1-4。
2. クレーム1の表現システム(そこでは合成遺伝子は合成遺伝子のN終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む)。
3. 遺伝子がシーケンスのN-終点でさらにメット翼状突起翼状突起を含む人間のUGのためにコード化する人間のシーDNAシーケンスを含むrhUGの生産用の細菌発現システム。
4. クレーム3の表現システム(そこでは表現システムはおよそ2.8kbのパーのシーケンスをさらに含む)。
5. 次のものを含むrhUG研究種子銀行を生産する方法:
a。
成長培地上にrhUG表現システムを含むバクテリア株の少なくとも1つの植民地に接種すること;
b。
静止期まで接種を受けた成長培地をかえすことは到達します;
c。
接種を受けた成長培地にグリセリンを加えること;
d。
割り切れる部分中の文化の凍結;
またe。
約-50C未満の温度で冷凍の割り切れる部分を格納すること。
6. クレーム5の方法、光学濃度が約0.8AUから1.5AUの550nmから660nmの間に測定するまで、接種を受けた成長培地はどこでかえされるか、到達します。
7. クレーム5の方法(そこではcryopreservativeなものはグリセリンを含む)。
8. クレーム5の方法(そこでは割り切れる部分は約1mlである)。
9. クレーム5の方法(そこでは貯蔵温度は約-70の間に、および-90.程度ぐらいある)。
C。
10. rhUGマスターセルバンクを含むことを生産する方法:
a。
細菌培養を形成するためにrhUG研究種子銀行の割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁に接種すること;
b。
細菌培養をかえすこと;
c。
加えること、1つの、凍結保存された解決を形成する細菌培養にcryopreservative;
d。
cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
またe。
約-60C未満の温度でcryovialを格納すること。
11. クレーム10の方法(到達して、光学濃度が約0.8AUから1.5AUの550nmから660nmの間に測定するまで、そこでは、文化はかえされる)。
12. クレーム10の方法(そこではcryopreservativeなものはグリセリンを含む)。
13. クレーム10の方法(そこではcryovialに転送された部分は約1mlである)。
14. クレーム10の方法(そこでは貯蔵温度は約-70と約-90Cの間にある)。
15. 次のものを含むrhUG生産セル・バンクを生産する方法:
a。
細菌培養を形成するためにrhUGマスターセルバンクの割り切れる部分を備えた適切なかえる煮出し汁に接種すること;
b。
細菌培養をかえすこと;
c。
加えること、1つの、凍結保存された解決を形成する細菌培養にcryopreservative;
d。
cryovialの凍結保存された解決策の一部の転送;
またe。
約-60C未満の温度でcryovialを格納すること。
16. クレーム15の方法、光学濃度が約0.8AUから1.5AUの550nmから660nmの間に測定するまで、細菌培養はどこでかえされるか、到達します。
17. クレーム15の方法(そこではcryopreservativeなものはグリセリンを含む)。
18. クレーム15の方法(そこではcryovialに転送された部分は約1mlである)。
19. クレーム15の方法(そこでは貯蔵温度は約-70と約-90Cの間にある)。
20. 次のもののステップを含むrhUGを表現する方法:
a。
rhUGを表現することができる発現ベクターを含む生産シード・セル・バンク文化の提供;
b。
接種原を形成するために生産シード・セル・バンク文化を備えた肉汁培地に接種すること;
c。
ステップbの中で形成された細菌培養をかえすこと;
d。
発酵培養を形成するためにステップcで形成された接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
e。
大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
f。
発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
またg。
ステップfの後に発酵培養を収穫すること。
21. クレーム20の方法(そこでは発現ベクターは以下ID番号1-4を含む)。
22. クレーム20の方法(そこでは28.程度に関して温度で約12時間と約24時間の間の期間の間接種原は間に培養される)。
C.、そして36.程度に関して。
C。
23. クレーム20の方法(そこでは大規模発酵槽に少なくとも300リットルのキャパシティーがある)。
24. クレーム20の方法(光学濃度550nmから660nmが2.0AUの最小のODまで到達するまで、そこでは、ステップeの孵化は継続される)。
25. クレーム20の方法(そこでは誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含む)。
26. クレーム20の方法、そこで、約1〜約4時間の、ステップfおよびステップgの間に経過します。
27. クレーム20の方法(そこでは発酵培養の収穫は遠心分離を含む)。
28. 次のもののステップを含むrhUGを表現する方法:
a。
発酵培養を形成するためにrhUGを表現することができる発現ベクターを含む接種原を備えた大規模発酵槽への接種;
b。
大規模発酵槽内の発酵培養をかえすこと;
c。
発酵培養にrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
またd。
発酵培養の収穫。
29. クレーム28の方法(そこでは発現ベクターは以下ID番号1-4を含む)。
30. クレーム28の方法(そこでは大規模発酵槽に少なくとも300リットルのキャパシティーがある)。
31. クレーム28の方法(光学濃度550nmから660nmが2.0AUの最小のODまで到達するまで、そこでは、ステップbの孵化は継続される)。
32. クレーム28の方法(そこでは誘導代理人はイソプロピル-ベータ-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含む)。
33. クレーム28の方法、そこで、約1〜約4時間の、ステップcおよびステップdの間に経過します。
34. クレーム28の方法(そこでは発酵培養の収穫は遠心分離を含む)。
35. 次のもののステップを含むrhUGを精製する方法:
a。
過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞を含む細菌細胞ペーストの提供;
b。
上澄みを形成するために細菌細胞ペーストを溶解すること;
c。
1位を形成するために薄膜から(NMWCO)カットされた最初の名目上の分子量によってステップbの中で形成された上澄みのろ過、浸透する;
d。
1番目の集中、別のNMWCO薄膜の使用によってステップcで形成されて浸透する;
e。
濃縮もののロード、最初の溶離液を形成するために陰イオン交換カラム上にステップdの中で形成されて浸透する;
f。
別の濃縮物を形成する3番めのNMWCO薄膜の使用によってステップeの中で形成された最初の溶離液の集中;
g。
別の溶離液を形成するためにハイドロキシアパタイト(HA)カラム上にステップfで形成された第2の濃縮物のロード;
精製されたrhUGを提供するためにステップgで形成された第2の溶離液中のrhUGからホストを派生したタンパク質を分けるh;
またi。
ステップhで形成された、精製されたrhUGの回復
36. クレーム35の方法(そこでは細菌細胞の中で発現した合成遺伝子は以下ID番号1-4を含む)。
37. クレーム35の方法(そこでは溶解は刈ることを含む)。
38. クレーム35の方法(ステップbおよびステップcの間で、そこでは細胞残屑は遠心分離によって削除される)。
39. クレーム35の方法(そこではステップbの薄膜は30K〜100KのNMWCO薄膜に関係している)。
40. クレーム39の方法(そこではステップcのフィルタリングは接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含む)。
41. クレーム35の方法(そこではステップdの薄膜は5つKのNMWCO薄膜に関係している)。
42. クレーム35の方法、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップを含むこと
43. クレーム42の方法(そこでは陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップはハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー・ステップの代わりに用いられる)。
44. クレーム42の方法(そこではSP Sepharose速いフロー(SPSFF)陽イオン交換カラムは使用される)。
45. クレーム35の方法、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィー・ステップを含むこと
46. クレーム45の方法(そこでは疎水性相互作用クロマトグラフィー・ステップは別のクロマトグラフィー・ステップの代わりに用いられる)。
47. クレーム46の方法(そこではフェニル基を含むSepharose速いフロー/最高値代用(PSFFHS)カラムは使用される)。
48. クレーム41の方法(そこではステップeの陰イオン交換カラムはマクロのQ陰イオン交換カラムである)。
49. クレーム41の方法(そこではキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムでステップhのホストを派生したタンパク質は分離される)。
50. クレーム49の方法(そこではCSFF樹脂カラムは銅を含む)。
51. クレーム50の方法、そこで、ステップhの後に、1つの、確かに、荷電膜は、パスを形成するCSFFカラムに下流に通り抜けて本質的に置かれます、ホスト誘導蛋白質がない
52. クレーム51の方法、そこで、確かに、荷電膜はSartobind Q TFF薄膜です。
53. クレーム35の方法(そこでは第2の溶離液は30KのNMWCO薄膜に関してdiafilteredされる)。
54. クレーム35の方法、rhUGは、どこでステップiの中で回復したか、総計が本質的にありません。
55. 次のもののステップを含むrhUGを精製する方法:
a。
過剰表現するrhUGに有能な細菌細胞の提供;
b。
上澄みを形成するために細菌細胞を溶解すること;
c。
薄膜から(NMWCO)カットされた分子量によって液体をろ過すること;
d。
交換柱に液体を載せること;
e。
rhUGから精製されたrhUGを提供するためにホストを派生したタンパク質を分けること;
またf。
精製されたrhUGの回復。
56. クレーム55の方法(そこでは細菌細胞の中で発現した合成遺伝子は以下ID番号1-4を含む)。
57. クレーム55の方法(そこではステップcのフィルタリングは接線のフローろ過(TFF)システムの使用を含む)。
58. クレーム55の方法(そこではステップdの交換柱はマクロのQ陰イオン交換カラムである)。
59. クレーム55の方法(そこではキレート化するSepharose速いフロー(CSFF)樹脂カラムでステップeのホストを派生したタンパク質は分離される)。
60. クレーム55の方法、rhUGは、どこでステップfで回復したか、総計が本質的にありません。
61. 次のもののステップを含む製薬の等級rhUG製剤原料を生産する方法:
a。
rhUGを表現することができる細菌発現システムの提供;
b。
発酵培養を形成するために細菌発現システムを含む接種原を備えた発酵槽への接種;
c。
発酵培養に細菌発現システムによるrhUGの表現を引き起こすために誘導代理人を加えること;
d。
ステップcで表現されたrhUGの収穫;
またe。
rhUGの精製はステップdの中で収穫しました。そこでは精製するステップは、少なくとも1つのろ過段階および少なくとも1 exhangeカラムの使用を含みます。
62. 次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)、前述のサンプルへのラベルが付けられた基板の導入、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)分裂の決定するレベル。
63. クレーム62の方法、分析は、どこで使用されるか、1つの、標準、ラベルは.sup.14C付けられた、分析します。
64. クレーム62の方法(そこでは放射性同位体で識別された基板は1-stearoyl-2-[.sup.14C]arachidonyl phosphotidylコリンである)。
65. クレーム62の方法(そこでは200 nMへの2 nMの終末濃度に組換えの人間uteroglobinホスホリパーゼA.sub.2は加えられる)。
66. クレーム62の方法(そこではステップ(a)のサンプルは30.程度で15分から30分間前培養される)。
40.程度へのC.。
C。
67. クレーム62の方法(そこではステップ(b)の中の反応は解決を止める有機相の追加によって止められる)。
68. クレーム62の方法(そこでは攪拌と遠心分離により、ステップ(c)の中のサンプルは分離される)。
69. クレーム62の方法(そこではステップ(c)の製品は液体の液体の分離によってサンプルから分けられる)。
70. クレーム62の方法(そこではひらめきを数えることにより、ステップ(d)の中の分裂のレベルは決定される)。
71. 次のものを含む組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2酵素の抑制あるいはブロッキングからの抗炎症作用を発生することを生体外で測定する方法:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
72. 次のものを含む組換え型ヒトuteroglobinによる分泌のphopsholipase A.sub.2活動の抑制のための分析する分析方法:
(a) サンプルと連絡をとること、ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいること、(b)前述のサンプルへの導入するラベルが付けられた基板、(c)サンプルからの分離する製品、また(d)ひらめきを数えることによる分裂の決定するレベル。
73. 次のものを含むサンプル中の組換え型ヒトuteroglobinの性能を決定する分析方法:
(a) ホスホリパーゼA.sub.2を備えた組換えの人間uterogloblinを含んでいるサンプルと連絡をとって、(b)flourescentlyに導入することは、flourescenceによって前述のサンプルへの基板、(c)サンプルからの分離する裂かれていない基板および(d)決定する量の裂かれた基板にラベルを付けました。
74. クレーム73の方法(そこでは34.mu.M.に対してステップ(a)の中の組換え型ヒトuteroglobinのサンプルは34 nMの終末濃度をしている)。
75. クレーム73の方法(そこではステップ(a)のサンプルは40.程度に約30で約15〜30分間前培養される)。
C。
76. クレーム73の方法(そこではラベルがflourescentlyに付けられた基板は2-デカノイル-1-(O-(11-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-indac-である)(エン-3propionyl)アミノ)ウンデシル)-sn-glycero-3-phosphotidylcholine)(。)
77. クレーム73の方法(そこではステップ(b)の中の反応は解決を止める有機相の追加によって止められる)。
78. クレーム73の方法(100までステップ(c)1.mu.Lでは、そこでは止められた分析の.mu.Lは珪酸正常相HPLCカラムに直接載せられる)。
79. 次のものを含むフィブロネクチンへの組換え型ヒトuteroglobinの結合を生体外で測定する方法:
(a) 組換えの人間CC10-HRP共役を備えた人間のフィブロネクチンの組換えの破片との接触、フィブロネクチン破片への組換え型ヒトuteroglobinの結合を決定するために(b)分析を視覚化すること
80. 含む組換え型ヒトuteroglobinの清浄、(a)クレーム35のプロセス内の各ステップの中間物のとるサンプルおよび(b)プロセス中間物を分析することを決定する方法。
81. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物はSDS-PAGEによって分析される)。
82. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物はrhUG ELISAによって分析される)。
83. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物はLALによって分析される)。
84. クレーム80の方法(そこではプロセス中間物は蛋白質含有量のために分析される)。
85. クレーム35の精製された組換え型ヒトuteroglobinを含む製薬の構成。
86. 精製された組換え型ヒトuteroglobin、薬学的に受理可能なキャリアーあるいは希釈剤を含む製薬の構成。
87. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが組換え型ヒトuteroglobinの5%未満の総計を含んでいる、クレーム86の製薬の構成。
88. 前述の組換え型ヒトuteroglobinに95%以下の清浄がある、クレーム86の製薬の構成。
89. 前述の組換え型ヒトuteroglobinの内の菌体内毒素レベルが5未満のEU/mg rhUGを含む、クレーム86の製薬の構成。
90. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが塩化ナトリウム解決中である、クレーム86の製薬の構成。
91. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも4か月の間のC.。
92. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも6か月の間のC.。
93. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも9か月の間のC.。
94. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも12か月の間のC.。
95. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも15か月の間のC.。
96. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが4.程度で解決において安定している、クレーム86の製薬の構成。
少なくとも18か月の間のC.。
97. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも1か月のC.および60%の部屋湿度。
98. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも2か月の間のC.および60%の部屋湿度。
99. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも4か月の間のC.および60%の部屋湿度。
100. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが安定しているクレーム86の製薬の構成は、25.程度の解決です。
少なくとも7か月の間のC.および60%の部屋湿度。
101. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが哺乳動物に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
102. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが人間に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
103. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが気管内のチューブによって処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
104. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが未熟児に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
105. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが人工界面活性剤を受け取る患者に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
106. 前述の組換え型ヒトuteroglobinが呼吸困難中の患者に処理するのに安全な、クレーム86の製薬の構成。
添付書類Ｂ
（１２）特許協力条約（ＰＣＴ）の下に公開される国際出願
（１９）世界知的所有権機関国際事務局
（４３）国際公開日：２００９年１１月１９日
（１０）国際公開番号ＷＯ２００９／１４０２６９Ａ２
（５１）国際特許分類：未分類
（２１）国際出願番号：PCT/US2009/043613
（２２）国際出願日：２００９年５月１２日
（２５）出願の言語：英語
（２６）公開の言語：英語
（３０）優先権：61/052861 2008年5月13日 米国
（７１）出願人：クララッサンス，インコーポレイテッド；アメリカ合衆国，メリーランド州 ２０８５０，ロックビル，グレート セネカ ハイウェイ ９７００
（７２）（７５）発明者；及び発明者／出願人（米国）：ピロン，アプリーレ エル．；アメリカ合衆国，メリーランド州 ２０８７４，ジャーマンタウン，マナー ストーン ドライブ １３３２８
（７４）代理人：エヴァンズ，バリーら（クレイマー・レヴィン・ナフタリス＆フランケルＬＬＰ）；アメリカ合衆国，ニューヨーク州 １００３６，ニューヨーク，アヴェニュー オブ アメリカ １１７７
（５４）発明の名称：鼻性鼻炎の治療に使用するための組換えヒトＣＣ１０およびその組成物
（５７）要約
本発明は、全体として、鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープの治療における治療薬として使用される組換えヒトウテログロビンとしても知られる組換えヒトＣＣ１０（rhCC10）の使用に関する。詳細には、本発明は、上記の状態を安全かつ効果的に治療するために投与することができるｒｈＣＣ１０の臨界用量範囲および鼻腔内経路の投与を広く含む方法を提供する。本発明は、ヒトへのｒｈＣＣ１０の投与に有用な組成物をさらに提供する。
［発明の名称］鼻性鼻炎の治療に使用するための組換えヒトＣＣ１０およびその組成物
［技術分野］
［０００１］
関連文献の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２００８年５月１３日に出願した米国仮特許出願第６１／０５２，８６１号の利益および優先権を主張するものである。
［０００２］
本発明は、患者の鼻道の空気の流れの障害を減少させ、副鼻腔感染を一掃し、および副鼻腔の痛みを軽減する方法に関する。詳細には、本発明は、患者の鼻性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻ポリープを治療する方法ならびにこれらの方法に有用な組成物に関する。より詳細には、本発明は、鼻腔内投与される組換えヒトＣＣ１０を用いた上記の治療方法およびこれらの治療方法に有用な組換えヒトＣＣ１０の組成物に関する。
［背景技術］
［０００３］
クララ細胞「１０ｋＤａ」タンパク質（ＣＣ１０）またはウテログロビン（ＵＧ）は、いくつかの粘膜上皮および上皮起源の他の器官によって産生される小さいホモ二量体の分泌タンパク質である（Mukherjee、1999）。ＣＣ１０は、７０のアミノ酸残基の２つの同一のサブユニットからなり、各サブユニットは、Ｃｙｓ３と６９’との間および３’と６９との間の２つのジスルフィド結合によって逆平行方向に接合された「４つのヘリックスバンドル」二次構造モチーフを備えている（Matthews、1994; Morize、1997）。２つのジスルフィド結合を含むホモ二量体は、その主要な形態である細胞外活性型と思われる。ヒトでは、肺がＣＣ１０の産生の主な部位であり、いくつかの他の器官が、このタンパク質をコードするｍＲＮＡを少量合成する（Singh、1987; Sandmoller、1994）。ＣＣ１０は、他のタンパク質、受容体、および細胞型との様々な相互作用について特徴が明らかにされてきた抗炎症性の免疫調節タンパク質である（Mukherjee、2007、Mukherjee、1999、およびPilon、2000を参照）。低レベルのＣＣ１０タンパク質またはｍＲＮＡが、喘息（Lensmar、2000; Shijubo、1999; Van Vyve、1995）、肺炎（Nomori、1995）、閉塞性細気管支炎（Nord、2002）、サルコイドーシス（Shijubo、2000）、ならびに再発性副鼻腔炎および鼻ポリープを伴う慢性鼻炎の患者（Liu, 2004）を含むある程度の炎症によって特徴付けられた多数の臨床症状の様々な組織および流体試料で見出されている。肺上皮細胞、すなわち内因性ＣＣ１０の体内の主な供給源は、これらの症状で悪影響を受け、消耗し、または除去さえされる場合も多い（Shijubo、1999）。実際、ＣＣ１０は、特定のセットの非繊毛呼吸上皮細胞および関連構造の発生に必要な自己分泌および／または内分泌であると思われる（Castro、2000）。したがって、ＣＣ１０の欠乏が、炎症および／または症状の原因または結果であるかが未だに分かっていない。
［０００４］
鼻道内の空気の流れの障害、ならびに副鼻腔の痛みおよび圧迫感は、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻ポリープに苦しんでいるヒトにおける重大な病的状態の原因であることが知られている。鼻性鼻炎は、鼻咽頭腔（nasopharygeal cavity）における鼻道および副鼻腔の炎症である。アレルギー性と非アレルギー性の２種類の鼻炎が存在する。非アレルギー性鼻炎は、ウイルス、細菌、または他の感染、吸入した化学種または他の刺激物への曝露によるものであり、特発性の場合もあるが、アレルギー性鼻炎は、吸入したアレルゲンへの曝露によるものである。アレルギー性鼻炎は、樹木や草の花粉に対するアレルギーなどの季節性であるか、またはイエダニや一般的なカビに対するアレルギーなどの通年性である。鼻炎は、数時間、数日、または数週間に渡る痒み、くしゃみ、および鼻汁による軽度の季節性の不快感から、再発性の細菌感染に関連する場合が多い、痛みを伴う消耗性の慢性副鼻腔の炎症まで重症度に幅がある。細菌感染の存在下での慢性副鼻腔の炎症は、時には慢性副鼻腔炎（「ＣＲＳ」）と呼ばれることもある。ＣＲＳは、気道上皮および副鼻腔組織の不可逆性リモデリングおよび瘢痕をもたらす。鼻組織のこれらの永久変化は、ウイルスおよび細菌の両方の感染と戦う能力の低下ならびに吸入したアレルゲンおよび刺激物を排除する能力の低下により、さらに重い炎症反応、さらに深刻なリモデリングおよび線維症、さらに重度または持続的な感染が起こる悪循環をもたらす。理論的には、炎症は、感染がなければ可逆的であり、刺激物、病原体、またはアレルゲンが局所組織から除去されるとすぐに消失するはずである。したがって、季節性または軽度の鼻炎からＣＲＳへの移行は、通年性アレルゲンへの慢性曝露および／または炎症を起こした鼻および副鼻腔の組織の再発性細菌感染に大きく起因し、元の鼻炎の刺激（アレルゲンまたは刺激物）が無くなって長い時間が経過しても感染が持続する。実際、慢性鼻炎をもたらす通年性アレルギーの患者は、炎症反応がアレルゲン−刺激反応から感染−刺激反応に移行すると、再発性細菌感染（副鼻腔炎）に罹患する場合が多い。これらは、重度の持続性鼻副鼻腔炎ＣＲＳ疾患に罹患した、最も重度の病的状態の患者である。慢性鼻炎は、アレルギー性または非アレルギー性にかかわらず、呼吸を障害し、睡眠を妨げ、そして繰り返される細菌性副鼻腔感染に罹りやすくする鼻道の過度の粘液の産生および腫れを引き起こす。副鼻腔の痛みおよび圧迫感は、この疾患の重大な病的状態を引き起こす。細菌感染は、急性または慢性にかかわらず、これらの症状を悪化させる。最も重度の場合、鼻ポリープが、鼻の気道で成長し、鼻の気道を徐々に塞ぐ。これらのポリープは、副鼻腔切除手術によってのみ除去することができる副鼻腔組織の非悪性増殖物である。鼻ポリープの患者は、除去するたびにポリープが再び成長して、定期的に副鼻腔切除術を受けなければならない場合もある。
［０００５］
しかし、鼻ポリープの有るまたは無い鼻炎、特に慢性鼻炎および鼻副鼻腔炎の患者ならびに慢性または再発性細菌性副鼻腔感染の患者において、ｒｈＣＣ１０が炎症を緩和できるか否か、およびその用量は解明されていなかった。実際、以下に示すように、近年の研究は、既知の一般的に使用されている用量では、ｒｈＣＣ１０が有効でないことを示している。 ［０００６］ 季節性アレルギーによる鼻の炎症および鼻炎を抑制する鼻腔内のｒｈＣＣ１０の効果を評価するための近年の第２相臨床試験では、ｒｈＣＣ１０の治療により、プラセボと比較して、６つの有効性指標の１つで症状の有意な悪化がもたらされた（Widegrenら、2009）。残りの５つの有効性指標については、ｒｈＣＣ１０とプラセボとの間に違いがなかったが、すべてはプラセボが優れている傾向にあった。ｒｈＣＣ１０は、鼻吸引のピークの流れの改善（増加）および空気アレルゲンの投与によって引き起こされる鼻漏の緩和においてプラセボよりも劣っていた。表１は、各治療期間の最後の３日間（５日目〜７日目）の間に測定された、プラセボを摂取した患者の結果に対するｒｈＣＣ１０を摂取した同じ患者の結果の比較を示している。
［０００７］
［０００８］
この概念実証試験は、季節性アレルギー性鼻炎のこの鼻アレルゲン曝露モデルにおいて、７日間に渡って１日１回投与されたｒｈＣＣ１０の全体的な有効性を実証することに失敗した。２００μＬに溶解した１．１ｍｇのｒｈＣＣ１０の１日１回の鼻腔内投与は、プラセボと比較して、アレルゲン誘導性の朝の症状、曝露後の症状、または晩の症状に良い影響を与えなかった。高いＰＮＩＦは、より多くの空気の流れを反映し、低いＰＮＩＦは、制限された空気の流れを示す。朝および晩のＰＮＩＦは、ｒｈＣＣ１０によって影響されなかったが、曝露後のＰＮＩＦは、プラセボと比較してｒｈＣＣ１０の治療によりやや減少したが、この減少は統計的有意ではなかった。プラセボ群で達した症状のスコアおよびＰＮＩＦのレベルは、このモデルで経時的に記録した値に非常に近かった。好酸球陽イオンタンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、およびα２−マクログロブリンのレベルを含む鼻洗浄液中の炎症マーカーも同様であり、ｒｈＣＣ１０は、プラセボと比較してこれらのマーカーの減少を一切仲介しなかった。このモデルでは、コルチコステロイドが、朝の症状、曝露後の症状、および晩の症状ならびに鼻洗浄液中の炎症マーカー（Ahlstrom-Emanuelssonら、2002 & 2007）を抑制し、抗ヒスタミン剤が、曝露後の症状のみを軽減すること（Korsgrenら、2007）が実証された。したがって、この用量、投与計画、鼻腔内投与の量およびスプレー方法を用いると、ｒｈＣＣ１０は、６つすべての臨床結果の指標または鼻洗浄液中の３つすべての炎症マーカーにおける抗アレルギー、抗炎症効果を示さなかった。
［０００９］
現在、殆どの鼻性鼻炎および鼻副鼻腔炎は、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、非ステロイド系抗炎症薬（「NSAIDS」）および様々な非薬理的鼻用スプレー、および洗浄液などの市販薬および処方薬で治療される。クロム点鼻薬、口腔用抗ヒスタミン剤、およびロイコトリエン受容体拮抗薬は、症状を治療するが、２、３時間の症状の除去にすぎない。オキシメタゾリン点鼻薬は、鼻道の開存に非常に有効であるが、過度の使用は、「リバウンド効果」をもたらし、有効性が急速に低下して症状が悪化する。これらの種類の薬物の副作用には、特に、咽頭炎、鼻組織の乾燥、および便秘が含まれる。
［００１０］
さらに、副鼻腔炎は、典型的には口腔用の抗生物質で治療される。抗生物質は、副作用の弱いものから強いものまであり、副作用には、便秘や他の消化の問題、頭痛、めまい、発疹、肝臓毒性、腎臓毒性、および膀胱毒性、筋肉および関節の痛みなどが含まれ得る。また、抗生物質は、特に、抗生物質を繰り返し摂取しなければならず、最終的にその抗生物質に対してアレルギーを持つようになる再発性副鼻腔炎の患者で過敏性反応を引き起こすことがある。抗生物質に対する過敏性反応は、アレルギーの兆候や前兆なしに起こることがあり、突然、致命的となることがある。
［００１１］
重度および／または慢性の鼻副鼻腔炎疾患の場合、医師は、現在、炎症を軽減するが数週間または数カ月の連続的な治療後に有効性が失われる場合が多い鼻用のコルチコステロイドを処方する。口腔用のコルチコステロイドもまた、有効であるが、長期に渡って使用すると多数の望ましくない副作用が起きる。例えば、成人では、高血圧症および発作を含む心血管合併症は、コルチコステロイド使用の主な副作用である。小児では、コルチコステロイドは、正常な成長および発達を阻害する。すべての患者で、コルチコステロイドは、患者の免疫機能を低下させ、あらゆる種類の感染（細菌、ウイルス、真菌など）に罹りやすくする。したがって、安全が、鼻性鼻炎、特に慢性副鼻腔炎、鼻ポリープ、慢性または再発性細菌性副鼻腔感染、それらに関連した病的状態、および他の同様の状態を治療、予防、または治癒するために使用される薬物および複合薬の選択における主な考慮事項である。
［００１２］
鼻炎、副鼻腔炎、および鼻副鼻腔炎を治療するために薬物を鼻腔内投与することができるいくつかの製剤、装置、および方法が存在する。鼻道および副鼻腔への薬物の局所鼻腔内投与の１つの方法では、スプレーボトルまたはスプレーポンプ装置内の液体製剤が使用され、液体製剤が小さい開口に通過されてエアロゾルに変換され、各鼻孔内の鼻腔の前側部分にスプレーされる。
［００１３］
上述の装置によって生成される粒度は、鼻咽頭腔（nasopharygeal cavity）の内側を覆っている鼻粘膜への薬物の送達および局所堆積を最大化する５μｍ〜１０μｍの範囲である。鼻粘膜は、鼻咽頭腔の鼻道および副鼻腔における湿った上皮の上に位置する通常は薄い粘膜の層からなる。鼻孔内にスプレーされる５μｍ〜１０μｍの粒子の殆どが、鼻咽頭腔の前側部分の非繊毛上皮に衝当する。鼻粘膜の衝当部位に堆積されると、薬物は、粘膜全体に行き渡り、薬物および粘膜が飲み込まれる咽頭に向かって押す鼻咽頭腔の前側３分の２に位置する繊毛および繊毛上皮細胞の作用によって様々な速度で除去され得る。鼻腔内に堆積される薬物の局所作用は、送達される粒度、製剤、および除去速度に左右される。これらの因子は、局所送達の有効性、ならびに鼻咽頭粘膜および上皮が薬物に曝露されてから除去されるまでの時間の長さに影響を与える。
［００１４］
鼻腔内投与される薬物の局所作用はまた、送達時の鼻粘膜および組織の状態に左右される。例えば、鼻道が厚い粘膜によって塞がれている場合は、薬物の局所送達は、不可能ではないにしても非常に困難である。
［００１５］
したがって、重度の副作用なしに、長期に渡って気道の閉塞、副鼻腔の痛みおよび不快感を緩和する作用物質およびその作用物質の正しい用量を見出すことが重要な課題である。したがって、より効果的または持続的な新規の作用物質およびその製剤、ならびに特に慢性疾患の患者へのその投与および投与計画の要求が存在する。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
［００１６］
上記は、本発明によって達成される目的の包括的なリストを提供する。
［００１７］
本発明の主な目的は、ｒｈＣＣ１０を用いて、鼻ポリープの有るまたは無い患者の鼻性鼻炎、副鼻腔炎、特に慢性鼻炎および鼻副鼻腔炎を治療、治癒、または予防することにある。
［００１８］
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０を用いて、慢性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻副鼻腔炎に関連した痛みおよび副鼻腔の圧迫感を緩和することにある。
［００１９］
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０を用いて、鼻性鼻炎または副鼻腔炎の患者がより良質の睡眠を得ることを可能にすることにある。
［００２０］
本発明のさらなる目的は、鼻腔内滴下注入、鼻洗浄によって、またはスプレー装置の使用を伴う鼻腔内エアロゾルとして患者にｒｈＣＣ１０を投与することにある。
［００２１］
本発明のさらなる目的は、上記の目的を達成し、かつ免疫応答を有意に抑制しない、そして有害事象の頻度または重症度を高めない、安全で忍容性が良好なｒｈＣＣ１０の有効量の範囲を提供することにある。
［００２２］
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０をエアロゾル、ゲル、または液体として鼻咽頭腔（nasopharygeal cavity）に効果的に投与できる薬物−装置組合せを提供することにある。
［００２３］
本発明のさらなる目的は、使い捨てスワブアプリケータ（swab applicator）を用いた、局所投与および持続放出のためのゲルまたはクリームでの適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２４］
本発明のさらなる目的は、スプレーポンプまたはスクイーズボトルを用いた、局所投与および堆積のための５μｍ〜１０μｍの粒度範囲のエアロゾルとしての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２５］
本発明のさらなる目的は、複数回使用されるスプレーポンプディスペンサー、定量吸入器（ＭＤＩ）、またはスクイーズボトル装置を用いた、局所投与および堆積のための５μｍ〜１０μｍの粒度範囲のエアロゾルとしての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２６］
本発明のさらなる目的は、１回または複数回使用されるスプレーポンプディスペンサー、定量吸入器（ＭＤＩ）、またはスクイーズボトル装置を用いた、経肺投与および堆積のための１μｍ〜５μｍの粒度範囲のエアロゾルとしての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２７］
本発明のさらなる目的は、単回または多回投与用シリンジ装置内の注入物としての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２８］
本発明のさらなる目的は、「ネティポット（neti pot）」または同様の重力流洗浄装置を用いた鼻洗浄液中の注入物としての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２９］
本発明のさらなる目的は、鼻咽頭腔における他の薬物の投与部位での局所炎症反応によって引き起こされる痛み、刺激、および不快感の緩和のために、薬理学的に許容される鼻用賦形剤としてｒｈＣＣ１０自体を提供することにある。
［００３０］
本発明のさらなる目的は、鼻咽頭腔に投与される、または鼻咽頭腔を介して投与される他の薬物のバイオアベイラビリティを促進するために薬理学的に許容される鼻用賦形剤としてｒｈＣＣ１０自体を提供することにある。
［００３１］
