JP2016121158A - 創傷の治癒 - Google Patents

Abstract

【課題】急性及び慢性のいずれの創傷においてもその創傷治癒プロセスを制御することができ、それによって機能的もしくは美容的な障害をもたらすことなく損傷組織が新しい組織に置き換えられる、治療用組成物、及び美容用組成物の提供。
【解決手段】脈絡叢（ＣＰ）分泌タンパク質として、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦβ、ＴＧＦ‐α、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐１、シスタチン、α‐２ミクログロブリン、多面的因子β、ＮＧＦ、ＮＴ、トランスサイレチン、レチノイン酸、ＰＴＨＬＨ、ハプトコリン、トロポモジュリン３、ＰＥＤＦ、β‐２‐ミクログロブリン、ソマトスタチン、フィブロネクチン、ラミニンβ１、及び分泌された細胞外マトリックス因子、のうち少なくとも２つの混合物を含むＣＰ分泌タンパク質を含有する、治療用組成物、及び美容用組成物。
【選択図】図１

Description

本発明は、創傷の治癒を改善するための、特に瘢痕の形成を予防し、それによって創傷の自然治癒プロセスの過程において傷害組織に起こりうる機能の喪失を予防するための方法および組成物に関する。特に、これに限定されないが、本発明は、糖尿病性潰瘍などの慢性創傷の治癒に関する。

創傷とは、変性性または外傷性の生体物質の喪失を典型的に伴う、組織の完全性の破壊である。単純な創傷としては、皮膚の切創および掻爬創が挙げられ、一方、筋肉組織、骨格系、または内部臓器へのより深い傷害は、複雑創傷（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｗｏｕｎｄｓ）として定義される^１。

創傷はすべて、創傷の種類または組織への損傷の度合いに関わらず、類似の修復プロセスを受ける^{１，２，３}。創傷の治癒には別々の３つのフェーズが認識されている。第一に、劣化した組織の分離および創傷の清浄化のための炎症または浸出フェーズ；第二に、肉芽組織の成長のための増殖フェーズ；ならびに、第三に、成熟化および瘢痕形成のための分化または再生フェーズ、である^１。

炎症フェーズは、止血および炎症を特徴とする。組織への傷害が発生すると、創傷の形成によって損傷を受けた細胞膜が、強力な血管収縮剤であるトロンボキサンＡ_２およびプロスタグランジン２‐アルファを放出する。この最初の反応は、出血を抑える手助けとなる。次に、毛細血管拡張が発生し、炎症細胞（血小板、好中球、白血球、マクロファージ、およびＴリンパ球）が創傷部位へ遊走する。特に、好中球顆粒球が、貪食を介して創傷の清浄化における中心的役割を果たしている。創傷に存在する次の細胞は、白血球とマクロファージである。特にマクロファージは、創傷の治癒に不可欠である。マクロファージによって数多くの酵素およびサイトカインが分泌され、創傷を除去するコラゲナーゼ；線維芽細胞を刺激し（コラーゲン産生のため）、血管新生を促進するインターロイキンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；ならびに、ケラチノサイトを刺激するトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）が挙げられる^２。この段階は、組織再構築のプロセス、すなわち増殖フェーズへの移行を示すものである。

増殖フェーズは、上皮化、血管新生、肉芽組織形成、およびコラーゲン沈着を特徴とする。ＴＮＦアルファなどの複数の因子によって刺激される血管新生は、創傷部位の内部および周辺部へ栄養を送達するのに不可欠であり、効率的な創傷の治癒にとって極めて重要である。肉芽組織形成は、コラーゲンの産生を通して組織の成長を促進する白血球、組織球、形質細胞、マスト細胞、および特に線維芽細胞が関与する複雑な現象である。増殖フェーズを制御する段階および機構は正確には分かっていない。関与するいくつかのサイトカインとして、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および上皮成長因子（ＥＧＦ）が挙げられる。これらすべてがコラーゲンの形成に必要である^２。

