JP2016131498A - Primer for amplifying influenza virus rna, and influenza virus detection method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列を特異的に増幅可能なプライマー、およびそれを用いたインフルエンザウイルスの検出方法に関する。 The present invention relates to a primer capable of specifically amplifying a specific nucleotide sequence of influenza virus RNA, and a method for detecting influenza virus using the primer.
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルス（ゲノムとしてＲＮＡを有するウイルス）であり、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。さらにＡ型は、ウイルス表面上のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質に基づいて、亜型へと分類される。インフルエンザウイルスのうちＡ型（中でもＨ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）ならびにＢ型は、季節性インフルエンザとして毎年流行を繰り返している。 Influenza viruses are RNA viruses belonging to the Orthomyxoviridae family (viruses having RNA as a genome), and are classified into types A, B and C. Type A is further classified into subtypes based on the HA and NA proteins on the viral surface. Among influenza viruses, type A (especially H1N1 and H3N2 subtypes) and type B have been repeated every year as seasonal influenza.
インフルエンザに対する治療法としては、抗インフルエンザウイルス薬の投与が効果的である。しかしながら抗インフルエンザウイルス薬の多くはウイルスの増殖を阻害する作用機構のため、発症後早期に投与する必要がある。また類似の症状を示す他のウイルスや病原菌に対しては効果がない。従って、季節性インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出することが、臨床上重要である。 As a treatment for influenza, administration of an anti-influenza virus drug is effective. However, many anti-influenza virus drugs need to be administered early after onset because of the mechanism of action that inhibits virus growth. It is also ineffective against other viruses and pathogens that show similar symptoms. Therefore, it is clinically important to detect seasonal influenza viruses quickly and with high sensitivity.
インフルエンザウイルスの検出法としては種々の方法が知られており、中でも臨床的にはイムノクロマト法による検出法が最も用いられている。しかしながら、イムノクロマト法による検出法は検出感度が低く、インフルエンザウイルス数が少ない感染初期では検出できないことが課題となっている。 Various methods for detecting influenza virus are known, and among them, the detection method by immunochromatography is the most clinically used. However, the detection method by the immunochromatography method has a low detection sensitivity and cannot be detected at the early stage of infection with a small number of influenza viruses.
イムノクロマト法よりも高感度にインフルエンザウイルスを検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＴＲＣ法（特許文献２、非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）等の核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に増幅して検出するため、インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出できる可能性を有している。しかしながらインフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出するには、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）、すなわちフォワードプライマー（第一のプライマー）とリバースプライマー（第二のプライマー）との組み合わせを最適化する必要がある。 RT-PCR method, TMA method (Patent Document 1), TRC method (Patent Document 2, Non-Patent Document 1), NASBA method (Patent Documents 3 and 4) are methods for detecting influenza virus with higher sensitivity than immunochromatography. A detection method using a nucleic acid amplification method such as the above is known. Since the detection method using the nucleic acid amplification method specifically detects and detects influenza virus RNA, it has the potential to detect influenza virus rapidly and with high sensitivity. However, in order to detect influenza virus quickly and with high sensitivity, oligonucleotides (primers) for specifically amplifying influenza virus RNA, ie, a forward primer (first primer) and a reverse primer (second primer) It is necessary to optimize the combination.
本発明の目的は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的かつ迅速、高感度に増幅可能なプライマー、および当該プライマーを用いたインフルエンザウイルスの検出法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a primer capable of specifically, rapidly and sensitively amplifying influenza virus RNA, and a method for detecting influenza virus using the primer.
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的かつ迅速、高感度に増幅可能なプライマーセットを見出し、本発明に到達した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have intensively studied. As a result, they have found a primer set capable of amplifying influenza virus RNA specifically, rapidly and with high sensitivity, and reached the present invention.
すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１７、１８、４１、４８から５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号３５、３６、４７のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセットである。
That is, the first aspect of the present invention is:
The first primer having a sequence complementary to a part of a specific base sequence of influenza virus RNA contained in a sample, and the second primer having a sequence homologous to a part of the specific base sequence, A primer set for amplifying a nucleic acid comprising a specific base sequence or a complementary sequence of the specific base sequence,
The first primer is one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 17, 18, 41, 48 to 50;
The second primer is one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 35, 36, and 47.