本発明のさらなる目的は、鼻腔内投与のために他の薬物との複合製剤中の活性成分としてｒｈＣＣ１０を提供することにある。
［００３２］
用語「薬理学的に許容される」は、有害効果をもたらさないか、または既知であって規制当局が許容する、または許容できる有害効果をもたらす製剤または賦形剤の組合せを特徴付けることを意図する。
［課題を解決するための手段］
［００３３］
これらおよび他の目的、特徴、および利点は、鼻ポリープを伴うまたは伴わない鼻性鼻炎、副鼻腔炎、鼻副鼻腔炎、およびＣＲＳを治療、治癒、または予防するために適切な間隔での所定の用量範囲または単回投与でｒｈＣＣ１０を投与することによって達成される。さらに、慢性鼻炎患者に対して、ｒｈＣＣ１０は、適切な間隔での所定の用量範囲または単回投与で投与される場合に慢性鼻炎の治療、治癒、または予防にさらに大きな利点を提供する。したがって、鼻の炎症、鼻炎、鼻性鼻炎、慢性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻副鼻腔炎の治癒、治療、または予防に効果がないと思われたｒｈＣＣ１０が、驚くべきことに、実際は本発明に従って使用すると有効であることを見出した。
［００３４］
これらおよび他の目的、特徴、および利点はまた、副鼻腔の痛みおよび圧迫感、副鼻腔の不快感による不眠、慢性鼻炎、鼻副鼻腔炎、および鼻ポリープの成長または再成長の１つ以上を患者が示す場合、適切な間隔での所定の用量範囲または単回投与でｒｈＣＣ１０を投与することによって達成される。
［００３５］
これらおよび他の目的、特徴、および利点はまた、血小板の凝集を阻害しない、風邪またはインフルエンザなどにおける免疫応答を抑制しない、またはあらゆる有害事象の頻度もしくは重症度を増加させないように、ｒｈＣＣ１０を投与することによって達成される。
［００３６］
本発明の特定の態様では、ｒｈＣＣ１０は、重度の鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、特に慢性副鼻腔炎、および／または鼻ポリープを治療、治癒、または予防するために、１日に１．５μｇ〜１．１ｍｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された単回投与で、または１日に合計するとこの用量範囲を達成する多回投与で鼻腔内に投与される。別の態様では、１日に１．５μｇ〜１．１ｍｇの範囲のｒｈＣＣ１０の鼻腔内量又は各鼻孔間でほぼ等分された量を、重度の鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、再発性副鼻腔炎を伴う慢性鼻炎、特に鼻副鼻腔炎、および／または鼻ポリープを治療、治癒、または予防するために適切な間隔で繰り返すことができる。本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、７日間、１０日間、１４日間、または２１日間連続して毎日鼻腔内投与される。
［００３７］
本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約８時間の間隔で１日に３回投与される。本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、１日に０．７５μｇ〜６５０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約１２時間の間隔で１日に２回投与される。
［００３８］
本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、まず、３日間、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約８時間の間隔で１日に３回、次いで、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約１２時間の間隔で１日に２回、次いで、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で１日に１回、漸減式に投与される。本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、上記の態様に従うが、合計して約１５ｎｇ〜約１０ｍｇの範囲となる単回または多回投与で鼻腔内投与される。
［００３９］
鼻腔内投与であるかないかにかかわらず、ｒｈＣＣ１０は、限定されるものではないが、鼻腔内または全身コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤ（アスピリン、COX-2阻害剤を含む）、鎮痛薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌剤、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、クロム溶液、鼻洗浄、生理食塩水鼻洗浄、およびホメオパシー療法を含む他の標準的な鼻炎および副鼻腔炎の治療の前または後に、これらの治療と組み合わせて、または単独で投与することができる。
［００４０］
別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、適用部位における望ましくない局所炎症を引き起こすことがある、もしくは引き起こすことがない、または望ましくない局所炎症を他の方法で誘発する、もしくは誘発することがある他の薬物の鼻組織への局所送達または全身吸収のための局所鼻送達または適用を促進するために、賦形剤および／または局所抗炎症剤、および／または局所免疫抑制剤として用いることができる。したがって、ｒｈＣＣ１０は、鼻送達に関連した不快感を緩和または回避するために他の薬物の賦形剤として用いることができる。
［００４１］
別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、賦形剤として、または局所送達もしくは全身送達のために他の薬物の鼻腔内投与によって引き起こされる炎症を緩和するために用いることができる。
［００４２］
加えて、ｒｈＣＣ１０は、鼻への適用に適した粘度および鼻咽頭腔の局所分布プロフィールを得るために、水溶液、懸濁液（鼻用界面活性賦形剤を含む）、またはゲル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースを利用するヒドロゲルなど）として製剤することができる。同様に、ｒｈＣＣ１０は、抗生物質または他の抗菌剤、生理食塩水鼻洗浄、充血除去剤、粘液溶解薬、ＬＴＲＡ、β作動薬、気管支拡張剤など他の活性成分と組み合わせて製剤することができる。
［００４３］
別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、鼻用スプレー圧迫ボトル、定量吸入器、またはスプレーポンプ装置内に充填される水溶液として製剤される。さらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、鼻用シリンジ型適用装置、定量吸入器、または他の鼻用適用装置内に充填される界面活性剤の懸濁物質として製剤される。さらに、さらなる別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、ヒドロゲルまたは他の形態の人工粘液中に製剤され、１回の用量が、鼻腔内投与のために使い捨て鼻用スワブ装置に設けられる。
［発明を実施するための形態］
［００４４］
本発明は、鼻性鼻炎および副鼻腔炎、特に再発性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープを伴うヒトの慢性鼻性鼻炎を治療、治癒、または予防するためのｒｈＣＣ１０投与の臨界用量および時期に関する。ｒｈＣＣ１０は、好ましくは、それぞれが参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Ｅｘ．Ａ＆Ｂとして本明細書に添付された米国特許出願公開第２００３−０１０９４２９号および同第２００３−０２０７７９５号に記載されているプロセス、または医薬品グレード（FDAの要求を満たす）のｒｈＣＣ１０を生産する任意の他のプロセスによって得られる。本発明の実施形態のｒｈＣＣ１０は、他の鼻腔内、肺、または全身治療を用いて、用いずに、その前、またはその後で投与することができる。
［００４５］
用量
好ましくは、鼻性鼻炎、副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープの治療または予防では、ｒｈＣＣ１０は、各鼻孔に１日に１回〜３回を７日間〜１４日間、その後の１４日間は１日おきに、そしてその後は必要に応じて鼻腔内に投与される。より好ましくは、ｒｈＣＣ１０は、患者が副鼻腔の痛みおよび圧迫感を感じ始めたらすぐに投与される。
［００４６］
詳細を後述する所望の結果を達成するために、以下の実施形態で説明する投与方法について述べる。
［００４７］
一実施形態では、約１．５μｇ〜約１．５ｍｇの用量範囲に等しいｒｈＣＣ１０を単回または多回投与することができる。別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、毎日この用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、少なくとも連続７日間、毎日この用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、少なくとも連続１４日間、毎日この用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、連続して３０日間、１日おきにこの用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、連続して１０日間毎日、漸減する用量で投与することができ、この漸減する用量は、最初の３日間の各投与での高用量、次の３日間の各投与での中間用量、および最後の４日間の各投与での低用量を含む。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、１日に最大３回、約８時間毎に、この用量範囲または漸減する用量で投与することができる。
［００４８］
別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０の上記の用量を患者の鼻腔内に投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０の上記の用量を、鼻腔内滴下注入によって、または鼻道へのゲルもしくはクリームの堆積によってエアロゾルとして患者に投与することができる。さらなる実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、上記の方法に従って、経口もしくは鼻腔用の充血除去剤、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、粘液溶解薬、去痰薬、粘液抑制剤、界面活性剤、気管支拡張剤、血管収縮剤、副鼻腔鎮痛薬、または他の典型的な治療の前、最中、または後で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、上記の方法に従って、患者の鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、または鼻ポリープを治療または予防するために投与することができる。
［００４９］
ｒｈＣＣ１０の用量および上記の適用方法は、治療する疾患の重症度、患者の健康全体、および急性疾患または慢性疾患のいずれかが治療されるかによって１日１回、１日に２回以上、１日３回、１日おき、または漸減式に投与することができる。例えば、疾患の状態が重症であればあるほど、疾患を効果的に治療するためにはより多量のｒｈＣＣ１０が必要である。例えば、鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、または鼻ポリープの悪化を防止するための慢性疾患の維持療法の場合は、低用量が使用される。医師は、必要に応じて、患者の症状および治療に対する応答に基づいて、本発明の実施形態に記載されたパラメータおよび用量の範囲内で、用量、製剤、および適用方法を監視し調節することができることを理解されたい。
［００５０］
製剤
ｒｈＣＣ１０は、例えば、スプレーボトル、スプレーポンプ、または洗浄液内の液体製剤の使用によって、局所鼻上皮に直接適用すると最も効果的である。したがって、時には、ｒｈＣＣ１０を鼻上皮に効果的に適用する前に、即効性の局所粘液溶解薬、抗ヒスタミン剤、および／または充血除去剤、ならびに鼻道を開存させるための暖かい湿った空気の吸引、顔に温湿布をすること、および塩水での鼻の洗浄などの物理的な方法を使用する必要がある。
［００５１］
鼻腔内滴下注入は、液体製剤またはゲル製剤に含められたｒｈＣＣ１０を用いて達成できるｒｈＣＣ１０を投与する別の方法である。ゲル剤形は、１回分のｒｈＣＣ１０が綿棒で塗られる鼻局所領域にこのｒｈＣＣ１０が長く維持されることによって長期間に渡る良好な局所投与の利点を提供するが、液体剤形は、正常な鼻の排出動作による滴下注入後の部分的な飲み込みにより、大幅に短い局所曝露および少ない局所投与となり得る。しかし、「ネティポット」型の装置を用いた鼻洗浄による液体剤形の鼻腔内滴下注入は、ゲル製剤の局所適用よりも、投与量が、鼻組織および副鼻腔の広い面積に渡って迅速に行き渡るという利点を与える。
［００５２］
ｒｈＣＣ１０は、鼻腔内送達のためにいくつかの鼻用賦形剤と共に製剤化することができる。これらには、薬物のｐＨを調節する賦形剤、溶解性を維持するために薬物を緩衝する賦形剤、微生物の増殖および／または移動を防止するための防腐剤または強化防腐剤として作用する賦形剤、薬物の張度、溶解性、または粘度を調節する賦形剤、薬物の進入または浸透（全身送達）を促進する賦形剤、薬物の局所バイオアベイラビリティおよび半減期を変更する（粘度を増加させる）賦形剤、毒性を低減する賦形剤、不溶性薬物を懸濁する賦形剤、および製剤の味を変更する賦形剤が含まれる。表２は、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内製剤の例示的な賦形剤およびそれらの機能の限定目的ではないリストを含む。１つの賦形剤または賦形剤の組合せのいずれを用いても、鼻腔内投与用のｒｈＣＣ１０を製剤化することができる。
［００５３］
［００５４］
また、ｒｈＣＣ１０は、鼻腔内投与用に他の薬物、人工粘液、または他の活性成分と組み合わせて製剤することもできる。鼻腔内投与用にｒｈＣＣ１０と共に製剤できる薬物には、限定されるものではないが、局所または全身抗菌剤（抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤）、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、粘液溶解薬、去痰薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、気管支拡張剤、β２アドレナリン作動性受容体作動薬、局所作用血管収縮剤（例えば、オキシメタゾリン）、抗炎症剤、および鎮痛剤が含まれる。局所効果または全身効果を得るために鼻腔内投与用にｒｈＣＣ１０と共に製剤できるさらに他の薬剤には、抗炎症剤、β２アドレナリン作動性受容体作動薬、抗癌剤、血管新生阻害剤、抗線維化剤、免疫調節剤、ワクチン、代謝製剤、鎮痛薬、神経弛緩剤、麻酔薬、抑うつおよび他の精神病（メンタルヘルス）のための作用物質、依存抑制剤、ホメオパシー薬剤、漢方薬、ビタミン、およびミネラルなどが含まれる。
［００５５］
ｒｈＣＣ１０は、親水性および疎水性化学種、核酸および核酸類似体、タンパク質およびペプチド、糖質、脂質、およびリン脂質などを含め、殆どの反応しない化学種および薬物と混合可能である。セクレトグロビン（secretoglobin）は、上皮細胞における物質の輸送に大きく関与し、ｒｈＣＣ１０は、鼻道による他の薬物の送達を促進するのに理想的に適している。また、ｒｈＣＣ１０は、例えば、投与時に「灼熱感」を引き起こす化学療法剤および薬物などの他の薬物の投与部位での痛みを伴う局所的な鼻の応答を抑制する賦形剤として使用することができる、局所抗炎症剤として作用することができる。
［００５６］
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与に関連した薬効に関する重要なパラメータは、ｒｈＣＣ１０自体の濃度である。ｒｈＣＣ１０濃度の高すぎる（すなわち、２ｍｇ／ｍｌよりも高い）製剤は、上記の背景技術に記載されているように、臨床結果から分かるように効果ゼロまたは有害効果さえも示した。ｒｈＣＣ１０製剤は、５．６ｍｇ／ｍｌであり、患者の鼻孔に直接適用した（Widegrenら、2009）。逆に、ｒｈＣＣ１０の濃度が２５０μｇ／ｍｌ〜２６２μｇ／ｍｌである実施例４では、臨床上の利点が得られた。無関係の実験では、重度の低酸素症の早産のラムを、気管支内注入による投与によってｒｈＣＣ１０の５．５ｍｇ／ｍｌ製剤を用いて体重１ｋｇ当たり５ｍｇで処理すると、３／４の動物が、薬物投与の４時間以内に呼吸不全で死に、プラセボで処理した４匹の動物は１匹も死ななかった（未発表、Ikegami, M.、Cincinnati大学）。対照的に、ｒｈＣＣ１０の同じ製剤を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、挿管された早産のラムに気管支内注入によって投与すると、動物は、プラセボと比較して、薬物摂取による様々な利点を示した（Miller、2005a、2005b、2007; Shashikant、2005）。どの特定の理論に拘束されることなく、この現象は、ｒｈＣＣ１０の極めて広範囲の水和に関連し得る。すなわち、ＣＣ１０に配位される水分子の数は平均的なタンパク質よりも多い。粘膜および他の体液への高濃度のＣＣ１０の投与は、「サブトラクション」、すなわち局所流体からの水分の喪失をもたらし、これにより局所脱水、および局所生物学的環境における物質間の平衡における有害な混乱が起こる。別法または前述の内容と組み合わせて、ＣＣ１０の急性の局所的な過剰は、ＣＣ１０の存在に対する細胞および組織の脱感作をもたらすことがあり、薬理効果が向上するのではなく薬物の有効性が効果的に減少する。場合によっては、特定の代謝産物またはメディエーターに関与する経路または一連の経路のフィードバック阻害が、実際に、低用量の代謝産物またはメディエーターで観察され得る逆効果（活性化対抑制および逆も同様）となり得る。鼻腔内投与、気管内投与、または他の局所／局所性投与によって鼻および他の粘膜表面に投与されるｒｈＣＣ１０製剤のカットオフは、２ｍｇ／ｍｌであり、これよりも高いと、ｒｈＣＣ１０が効果的ではなく有害とさえなり得る。
［００５７］
以下の詳細な実施例は、実施形態の例示である。当然のことながら、これらは、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］
［００５８］
アレルギー性鼻炎患者に対するｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
ｒｈＣＣ１０は、それぞれが参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３−０１０９４２９号および同第２００３−０２０７７９５号に記載されているプロセス（Claragen, Inc.、College Park、MD）によって大腸菌で生産し、精製した。試験用のタンパク質は、組換えヒトＣＣ１０ホモ二量体の９８％を超える純度の溶液として用意した。各バッチの生物学的活性を、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００２−０１６９１０８号に記載されている独自の分泌ＰＬＡ２阻害アッセイを用いて比較した。
［００５９］