典型的な創傷治癒カスケードの最終フェーズは、分化フェーズである。創傷は、収縮を受け、肉芽組織は次第にその体液および血管を減少させ、強化し始め、そしてリモデリングを受けて瘢痕組織が形成される。創傷が皮膚の損傷を伴う場合、創傷治癒におけるこの最終段階は上皮化であり、それによって上皮細胞が遊走して剥皮領域に新しい表面が形成される。創傷が骨格筋への損傷を含む場合、分化して筋芽細胞を形成する衛星細胞を介して新しい筋肉細胞が配置される（増殖フェーズにおける肉芽組織に加えて）^４。創傷治癒の最終段階では、筋芽細胞が分化して筋管を形成し、これが成熟して筋線維に取り込まれる。このプロセスによって創傷部位における筋肉機能がある程度得られるが、筋肉の創傷が、筋肉組織の喪失、瘢痕、および元の筋肉機能の喪失という結果をもたらすことは避けられない。

慢性の創傷および潰瘍などの大きな開放創のいくつかでは、通常の修復プロセスが妨げられ、治癒プロセスが長引くかまたは不完全なものとなる。不十分な創傷治癒に寄与し得る要因は多く、創傷感染、組織低酸素、外傷の繰り返し、組織片（ｄｅｂｒｉｓ）および壊死組織の存在などの局所的原因、ならびに真性糖尿病、栄養不良、免疫不全、およびある種の医薬の使用などの全身的原因が挙げられる。

例えば、糖尿病性潰瘍は、足および下肢切断の原因として最も一般的である。Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の患者の場合、足部潰瘍の発症率はおよそ年２％であり、そのような潰瘍は感染症を起こしやすく、周知のように治癒が困難である。

急性および慢性組織創傷に対する現行の治療法には、循環を改善し、それによって酸素および栄養の創傷部位への送達を改善させ、治癒時間を短縮させる方法が含まれる。これは、超音波治療、磁気および電気刺激、渦流療法（ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、および酸素療法を用いるなど、物理的に達成することができる。しかし、これらの治療法は、創傷治癒プロセスの刺激、さらには加速にさえ効果的ではあるが、それでもやはり、創傷部位において機能的および／または美容的な障害が起こる結果となってしまう^５。

サイトカインならびにＴＧＦ‐ベータ、ＥＧＦ、およびＩＧＦ‐１などの成長因子を用いた新しい治療法が現在研究されている。ＴＮＦアゴニストおよびアンタゴニストもまた、血管新生の改変に有用であり得るものであり、従って、治癒プロセスを直接改善させるための大きな可能性を提供する。しかし、現在までのところ、臨床行為における成長因子の役割は限られてきた。現在市販されている唯一の製品はＰＤＧＦ（Ｒｅｇｒａｎｅｘ）であり、これは、すべてではないがいくつかの研究において治癒時間を少し改善させることが示されているが、治癒組織の美容的または機能的性質の改善には成功していない^２。

従って、急性および慢性のいずれの創傷においてもその創傷治癒プロセスを制御することができ、それによって機能的もしくは美容的な障害をもたらすことなく損傷組織が新しい組織に置き換えられる新たな創傷治癒療法を提供することが求められている。

本発明の目的は、この要求を満たす手助けとなること、および／または人々に有用な選択肢を提供することである。

発明の概要
驚くべきことに、脈絡叢（ＣＰ）細胞によって分泌されるタンパク質が、創傷治癒プロセスの加速、特に全層創傷および慢性創傷の治癒における瘢痕の軽減に有用であることが初めて示された。

従って、本発明は、単離もしくは精製されたＣＰ分泌タンパク質を含む治療用組成物を提供し、ここで、このＣＰ分泌タンパク質は、ＣＰ条件培地（ＣＰ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）から単離もしくは精製される。