The primer set.
また本発明の第二の態様は、
第一のプライマーが、配列番号１１、１３、５１から５３、５６のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号５４、５５、５７のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記第一の態様に記載のプライマーセットである。
The second aspect of the present invention is as follows.
The first primer is one or more oligonucleotides consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 11, 13, 51 to 53, 56;
The second primer is one or more oligonucleotides consisting of at least 19 consecutive bases in the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 54, 55, and 57.
The primer set according to the first aspect.
また本発明の第三の態様は、
第一のプライマーが、配列番号４から１６、３７から４０のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１９から３４、４２から４６のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記第二の態様に記載のプライマーセットである。
The third aspect of the present invention is as follows.
The first primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 4 to 16, 37 to 40,
The second primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 19 to 34 and 42 to 46,
It is a primer set as described in said 2nd aspect.
また本発明の第四の態様は、
第一のプライマーが、配列番号７、９、１０のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチド、および配列番号３８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１９、２８のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチド、および配列番号４４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第三の態様に記載のプライマーセットである。
The fourth aspect of the present invention is:
The first primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 7, 9, and 10; and the oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 38;
The second primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 19 and 28, and oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 44,
It is a primer set as described in said 3rd aspect.
また本発明の第五の態様は、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットである。 The fifth aspect of the present invention is the method according to any one of the first to fourth aspects, wherein a promoter for RNA polymerase is further added to the 5 ′ end of either the first or second primer. It is a primer set of description.
さらに本発明の第六の態様は、前記第一から第五の態様のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを用いて、インフルエンザウイルスＲＮＡを検出する方法である。 Furthermore, a sixth aspect of the present invention provides a nucleic acid comprising a specific base sequence amplified by the primer set according to any of the first to fifth aspects or a complementary sequence of the specific base sequence, a part of the nucleic acid And influenza virus RNA using a nucleic acid probe labeled with an intercalating fluorescent dye that can specifically hybridize under stringent conditions.
また本発明の第七の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第六の態様に記載の方法である。 In the seventh aspect of the present invention, the oligonucleotide constituting the nucleic acid probe labeled with the intercalating fluorescent dye is an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, and / or SEQ ID NO: 2. The method according to the sixth aspect, which is an oligonucleotide comprising the base sequence described in 1. or a complementary sequence thereof.
さらに本発明の第八の態様は、
前記第一から第五の態様のいずれかに記載のプライマーセットと、
配列番号１に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、
インフルエンザウイルスＲＮＡ検出試薬である。
Furthermore, an eighth aspect of the present invention provides
The primer set according to any one of the first to fifth aspects;
An oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and / or a nucleic acid probe obtained by labeling an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof with an intercalating fluorescent dye ,
Influenza virus RNA detection reagent.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明において特定塩基配列とは、インフルエンザウイルスＲＮＡのうち、第二のプライマーとの相同領域の５’末端から第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。 In the present invention, the specific base sequence refers to a base sequence from the 5 'end of the homologous region with the second primer to the 3' end of the complementary region with the first primer in influenza virus RNA.
本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。 Examples of stringent conditions in the present invention include 50% (v / v) formamide, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 50 mM phosphoric acid at 42 ° C. Examples include conditions in which sodium buffer (pH 6.5), 150 mM sodium chloride, and 75 mM sodium citrate are present, and nucleic acid amplification conditions described in the examples of the present specification.