鼻アレルゲン曝露モデルでは、既知のアレルゲンに対する既知の季節性アレルギーの患者に、連続して７日間、鼻咽頭腔内にアレルゲン溶液を滴下注入した。安全上のリスクを最小限にするために、滴下注入するアレルゲンの量を、７日間の曝露期間に渡って４つの主な結果のパラメータを用いて定量される軽度の局所アレルギー応答を誘発するように各患者で注意深く調整した。これらのパラメータには、（１）鼻の症状の全スコア、（２）ピーク鼻呼気流、（３）鼻洗浄液中のバイオマーカーの定量、および（４）ヒスタミン曝露に対する応答が含まれる。
［００６０］
樹木花粉に対して季節性アレルギーの合計３５人の患者に対して、スウェーデンのＬｕｎｄにあるＬｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌにて、ｒｈＣＣ１０対プラセボのプラセボ対照無作為化盲交差鼻アレルゲン曝露試験（placebo-controlled, randomized, blinded, cross-over nasal allergen challenge study）を行った。この試験の目的は、アレルギー性鼻炎の患者における組換えヒトＣｌａｒａ Ｃｅｌｌ １０ｋＤａ（ｒｈＣＣ１０）タンパク質の鼻腔内投与の安全性、許容性、および効果を決定することにあった。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与が、鼻アレルゲン曝露によって引き起こされる鼻性鼻炎の症状を緩和できるか否かを調べることである。
［００６１］
ｒｈＣＣ１０の非存在下での鼻アレルゲン曝露に対する患者の応答をまず測定し、基準データを記録した。合計３９人の患者を、試験に含めるためにスクリーニングした。すべての患者は、年齢が１８〜５０歳で、肥満指数（BMI）が１８ｋｇ／ｍ２〜２８ｋｇ／ｍ２であり、少なくとも過去２年の間、カバノキおよび／またはオオアワガエリ花粉誘発季節性アレルギー性鼻炎であり、その他は健康な男性対象であった。各患者は、少なくとも１つの空気アレルゲン（例えば、オオアワガエリまたはカバノキ花粉）に対して特異的ＩｇＥが上昇するか、または少なくとも１つの皮膚プリックテスト（SPT）で陽性であり、各患者は、アレルゲンによって引き起こされた症状を示し、対応する特異的ＩｇＥの上昇または陽性ＳＰＴを示した。対象がネコおよびイヌに曝露されない条件下でのネコおよび／またはイヌ感受性を除く、通年性アレルギー（例えば、慢性鼻炎）を持つ場合、これらの対象を試験から除外した。また、対象は、試験の開始前の２週間の間に他の鼻疾患（例えば、鼻の構造的な異常、鼻副鼻腔炎、または鼻ポリープ）または任意の上気道感染がある場合、登録の４週間以内に、グルココルチコステロイド、β２アドレナリン作動性受容体作動薬、もしくは任意の他の抗炎症性薬物の鼻腔内、吸引、もしくは全身投与で治療を受けている、または治療を既に受けた場合、あるいは登録前の過去１カ月以内に細菌もしくは真菌感染している場合は除外した。患者の特徴および基準データの要約を表２に示す。
［００６２］
［００６３］
患者を、まず樹木花粉アレルゲンに対する応答についてスクリーニングして、個々の患者の応答に基づいて調整される曝露期間中に投与されるアレルゲンの量を決定した。耳、鼻、および咽の検査ならびにバイタルサインを含む物理的検査を行った。次いで、少なくとも５回のくしゃみおよび／または鼻詰まりまたは鼻漏の症状のいずれかについて０〜３のスケールに対して少なくとも２の症状スコアをもたらすアレルゲン用量を確立するために鼻アレルゲン曝露を行った。鼻漏は、鼻粘膜からの分泌物と定義され、典型的には水様である。すべてのアレルゲン投与は、病院スタッフによってクリニックで行われた。各個人に対して、症状を引き起こす許容される繰り返し可能なアレルゲン用量を鼻の連続曝露について推定するために、すべての対象で滴定法を行った。皮膚プリックテストで最も有意な膨疹反応を誘発するアレルゲン（カバノキまたはオオアワガエリ花粉）を、鼻用滴定のために選択した。増加する用量のアレルゲン（Alutard（登録商標）、ALK、Denmark）を、鼻スプレー装置を用いて１０分間隔で投与した。スプレー装置は、１回の作動で１００μｌを送達し、一吹きが、各鼻孔内にスプレーされると、１鼻孔当たり１００、３００、１０００、および３０００ＳＱ単位の有効量となった。この操作は、患者が、少なくとも５回のくしゃみおよび／または鼻詰まりまたは鼻水の症状のいずれかについて０〜３のスケールに対して少なくとも２以上の症状スコアで急性に反応するまで続けた。この効果をもたらせるアレルゲン用量を、第１および第２の治療期間中の毎日のアレルゲン連続曝露のために選択した（例えば、コホート）。各患者に投与されるアレルゲンの種類および量を表３に示す。
［００６４］
［００６５］
この試験は、花粉のない冬場に行われた。試験は、医師および患者がｒｈＣＣ１０またはプラセボを摂取したか否かを知らないという点で盲検およびプラセボ対照試験であった。試験は、患者がｒｈＣＣ１０治療群またはプラセボ治療群のいずれかに無作為に割り当てられたという点で無作為であった。試験は、各患者が、３〜５週間のウォッシュアウト期間によって分離された２つの７日のコホートで治療されたという点で交差設計であった。各患者は、ｒｈＣＣ１０を摂取したコホートおよびプラセボを摂取したコホートを構成した。患者は、治療期間中の患者の鼻および副鼻腔の不快感を緩和するために、必要に応じて、いくつかの種類の非ステロイド系の薬物を摂取することを許可された。鎮痛薬（アスピリンは含むがイブプロフェンは含まない）および抗生物質は許可され、重度のアレルギー症状の場合は、Ｃｌａｒｉｔｙｎ（登録商標）（Claritin（商標））１０ｍｇが許可され、クリニックによって提供された。
［００６６］
試験作用物質、プラセボ、およびｒｈＣＣ１０を、クリニックの医師および患者が識別できるように数字が貼られた１０ｍＬガラスバイアルに入れた。鍵は、病院の薬局に保管され、医師が患者を治療するためにバイアルの情報が必要な有害事象の場合にのみ、医師に各バイアルの識別が知らされた。Ｖａｌｏｉｓ Ｐｈａｒｍ（France）によって製造された使い捨て医療用鼻スプレー装置を、投与の直前に臨床現場で１０ｍＬバイアルに接続した。この装置は、ポンプ（VP7/100S 18PH）、アクチュエータ（PR147）、およびキャップ（B25/A）から構成されていた。プラセボは、滅菌した非緩衝０．９％塩化ナトリウムから構成されていた。ｒｈＣＣ１０は、濃度５．６ｍｇ／ｍｌの滅菌非緩衝０．９％塩化ナトリウムに溶解した。プラセボおよびｒｈＣＣ１０は共に、容易に識別できない透明で無色無臭の液体とした。各治療期間中の連続した合計７日間の治療で毎日、総量１００μｌのプラセボまたはｒｈＣＣ１０を、各患者の各鼻孔に投与した。すべてのアレルゲンおよび試験作用物質の投与は、病院スタッフによってクリニックで行われた。ｒｈＣＣ１０の１日の合計用量は、１日当たり１．１ｍｇであり、各鼻孔に１００μｌの用量、または１鼻孔当たり０．５６ｍｇでエアロゾルスプレーとして単回投与した。ｒｈＣＣ１０は、アレルゲンの投与の１５分〜３０分前に投与した。
［００６７］
これらの結果を以下の通り測定した。
［００６８］
１．鼻症状の合計スコア（TNSS）
鼻詰まり、鼻漏、およびくしゃみ／鼻の痒みを含む鼻の症状は、朝の試験薬物の投与の前に毎日患者によって得点が付けられ、記録された（前の１２時間の間の症状を格付けしたが、試験薬物投与後の最初の１５分は可能な症状を無視した）。ＴＮＳＳは、各アレルゲンの曝露の１５分後に記録した。加えて、症状は、晩に得点を付けた（投与直後の症状を除く、前の１２時間の間の症状を再び反映した）。症状には、０＝症状無し、１＝軽度の症状、２＝中程度の症状、３＝重度の症状に基づいてそれぞれ得点を付けた。これらのスコアを加えて、０〜９の範囲の各時点の合計スコアを得た。各アレルゲン曝露期間の最後の３日の朝の記録、アレルゲン曝露の１０分後の記録、および晩の記録の鼻症状の平均スコアを統計分析に用いた。
［００６９］
２．ピーク鼻呼気流（PNIF）
ＰＮＩＦは、朝の薬物摂取前、アレルゲン曝露の１０分後、および晩に患者が測定した。測定は、顔面マスクを備えたＰＩＦメータ（Clements-Clarke、Harlow、U.K.）を用いて行った。患者は、測定の際は起立し、両手でマスクを顔にぴったりと取り付け、口を閉じて鼻から呼吸した。患者は、値を記録し、装置を３０の読みに戻し、この手順をさらに２回繰り返した。この３回の測定の最も高い値を毎日記録した。鼻の症状のスコアと同様に、各アレルゲン曝露期間の最後の３日の各時点のＰＮＩＦの記録を、統計分析に用いた。
［実施例２］
［００７０］
薬物の同時投与
プラセボ群およびｒｈＣＣ１０群の両方の合計１０人の患者が、プロトコールの間に患者の不快感およびアレルギー症状を治療するために救急薬が必要であった。表５から分かるように、抗炎症剤、アレルギー薬、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド（Flutide）、およびオキシメタゾリンを含む、鼻腔内の症状を緩和するための様々な局所および全身薬物が摂取された。
［００７１］
［００７２］
ロラタジンは、鎮痛作用のない抗ヒスタミン剤であり、パラセタモールは、鎮痛剤であり、解熱フルチカゾンは、コルチコステロイド抗炎症剤であり、オキシメタゾリンは、選択性α−１作用薬および部分α−２作用薬局所充血除去剤（selective alpha-1 agonist and partial alpha-2 agonist topical decongestant）であり、エバスチンは、鎮痛作用のないＨ１抗ヒスタミン剤である。これらの患者は、ｒｈＣＣ１０と同時のこれらの他の作用物質の同時投与の結果として有意なＡＥを一切受けなかったため、これらの薬物とｒｈＣＣ１０の併用は、安全であり、薬理学的に許容される。
［実施例３］
［００７３］
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与の安全性および忍容性
この概念の実証のための安全性評価の一部として、ヒト有害事象（AE）および重度の有害事象（SAE）におけるｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与を監視し、記録し、報告した。臨床研究者は、ＡＥまたはＳＡＥの基準および定義を満たす事象の検出および文書化に対して責任を有した。ＡＥは、有害事象が薬物と因果関係にあると見なされるか否かについての試験薬物の使用に関連した一時的な臨床試験または対象におけるあらゆる有害な医療事態である。この試験では、事前に存在する状態（すなわち、ＡＥ記録期間が開始される前に存在し、かつ事前の治療の医療履歴／物理的な試験形態に書き留められる障害）は、この状態が悪化するか、またはＡＥ記録期間中の発症の頻度が増加しないかぎり、ＡＥとして記録しなかった。重度の有害事象は、任意の用量で、（１）死に至る、（２）生命を脅かす、（３）入院または既に入院している場合は入院の長期化を必要とする、（４）身体障害／就労不能になる、（５）先天異常／出産異常である、（６）重要な他の医療事象（ＯＭＥ）である、および（７）グレード４のすべての検査所見であるあらゆる有害医療事態と定義した。試験薬物の最初の用量を摂取したときに始まり、試験薬物の停止の２週間後に終了するＡＥ記録期間は通院する（追跡調査来院）。
［００７４］
ＳＡＥは、試験中に起きなかった。全体として、合計１５の有害事象が、プラセボ治療群およびｒｈＣＣ１０治療群の両方の対象で報告された。すべてのＡＥは、軽度の重症度と格付けされた。各群では、１５のＡＥのうちの１１が、試験薬物に対する関連性について評価不能と格付けされ、各群における１５のＡＥのうちの４が、試験薬物に関連している可能性が低いと格付けされた。プラセボを摂取する各患者のＡＥの要約を表６に示し、ＡＥの時点でｒｈＣＣ１０を摂取する患者のＡＥの要約を表７に示す。
［００７５］
［００７６］
［００７７］
したがって、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与が、連続して７日間、１．１ｍｇの分割用量、１鼻孔当たり０．５６ｍｇでエアロゾルとして１日１回投与された場合、ヒトでは安全性であり、忍容性が良好であることが分かった。
［実施例４］
［００７８］
慢性鼻炎および再発性副鼻腔炎（別名、慢性副鼻腔炎）の患者に対するｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
ｒｈＣＣ１０の１１ｍｇ（２ｍｌ）のアリコートを、リン酸二ナトリウムおよび一ナトリウム、およびフェニルカルビノール（保存剤）と塩化ベンジルコニウム（保存剤）、または０．１％チメロゾール（thimerosol）（これも、保存剤）を含有する０．６５％滅菌生理食塩水４２ｍｌを含む軟質プラスチック噴射ボトルに添加して、２５０μｇ／ｍｌのｒｈＣＣ１０溶液を得た。患者は、薬物を排出する開口が鼻孔内に維持されるようにボトルのアプリケータ端部を鼻に挿入し、押圧と吸引を同時に行ってｒｈＣＣ１０を自己投与した。ボトルが迅速に圧迫され、鼻アプリケータ端部の上部の小さいピンホールから液体が押し出されるときに単純なエアロゾルが形成される。送達される量および用量は、加えられる圧迫および力の速さによって決まる。典型的には、ｒｈＣＣ１０ ６．６μｇ〜１３１μｇに一致する２５μｌ〜５００μｌの範囲の量を排出する。圧迫が強ければ強いほど多くの量が送達され、鼻道が洗浄され、用量の一部は、飲み込まれるか、または数分の間、気管支内に流れ得る。
［００７９］
この例では、ｒｈＣＣ１０を、再発性細菌性副鼻腔感染を伴う、通年性アレルギーに起因する、慢性副鼻腔炎による偶発性および／または慢性の副鼻腔の痛みに苦しんでいる患者に投与した。患者の病歴には、（１）過去６年間に副鼻腔感染のために年に２回〜１２回、抗生物質が処方された、（２）過去６年間に鼻腔内コルチコステロイドが処方され、必要に応じて摂取した、および（３）副鼻腔の痛み、鼻および胸の詰まりを緩和し、患者が一晩中眠れるように、非処方鎮痛薬、充血除去剤、および抗ヒスタミン剤を毎日摂取したことが含まれる。ｒｈＣＣ１０は、以下の用量、投与計画、製剤、および薬物−装置組合せで、患者にとって有用な代替および補助療法であった。
［００８０］
初めの投与計画では、患者は、３日間、１日に３回、１鼻孔当たり２回噴射する噴射ボトルからｒｈＣＣ１０を自己投与する３日間前から、痛みを伴う感染性副鼻腔感染に苦しんでいた。この方法を用いた１日の合計摂取用量は、平均７０ｋｇの患者で１日に体重１ｋｇ当たり１．１μｇ〜２２．５μｇに一致する合計７８．６μｇ〜１，５７２μｇ（１鼻孔当たり３９．３μｇ〜７８６μｇ）の範囲であった。次いで、患者は、２日間、１日に２回（平均７０ｋｇの患者で１日に体重１ｋｇ当たり７４９ｎｇ〜１４．６μｇに一致する１日に合計５２．４μｇ〜１，０２４μｇ（１鼻孔当たり２６．２μｇ〜５１２μｇ））、次いで２日間、１日に１回（平均７０ｋｇの患者で１日に体重１ｋｇ当たり３７４ｎｇ〜７．５μｇに一致する１日に合計２６．２μｇ〜５２４μｇ）と用量を漸減した。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内の漸減投与計画の１週間後、患者は使用を中止した。患者の副鼻腔の痛み、鼻炎、および気管支炎の症状（鼻詰まり、くしゃみ、咳、気道閉塞、および胸の詰まり）、ならびに不眠症が、治療の開始から２４時間以内に消失し、ｒｈＣＣ１０の最後の投与から少なくとも６週間は元に戻らなかった。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与は、鼻粘膜のある程度の乾燥が起きたが、患者にとって安全であり忍容性が良好であった。
［実施例５］
［００８１］
再発性副鼻腔炎を予防するための患者へのｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
第２の投与計画では、患者は、初めに副鼻腔の痛みを感じて１２時間以内に、朝と晩の１日に２回、実施例４の製剤およびスプレーボトルのｒｈＣＣ１０を摂取した。副鼻腔の痛みは、強力な広域スペクトル抗生物質（例えば、レバクイン（Levaquin））で１４日間治療し、治療中に痛みは軽減されたが抗生物質の終了から４日以内に元に戻った、細菌性副鼻腔感染の再発に関連していた。便秘および過敏性大腸、胸痛、めまい、四肢の一過性の麻痺および刺痛、極度の日焼け、およびあざができやすくなることを含め、抗生物質に関連した周知の副作用が患者に起きた。結果として、医師は、抗生物質のさらなる使用を中止するように患者に助言した。次いで、患者は、市販の充血除去剤と共にｒｈＣＣ１０を使用して、再発性副鼻腔感染に関連した症状を治療した。最初の投与から２４時間以内に、鼻の痛みおよび鼻詰まりが消失した。患者は、ｒｈＣＣ１０を１週間、１日に２回、次いで１週間、１日に１回に減らして投与して治療を終了した。細菌感染は、ｒｈＣＣ１０での鼻腔内の治療後、少なくとも６週間は再発しなかった。
［実施例６］
［００８２］
維持のためのｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
季節性または通年性アレルギーおよび空気アレルゲンへの曝露から起きる場合が多い副鼻腔の痛みおよび感染を予防するためにｒｈＣＣ１０を用いた維持療法も可能である。最大２カ月半の間、５００μｇ／ｍｌを超えない（好ましくは２５０μｇ／ｍｌを超えない）製剤濃度で、体重１ｋｇ当たり３７４ｎｇ〜７．５μｇに一致する合計２６．２μｇ〜５２４μｇの用量で、１鼻孔に１回または複数回の作動で与えるｒｈＣＣ１０の毎日の鼻腔内投与は、慢性鼻炎の症状、鼻副鼻腔炎、鼻および胸の詰まり、副鼻腔の感染および痛み、ならびに不眠症を安全に制御し、抗生物質、鎮痛薬（アスピリン、イブプロフェンなどのNSAIDS）、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、および睡眠薬が必要なくなるであろう。
［００８３］
これらの方法、製剤、用量、投与計画、および薬物−装置組合せを用いると、ｒｈＣＣ１０は、慢性鼻炎および細菌性副鼻腔感染（別名、慢性副鼻腔炎）に関連した症状の緩和に有効であった。重度または再発性副鼻腔感染のさらに別の場合では、いくつかの他の抗生物質（アモキシシリン、ジスロマック（Zithromax）、ビアキシン（Biaxin）など）を用いて細菌の増殖を抑制すると共に、ｒｈＣＣ１０が痛みおよび症状を緩和した。軽度の感染で、重度の痛みを伴う感染を予防するためには、抗生物質を用いずにｒｈＣＣ１０を用いて、抗生物質に関連した負の副作用を患者から排除する。ｒｈＣＣ１０、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、および抗生物質との間の潜在的な相互作用に関連した有害事象は存在しない。したがって、市販の充血除去剤および抗ヒスタミン剤、ならびに鼻性副鼻腔炎に対して一般に処方される抗生物質は、全く使用しないか、または中程度から重度の鼻の症状を緩和するためにｒｈＣＣ１０と共に安全に使用した。
［実施例７］
［００８４］
コルチコステロイド治療抵抗性で抗生物質が効かない急性副鼻腔感染の治療のためのｒ
ｈＣＣ１０の鼻腔内投与