本発明はまた、創傷治癒に有用であるタンパク質を分泌するカプセル化ＣＰ細胞を含む治療用組成物も提供する。

本発明はまた、ＣＰ条件培地を含む治療用組成物も提供する。

本発明はまた、ＣＰ条件培地を含む美容用組成物も提供する。

本発明はまた、カプセル化ＣＰ細胞を含む美容用組成物も提供する。

本発明の治療および美容用組成物を薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、医薬組成物を提供することができる。

本発明の組成物は、１もしくは２つ以上の化合物を追加で含んで、付加的なまたは相乗的な効果を得ることができ、ここで、この化合物は、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾンなどのグルココルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、成長因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ‐ベータ、など）、抗生物質、トロフィックまたはトロピック化合物（ｔｒｏｐｈｉｃ ｏｒ ｔｒｏｐｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ペプチド、模倣薬、オリゴヌクレオチド、抗体、阻害薬、ならびに第一および第二世代抗ＴＮＦα薬から成る群より選択される。

本発明の組成物は、局所、皮膚、皮下、皮内、経口、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、骨内、眼内、または静脈内投与のための製剤とすることができる。好ましくは、この組成物は局所投与用に製剤される。

本発明はまた、組織創傷の治癒を改善する方法も提供し、その方法は、本発明の組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明はまた、患者の創傷を治療する方法も提供し、その方法は、本発明の組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明はまた、創傷治癒を促進する方法も提供し、その方法は、本発明の組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明はまた、患者の創傷部位における線維芽細胞の蓄積を調節する方法も提供し、その方法は、本発明の組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明はまた、患者の創傷部位におけるコラーゲンの蓄積を調節する方法も提供し、その方法は、本発明の組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明は、動物およびヒトの両方の創傷治癒に有用であり得る。

ヒトまたは動物である患者の創傷治癒は、以下の機構の１もしくは２つ以上：
（ａ）創傷回復の時間の短縮；
（ｂ）皮膚もしくは上皮の改良された特徴（ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｅｒｍａｌ ｏｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ）の回復
（ｃ）炎症反応の加速および増加；ならびに、
（ｄ）瘢痕組織形成の低減もしくは阻害、
を介して改善され、これによって、治療された組織の機能および美容的外観が改善される結果となる。

本発明のＣＰによって発現されるタンパク質は、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦ‐β、ＴＧＦ‐α、ＩＬ８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐２、シスタチン、ベータ‐２‐ミクログロブリン、多面的因子β（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ β）、ＰＴＨＬＨ、およびその他の成長因子ならびに細胞外マトリックス因子、の混合物（例：２もしくは３種類以上；これらのいずれかの組み合わせ）を含む。

本発明はまた、創傷治癒の改善をそれを必要とする患者に施すための医薬の製造における、ＣＰ条件培地から単離または精製されたＣＰ分泌タンパク質の使用も提供する。

本発明はまた、皮膚の美容的治療のための医薬の製造における、ＣＰ条件培地から単離または精製されたＣＰ分泌タンパク質の使用も提供する。

本発明はまた、創傷治癒の改善をそれを必要とする患者に施すための医薬の製造における、ＣＰ条件培地の使用も提供する。

本発明はまた、皮膚の美容的治療のための医薬の製造における、ＣＰ条件培地の使用も提供する。

本発明はまた、創傷治癒の改善をそれを必要とする患者に施すための医薬の製造における、カプセル化ＣＰ細胞の使用も提供する。

本発明はさらに、皮膚の美容的治療のための医薬の製造における、カプセル化ＣＰ細胞の使用も提供する。

医薬は、局所または全身投与用に製剤してよく、例えば、医薬は、外部の創傷部位への局所投与用に製剤してよく、または内部の創傷部位への注射用に製剤してもよい。美容的治療については、医薬は局所投与用に製剤することが好ましい。