本発明は、
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の６１０番目から６４７番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の６５５番目から６９２番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４（Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の４２５番目から４５４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の５６９番目から５９８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号５０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７２番目から４９７番目までの塩基配列の相補配列）のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号３５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７６６番目までの塩基配列）、配列番号３６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７９３番目までの塩基配列）、配列番号４７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４０番目から５６６番目までの塩基配列）のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いることを特徴としている。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。
The present invention
As a first primer having a sequence complementary to a part of a specific base sequence of influenza virus RNA contained in a sample, SEQ ID NO: 17 (GenBank No. FJ969536 (H1N1 subtype A influenza virus RNA (-strand)) Complementary sequence of the nucleotide sequence from the 610th to the 647th sequence), SEQ ID NO: 18 (GenBank No. KJ741989 (H3N2 subtype A influenza virus RNA (-strand)) complementary sequence of the 655th to 692th nucleotide sequences ), SEQ ID NO: 41 (complementary sequence of base sequence from 425th to 454th of GenBank No. CY115184 (type B influenza virus RNA (-strand))), SEQ ID NO: 48 (569th to 598th of GenBank No. FJ969536) Bases up to Sequence complementary), SEQ ID NO: 49 (complementary sequence of base sequence from 618 to 643 of GenBank No. KJ741989), SEQ ID NO: 50 (complementary sequence of base sequence from 472 to 497 of GenBank No. FJ969536) ) One or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence according to any one of
As a second primer having a sequence homologous to a part of the specific base sequence of influenza virus RNA contained in the sample, SEQ ID NO: 35 (base sequence from 717th to 766th in GenBank No. FJ969536), SEQ ID NO: 36 (GenBank No. KJ741989, nucleotide sequence from 762 to 793), SEQ ID NO: 47 (GenBank No. CY115184, nucleotide sequence from 540 to 566) and stringent conditions One or more oligonucleotides that can specifically hybridize with
It is characterized by using each. That is, the base sequence may be substituted, deleted, added, or modified as long as the base sequence can be sufficiently specifically and efficiently hybridized under the stringent conditions described above. The length of the primer can be arbitrarily set, but is preferably in the range of 10 to 50 bases.
本発明のプライマーセットは、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡの種類により、前述したオリゴヌクレオチドの中から適宜選択して用いればよい。例えば、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＨ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、
第一のプライマーとして、配列番号１７、４８、５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
第二のプライマーとして、配列番号３５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いればよく、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＨ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、
第一のプライマーとして、配列番号１８、４９、５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
第二のプライマーとして、配列番号３６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いればよく、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、
第一のプライマーとして、配列番号４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
第二のプライマーとして、配列番号４７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いればよい。さらに複数の種類のインフルエンザウイルスＲＮＡを同時に検出したい場合は、前述した各種インフルエンザウイルスＲＮＡに適したプライマーセット（第一および第二のプライマー）を混合させればよい。例えば、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出したい場合は、
第一のプライマーとして、
配列番号１７もしくは４８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号１８もしくは４９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとの混合物、または
配列番号５０に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号４１に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとの混合物を、
第二のプライマーセットとして、
配列番号３５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号３６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号４７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとの混合物を、
それぞれ用いればよい。
The primer set of the present invention may be appropriately selected from the oligonucleotides described above depending on the type of influenza virus RNA to be detected. For example, if the influenza virus RNA to be detected is H1N1 subtype A influenza virus RNA,
As a first primer, an oligonucleotide capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 17, 48 and 50,
As the second primer, one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35,
If the influenza virus RNA to be detected is H3N2 subtype A influenza virus RNA,
As a first primer, an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence of SEQ ID NO: 18, 49, 50,
As the second primer, one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36,
If the influenza virus RNA to be detected is type B influenza virus RNA,
As a first primer, an oligonucleotide capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41,
As the second primer, one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 47,
Each may be used. Furthermore, when it is desired to simultaneously detect a plurality of types of influenza virus RNA, primer sets (first and second primers) suitable for the various influenza virus RNAs described above may be mixed. For example, if you want to detect both influenza A RNA (types H1N1 and H3N2) and type B influenza virus,
As the first primer,
An oligonucleotide capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 48 and capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18 or 49 A mixture of an oligonucleotide and an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41, or a specific sequence under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 50 A mixture of the oligonucleotide that can be hybridized with the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 and the oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions,
As a second primer set,
An oligonucleotide capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 35; and an oligonucleotide capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 36; A mixture of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 47 and an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions,
Each may be used.