患者は、痛み、圧迫感、睡眠障害、起立時の血圧の低下、および歩行不能によって特徴付けられた重度の進行中の副鼻腔感染に苦しんでいた。患者は、空気アレルゲン（季節性または通年性）に対してアレルギーがなく、感染は、季節性アレルゲンが存在しない１月に起きた。副鼻腔感染の診断および重症度は、ＣＴスキャンによって評価した。ｒｈＣＣ１０を摂取する前に、患者は、抗生物質を５週間服用し（アモキシシリンを５００ｍｇ／日で１０日間、次いでオウグメンチンを４ｇ／日で３週間）、鼻腔内コルチコステロイド治療を１０日間受けた（プロピオン酸フルチカゾン）。これらの治療にもかかわらず、患者は、相当な痛み、副鼻腔全体の圧迫感、および顔面浮腫（腫れ）が残ったままであった。ｒｈＣＣ１０を摂取する直前は、患者の鼻中隔の両側は、濃い赤色であり、容易に目に見える拡張した毛細血管を含み、重度の局所炎症の存在を示していた。リン酸二ナトリウムおよび一ナトリウム、フェニルカルビノール（保存剤）、および塩化ベンジルコニウム（保存剤）を含有する０．６５％生理食塩水に溶解した２５０μｇ／ｍｌのｒｈＣＣ１０溶液を、１鼻孔当たり約２０μｇ〜５０μｇの用量で各鼻孔内にスプレーとして鼻腔内に単回投与した。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内単回投与を受けた約１２時間後に、患者の鼻中隔は、正常なくすんだ紫色で、拡張した毛細血管は見当たらず、強い局所抗炎症効果を示していた。患者は、１日に２回のｒｈＣＣ１０の服用を７日間続け、副鼻腔の痛みおよび圧迫感の症状の緩和を示した。ｒｈＣＣ１０の投与計画は、３日間の１日２回の１鼻孔当たり２回の噴射から、３日間の１日２回の１鼻孔当たり１回の噴射、そして３日間の１日１回の１鼻孔当たり１回の噴射に漸減するものであった。患者は、この計画を４日間続けた。しかし、５日目に、患者が、鼻スプレーで到達させるのに困難な篩骨洞に強い痛みが残っていることに気付いた。その後、ｒｈＣＣ１０の篩骨洞領域の表面への到達を増加させるために、洗浄技術によって同じ計画でｒｈＣＣ１０を投与した。この洗浄法では、合計用量２５０μｇのｒｈＣＣ１０（すなわち、２５０μｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ）を、標準的な市販の鼻洗浄液１１８ｍｌ（１／２カップ、４液量オンス）に添加した。患者は、ｒｈＣＣ１０製剤が副鼻腔内に３〜５分間留まるように、頭を後に傾けた仰臥位で洗浄を受けた。次いで、患者は、鼻をかむことにより洗浄液を流出させて排出できるように上半身を起こした。洗浄液は、２日間、１日２回、次いで３日間、１日１回投与を行って終了した。ｒｈＣＣ１０の最初の投与から２１日後にＣＴスキャンを行うと、瘢痕、上皮の肥厚、または他の残りの閉塞の形跡が一切なく、副鼻腔感染の完全な消散が明らかになった。ｒｈＣＣ１０製剤は、アレルギーではなく細菌感染によって引き起こされた強力な抗炎症反応を媒介した。ｒｈＣＣ１０はさらに、鼻腔内コルチコステロイドの形の標準的な抗炎症療法が失敗した場合に、抗炎症反応を媒介した。また、ｒｈＣＣ１０は、細菌感染の除去を促進し、細菌感染が、追加の抗生物質を使用することなく消散した。最終的に、ｒｈＣＣ１０は、瘢痕、線維症、および典型的にはこのような重度の感染に付随する上皮の肥厚を回避して、鼻上皮の完全な回復を介在した。
［実施例８］
［００８５］
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内製剤
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内送達は、例えば、通年性アレルギー、感染、またはある種の他の形態の急性もしくは慢性の上部呼吸器刺激による上部呼吸器（鼻および副鼻腔および上気道）の炎症および線維症を治療する際に有用である。ｒｈＣＣ１０は、例えば、３．９〜８．５の広範なｐＨ値、および広範な塩濃度（例えば、０．１％〜４％）、ならびに様々なアルコール／水混合物（例えば、０．１％〜９０％エタノール）の様々な水溶液に溶解性である。したがって、ｒｈＣＣ１０は、限定されるものではないが、例えば、液体エアロゾルの自己投与用の用量制御ができない単純な噴射ボトル、液体エアロゾルの自己投与用のポンプ作動式または圧力式キャニスター定量噴霧装置、自己投与用の推進剤駆動乾燥粉末または液体エアロゾル定量噴霧装置、鼻道への局所送達用のゲル付き鼻用スワブ、ならびに意識のあるまたは意識のない患者への任意または強制投与のための副鼻腔洗浄用および深い局所投与用の薬物充填シリンジを含め、様々な鼻腔内排出装置に使用できる溶解性および安定性の特性を有する。
［００８６］
上記に基づいて、鼻性鼻炎、特に非アレルギー性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープを安全に治療、治癒、および予防するのに有効なｒｈＣＣ１０の投与量の臨界範囲を見出した。したがって、本発明は、鼻性鼻炎、特に非アレルギー性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープの症状の治療に有効であり、このためこれらの症状に苦しんでいる小児および成人患者の重大な病的状態を軽減するが、危険な副作用を一切引き起こさない、安全で忍容性が良好な、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与に基づいた療法を提供する。
［書類名］特許請求の範囲
［請求項１］
患者の鼻道の鼻副鼻腔炎を治療するための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項２］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約１．５μｇ〜約１．５ｍｇである、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約１．１ｍｇ未満である、請求項１に記載の方法。
［請求項４］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約０．７５μｇ〜約６５０μｇである、請求項１に記載の方法。
［請求項５］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約０．５μｇ〜約３７０μｇである、請求項１に記載の方法。
［請求項６］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項１に記載の方法。
［請求項７］
ｒｈＣＣ１０の投与が、約２日繰り返される、請求項１に記載の方法。
［請求項８］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項１に記載の方法。
［請求項９］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項１に記載の方法。
［請求項１０］
患者の鼻ポリープの成長もしくは再成長を防止または遅くするための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項１１］
約１．５μｇ〜１．５ｍｇのｒｈＣＣ１０が、少なくとも２日間、毎日投与される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に１．１ｍｇ以下である、請求項１０に記載の方法。
［請求項１３］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１４］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１５］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１６］
患者の慢性または再発性細菌性副鼻腔感染症を治療または予防するための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項１７］
約１．５μｇ〜１．５ｍｇのｒｈＣＣ１０が、少なくとも２日間、毎日投与される、請求項１６に記載の方法。
［請求項１８］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に１．１ｍｇ以下である、請求項１６に記載の方法。
［請求項１９］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項１６に記載の方法。
［請求項２０］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項１６に記載の方法。
［請求項２１］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項１６に記載の方法。
［請求項２２］
患者の副鼻腔の痛みを治療するための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項２３］
約１．５μｇ〜１．５ｍｇのｒｈＣＣ１０が、少なくとも２日間、毎日投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２４］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に１．１ｍｇ以下である、請求項２２に記載の方法。
［請求項２５］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２６］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２７］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２８］
鼻用賦形剤とｒｈＣＣ１０を含有する処方を含む、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与のための医薬組成物。
［請求項２９］
２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度でｒｈＣＣ１０を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
［請求項３０］
ｐＨ４．０〜８．０の０．６５％塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、フェニルカルビノール、リン酸一ナトリウム、および塩化ベンザルコニウム中に２５０μｇ／ｍｌの濃度でｒｈＣＣ１０を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
［請求項３１］
ｒｈＣＣ１０が、請求項２９に記載の医薬組成物の形態で１日に最大４回、１鼻孔当たり２０μｇ〜５０μｇの用量で投与される、請求項１、１０、１６、および２２に記載の方法。
［請求項３２］
請求項３０に記載の医薬組成物と、鼻道の表面へのｒｈＣＣ１０の局所適用を可能にする圧迫スプレーボトル、ポンプ作動式スプレー装置、定量噴霧鼻用アクチュエータ、シリンジ型滴下注入装置、鼻用スワブアプリケータ、または「ネティポット」洗浄装置と、を含む薬物−装置組合せ構成物。
（１２）特許協力条約（ＰＣＴ）の下に公開される国際出願
（１９）世界知的所有権機関国際事務局
（４３）国際公開日：２００９年１１月１９日
（１０）国際公開番号ＷＯ２００９／１４０２６９Ａ２
（５１）国際特許分類：未分類
（２１）国際出願番号：PCT/US2009/043613
（２２）国際出願日：２００９年５月１２日
（２５）出願の言語：英語
（２６）公開の言語：英語
（３０）優先権：61/052861 2008年5月13日 米国
（７１）出願人：クララッサンス，インコーポレイテッド；アメリカ合衆国，メリーランド州 ２０８５０，ロックビル，グレート セネカ ハイウェイ ９７００
（７２）（７５）発明者；及び発明者／出願人（米国）：ピロン，アプリーレ エル．；アメリカ合衆国，メリーランド州 ２０８７４，ジャーマンタウン，マナー ストーン ドライブ １３３２８
（７４）代理人：エヴァンズ，バリーら（クレイマー・レヴィン・ナフタリス＆フランケルＬＬＰ）；アメリカ合衆国，ニューヨーク州 １００３６，ニューヨーク，アヴェニュー オブ アメリカ １１７７
（５４）発明の名称：鼻性鼻炎の治療に使用するための組換えヒトＣＣ１０およびその組成物
（５７）要約
本発明は、全体として、鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープの治療における治療薬として使用される組換えヒトウテログロビンとしても知られる組換えヒトＣＣ１０（rhCC10）の使用に関する。詳細には、本発明は、上記の状態を安全かつ効果的に治療するために投与することができるｒｈＣＣ１０の臨界用量範囲および鼻腔内経路の投与を広く含む方法を提供する。本発明は、ヒトへのｒｈＣＣ１０の投与に有用な組成物をさらに提供する。
［発明の名称］鼻性鼻炎の治療に使用するための組換えヒトＣＣ１０およびその組成物
［技術分野］
［０００１］
関連文献の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２００８年５月１３日に出願した米国仮特許出願第６１／０５２，８６１号の利益および優先権を主張するものである。
［０００２］
本発明は、患者の鼻道の空気の流れの障害を減少させ、副鼻腔感染を一掃し、および副鼻腔の痛みを軽減する方法に関する。詳細には、本発明は、患者の鼻性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻ポリープを治療する方法ならびにこれらの方法に有用な組成物に関する。より詳細には、本発明は、鼻腔内投与される組換えヒトＣＣ１０を用いた上記の治療方法およびこれらの治療方法に有用な組換えヒトＣＣ１０の組成物に関する。
［背景技術］
［０００３］
クララ細胞「１０ｋＤａ」タンパク質（ＣＣ１０）またはウテログロビン（ＵＧ）は、いくつかの粘膜上皮および上皮起源の他の器官によって産生される小さいホモ二量体の分泌タンパク質である（Mukherjee、1999）。ＣＣ１０は、７０のアミノ酸残基の２つの同一のサブユニットからなり、各サブユニットは、Ｃｙｓ３と６９’との間および３’と６９との間の２つのジスルフィド結合によって逆平行方向に接合された「４つのヘリックスバンドル」二次構造モチーフを備えている（Matthews、1994; Morize、1997）。２つのジスルフィド結合を含むホモ二量体は、その主要な形態である細胞外活性型と思われる。ヒトでは、肺がＣＣ１０の産生の主な部位であり、いくつかの他の器官が、このタンパク質をコードするｍＲＮＡを少量合成する（Singh、1987; Sandmoller、1994）。ＣＣ１０は、他のタンパク質、受容体、および細胞型との様々な相互作用について特徴が明らかにされてきた抗炎症性の免疫調節タンパク質である（Mukherjee、2007、Mukherjee、1999、およびPilon、2000を参照）。低レベルのＣＣ１０タンパク質またはｍＲＮＡが、喘息（Lensmar、2000; Shijubo、1999; Van Vyve、1995）、肺炎（Nomori、1995）、閉塞性細気管支炎（Nord、2002）、サルコイドーシス（Shijubo、2000）、ならびに再発性副鼻腔炎および鼻ポリープを伴う慢性鼻炎の患者（Liu, 2004）を含むある程度の炎症によって特徴付けられた多数の臨床症状の様々な組織および流体試料で見出されている。肺上皮細胞、すなわち内因性ＣＣ１０の体内の主な供給源は、これらの症状で悪影響を受け、消耗し、または除去さえされる場合も多い（Shijubo、1999）。実際、ＣＣ１０は、特定のセットの非繊毛呼吸上皮細胞および関連構造の発生に必要な自己分泌および／または内分泌であると思われる（Castro、2000）。したがって、ＣＣ１０の欠乏が、炎症および／または症状の原因または結果であるかが未だに分かっていない。
［０００４］
鼻道内の空気の流れの障害、ならびに副鼻腔の痛みおよび圧迫感は、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻ポリープに苦しんでいるヒトにおける重大な病的状態の原因であることが知られている。鼻性鼻炎は、鼻咽頭腔（nasopharygeal cavity）における鼻道および副鼻腔の炎症である。アレルギー性と非アレルギー性の２種類の鼻炎が存在する。非アレルギー性鼻炎は、ウイルス、細菌、または他の感染、吸入した化学種または他の刺激物への曝露によるものであり、特発性の場合もあるが、アレルギー性鼻炎は、吸入したアレルゲンへの曝露によるものである。アレルギー性鼻炎は、樹木や草の花粉に対するアレルギーなどの季節性であるか、またはイエダニや一般的なカビに対するアレルギーなどの通年性である。鼻炎は、数時間、数日、または数週間に渡る痒み、くしゃみ、および鼻汁による軽度の季節性の不快感から、再発性の細菌感染に関連する場合が多い、痛みを伴う消耗性の慢性副鼻腔の炎症まで重症度に幅がある。細菌感染の存在下での慢性副鼻腔の炎症は、時には慢性副鼻腔炎（「ＣＲＳ」）と呼ばれることもある。ＣＲＳは、気道上皮および副鼻腔組織の不可逆性リモデリングおよび瘢痕をもたらす。鼻組織のこれらの永久変化は、ウイルスおよび細菌の両方の感染と戦う能力の低下ならびに吸入したアレルゲンおよび刺激物を排除する能力の低下により、さらに重い炎症反応、さらに深刻なリモデリングおよび線維症、さらに重度または持続的な感染が起こる悪循環をもたらす。理論的には、炎症は、感染がなければ可逆的であり、刺激物、病原体、またはアレルゲンが局所組織から除去されるとすぐに消失するはずである。したがって、季節性または軽度の鼻炎からＣＲＳへの移行は、通年性アレルゲンへの慢性曝露および／または炎症を起こした鼻および副鼻腔の組織の再発性細菌感染に大きく起因し、元の鼻炎の刺激（アレルゲンまたは刺激物）が無くなって長い時間が経過しても感染が持続する。実際、慢性鼻炎をもたらす通年性アレルギーの患者は、炎症反応がアレルゲン−刺激反応から感染−刺激反応に移行すると、再発性細菌感染（副鼻腔炎）に罹患する場合が多い。これらは、重度の持続性鼻副鼻腔炎ＣＲＳ疾患に罹患した、最も重度の病的状態の患者である。慢性鼻炎は、アレルギー性または非アレルギー性にかかわらず、呼吸を障害し、睡眠を妨げ、そして繰り返される細菌性副鼻腔感染に罹りやすくする鼻道の過度の粘液の産生および腫れを引き起こす。副鼻腔の痛みおよび圧迫感は、この疾患の重大な病的状態を引き起こす。細菌感染は、急性または慢性にかかわらず、これらの症状を悪化させる。最も重度の場合、鼻ポリープが、鼻の気道で成長し、鼻の気道を徐々に塞ぐ。これらのポリープは、副鼻腔切除手術によってのみ除去することができる副鼻腔組織の非悪性増殖物である。鼻ポリープの患者は、除去するたびにポリープが再び成長して、定期的に副鼻腔切除術を受けなければならない場合もある。
［０００５］
しかし、鼻ポリープの有るまたは無い鼻炎、特に慢性鼻炎および鼻副鼻腔炎の患者ならびに慢性または再発性細菌性副鼻腔感染の患者において、ｒｈＣＣ１０が炎症を緩和できるか否か、およびその用量は解明されていなかった。実際、以下に示すように、近年の研究は、既知の一般的に使用されている用量では、ｒｈＣＣ１０が有効でないことを示している。 ［０００６］ 季節性アレルギーによる鼻の炎症および鼻炎を抑制する鼻腔内のｒｈＣＣ１０の効果を評価するための近年の第２相臨床試験では、ｒｈＣＣ１０の治療により、プラセボと比較して、６つの有効性指標の１つで症状の有意な悪化がもたらされた（Widegrenら、2009）。残りの５つの有効性指標については、ｒｈＣＣ１０とプラセボとの間に違いがなかったが、すべてはプラセボが優れている傾向にあった。ｒｈＣＣ１０は、鼻吸引のピークの流れの改善（増加）および空気アレルゲンの投与によって引き起こされる鼻漏の緩和においてプラセボよりも劣っていた。表１は、各治療期間の最後の３日間（５日目〜７日目）の間に測定された、プラセボを摂取した患者の結果に対するｒｈＣＣ１０を摂取した同じ患者の結果の比較を示している。
［０００７］
［０００８］
この概念実証試験は、季節性アレルギー性鼻炎のこの鼻アレルゲン曝露モデルにおいて、７日間に渡って１日１回投与されたｒｈＣＣ１０の全体的な有効性を実証することに失敗した。２００μＬに溶解した１．１ｍｇのｒｈＣＣ１０の１日１回の鼻腔内投与は、プラセボと比較して、アレルゲン誘導性の朝の症状、曝露後の症状、または晩の症状に良い影響を与えなかった。高いＰＮＩＦは、より多くの空気の流れを反映し、低いＰＮＩＦは、制限された空気の流れを示す。朝および晩のＰＮＩＦは、ｒｈＣＣ１０によって影響されなかったが、曝露後のＰＮＩＦは、プラセボと比較してｒｈＣＣ１０の治療によりやや減少したが、この減少は統計的有意ではなかった。プラセボ群で達した症状のスコアおよびＰＮＩＦのレベルは、このモデルで経時的に記録した値に非常に近かった。好酸球陽イオンタンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、およびα２−マクログロブリンのレベルを含む鼻洗浄液中の炎症マーカーも同様であり、ｒｈＣＣ１０は、プラセボと比較してこれらのマーカーの減少を一切仲介しなかった。このモデルでは、コルチコステロイドが、朝の症状、曝露後の症状、および晩の症状ならびに鼻洗浄液中の炎症マーカー（Ahlstrom-Emanuelssonら、2002 & 2007）を抑制し、抗ヒスタミン剤が、曝露後の症状のみを軽減すること（Korsgrenら、2007）が実証された。したがって、この用量、投与計画、鼻腔内投与の量およびスプレー方法を用いると、ｒｈＣＣ１０は、６つすべての臨床結果の指標または鼻洗浄液中の３つすべての炎症マーカーにおける抗アレルギー、抗炎症効果を示さなかった。