別の実施形態は、脈絡叢（ＣＰ）によって分泌された２もしくは３つ以上の単離または精製されたタンパク質（例：本明細書で示したもの）、および臨床的に許容される表層創傷治療用物品（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｗｏｕｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｒｔｉｃｌｅ）（例：陰圧治療デバイス、包帯、フィルム、および接着剤など）を含む治療用組成物である。

本発明はさらに、創傷治癒を改善する方法において、または美容的皮膚治療のために、それを必要とする患者に対して使用するための単離もしくは精製されたＣＰ分泌タンパク質、ＣＰ条件培地、またはカプセル化ＣＰ細胞を提供する。

本発明はまた、ＣＰ分泌タンパク質を含む組成物の製造方法も提供し、この方法は、以下の工程：
ａ）ＣＰ細胞をインビトロで培養する工程；
ｂ）ＣＰ条件培地を抽出する工程；
ｃ）ＣＰ条件培地を凍結乾燥する工程；および、
ｄ）所望される場合は、工程ｃ）の前もしくは後にＣＰ条件培地を透析にかける工程、
を含む。

凍結乾燥された（および所望される場合は透析にかけられた）ＣＰ条件培地を、適切な医薬キャリアまたは賦形剤と組み合わせて、医薬組成物を作製することができる。

本発明はまた、本発明の方法によって製造された組成物も提供する（例：本明細書で示したもの）。

本発明はさらに、ＣＰ細胞によってインビトロで分泌されたタンパク質の組成を調節して、創傷治癒の向上に効果的であるタンパク質の量を増加させる方法も提供し、前記方法は、以下の工程：
ａ）適切な基本培地中、インビトロにてＣＰ細胞を培養する工程；
ｂ）カプセル状ＣＰ（ＣＰ ｃａｐｓｕｌｏｉｄｓ）の形成を開始させるのに十分な量のマトリックスタンパク質を含有する培地を添加する工程、
を含み、
ここで、前記カプセル状物は、基本培地のみで成長させたＣＰ細胞（例：さらなる工程なし、さらなる追加の剤なし、工程（ｂ）なし）と比較して、非常に高いレベルのタンパク質分泌小胞を含んでいる。

この方法によって抽出されたＣＰ条件培地は、創傷治癒を加速させるのに有用であるＶＥＧＦおよびその他のＣＰ分泌タンパク質の含有量が高められている。

本発明はまた、含有する分泌タンパク質のレベルが調節されたカプセル状ＣＰによって分泌されたＣＰタンパク質を含む組成物も提供し、前記カプセル状物は、本発明の方法で生成される。