配列番号１７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１０番目から６４７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６２５番目から６４７番目までの塩基配列）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６２１番目から６４０番目までの塩基配列）、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１７番目から６３６番目までの塩基配列）、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１６番目から６３５番目までの塩基配列）および配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１０番目から６３５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide capable of specifically hybridizing under stringent conditions with the base sequence described in SEQ ID NO: 17, the base described in SEQ ID NO: 51 (base sequence from 610th to 647th of GenBank No. FJ969536) Examples include oligonucleotides consisting of at least 20 consecutive nucleotides in the sequence, and more specific examples include SEQ ID NO: 4 (base sequence from position 625 to 647 of GenBank No. FJ969536) and SEQ ID NO: 5 (GenBank No. 5). FJ969536 base sequence from 621st to 640th), SEQ ID NO: 6 (GenBank No. FJ969536 base sequence from 617th to 636th), SEQ ID NO: 7 (GenBank No. FJ969536 base sequence from 616th to 635) And oligonucleotides having the base sequences described in SEQ ID NO: 8 (base sequence from 610th to 635th base of GenBank No. FJ969536).
配列番号１８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６５５番目から６９２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６５６番目から６８０番目までの塩基配列）および配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６６２番目から６８１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence described in SEQ ID NO: 18, the base described in SEQ ID NO: 52 (base sequence from 655th to 692 of GenBank No. KJ741989) Examples include oligonucleotides consisting of at least 20 consecutive nucleotides in the sequence, and more specific examples include SEQ ID NO: 9 (base sequence from 656th to 680th position of GenBank No. KJ741989) and SEQ ID NO: 10 (GenBank No. And an oligonucleotide having the base sequence described in KJ741989 (base sequence from 662 to 681).
配列番号４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４２５番目から４５４番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４３４番目から４５４番目までの塩基配列）、配列番号３８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４３２番目から４５２番目までの塩基配列）、配列番号３９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４２５番目から４５０番目までの塩基配列）および配列番号４０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４２５番目から４４７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 41, the base set forth in SEQ ID NO: 56 (base sequence from GenBank No. CY115184 to the 425th to 454th positions) Examples include oligonucleotides consisting of at least 20 consecutive nucleotides in the sequence, and more specific examples include SEQ ID NO: 37 (base sequence from 434th to 454th positions of GenBank No. CY115184) and SEQ ID NO: 38 (GenBank No. 432 base sequence from 432 to 452 of CY115184), SEQ ID NO: 39 (base sequence from 425th to 450th position of GenBank No. CY115184) and SEQ ID NO: 40 (No. 425 of GenBank No. CY115184) An oligonucleotide having the base sequence described in the above (base sequence from eye to 447).
配列番号４８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の５６９番目から５９８番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１１および配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の５６９番目から５９６番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence described in SEQ ID NO: 48, the base described in SEQ ID NO: 11 (base sequence from GenBank No. FJ969536 from the 569th to the 598th base) Examples include oligonucleotides composed of at least 20 consecutive bases in the sequence, and more specific examples include bases described in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (base sequences from 569th to 596th positions in GenBank No. FJ969536). Examples include oligonucleotides consisting of sequences.
配列番号４９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４３番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１３および配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 49, the base set forth in SEQ ID NO: 13 (base sequence from 618th to 643rd base of GenBank No. KJ741989) Examples include oligonucleotides comprising at least 20 consecutive bases in the sequence, and more specific examples include the bases described in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (base sequence from 618th to 641st positions of GenBank No. KJ741989). Examples include oligonucleotides consisting of sequences.
配列番号５０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７２番目から４９７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７７番目から４９７番目までの塩基配列）および配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７２番目から４９２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 50, the base set forth in SEQ ID NO: 53 (the base sequence from position 472 to position 497 of GenBank No. FJ969536) Examples include oligonucleotides consisting of at least 20 consecutive bases in the sequence, and more specific examples include SEQ ID NO: 15 (base sequence from position 477 to 497 of GenBank No. FJ969536) and SEQ ID NO: 16 (GenBank No. 5). And an oligonucleotide having the base sequence described in FJ969536 (base sequence from 472 to 492).