［０００９］
現在、殆どの鼻性鼻炎および鼻副鼻腔炎は、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、非ステロイド系抗炎症薬（「NSAIDS」）および様々な非薬理的鼻用スプレー、および洗浄液などの市販薬および処方薬で治療される。クロム点鼻薬、口腔用抗ヒスタミン剤、およびロイコトリエン受容体拮抗薬は、症状を治療するが、２、３時間の症状の除去にすぎない。オキシメタゾリン点鼻薬は、鼻道の開存に非常に有効であるが、過度の使用は、「リバウンド効果」をもたらし、有効性が急速に低下して症状が悪化する。これらの種類の薬物の副作用には、特に、咽頭炎、鼻組織の乾燥、および便秘が含まれる。
［００１０］
さらに、副鼻腔炎は、典型的には口腔用の抗生物質で治療される。抗生物質は、副作用の弱いものから強いものまであり、副作用には、便秘や他の消化の問題、頭痛、めまい、発疹、肝臓毒性、腎臓毒性、および膀胱毒性、筋肉および関節の痛みなどが含まれ得る。また、抗生物質は、特に、抗生物質を繰り返し摂取しなければならず、最終的にその抗生物質に対してアレルギーを持つようになる再発性副鼻腔炎の患者で過敏性反応を引き起こすことがある。抗生物質に対する過敏性反応は、アレルギーの兆候や前兆なしに起こることがあり、突然、致命的となることがある。
［００１１］
重度および／または慢性の鼻副鼻腔炎疾患の場合、医師は、現在、炎症を軽減するが数週間または数カ月の連続的な治療後に有効性が失われる場合が多い鼻用のコルチコステロイドを処方する。口腔用のコルチコステロイドもまた、有効であるが、長期に渡って使用すると多数の望ましくない副作用が起きる。例えば、成人では、高血圧症および発作を含む心血管合併症は、コルチコステロイド使用の主な副作用である。小児では、コルチコステロイドは、正常な成長および発達を阻害する。すべての患者で、コルチコステロイドは、患者の免疫機能を低下させ、あらゆる種類の感染（細菌、ウイルス、真菌など）に罹りやすくする。したがって、安全が、鼻性鼻炎、特に慢性副鼻腔炎、鼻ポリープ、慢性または再発性細菌性副鼻腔感染、それらに関連した病的状態、および他の同様の状態を治療、予防、または治癒するために使用される薬物および複合薬の選択における主な考慮事項である。
［００１２］
鼻炎、副鼻腔炎、および鼻副鼻腔炎を治療するために薬物を鼻腔内投与することができるいくつかの製剤、装置、および方法が存在する。鼻道および副鼻腔への薬物の局所鼻腔内投与の１つの方法では、スプレーボトルまたはスプレーポンプ装置内の液体製剤が使用され、液体製剤が小さい開口に通過されてエアロゾルに変換され、各鼻孔内の鼻腔の前側部分にスプレーされる。
［００１３］
上述の装置によって生成される粒度は、鼻咽頭腔（nasopharygeal cavity）の内側を覆っている鼻粘膜への薬物の送達および局所堆積を最大化する５μｍ〜１０μｍの範囲である。鼻粘膜は、鼻咽頭腔の鼻道および副鼻腔における湿った上皮の上に位置する通常は薄い粘膜の層からなる。鼻孔内にスプレーされる５μｍ〜１０μｍの粒子の殆どが、鼻咽頭腔の前側部分の非繊毛上皮に衝当する。鼻粘膜の衝当部位に堆積されると、薬物は、粘膜全体に行き渡り、薬物および粘膜が飲み込まれる咽頭に向かって押す鼻咽頭腔の前側３分の２に位置する繊毛および繊毛上皮細胞の作用によって様々な速度で除去され得る。鼻腔内に堆積される薬物の局所作用は、送達される粒度、製剤、および除去速度に左右される。これらの因子は、局所送達の有効性、ならびに鼻咽頭粘膜および上皮が薬物に曝露されてから除去されるまでの時間の長さに影響を与える。
［００１４］
鼻腔内投与される薬物の局所作用はまた、送達時の鼻粘膜および組織の状態に左右される。例えば、鼻道が厚い粘膜によって塞がれている場合は、薬物の局所送達は、不可能ではないにしても非常に困難である。
［００１５］
したがって、重度の副作用なしに、長期に渡って気道の閉塞、副鼻腔の痛みおよび不快感を緩和する作用物質およびその作用物質の正しい用量を見出すことが重要な課題である。したがって、より効果的または持続的な新規の作用物質およびその製剤、ならびに特に慢性疾患の患者へのその投与および投与計画の要求が存在する。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
［００１６］
上記は、本発明によって達成される目的の包括的なリストを提供する。
［００１７］
本発明の主な目的は、ｒｈＣＣ１０を用いて、鼻ポリープの有るまたは無い患者の鼻性鼻炎、副鼻腔炎、特に慢性鼻炎および鼻副鼻腔炎を治療、治癒、または予防することにある。
［００１８］
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０を用いて、慢性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻副鼻腔炎に関連した痛みおよび副鼻腔の圧迫感を緩和することにある。
［００１９］
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０を用いて、鼻性鼻炎または副鼻腔炎の患者がより良質の睡眠を得ることを可能にすることにある。
［００２０］
本発明のさらなる目的は、鼻腔内滴下注入、鼻洗浄によって、またはスプレー装置の使用を伴う鼻腔内エアロゾルとして患者にｒｈＣＣ１０を投与することにある。
［００２１］
本発明のさらなる目的は、上記の目的を達成し、かつ免疫応答を有意に抑制しない、そして有害事象の頻度または重症度を高めない、安全で忍容性が良好なｒｈＣＣ１０の有効量の範囲を提供することにある。
［００２２］
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０をエアロゾル、ゲル、または液体として鼻咽頭腔（nasopharygeal cavity）に効果的に投与できる薬物−装置組合せを提供することにある。
［００２３］
本発明のさらなる目的は、使い捨てスワブアプリケータ（swab applicator）を用いた、局所投与および持続放出のためのゲルまたはクリームでの適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２４］
本発明のさらなる目的は、スプレーポンプまたはスクイーズボトルを用いた、局所投与および堆積のための５μｍ〜１０μｍの粒度範囲のエアロゾルとしての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２５］
本発明のさらなる目的は、複数回使用されるスプレーポンプディスペンサー、定量吸入器（ＭＤＩ）、またはスクイーズボトル装置を用いた、局所投与および堆積のための５μｍ〜１０μｍの粒度範囲のエアロゾルとしての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２６］
本発明のさらなる目的は、１回または複数回使用されるスプレーポンプディスペンサー、定量吸入器（ＭＤＩ）、またはスクイーズボトル装置を用いた、経肺投与および堆積のための１μｍ〜５μｍの粒度範囲のエアロゾルとしての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２７］
本発明のさらなる目的は、単回または多回投与用シリンジ装置内の注入物としての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２８］
本発明のさらなる目的は、「ネティポット（neti pot）」または同様の重力流洗浄装置を用いた鼻洗浄液中の注入物としての適用のために、薬理学的に許容される特定の鼻用賦形剤に含められたｒｈＣＣ１０の製剤を提供することにある。
［００２９］
本発明のさらなる目的は、鼻咽頭腔における他の薬物の投与部位での局所炎症反応によって引き起こされる痛み、刺激、および不快感の緩和のために、薬理学的に許容される鼻用賦形剤としてｒｈＣＣ１０自体を提供することにある。
［００３０］
本発明のさらなる目的は、鼻咽頭腔に投与される、または鼻咽頭腔を介して投与される他の薬物のバイオアベイラビリティを促進するために薬理学的に許容される鼻用賦形剤としてｒｈＣＣ１０自体を提供することにある。
［００３１］
本発明のさらなる目的は、鼻腔内投与のために他の薬物との複合製剤中の活性成分としてｒｈＣＣ１０を提供することにある。
［００３２］
用語「薬理学的に許容される」は、有害効果をもたらさないか、または既知であって規制当局が許容する、または許容できる有害効果をもたらす製剤または賦形剤の組合せを特徴付けることを意図する。
［課題を解決するための手段］
［００３３］
これらおよび他の目的、特徴、および利点は、鼻ポリープを伴うまたは伴わない鼻性鼻炎、副鼻腔炎、鼻副鼻腔炎、およびＣＲＳを治療、治癒、または予防するために適切な間隔での所定の用量範囲または単回投与でｒｈＣＣ１０を投与することによって達成される。さらに、慢性鼻炎患者に対して、ｒｈＣＣ１０は、適切な間隔での所定の用量範囲または単回投与で投与される場合に慢性鼻炎の治療、治癒、または予防にさらに大きな利点を提供する。したがって、鼻の炎症、鼻炎、鼻性鼻炎、慢性鼻炎、副鼻腔炎、および鼻副鼻腔炎の治癒、治療、または予防に効果がないと思われたｒｈＣＣ１０が、驚くべきことに、実際は本発明に従って使用すると有効であることを見出した。
［００３４］
これらおよび他の目的、特徴、および利点はまた、副鼻腔の痛みおよび圧迫感、副鼻腔の不快感による不眠、慢性鼻炎、鼻副鼻腔炎、および鼻ポリープの成長または再成長の１つ以上を患者が示す場合、適切な間隔での所定の用量範囲または単回投与でｒｈＣＣ１０を投与することによって達成される。
［００３５］
これらおよび他の目的、特徴、および利点はまた、血小板の凝集を阻害しない、風邪またはインフルエンザなどにおける免疫応答を抑制しない、またはあらゆる有害事象の頻度もしくは重症度を増加させないように、ｒｈＣＣ１０を投与することによって達成される。
［００３６］
本発明の特定の態様では、ｒｈＣＣ１０は、重度の鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、特に慢性副鼻腔炎、および／または鼻ポリープを治療、治癒、または予防するために、１日に１．５μｇ〜１．１ｍｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された単回投与で、または１日に合計するとこの用量範囲を達成する多回投与で鼻腔内に投与される。別の態様では、１日に１．５μｇ〜１．１ｍｇの範囲のｒｈＣＣ１０の鼻腔内量又は各鼻孔間でほぼ等分された量を、重度の鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、再発性副鼻腔炎を伴う慢性鼻炎、特に鼻副鼻腔炎、および／または鼻ポリープを治療、治癒、または予防するために適切な間隔で繰り返すことができる。本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、７日間、１０日間、１４日間、または２１日間連続して毎日鼻腔内投与される。
［００３７］
本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約８時間の間隔で１日に３回投与される。本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、１日に０．７５μｇ〜６５０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約１２時間の間隔で１日に２回投与される。
［００３８］
本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、まず、３日間、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約８時間の間隔で１日に３回、次いで、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で、約１２時間の間隔で１日に２回、次いで、１日に０．５μｇ〜３７０μｇの範囲の各鼻孔間でほぼ等分された鼻腔内投与で１日に１回、漸減式に投与される。本発明のさらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、上記の態様に従うが、合計して約１５ｎｇ〜約１０ｍｇの範囲となる単回または多回投与で鼻腔内投与される。
［００３９］
鼻腔内投与であるかないかにかかわらず、ｒｈＣＣ１０は、限定されるものではないが、鼻腔内または全身コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤ（アスピリン、COX-2阻害剤を含む）、鎮痛薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌剤、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、クロム溶液、鼻洗浄、生理食塩水鼻洗浄、およびホメオパシー療法を含む他の標準的な鼻炎および副鼻腔炎の治療の前または後に、これらの治療と組み合わせて、または単独で投与することができる。
［００４０］
別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、適用部位における望ましくない局所炎症を引き起こすことがある、もしくは引き起こすことがない、または望ましくない局所炎症を他の方法で誘発する、もしくは誘発することがある他の薬物の鼻組織への局所送達または全身吸収のための局所鼻送達または適用を促進するために、賦形剤および／または局所抗炎症剤、および／または局所免疫抑制剤として用いることができる。したがって、ｒｈＣＣ１０は、鼻送達に関連した不快感を緩和または回避するために他の薬物の賦形剤として用いることができる。
［００４１］
別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、賦形剤として、または局所送達もしくは全身送達のために他の薬物の鼻腔内投与によって引き起こされる炎症を緩和するために用いることができる。
［００４２］
加えて、ｒｈＣＣ１０は、鼻への適用に適した粘度および鼻咽頭腔の局所分布プロフィールを得るために、水溶液、懸濁液（鼻用界面活性賦形剤を含む）、またはゲル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースを利用するヒドロゲルなど）として製剤することができる。同様に、ｒｈＣＣ１０は、抗生物質または他の抗菌剤、生理食塩水鼻洗浄、充血除去剤、粘液溶解薬、ＬＴＲＡ、β作動薬、気管支拡張剤など他の活性成分と組み合わせて製剤することができる。
［００４３］
別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、鼻用スプレー圧迫ボトル、定量吸入器、またはスプレーポンプ装置内に充填される水溶液として製剤される。さらに別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、鼻用シリンジ型適用装置、定量吸入器、または他の鼻用適用装置内に充填される界面活性剤の懸濁物質として製剤される。さらに、さらなる別の態様では、ｒｈＣＣ１０は、ヒドロゲルまたは他の形態の人工粘液中に製剤され、１回の用量が、鼻腔内投与のために使い捨て鼻用スワブ装置に設けられる。
［発明を実施するための形態］
［００４４］
本発明は、鼻性鼻炎および副鼻腔炎、特に再発性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープを伴うヒトの慢性鼻性鼻炎を治療、治癒、または予防するためのｒｈＣＣ１０投与の臨界用量および時期に関する。ｒｈＣＣ１０は、好ましくは、それぞれが参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Ｅｘ．Ａ＆Ｂとして本明細書に添付された米国特許出願公開第２００３−０１０９４２９号および同第２００３−０２０７７９５号に記載されているプロセス、または医薬品グレード（FDAの要求を満たす）のｒｈＣＣ１０を生産する任意の他のプロセスによって得られる。本発明の実施形態のｒｈＣＣ１０は、他の鼻腔内、肺、または全身治療を用いて、用いずに、その前、またはその後で投与することができる。
［００４５］
用量
好ましくは、鼻性鼻炎、副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープの治療または予防では、ｒｈＣＣ１０は、各鼻孔に１日に１回〜３回を７日間〜１４日間、その後の１４日間は１日おきに、そしてその後は必要に応じて鼻腔内に投与される。より好ましくは、ｒｈＣＣ１０は、患者が副鼻腔の痛みおよび圧迫感を感じ始めたらすぐに投与される。
［００４６］
詳細を後述する所望の結果を達成するために、以下の実施形態で説明する投与方法について述べる。
［００４７］
一実施形態では、約１．５μｇ〜約１．５ｍｇの用量範囲に等しいｒｈＣＣ１０を単回または多回投与することができる。別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、毎日この用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、少なくとも連続７日間、毎日この用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、少なくとも連続１４日間、毎日この用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、連続して３０日間、１日おきにこの用量範囲で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、連続して１０日間毎日、漸減する用量で投与することができ、この漸減する用量は、最初の３日間の各投与での高用量、次の３日間の各投与での中間用量、および最後の４日間の各投与での低用量を含む。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、１日に最大３回、約８時間毎に、この用量範囲または漸減する用量で投与することができる。
［００４８］
別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０の上記の用量を患者の鼻腔内に投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０の上記の用量を、鼻腔内滴下注入によって、または鼻道へのゲルもしくはクリームの堆積によってエアロゾルとして患者に投与することができる。さらなる実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、上記の方法に従って、経口もしくは鼻腔用の充血除去剤、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、粘液溶解薬、去痰薬、粘液抑制剤、界面活性剤、気管支拡張剤、血管収縮剤、副鼻腔鎮痛薬、または他の典型的な治療の前、最中、または後で投与することができる。さらに別の実施形態では、ｒｈＣＣ１０を、上記の方法に従って、患者の鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、または鼻ポリープを治療または予防するために投与することができる。
［００４９］