ここで本発明を、添付図面の図を参照してより詳細に説明する。

損傷した線維芽細胞単層に対するＣＰ分泌タンパク質のインビトロにおける創傷治癒効果を示す図である。 損傷したケラチノサイト単層に対するＣＰ分泌タンパク質のインビトロにおける創傷治癒効果を示す図である。 インビトロ線維芽細胞創傷モデルに対するＣＰ条件培地のインビトロにおける創傷治癒効果を示す図である。 ブタドナーの脈絡叢によって産生されたＶＥＧＦの量を示す図である。 ブタドナーによって産生されたＶＥＧＦの推定最小１日治療用量を示す図である。 本発明の治療用組成物を作製するためのＣＰ条件培地の種々の製造プロセスを示す図である。 図６ａから６ｅは、線維芽細胞、平滑筋細胞、および炎症細胞遊走に対するカプセル化ＣＰ細胞から分泌されたタンパク質の影響を示す図である（図６ａおよび６ｄ：コントロール；図６ｂ、６ｃ、および６ｅ：カプセル化ＣＰ細胞）。 慢性創傷モデルの創傷面積の減少に対するＣＰ条件培地のインビボにおける効果を示す図である。 コントロール（凍結乾燥ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ）に対して凍結乾燥ＣＰ条件培地を用いたインビボにおける慢性創傷の治癒の証拠を示す図である。 全層創傷の治癒の証拠を示すための、毛包の存在に基づく創傷跡を示す図である。 処理および未処理動物におけるＣＰ条件培地の慢性創傷からの組織の断面を５×の倍率で示す図である。 図６ｂの組織を１０×の倍率で示す図である。 単純な切創による創傷組織の創傷強度を、ＣＰ条件培地で処理したもの（処理）またはコントロール培地で処理したもの（未処理）について示す図である。 図９ａ〜９ｄは、慢性創傷のインビボでの治癒に対するＣＰ条件培地の効果を示す図であり、処理（図９ａ、９ｂ、９ｃ）およびコントロール動物（図９ｂ）の低倍率（×４）での図、ならびに処理およびコントロール動物の間の高倍率での図（図９ｄ）である。 インビトロで培養した通常ＣＰクラスターの透過電子顕微鏡写真を示す図である。 マトリックスタンパク質を含有する培地での培養によりインビトロで生成したカプセル状ＣＰを示す図である。 図９のカプセル状ＣＰを低倍率（×１０）で示す図である。 図９のカプセル状ＣＰを非常に低い倍率（×４）で示す図である。 通常ＣＰ培養細胞から、および培養カプセル状ＣＰから抽出されたＣＰ条件培地からの、第７日および１４日のＶＥＧＦのインビトロでの分泌を示す図である。 図１４ａ〜１４ｂは、ＲＰＭＩ‐ＣＮＰ培地で培養されたカプセル状物（図１４ａ）と比較した、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ培地で培養されたカプセル状ＣＰ（図１４ｂ）中のタンパク質分泌小胞の増加を示す図である。 ＲＰＭＩ‐ＣＰＮで培養された通常ＣＰ細胞と比較した、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭまたはＥＣＭ複合物で培養されたカプセル状ＣＰの発現レベルの変化を３日後（図１５ａおよび図１５ｂ）または１６日後（図１５ｃおよび図１５ｄ）について示す図である。 ＰＬＧＡ‐ＣＰＣＭナノスフィア（ＰＬＧＡ‐ＣＰＣＭ ｎｏｎｓｐｈｅｒｅｓ）のコールター粒子分析を示す図である。 ＰＬＧＡ‐ＣＰＣＭナノスフィアの走査電子顕微鏡写真を示す図である。 創傷治癒プロセスの概略図である。 カプセル状ＣＰと共培養されたＨＵＶＥＣを示す図である（１９Ａおよび１９Ｂ）。 カプセル状ＣＰなしで共培養されたＨＵＶＥＣを示す図である。 組織操作用のデバイスを示す図であり：（Ａ）コントロール組織を含む組織分析用治具（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｆｉｘｔｕｒｅ）；（Ｂ）ＬＣＭ処理組織を含む組織分析用治具；（Ｃ）張力試験のためのサンプリング治具に配置された切創周辺の外植皮膚、である。クランプ機構により、治具内での切創部のセンタリング、および均一な組織サンプリングを確実に行った。剃刀刃の最上部にアルミニウムブロックを配置し、次にプレスを用いて組織を切断した。 消化処理した脈絡叢クラスターの最初の組織培養物を示す図である。（上図）クラスターは、各々２ＣＰ当量を含有する別々のサンプルにおいて、最初の８日間にわたって計数した。示した数値は、平均値＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。（下図）単離後の第２日および第８日における、ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ組織培地中のＣＰクラスターの光学顕微鏡写真。スケールバー＝２５０μｍ。 実験の開始時に等分しておいた別々の回収フラスコにおいてＥＬＩＳＡによって測定した、ＣＰ当量あたりで標準化したＶＥＧＦアウトプットを示す図である。数値は、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。 ＮＨＥＫ細胞（上図）およびおＮＨＤＦ細胞（下図）を含むインビトロスクラッチアッセイにおける面積の減少パーセントを示す図である。基本培地１ｍＬ、ウェルあたりのカプセル化ＣＰクラスターの数を表すものであるｘ軸上に示す用量における培養単層からのカプセル化ＣＰの分離は、トランスウェル膜（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）で行った。数値は、面積減少の平均パーセント、（［開始面積−最終面積］／［開始面積］）＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．、を表す。 Ｈ＆Ｅ組織分析のために処理した開放創の代表的なイメージを示す図である。（Ａ）傷害を受けていない正常なラット皮膚、（Ｂ）バシトラシン処理した開放創、（Ｃ）バシトラシン中のＬＣＭで処理した開放創、および（Ｄ）バシトラシン中のＤＬＣＭで処理した開放創。創傷は１０日間処理し、４日後にサンプリングした。スケールバー＝２００μｍ。 開放創の中央部形態計測（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）を示す図である。数値は、平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。（Ａ）中央の断面全体にわたって上皮付属物（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｐｐｅｎｄａｇｅｓ）を計数した。（Ｂ）創傷の中間部の中央部分内の核計数、および（Ｃ）組織ブロック中間部の創傷面積。 凍結乾燥ＣＰ条件培地を含むバシトラシン軟膏による直線状切創の処理を示す図である。８日間の処理後における代表的なマクロ写真を示す。（Ａ）コントロール ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ、（Ｂ）ＬＣＭ、および（Ｃ）ＤＬＣＭ。 凍結乾燥ＣＰ条件培地を含むバシトラシン軟膏による直線状切創の処理を示す図である。１０日間の処理、およびさらに４日間の治癒後における代表的なイメージを示す。（Ａ）コントロール ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ、（Ｂ）ＬＣＭ、および（Ｃ）ＤＬＣＭ。スケールバー＝１００μｍ。 凍結乾燥ＣＰ条件培地を含むバシトラシン軟膏による直線状切創の処理を示す図である。切創部を中心とした１ｃｍ幅の皮膚セクションの、インストロン張力試験で測定したピーク破断強度（^＊＊ｐ＜０．０１）。