配列番号３５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７４５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１９番目から７４５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７２１番目から７４５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７２７番目から７４８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７３９番目から７５８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７３９番目から７６０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７４０番目から７５９番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号２７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７４５番目から７６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize with the base sequence described in SEQ ID NO: 35 under stringent conditions, SEQ ID NO: 54 (complementary sequence of the base sequence from 717 to 766 of GenBank No. FJ969536) Among the described base sequences, oligonucleotides comprising at least 19 consecutive bases can be mentioned. As a more specific example, SEQ ID NO: 19 (complementary sequence of base sequences from 717 to 743 of GenBank No. FJ969536), sequence No. 20 (complementary sequence of base sequence from 717 to 745 of GenBank No. FJ969536), SEQ ID NO: 21 (complementary sequence of base sequence from 719 to 745 of GenBank No. FJ969536), SEQ ID NO: 22 (GenBa k No. FJ969536 complementary sequence of nucleotide sequences from 721 to 745), SEQ ID NO: 23 (complementary sequence of 727th to 748th nucleotide sequence of GenBank No. FJ969536), SEQ ID NO: 24 (GenBank No. FJ969536) From the 739th to the 758th base sequence), SEQ ID NO: 25 (complementary sequence of the 739th to 760th base sequence of GenBank No. FJ969536), SEQ ID NO: 26 (the 740th position of GenBank No. FJ969536) And an oligonucleotide having a base sequence described in SEQ ID NO: 27 (complementary sequence of base sequence from 745 to 766 of GenBank No. FJ969536).
配列番号３６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７９３番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６４番目から７９０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６６番目から７９０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７７２番目から７９３番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号３４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７７４番目から７９３番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 55 (the complementary sequence of the nucleotide sequence from 762 to 793 of GenBank No. KJ741989) An oligonucleotide consisting of at least 19 consecutive bases is included in the described base sequence. As a more specific example, SEQ ID NO: 28 (complementary sequence of base sequence from 762 to 788 of GenBank No. KJ741989), sequence No. 29 (complementary sequence of the base sequence from 762 to 786 of GenBank No. KJ741989), SEQ ID NO: 30 (complementary sequence of the base sequence from 762 to 784 of GenBank No. KJ741989), SEQ ID NO: 31 (GenBa k No. KJ741989, complementary sequence of base sequence from 764th to 790th), SEQ ID NO: 32 (complementary sequence of base sequence from 766th to 790th of GenBank No. KJ741989), SEQ ID NO: 33 (GenBank No. KJ741989) And the oligonucleotide having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 34 (the complementary sequence of the nucleotide sequence from 774 to 793 of GenBank No. KJ741989).
配列番号４７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４０番目から５６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号４２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４０番目から５６２番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４２番目から５６５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４３番目から５６５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４３番目から５６１番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号４６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４５番目から５６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 As an example of an oligonucleotide that can specifically hybridize with the base sequence described in SEQ ID NO: 47 under stringent conditions, SEQ ID NO: 57 (the complementary sequence of the base sequence from 540th to 566th of GenBank No. CY115184) An oligonucleotide consisting of at least 19 consecutive bases is included in the described base sequence. As a more specific example, SEQ ID NO: 42 (complementary sequence of base sequence from 540 to 562 of GenBank No. CY115184), sequence No. 43 (complementary sequence of the base sequence from 542 to 565 of GenBank No. CY115184), SEQ ID NO: 44 (complementary sequence of the base sequence from 543 to 565 of GenBank No. CY115184), SEQ ID NO: 45 (GenBa k No. CY115184 complementary sequence of nucleotide sequence from 543 to 561) and SEQ ID NO: 46 (GenBank No. CY115184 complementary sequence of nucleotide sequence from 545 to 566) Can be given.
本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（Ｔ７プロモーター）である配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。 The primer set of the present invention is a primer set for amplifying a nucleic acid comprising a specific base sequence of influenza virus RNA or a complementary sequence of the specific base sequence using a nucleic acid amplification method commonly used by those skilled in the art, such as RT-PCR. Useful as. When a RNA polymerase promoter is further added to the 5 ′ end of either the first or second primer, a nucleic acid comprising a specific base sequence to which the RNA polymerase promoter is added or a complementary sequence of the specific base sequence is obtained. Since it is synthesized, it is preferable in that RNA can be amplified from these nucleic acids using a method of amplifying RNA at a constant temperature such as NASBA method, TMA method, and TRC method. An example of an RNA polymerase promoter is an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 3 which is a T7 RNA polymerase promoter (T7 promoter).