ｒｈＣＣ１０の用量および上記の適用方法は、治療する疾患の重症度、患者の健康全体、および急性疾患または慢性疾患のいずれかが治療されるかによって１日１回、１日に２回以上、１日３回、１日おき、または漸減式に投与することができる。例えば、疾患の状態が重症であればあるほど、疾患を効果的に治療するためにはより多量のｒｈＣＣ１０が必要である。例えば、鼻性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、または鼻ポリープの悪化を防止するための慢性疾患の維持療法の場合は、低用量が使用される。医師は、必要に応じて、患者の症状および治療に対する応答に基づいて、本発明の実施形態に記載されたパラメータおよび用量の範囲内で、用量、製剤、および適用方法を監視し調節することができることを理解されたい。
［００５０］
製剤
ｒｈＣＣ１０は、例えば、スプレーボトル、スプレーポンプ、または洗浄液内の液体製剤の使用によって、局所鼻上皮に直接適用すると最も効果的である。したがって、時には、ｒｈＣＣ１０を鼻上皮に効果的に適用する前に、即効性の局所粘液溶解薬、抗ヒスタミン剤、および／または充血除去剤、ならびに鼻道を開存させるための暖かい湿った空気の吸引、顔に温湿布をすること、および塩水での鼻の洗浄などの物理的な方法を使用する必要がある。
［００５１］
鼻腔内滴下注入は、液体製剤またはゲル製剤に含められたｒｈＣＣ１０を用いて達成できるｒｈＣＣ１０を投与する別の方法である。ゲル剤形は、１回分のｒｈＣＣ１０が綿棒で塗られる鼻局所領域にこのｒｈＣＣ１０が長く維持されることによって長期間に渡る良好な局所投与の利点を提供するが、液体剤形は、正常な鼻の排出動作による滴下注入後の部分的な飲み込みにより、大幅に短い局所曝露および少ない局所投与となり得る。しかし、「ネティポット」型の装置を用いた鼻洗浄による液体剤形の鼻腔内滴下注入は、ゲル製剤の局所適用よりも、投与量が、鼻組織および副鼻腔の広い面積に渡って迅速に行き渡るという利点を与える。
［００５２］
ｒｈＣＣ１０は、鼻腔内送達のためにいくつかの鼻用賦形剤と共に製剤化することができる。これらには、薬物のｐＨを調節する賦形剤、溶解性を維持するために薬物を緩衝する賦形剤、微生物の増殖および／または移動を防止するための防腐剤または強化防腐剤として作用する賦形剤、薬物の張度、溶解性、または粘度を調節する賦形剤、薬物の進入または浸透（全身送達）を促進する賦形剤、薬物の局所バイオアベイラビリティおよび半減期を変更する（粘度を増加させる）賦形剤、毒性を低減する賦形剤、不溶性薬物を懸濁する賦形剤、および製剤の味を変更する賦形剤が含まれる。表２は、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内製剤の例示的な賦形剤およびそれらの機能の限定目的ではないリストを含む。１つの賦形剤または賦形剤の組合せのいずれを用いても、鼻腔内投与用のｒｈＣＣ１０を製剤化することができる。
［００５３］
［００５４］
また、ｒｈＣＣ１０は、鼻腔内投与用に他の薬物、人工粘液、または他の活性成分と組み合わせて製剤することもできる。鼻腔内投与用にｒｈＣＣ１０と共に製剤できる薬物には、限定されるものではないが、局所または全身抗菌剤（抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤）、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、粘液溶解薬、去痰薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、気管支拡張剤、β２アドレナリン作動性受容体作動薬、局所作用血管収縮剤（例えば、オキシメタゾリン）、抗炎症剤、および鎮痛剤が含まれる。局所効果または全身効果を得るために鼻腔内投与用にｒｈＣＣ１０と共に製剤できるさらに他の薬剤には、抗炎症剤、β２アドレナリン作動性受容体作動薬、抗癌剤、血管新生阻害剤、抗線維化剤、免疫調節剤、ワクチン、代謝製剤、鎮痛薬、神経弛緩剤、麻酔薬、抑うつおよび他の精神病（メンタルヘルス）のための作用物質、依存抑制剤、ホメオパシー薬剤、漢方薬、ビタミン、およびミネラルなどが含まれる。
［００５５］
ｒｈＣＣ１０は、親水性および疎水性化学種、核酸および核酸類似体、タンパク質およびペプチド、糖質、脂質、およびリン脂質などを含め、殆どの反応しない化学種および薬物と混合可能である。セクレトグロビン（secretoglobin）は、上皮細胞における物質の輸送に大きく関与し、ｒｈＣＣ１０は、鼻道による他の薬物の送達を促進するのに理想的に適している。また、ｒｈＣＣ１０は、例えば、投与時に「灼熱感」を引き起こす化学療法剤および薬物などの他の薬物の投与部位での痛みを伴う局所的な鼻の応答を抑制する賦形剤として使用することができる、局所抗炎症剤として作用することができる。
［００５６］
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与に関連した薬効に関する重要なパラメータは、ｒｈＣＣ１０自体の濃度である。ｒｈＣＣ１０濃度の高すぎる（すなわち、２ｍｇ／ｍｌよりも高い）製剤は、上記の背景技術に記載されているように、臨床結果から分かるように効果ゼロまたは有害効果さえも示した。ｒｈＣＣ１０製剤は、５．６ｍｇ／ｍｌであり、患者の鼻孔に直接適用した（Widegrenら、2009）。逆に、ｒｈＣＣ１０の濃度が２５０μｇ／ｍｌ〜２６２μｇ／ｍｌである実施例４では、臨床上の利点が得られた。無関係の実験では、重度の低酸素症の早産のラムを、気管支内注入による投与によってｒｈＣＣ１０の５．５ｍｇ／ｍｌ製剤を用いて体重１ｋｇ当たり５ｍｇで処理すると、３／４の動物が、薬物投与の４時間以内に呼吸不全で死に、プラセボで処理した４匹の動物は１匹も死ななかった（未発表、Ikegami, M.、Cincinnati大学）。対照的に、ｒｈＣＣ１０の同じ製剤を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、挿管された早産のラムに気管支内注入によって投与すると、動物は、プラセボと比較して、薬物摂取による様々な利点を示した（Miller、2005a、2005b、2007; Shashikant、2005）。どの特定の理論に拘束されることなく、この現象は、ｒｈＣＣ１０の極めて広範囲の水和に関連し得る。すなわち、ＣＣ１０に配位される水分子の数は平均的なタンパク質よりも多い。粘膜および他の体液への高濃度のＣＣ１０の投与は、「サブトラクション」、すなわち局所流体からの水分の喪失をもたらし、これにより局所脱水、および局所生物学的環境における物質間の平衡における有害な混乱が起こる。別法または前述の内容と組み合わせて、ＣＣ１０の急性の局所的な過剰は、ＣＣ１０の存在に対する細胞および組織の脱感作をもたらすことがあり、薬理効果が向上するのではなく薬物の有効性が効果的に減少する。場合によっては、特定の代謝産物またはメディエーターに関与する経路または一連の経路のフィードバック阻害が、実際に、低用量の代謝産物またはメディエーターで観察され得る逆効果（活性化対抑制および逆も同様）となり得る。鼻腔内投与、気管内投与、または他の局所／局所性投与によって鼻および他の粘膜表面に投与されるｒｈＣＣ１０製剤のカットオフは、２ｍｇ／ｍｌであり、これよりも高いと、ｒｈＣＣ１０が効果的ではなく有害とさえなり得る。
［００５７］
以下の詳細な実施例は、実施形態の例示である。当然のことながら、これらは、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］
［００５８］
アレルギー性鼻炎患者に対するｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
ｒｈＣＣ１０は、それぞれが参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３−０１０９４２９号および同第２００３−０２０７７９５号に記載されているプロセス（Claragen, Inc.、College Park、MD）によって大腸菌で生産し、精製した。試験用のタンパク質は、組換えヒトＣＣ１０ホモ二量体の９８％を超える純度の溶液として用意した。各バッチの生物学的活性を、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００２−０１６９１０８号に記載されている独自の分泌ＰＬＡ２阻害アッセイを用いて比較した。
［００５９］
鼻アレルゲン曝露モデルでは、既知のアレルゲンに対する既知の季節性アレルギーの患者に、連続して７日間、鼻咽頭腔内にアレルゲン溶液を滴下注入した。安全上のリスクを最小限にするために、滴下注入するアレルゲンの量を、７日間の曝露期間に渡って４つの主な結果のパラメータを用いて定量される軽度の局所アレルギー応答を誘発するように各患者で注意深く調整した。これらのパラメータには、（１）鼻の症状の全スコア、（２）ピーク鼻呼気流、（３）鼻洗浄液中のバイオマーカーの定量、および（４）ヒスタミン曝露に対する応答が含まれる。
［００６０］
樹木花粉に対して季節性アレルギーの合計３５人の患者に対して、スウェーデンのＬｕｎｄにあるＬｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌにて、ｒｈＣＣ１０対プラセボのプラセボ対照無作為化盲交差鼻アレルゲン曝露試験（placebo-controlled, randomized, blinded, cross-over nasal allergen challenge study）を行った。この試験の目的は、アレルギー性鼻炎の患者における組換えヒトＣｌａｒａ Ｃｅｌｌ １０ｋＤａ（ｒｈＣＣ１０）タンパク質の鼻腔内投与の安全性、許容性、および効果を決定することにあった。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与が、鼻アレルゲン曝露によって引き起こされる鼻性鼻炎の症状を緩和できるか否かを調べることである。
［００６１］
ｒｈＣＣ１０の非存在下での鼻アレルゲン曝露に対する患者の応答をまず測定し、基準データを記録した。合計３９人の患者を、試験に含めるためにスクリーニングした。すべての患者は、年齢が１８〜５０歳で、肥満指数（BMI）が１８ｋｇ／ｍ２〜２８ｋｇ／ｍ２であり、少なくとも過去２年の間、カバノキおよび／またはオオアワガエリ花粉誘発季節性アレルギー性鼻炎であり、その他は健康な男性対象であった。各患者は、少なくとも１つの空気アレルゲン（例えば、オオアワガエリまたはカバノキ花粉）に対して特異的ＩｇＥが上昇するか、または少なくとも１つの皮膚プリックテスト（SPT）で陽性であり、各患者は、アレルゲンによって引き起こされた症状を示し、対応する特異的ＩｇＥの上昇または陽性ＳＰＴを示した。対象がネコおよびイヌに曝露されない条件下でのネコおよび／またはイヌ感受性を除く、通年性アレルギー（例えば、慢性鼻炎）を持つ場合、これらの対象を試験から除外した。また、対象は、試験の開始前の２週間の間に他の鼻疾患（例えば、鼻の構造的な異常、鼻副鼻腔炎、または鼻ポリープ）または任意の上気道感染がある場合、登録の４週間以内に、グルココルチコステロイド、β２アドレナリン作動性受容体作動薬、もしくは任意の他の抗炎症性薬物の鼻腔内、吸引、もしくは全身投与で治療を受けている、または治療を既に受けた場合、あるいは登録前の過去１カ月以内に細菌もしくは真菌感染している場合は除外した。患者の特徴および基準データの要約を表２に示す。
［００６２］
［００６３］
患者を、まず樹木花粉アレルゲンに対する応答についてスクリーニングして、個々の患者の応答に基づいて調整される曝露期間中に投与されるアレルゲンの量を決定した。耳、鼻、および咽の検査ならびにバイタルサインを含む物理的検査を行った。次いで、少なくとも５回のくしゃみおよび／または鼻詰まりまたは鼻漏の症状のいずれかについて０〜３のスケールに対して少なくとも２の症状スコアをもたらすアレルゲン用量を確立するために鼻アレルゲン曝露を行った。鼻漏は、鼻粘膜からの分泌物と定義され、典型的には水様である。すべてのアレルゲン投与は、病院スタッフによってクリニックで行われた。各個人に対して、症状を引き起こす許容される繰り返し可能なアレルゲン用量を鼻の連続曝露について推定するために、すべての対象で滴定法を行った。皮膚プリックテストで最も有意な膨疹反応を誘発するアレルゲン（カバノキまたはオオアワガエリ花粉）を、鼻用滴定のために選択した。増加する用量のアレルゲン（Alutard（登録商標）、ALK、Denmark）を、鼻スプレー装置を用いて１０分間隔で投与した。スプレー装置は、１回の作動で１００μｌを送達し、一吹きが、各鼻孔内にスプレーされると、１鼻孔当たり１００、３００、１０００、および３０００ＳＱ単位の有効量となった。この操作は、患者が、少なくとも５回のくしゃみおよび／または鼻詰まりまたは鼻水の症状のいずれかについて０〜３のスケールに対して少なくとも２以上の症状スコアで急性に反応するまで続けた。この効果をもたらせるアレルゲン用量を、第１および第２の治療期間中の毎日のアレルゲン連続曝露のために選択した（例えば、コホート）。各患者に投与されるアレルゲンの種類および量を表３に示す。
［００６４］
［００６５］
この試験は、花粉のない冬場に行われた。試験は、医師および患者がｒｈＣＣ１０またはプラセボを摂取したか否かを知らないという点で盲検およびプラセボ対照試験であった。試験は、患者がｒｈＣＣ１０治療群またはプラセボ治療群のいずれかに無作為に割り当てられたという点で無作為であった。試験は、各患者が、３〜５週間のウォッシュアウト期間によって分離された２つの７日のコホートで治療されたという点で交差設計であった。各患者は、ｒｈＣＣ１０を摂取したコホートおよびプラセボを摂取したコホートを構成した。患者は、治療期間中の患者の鼻および副鼻腔の不快感を緩和するために、必要に応じて、いくつかの種類の非ステロイド系の薬物を摂取することを許可された。鎮痛薬（アスピリンは含むがイブプロフェンは含まない）および抗生物質は許可され、重度のアレルギー症状の場合は、Ｃｌａｒｉｔｙｎ（登録商標）（Claritin（商標））１０ｍｇが許可され、クリニックによって提供された。
［００６６］
試験作用物質、プラセボ、およびｒｈＣＣ１０を、クリニックの医師および患者が識別できるように数字が貼られた１０ｍＬガラスバイアルに入れた。鍵は、病院の薬局に保管され、医師が患者を治療するためにバイアルの情報が必要な有害事象の場合にのみ、医師に各バイアルの識別が知らされた。Ｖａｌｏｉｓ Ｐｈａｒｍ（France）によって製造された使い捨て医療用鼻スプレー装置を、投与の直前に臨床現場で１０ｍＬバイアルに接続した。この装置は、ポンプ（VP7/100S 18PH）、アクチュエータ（PR147）、およびキャップ（B25/A）から構成されていた。プラセボは、滅菌した非緩衝０．９％塩化ナトリウムから構成されていた。ｒｈＣＣ１０は、濃度５．６ｍｇ／ｍｌの滅菌非緩衝０．９％塩化ナトリウムに溶解した。プラセボおよびｒｈＣＣ１０は共に、容易に識別できない透明で無色無臭の液体とした。各治療期間中の連続した合計７日間の治療で毎日、総量１００μｌのプラセボまたはｒｈＣＣ１０を、各患者の各鼻孔に投与した。すべてのアレルゲンおよび試験作用物質の投与は、病院スタッフによってクリニックで行われた。ｒｈＣＣ１０の１日の合計用量は、１日当たり１．１ｍｇであり、各鼻孔に１００μｌの用量、または１鼻孔当たり０．５６ｍｇでエアロゾルスプレーとして単回投与した。ｒｈＣＣ１０は、アレルゲンの投与の１５分〜３０分前に投与した。
［００６７］
これらの結果を以下の通り測定した。
［００６８］
１．鼻症状の合計スコア（TNSS）
鼻詰まり、鼻漏、およびくしゃみ／鼻の痒みを含む鼻の症状は、朝の試験薬物の投与の前に毎日患者によって得点が付けられ、記録された（前の１２時間の間の症状を格付けしたが、試験薬物投与後の最初の１５分は可能な症状を無視した）。ＴＮＳＳは、各アレルゲンの曝露の１５分後に記録した。加えて、症状は、晩に得点を付けた（投与直後の症状を除く、前の１２時間の間の症状を再び反映した）。症状には、０＝症状無し、１＝軽度の症状、２＝中程度の症状、３＝重度の症状に基づいてそれぞれ得点を付けた。これらのスコアを加えて、０〜９の範囲の各時点の合計スコアを得た。各アレルゲン曝露期間の最後の３日の朝の記録、アレルゲン曝露の１０分後の記録、および晩の記録の鼻症状の平均スコアを統計分析に用いた。
［００６９］
２．ピーク鼻呼気流（PNIF）
ＰＮＩＦは、朝の薬物摂取前、アレルゲン曝露の１０分後、および晩に患者が測定した。測定は、顔面マスクを備えたＰＩＦメータ（Clements-Clarke、Harlow、U.K.）を用いて行った。患者は、測定の際は起立し、両手でマスクを顔にぴったりと取り付け、口を閉じて鼻から呼吸した。患者は、値を記録し、装置を３０の読みに戻し、この手順をさらに２回繰り返した。この３回の測定の最も高い値を毎日記録した。鼻の症状のスコアと同様に、各アレルゲン曝露期間の最後の３日の各時点のＰＮＩＦの記録を、統計分析に用いた。
［実施例２］
［００７０］
薬物の同時投与
プラセボ群およびｒｈＣＣ１０群の両方の合計１０人の患者が、プロトコールの間に患者の不快感およびアレルギー症状を治療するために救急薬が必要であった。表５から分かるように、抗炎症剤、アレルギー薬、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド（Flutide）、およびオキシメタゾリンを含む、鼻腔内の症状を緩和するための様々な局所および全身薬物が摂取された。
［００７１］
［００７２］
ロラタジンは、鎮痛作用のない抗ヒスタミン剤であり、パラセタモールは、鎮痛剤であり、解熱フルチカゾンは、コルチコステロイド抗炎症剤であり、オキシメタゾリンは、選択性α−１作用薬および部分α−２作用薬局所充血除去剤（selective alpha-1 agonist and partial alpha-2 agonist topical decongestant）であり、エバスチンは、鎮痛作用のないＨ１抗ヒスタミン剤である。これらの患者は、ｒｈＣＣ１０と同時のこれらの他の作用物質の同時投与の結果として有意なＡＥを一切受けなかったため、これらの薬物とｒｈＣＣ１０の併用は、安全であり、薬理学的に許容される。
［実施例３］
［００７３］
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与の安全性および忍容性
この概念の実証のための安全性評価の一部として、ヒト有害事象（AE）および重度の有害事象（SAE）におけるｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与を監視し、記録し、報告した。臨床研究者は、ＡＥまたはＳＡＥの基準および定義を満たす事象の検出および文書化に対して責任を有した。ＡＥは、有害事象が薬物と因果関係にあると見なされるか否かについての試験薬物の使用に関連した一時的な臨床試験または対象におけるあらゆる有害な医療事態である。この試験では、事前に存在する状態（すなわち、ＡＥ記録期間が開始される前に存在し、かつ事前の治療の医療履歴／物理的な試験形態に書き留められる障害）は、この状態が悪化するか、またはＡＥ記録期間中の発症の頻度が増加しないかぎり、ＡＥとして記録しなかった。重度の有害事象は、任意の用量で、（１）死に至る、（２）生命を脅かす、（３）入院または既に入院している場合は入院の長期化を必要とする、（４）身体障害／就労不能になる、（５）先天異常／出産異常である、（６）重要な他の医療事象（ＯＭＥ）である、および（７）グレード４のすべての検査所見であるあらゆる有害医療事態と定義した。試験薬物の最初の用量を摂取したときに始まり、試験薬物の停止の２週間後に終了するＡＥ記録期間は通院する（追跡調査来院）。
［００７４］
ＳＡＥは、試験中に起きなかった。全体として、合計１５の有害事象が、プラセボ治療群およびｒｈＣＣ１０治療群の両方の対象で報告された。すべてのＡＥは、軽度の重症度と格付けされた。各群では、１５のＡＥのうちの１１が、試験薬物に対する関連性について評価不能と格付けされ、各群における１５のＡＥのうちの４が、試験薬物に関連している可能性が低いと格付けされた。プラセボを摂取する各患者のＡＥの要約を表６に示し、ＡＥの時点でｒｈＣＣ１０を摂取する患者のＡＥの要約を表７に示す。
［００７５］
［００７６］
［００７７］