定義
本明細書および請求項を通して用いられる「創傷」とは、１もしくは２つ以上の組織に対する損傷を意味し、切創、掻爬創、および手術による切開など、急性および慢性のいずれをも含む開放創、ならびに例えば挫傷、血腫、筋膜もしくは軟部組織の損傷、ヘルニア、および腹壁の損傷などの内部創傷、さらには熱傷が挙げられる。「創傷」は、外傷によって引き起こされる組織の損傷、または、重なっている疾患によって発生する、虚血を例とする病理的な後遺症に起因する組織の損傷を意味する場合もある。本発明は、潰瘍、および特には糖尿病性潰瘍などの慢性開放創の治癒に特に有用である。

本明細書で用いる「単離された」または「精製された」とは、ＣＰ条件培地から抽出された分泌ＣＰタンパク質を意味する。そのような抽出としては、透析による培地からの塩の除去後の凍結乾燥を挙げることができ、またはＣＰ条件培地は直接凍結乾燥してもよい。

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法でこれらに割り当てられる意味を有し得るものであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得るものであり；「実質的に成っている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「実質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」などは、米国特許法で割り当てられる意味を有し、この用語に制限はなく、列挙されたものの基本的なまたは新規な特徴が列挙されたものを超えるものの存在によって変化しない限りにおいて、列挙されたものを超えるものが存在していてよいが、先行技術の実施形態は除く。

発明の詳細な説明
本発明は、ＣＰ条件培地が、創傷治癒の加速に用いることができるタンパク質のカクテルを含むことを初めて示すものである。特に、このタンパク質カクテルは、創傷治癒の特徴的な３つのフェーズ、すなわち、炎症フェーズ、増殖フェーズ、および分化フェーズのすべてにおいて有用であると思われる。