本発明のプライマーセットを用いて増幅したインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識プローブを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブがあげられる。
For detecting a nucleic acid containing a specific base sequence of influenza virus RNA amplified using the primer set of the present invention, a conventionally known nucleic acid detection method can be used. In particular,
(A) a method using electrophoresis or liquid chromatography,
(B) a hybridization method using a nucleic acid probe labeled with a detectable label;
(C) a method using a fluorescent dye-labeled probe designed to change fluorescence characteristics by hybridizing with a part of the base sequence of the amplification product,
Etc. Examples of the fluorescent dye labeled probe (C) include a fluorescent labeled probe using FRET (fluorescence resonance energy transfer) and a nucleic acid probe labeled with an intercalating fluorescent dye.
前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの一例として、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル部分または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍色素を標識した核酸プローブがある。前記核酸プローブはインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。 As an example of a nucleic acid probe labeled with the intercalating fluorescent dye, it can specifically hybridize under stringent conditions with a part of a nucleic acid containing a specific base sequence of influenza virus RNA or a complementary sequence of the specific base sequence. There is a nucleic acid probe in which an intercalating fluorescent dye is labeled through an appropriate linker on the phosphodiester portion or base portion of such an oligonucleotide. When the nucleic acid probe forms a complementary double strand with a specific base sequence of influenza virus RNA (or a complementary sequence of the specific base sequence), an intercalating fluorescent dye portion intercalates with the complementary double strand portion. It is a probe whose fluorescence characteristics change.
前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用としては配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６７９番目から７０１番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが、Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用としては配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが、それぞれあげられる。なお、プライマーセットのときと同様、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出したい場合は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用核酸プローブとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用核酸プローブとを混合させればよい。 As a preferable example of the oligonucleotide constituting the nucleic acid probe labeled with the intercalating fluorescent dye, 679 of SEQ ID NO: 1 (GenBank No. FJ969536) is used for detection of influenza virus RNA of type A (H1N1 subtype and H3N2 subtype). Oligonucleotide for the detection of influenza B virus RNA, the nucleotide sequence from 463 to 483 of GenBank No. CY115184 is used. Complementary sequence) or oligonucleotides comprising the complementary sequence. As with the primer set, type A (H1N1 subtype and H3N2 subtype) influenza can be used to detect both type A (H1N1 subtype and H3N2 subtype) influenza virus RNA and type B influenza virus RNA. What is necessary is just to mix the nucleic acid probe for viral RNA detection, and the nucleic acid probe for influenza B virus RNA detection.
本発明のプライマーセットは、配列番号１７、１８、４１、４８から５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号３５、３６、４７のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる第二のプライマーとから構成される、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであり、インフルエンザウイルスＲＮＡを迅速かつ高感度に増幅／検出することができる。さらに、本発明のプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせを最適化することで、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出することができる。 The primer set of the present invention comprises a first sequence comprising one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 17, 18, 41, and 48 to 50. A sample comprising a primer and a second primer comprising one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 35, 36, and 47 It is a primer set for amplifying a nucleic acid containing a specific base sequence of influenza virus RNA contained therein or a complementary sequence of the specific base sequence, and can rapidly amplify / detect influenza virus RNA. Furthermore, by optimizing the combination of the oligonucleotides that constitute the primer set of the present invention, it is possible to detect both type A (H1N1 subtype and H3N2 subtype) influenza virus RNA and type B influenza virus RNA. .
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は下記に示す方法で調製した。
（１）配列番号５８（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目までの塩基配列）、配列番号５９（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目までの塩基配列（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号６０（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡの５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
Example 1 Preparation of Standard RNA Influenza virus RNA (hereinafter referred to as standard RNA) used in Examples described later was prepared by the method shown below.
(1) SEQ ID NO: 58 (H1N1 subtype A influenza virus, segment 5, cDNA partial sequence, base sequence from position 410 to position 930 of GenBank No. FJ969536), SEQ ID NO: 59 (H3N2 subtype influenza A virus, Segment 5, cDNA partial sequence, nucleotide sequence from position 455 to 975 of GenBank No. NC — 007369 (where C is the 663rd C is T)) and SEQ ID NO: 60 (type B influenza virus, segment 7, cDNA partial sequence, GenBank No. . Double-stranded DNAs having the base sequence described in CY115184 (base sequence from the 206th to the 735th base sequence) are prepared and inserted into T-Vector pMD20 (manufactured by Takara Bio Inc.) (complementary strands of the cDNA sequence). SP6 promoter is added to the 5 ′ terminal side of
(2) The plasmid DNA prepared in (1) was digested with restriction enzymes at the 5 ′ end side of the inserted influenza virus cDNA to prepare linear DNA.