したがって、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与が、連続して７日間、１．１ｍｇの分割用量、１鼻孔当たり０．５６ｍｇでエアロゾルとして１日１回投与された場合、ヒトでは安全性であり、忍容性が良好であることが分かった。
［実施例４］
［００７８］
慢性鼻炎および再発性副鼻腔炎（別名、慢性副鼻腔炎）の患者に対するｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
ｒｈＣＣ１０の１１ｍｇ（２ｍｌ）のアリコートを、リン酸二ナトリウムおよび一ナトリウム、およびフェニルカルビノール（保存剤）と塩化ベンジルコニウム（保存剤）、または０．１％チメロゾール（thimerosol）（これも、保存剤）を含有する０．６５％滅菌生理食塩水４２ｍｌを含む軟質プラスチック噴射ボトルに添加して、２５０μｇ／ｍｌのｒｈＣＣ１０溶液を得た。患者は、薬物を排出する開口が鼻孔内に維持されるようにボトルのアプリケータ端部を鼻に挿入し、押圧と吸引を同時に行ってｒｈＣＣ１０を自己投与した。ボトルが迅速に圧迫され、鼻アプリケータ端部の上部の小さいピンホールから液体が押し出されるときに単純なエアロゾルが形成される。送達される量および用量は、加えられる圧迫および力の速さによって決まる。典型的には、ｒｈＣＣ１０ ６．６μｇ〜１３１μｇに一致する２５μｌ〜５００μｌの範囲の量を排出する。圧迫が強ければ強いほど多くの量が送達され、鼻道が洗浄され、用量の一部は、飲み込まれるか、または数分の間、気管支内に流れ得る。
［００７９］
この例では、ｒｈＣＣ１０を、再発性細菌性副鼻腔感染を伴う、通年性アレルギーに起因する、慢性副鼻腔炎による偶発性および／または慢性の副鼻腔の痛みに苦しんでいる患者に投与した。患者の病歴には、（１）過去６年間に副鼻腔感染のために年に２回〜１２回、抗生物質が処方された、（２）過去６年間に鼻腔内コルチコステロイドが処方され、必要に応じて摂取した、および（３）副鼻腔の痛み、鼻および胸の詰まりを緩和し、患者が一晩中眠れるように、非処方鎮痛薬、充血除去剤、および抗ヒスタミン剤を毎日摂取したことが含まれる。ｒｈＣＣ１０は、以下の用量、投与計画、製剤、および薬物−装置組合せで、患者にとって有用な代替および補助療法であった。
［００８０］
初めの投与計画では、患者は、３日間、１日に３回、１鼻孔当たり２回噴射する噴射ボトルからｒｈＣＣ１０を自己投与する３日間前から、痛みを伴う感染性副鼻腔感染に苦しんでいた。この方法を用いた１日の合計摂取用量は、平均７０ｋｇの患者で１日に体重１ｋｇ当たり１．１μｇ〜２２．５μｇに一致する合計７８．６μｇ〜１，５７２μｇ（１鼻孔当たり３９．３μｇ〜７８６μｇ）の範囲であった。次いで、患者は、２日間、１日に２回（平均７０ｋｇの患者で１日に体重１ｋｇ当たり７４９ｎｇ〜１４．６μｇに一致する１日に合計５２．４μｇ〜１，０２４μｇ（１鼻孔当たり２６．２μｇ〜５１２μｇ））、次いで２日間、１日に１回（平均７０ｋｇの患者で１日に体重１ｋｇ当たり３７４ｎｇ〜７．５μｇに一致する１日に合計２６．２μｇ〜５２４μｇ）と用量を漸減した。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内の漸減投与計画の１週間後、患者は使用を中止した。患者の副鼻腔の痛み、鼻炎、および気管支炎の症状（鼻詰まり、くしゃみ、咳、気道閉塞、および胸の詰まり）、ならびに不眠症が、治療の開始から２４時間以内に消失し、ｒｈＣＣ１０の最後の投与から少なくとも６週間は元に戻らなかった。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与は、鼻粘膜のある程度の乾燥が起きたが、患者にとって安全であり忍容性が良好であった。
［実施例５］
［００８１］
再発性副鼻腔炎を予防するための患者へのｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
第２の投与計画では、患者は、初めに副鼻腔の痛みを感じて１２時間以内に、朝と晩の１日に２回、実施例４の製剤およびスプレーボトルのｒｈＣＣ１０を摂取した。副鼻腔の痛みは、強力な広域スペクトル抗生物質（例えば、レバクイン（Levaquin））で１４日間治療し、治療中に痛みは軽減されたが抗生物質の終了から４日以内に元に戻った、細菌性副鼻腔感染の再発に関連していた。便秘および過敏性大腸、胸痛、めまい、四肢の一過性の麻痺および刺痛、極度の日焼け、およびあざができやすくなることを含め、抗生物質に関連した周知の副作用が患者に起きた。結果として、医師は、抗生物質のさらなる使用を中止するように患者に助言した。次いで、患者は、市販の充血除去剤と共にｒｈＣＣ１０を使用して、再発性副鼻腔感染に関連した症状を治療した。最初の投与から２４時間以内に、鼻の痛みおよび鼻詰まりが消失した。患者は、ｒｈＣＣ１０を１週間、１日に２回、次いで１週間、１日に１回に減らして投与して治療を終了した。細菌感染は、ｒｈＣＣ１０での鼻腔内の治療後、少なくとも６週間は再発しなかった。
［実施例６］
［００８２］
維持のためのｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与
季節性または通年性アレルギーおよび空気アレルゲンへの曝露から起きる場合が多い副鼻腔の痛みおよび感染を予防するためにｒｈＣＣ１０を用いた維持療法も可能である。最大２カ月半の間、５００μｇ／ｍｌを超えない（好ましくは２５０μｇ／ｍｌを超えない）製剤濃度で、体重１ｋｇ当たり３７４ｎｇ〜７．５μｇに一致する合計２６．２μｇ〜５２４μｇの用量で、１鼻孔に１回または複数回の作動で与えるｒｈＣＣ１０の毎日の鼻腔内投与は、慢性鼻炎の症状、鼻副鼻腔炎、鼻および胸の詰まり、副鼻腔の感染および痛み、ならびに不眠症を安全に制御し、抗生物質、鎮痛薬（アスピリン、イブプロフェンなどのNSAIDS）、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、および睡眠薬が必要なくなるであろう。
［００８３］
これらの方法、製剤、用量、投与計画、および薬物−装置組合せを用いると、ｒｈＣＣ１０は、慢性鼻炎および細菌性副鼻腔感染（別名、慢性副鼻腔炎）に関連した症状の緩和に有効であった。重度または再発性副鼻腔感染のさらに別の場合では、いくつかの他の抗生物質（アモキシシリン、ジスロマック（Zithromax）、ビアキシン（Biaxin）など）を用いて細菌の増殖を抑制すると共に、ｒｈＣＣ１０が痛みおよび症状を緩和した。軽度の感染で、重度の痛みを伴う感染を予防するためには、抗生物質を用いずにｒｈＣＣ１０を用いて、抗生物質に関連した負の副作用を患者から排除する。ｒｈＣＣ１０、充血除去剤、抗ヒスタミン剤、および抗生物質との間の潜在的な相互作用に関連した有害事象は存在しない。したがって、市販の充血除去剤および抗ヒスタミン剤、ならびに鼻性副鼻腔炎に対して一般に処方される抗生物質は、全く使用しないか、または中程度から重度の鼻の症状を緩和するためにｒｈＣＣ１０と共に安全に使用した。
［実施例７］
［００８４］
コルチコステロイド治療抵抗性で抗生物質が効かない急性副鼻腔感染の治療のためのｒ
ｈＣＣ１０の鼻腔内投与
患者は、痛み、圧迫感、睡眠障害、起立時の血圧の低下、および歩行不能によって特徴付けられた重度の進行中の副鼻腔感染に苦しんでいた。患者は、空気アレルゲン（季節性または通年性）に対してアレルギーがなく、感染は、季節性アレルゲンが存在しない１月に起きた。副鼻腔感染の診断および重症度は、ＣＴスキャンによって評価した。ｒｈＣＣ１０を摂取する前に、患者は、抗生物質を５週間服用し（アモキシシリンを５００ｍｇ／日で１０日間、次いでオウグメンチンを４ｇ／日で３週間）、鼻腔内コルチコステロイド治療を１０日間受けた（プロピオン酸フルチカゾン）。これらの治療にもかかわらず、患者は、相当な痛み、副鼻腔全体の圧迫感、および顔面浮腫（腫れ）が残ったままであった。ｒｈＣＣ１０を摂取する直前は、患者の鼻中隔の両側は、濃い赤色であり、容易に目に見える拡張した毛細血管を含み、重度の局所炎症の存在を示していた。リン酸二ナトリウムおよび一ナトリウム、フェニルカルビノール（保存剤）、および塩化ベンジルコニウム（保存剤）を含有する０．６５％生理食塩水に溶解した２５０μｇ／ｍｌのｒｈＣＣ１０溶液を、１鼻孔当たり約２０μｇ〜５０μｇの用量で各鼻孔内にスプレーとして鼻腔内に単回投与した。ｒｈＣＣ１０の鼻腔内単回投与を受けた約１２時間後に、患者の鼻中隔は、正常なくすんだ紫色で、拡張した毛細血管は見当たらず、強い局所抗炎症効果を示していた。患者は、１日に２回のｒｈＣＣ１０の服用を７日間続け、副鼻腔の痛みおよび圧迫感の症状の緩和を示した。ｒｈＣＣ１０の投与計画は、３日間の１日２回の１鼻孔当たり２回の噴射から、３日間の１日２回の１鼻孔当たり１回の噴射、そして３日間の１日１回の１鼻孔当たり１回の噴射に漸減するものであった。患者は、この計画を４日間続けた。しかし、５日目に、患者が、鼻スプレーで到達させるのに困難な篩骨洞に強い痛みが残っていることに気付いた。その後、ｒｈＣＣ１０の篩骨洞領域の表面への到達を増加させるために、洗浄技術によって同じ計画でｒｈＣＣ１０を投与した。この洗浄法では、合計用量２５０μｇのｒｈＣＣ１０（すなわち、２５０μｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ）を、標準的な市販の鼻洗浄液１１８ｍｌ（１／２カップ、４液量オンス）に添加した。患者は、ｒｈＣＣ１０製剤が副鼻腔内に３〜５分間留まるように、頭を後に傾けた仰臥位で洗浄を受けた。次いで、患者は、鼻をかむことにより洗浄液を流出させて排出できるように上半身を起こした。洗浄液は、２日間、１日２回、次いで３日間、１日１回投与を行って終了した。ｒｈＣＣ１０の最初の投与から２１日後にＣＴスキャンを行うと、瘢痕、上皮の肥厚、または他の残りの閉塞の形跡が一切なく、副鼻腔感染の完全な消散が明らかになった。ｒｈＣＣ１０製剤は、アレルギーではなく細菌感染によって引き起こされた強力な抗炎症反応を媒介した。ｒｈＣＣ１０はさらに、鼻腔内コルチコステロイドの形の標準的な抗炎症療法が失敗した場合に、抗炎症反応を媒介した。また、ｒｈＣＣ１０は、細菌感染の除去を促進し、細菌感染が、追加の抗生物質を使用することなく消散した。最終的に、ｒｈＣＣ１０は、瘢痕、線維症、および典型的にはこのような重度の感染に付随する上皮の肥厚を回避して、鼻上皮の完全な回復を介在した。
［実施例８］
［００８５］
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内製剤
ｒｈＣＣ１０の鼻腔内送達は、例えば、通年性アレルギー、感染、またはある種の他の形態の急性もしくは慢性の上部呼吸器刺激による上部呼吸器（鼻および副鼻腔および上気道）の炎症および線維症を治療する際に有用である。ｒｈＣＣ１０は、例えば、３．９〜８．５の広範なｐＨ値、および広範な塩濃度（例えば、０．１％〜４％）、ならびに様々なアルコール／水混合物（例えば、０．１％〜９０％エタノール）の様々な水溶液に溶解性である。したがって、ｒｈＣＣ１０は、限定されるものではないが、例えば、液体エアロゾルの自己投与用の用量制御ができない単純な噴射ボトル、液体エアロゾルの自己投与用のポンプ作動式または圧力式キャニスター定量噴霧装置、自己投与用の推進剤駆動乾燥粉末または液体エアロゾル定量噴霧装置、鼻道への局所送達用のゲル付き鼻用スワブ、ならびに意識のあるまたは意識のない患者への任意または強制投与のための副鼻腔洗浄用および深い局所投与用の薬物充填シリンジを含め、様々な鼻腔内排出装置に使用できる溶解性および安定性の特性を有する。
［００８６］
上記に基づいて、鼻性鼻炎、特に非アレルギー性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープを安全に治療、治癒、および予防するのに有効なｒｈＣＣ１０の投与量の臨界範囲を見出した。したがって、本発明は、鼻性鼻炎、特に非アレルギー性鼻炎、鼻性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、および鼻ポリープの症状の治療に有効であり、このためこれらの症状に苦しんでいる小児および成人患者の重大な病的状態を軽減するが、危険な副作用を一切引き起こさない、安全で忍容性が良好な、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与に基づいた療法を提供する。
［書類名］特許請求の範囲
［請求項１］
患者の鼻道の鼻副鼻腔炎を治療するための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項２］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約１．５μｇ〜約１．５ｍｇである、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約１．１ｍｇ未満である、請求項１に記載の方法。
［請求項４］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約０．７５μｇ〜約６５０μｇである、請求項１に記載の方法。
［請求項５］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に約０．５μｇ〜約３７０μｇである、請求項１に記載の方法。
［請求項６］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項１に記載の方法。
［請求項７］
ｒｈＣＣ１０の投与が、約２日繰り返される、請求項１に記載の方法。
［請求項８］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項１に記載の方法。
［請求項９］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項１に記載の方法。
［請求項１０］
患者の鼻ポリープの成長もしくは再成長を防止または遅くするための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項１１］
約１．５μｇ〜１．５ｍｇのｒｈＣＣ１０が、少なくとも２日間、毎日投与される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に１．１ｍｇ以下である、請求項１０に記載の方法。
［請求項１３］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１４］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１５］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項１０に記載の方法。
［請求項１６］
患者の慢性または再発性細菌性副鼻腔感染症を治療または予防するための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項１７］
約１．５μｇ〜１．５ｍｇのｒｈＣＣ１０が、少なくとも２日間、毎日投与される、請求項１６に記載の方法。
［請求項１８］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に１．１ｍｇ以下である、請求項１６に記載の方法。
［請求項１９］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項１６に記載の方法。
［請求項２０］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項１６に記載の方法。
［請求項２１］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項１６に記載の方法。
［請求項２２］
患者の副鼻腔の痛みを治療するための安全で忍容性が良好な方法であって、ｒｈＣＣ１０を前記患者に投与する工程を含む、方法。
［請求項２３］
約１．５μｇ〜１．５ｍｇのｒｈＣＣ１０が、少なくとも２日間、毎日投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２４］
投与されるｒｈＣＣ１０の量が、１日に１．１ｍｇ以下である、請求項２２に記載の方法。
［請求項２５］
ｒｈＣＣ１０の投与が、１日に約３回繰り返される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２６］
ｒｈＣＣ１０が、滴下注入、洗浄、スワブアプリケータ、またはスプレーによって鼻道に投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２７］
ｒｈＣＣ１０が、抗生物質、抗ヒスタミン剤、充血除去剤、粘液溶解薬、鎮痛薬、局所作用血管収縮薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ステロイド、鼻用賦形剤、または任意のこれらの組合せと併用投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２８］
鼻用賦形剤とｒｈＣＣ１０を含有する処方を含む、ｒｈＣＣ１０の鼻腔内投与のための医薬組成物。
［請求項２９］
２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度でｒｈＣＣ１０を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
［請求項３０］
ｐＨ４．０〜８．０の０．６５％塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、フェニルカルビノール、リン酸一ナトリウム、および塩化ベンザルコニウム中に２５０μｇ／ｍｌの濃度でｒｈＣＣ１０を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
［請求項３１］
ｒｈＣＣ１０が、請求項２９に記載の医薬組成物の形態で１日に最大４回、１鼻孔当たり２０μｇ〜５０μｇの用量で投与される、請求項１、１０、１６、および２２に記載の方法。
［請求項３２］
請求項３０に記載の医薬組成物と、鼻道の表面へのｒｈＣＣ１０の局所適用を可能にする圧迫スプレーボトル、ポンプ作動式スプレー装置、定量噴霧鼻用アクチュエータ、シリンジ型滴下注入装置、鼻用スワブアプリケータ、または「ネティポット」洗浄装置と、を含む薬物−装置組合せ構成物。
Claims (12)
- 患者の肺組織におけるインフルエンザの力価を低下させる方法であって、ヒトＣＣ１０又はｒｈＣＣ１０を患者に投与することを含む方法。
- 前記ｒｈＣＣ１０が、患者のインフルエンザ感染を処置、治療、又は予防する、請求項１に記載の方法。
- 前記インフルエンザが、Ａ型インフルエンザである、請求項１に記載の方法。
- 前記インフルエンザが、インフルエンザのＨ１Ｎ１株である、請求項１に記載の方法。
- 前記ヒトＣＣ１０又はｒｈＣＣ１０が、鼻腔内経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
- 前記ヒトＣＣ１０又はｒｈＣＣ１０が、鼻腔内経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
- 前記ヒトＣＣ１０又はｒｈＣＣ１０が、鼻腔内経路と静脈内経路の組合せによって投与される、請求項１に記載の方法。
- 患者の組織におけるウイルスの力価を低下させる方法であって、ヒトＣＣ１０又はｒｈＣＣ１０を患者に投与することを含む方法。
- 患者の組織におけるウイルスの力価を低下させる方法であって、組換え型セクレトグロビンを患者に投与することを含む方法。
- 細胞レベルでウイルスの自己複製を阻害する方法であって、ヒトＣＣ１０又はｒｈＣＣ１０を感染患者に投与することを含む方法。
- 細胞レベルでウイルスの自己複製を阻害する方法であって、ＣＣ１０又は組換え型ＣＣ１０を感染動物に投与することを含む方法。
- 細胞レベルでウイルスの自己複製を阻害する方法であって、ＣＣ１０又は組換え型ＣＣ１０を感染細胞に投与することを含む方法。
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