(3) In vitro transcription with SP6 RNA polymerase was performed using the DNA prepared in (2) as a template. Thereafter, the template DNA was completely digested by DNase I treatment and purified to prepare standard RNA. The prepared RNA was quantified by measuring the absorbance at 260 nm.
なお、本例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。 The full length of the standard RNA prepared in this example is about 500 bases, which is a part of the full length of influenza virus RNA (segment 5: about 1500 bases, segment 7: about 1100 bases). Is fully applicable.
実施例２ インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号１に記載の配列の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号２に記載の配列の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した（図１）。
Example 2 Preparation of Nucleic Acid Probe Labeled with Intercalating Fluorescent Dye According to the method of Ishiguro et al. (Ishiguro, T. et al, Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997 (1996)) Linkers are attached to the phosphodiester part between the 17th T and 18th T from the 5 'end of the sequence, and between the 8th A and 9th T from the 5' end of the sequence shown in SEQ ID NO: 2. A nucleic acid probe labeled with an intercalating fluorescent dye (hereinafter referred to as an INAF probe) was prepared by binding oxazole yellow (FIG. 1).
実施例３ Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、ＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと表記）を用いて、下記に示す方法で、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを測定した。なお、配列番号４から８、１１、１２、１９から２７に記載の塩基配列からなるプライマーは、Ｈ１Ｎ１亜型（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６）の塩基配列を基に、
配列番号９、１０、１３、１４、および２８から３４に記載の塩基配列からなるプライマーは、Ｈ３Ｎ２亜型（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９）の塩基配列を基に、
配列番号１５および１６に記載の塩基配列からなるプライマーは、Ｈ１Ｎ１亜型（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６）およびＨ３Ｎ２亜型（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９）で塩基配列が共通している領域を基に、それぞれ設計した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、ＴＥバッファーを用いて１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液１７μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
Example 3 Detection of influenza A virus RNA Using the combination of the first primer, the second primer, and the INAF probe shown in Table 1 (hereinafter referred to as the combination of oligonucleotides), A Type (H1N1 subtype and H3N2 subtype) influenza virus standard RNA was measured. The primers consisting of the base sequences described in SEQ ID NOs: 4 to 8, 11, 12, 19 to 27 are based on the base sequence of H1N1 subtype (GenBank No. FJ969536).
Primers consisting of the base sequences described in SEQ ID NOs: 9, 10, 13, 14, and 28 to 34 are based on the base sequence of H3N2 subtype (GenBank No. KJ741989).
Primers consisting of the base sequences described in SEQ ID NOs: 15 and 16 were designed based on regions having common base sequences in the H1N1 subtype (GenBank No. FJ969536) and H3N2 subtype (GenBank No. KJ741989), respectively. .
(1) Type A (H1N1 subtype and H3N2 subtype) influenza virus standard RNA prepared in Example 1 was diluted with TE buffer to 10 3 copies / 5 μL and used as an RNA sample.
(2) 17 μL of the reaction solution having the following composition was dispensed into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and then 5 μL of the RNA sample was added.
反応液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
９０ｍＭ トレハロース
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）
各０．２μＭ 第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている）
各０．２μＭ 第二のプライマー
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
Composition of reaction solution: concentration is the final concentration after addition of initiator (in 30 μL) 60 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
Each 2.6 mM ATP, CTP, GTP, TTP
3.06 mM ITP
90 mM trehalose 20 nM INAF probe each (prepared in Example 2)
Each 0.2 μM first primer (T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3) is added to the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO.)
Each 0.2 μM second primer 6.4 U AMV reverse transcriptase (Life Science)
142 U T7 RNA polymerase (3) After the above reaction solution was kept at 46 ° C. for 4 minutes, 8 μL of an initiator having the following composition was added.
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
Initiator composition: Concentration is final after addition of initiator (in 30 μL) 21.2 mM Magnesium chloride 102.7 mM Potassium chloride 1.2% Glycerol 11.5% DMSO
(4) Continuously measure the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution for 30 minutes using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube at the same time at 46 ° C. did.
開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１に示す。なお表１中のＮ．Ｔ．は未試験（Ｎｏｔ Ｔｅｓｔｅｄ）を意味する。 The time when the initiator is added is 0 minute, and the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeds 1.2 is determined as positive. Table 1 shows the results of time as detection time. In Table 1, N.I. T.A. Means not tested.
実施例４ Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表２に示す組み合わせを、ＲＮＡ試料としてＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（濃度：１０３コピー／５μＬ）を、それぞれ用いた他は、実施例３と同様な方法でＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出を試みた。結果を表２に示す。
The combinations shown in Table 2 as the combination of the detection oligonucleotide of Example 4 B-type influenza virus RNA, B-type influenza virus RNA (concentration: 10 3 copies / 5 [mu] L) as RNA samples, except for using each of the Example 3 Attempts were made to detect influenza B virus RNA in the same manner as described above. The results are shown in Table 2.
実施例５ Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出（その１）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表３に示す組み合わせを、ＲＮＡ試料としてＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡならびにＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（濃度：１０３コピー／５μＬ）を、それぞれ用いた他は、実施例３と同様な方法でＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの同時検出を試みた。結果を表３に示す。
Example 5 Detection of type A and type B influenza virus RNA (Part 1)
Others, using respectively: the combinations shown in Table 3 as a combination of an oligonucleotide, A type as RNA samples (H1N1 subtype and H3N2 subtype) influenza virus RNA and influenza B virus RNA (10 3 copies / 5 [mu] L Concentration) Attempted simultaneous detection of influenza A and B virus RNA in the same manner as in Example 3. The results are shown in Table 3.
実施例６ Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出（その２）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表４に示す組み合わせを、ＲＮＡ試料としてＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）ならびにＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（濃度：１０コピー／５μＬ）を、それぞれ用いた他は、実施例３と同様な方法でＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの同時検出を試みた。結果を表５に示す。なお表５中の検出時間は検出できた試料の平均検出時間を、検出率はＮ＝１０で測定した結果の検出率を、それぞれ示している。
Example 6 Detection of Type A and Type B Influenza Virus RNA (Part 2)
Except that the combinations shown in Table 4 were used as oligonucleotide combinations, and A type (H1N1 subtype and H3N2 subtype) and B type influenza virus RNA (concentration: 10 copies / 5 μL) were used as RNA samples, respectively. At the same time, an attempt was made to detect influenza A and B influenza virus RNA simultaneously. The results are shown in Table 5. In Table 5, the detection time indicates the average detection time of the detected sample, and the detection rate indicates the detection rate as a result of measurement with N = 10.
Claims (8)
第一のプライマーが、配列番号１７、１８、４１、４８から５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号３５、３６、４７のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。 The first primer having a sequence complementary to a part of a specific base sequence of influenza virus RNA contained in a sample, and the second primer having a sequence homologous to a part of the specific base sequence, A primer set for amplifying a nucleic acid comprising a specific base sequence or a complementary sequence of the specific base sequence,
The first primer is one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 17, 18, 41, 48 to 50;
The second primer is one or more oligonucleotides that can specifically hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 35, 36, and 47.
The primer set.
第二のプライマーが、配列番号５４、５５、５７のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載のプライマーセット。 The first primer is one or more oligonucleotides consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 11, 13, 51 to 53, 56;
The second primer is one or more oligonucleotides consisting of at least 19 consecutive bases in the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 54, 55, and 57.
The primer set according to claim 1.
第二のプライマーが、配列番号１９から３４、４２から４６のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
請求項２に記載のプライマーセット。 The first primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 4 to 16, 37 to 40,
The second primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 19 to 34 and 42 to 46,
The primer set according to claim 2.
第二のプライマーが、配列番号１９、２８のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチド、および配列番号４４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項３に記載のプライマーセット。 The first primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 7, 9, and 10; and the oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 38;
The second primer is one or more oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 19 and 28, and oligonucleotides consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 44,
The primer set according to claim 3.
配列番号１に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、
インフルエンザウイルスＲＮＡ検出試薬。 The primer set according to any one of claims 1 to 5,
An oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and / or a nucleic acid probe obtained by labeling an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof with an intercalating fluorescent dye ,
Influenza virus RNA detection reagent.
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