例えば、創傷をＣＰ条件培地で処理すると、マクロファージの数が増加してマクロファージの創傷部位への遊走が早まり（炎症フェーズ）、コラーゲンの沈着が減少し（増殖フェーズ）、および瘢痕組織形成が著しく低減される（分化フェーズ）。

従って、ＣＰ分泌タンパク質は、創傷治癒プロセスの強力な制御因子であると考えられ、これを操作して、自然の創傷治癒プロセスの過程で傷害組織に通常発生することになる瘢痕形成および結果としての機能の喪失を防止することができる。瘢痕を形成しないことは、特に、顔、首、手など容易に目に付く身体の外側部分に創傷の影響が及ぶ場合、美容的な目的においても重要である。

脈絡叢（ＣＰ）は、脳室の上衣層に由来する細胞の単一の連続層を含む分葉構造である。脈絡叢の１つの機能は、脳脊髄液（ＣＳＦ）の分泌である。脳脊髄液は、脳の４つの脳室を満たしており、脊髄および脳の弓隆部全体を循環している。ＣＳＦは脳の間質（細胞外）液と繋がっており、また、高分子を含む溶質は、ＣＳＦと間質液との間で自由に交換される。ＣＳＦの産生に加えて、脈絡叢は、ＣＳＦ‐血液関門の形成と関連付けられている^６。しかし、そのより広い機能は、部分的には広範囲にわたる成長因子をＣＳＦ中へ分泌することによる、脳および脊髄全体の細胞外環境のベースラインレベルの確立および維持である。ＴＧＦｂ、ＧＤＦ‐１５、ＧＤＮＦ、ＩＧＦ２、ＮＧＦ、ＮＴ‐３、ＮＴ‐４、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ２を含む数多くの強力なトロフィック因子（ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）が脈絡叢内に存在することが研究によって報告されている^７，８。

ＣＰ分泌因子は、神経障害の治療（国際公開第００／６６１８８号）、および自己免疫障害の治療（国際公開第２００６／１３２５４８号）における使用について既に報告されているが、ＣＰ分泌タンパク質が創傷の治療、特に潰瘍などの慢性創傷の治療に有用であることに関する開示も示唆もされていない。特に、ＣＰが、血管新生、すなわち創傷治癒の増殖ステージに関与していることが公知であるＶＥＧＦを分泌することは公知であるが^８、ＣＰは、主としてＣＳＦの完全性に関与する種々の追加の因子も分泌することから、ＣＰ分泌タンパク質のすべてを含有する組成物が創傷治癒の改善、特に慢性創傷の治癒の改善に高い効果を有することは、非常に驚くべきことであった。

本発明は、従って、創傷の治癒に用いるための、精製または単離されたＣＰ分泌タンパク質を含む治療用組成物に関する。ＣＰ分泌タンパク質は、ＣＰ条件培地から単離または精製される。治療用組成物は、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦ‐β、ＴＧＦ‐α、ＩＬ８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐２、シスタチン、ベータ‐２‐ミクログロブリン、多面的因子β、ＰＴＨＬＨ、ならびにその他の成長因子および細胞外マトリックス因子、の混合物（例：２もしくは３種類以上；これらのいずれかの組み合わせ）を含む。

ＣＰ条件培地から抽出され、本発明の方法に有用であるＣＰ分泌タンパク質は、以下で考察するように、動物モデルまたは創傷治癒のインビトロモデルにて生物活性について試験し、適切に活性である組成物を医薬組成物へ製剤することができる。本発明の医薬組成物は、本明細書で述べるＣＰ分泌タンパク質に加えて、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、バッファー、安定化剤、または本技術分野で公知のその他の物質を含んでよい。そのような物質は、無毒性であるべきであり、活性成分の効力に干渉するものであってはならない。キャリアまたはその他の物質の厳密な性質は、医薬組成物の所望される性質、および経口、静脈内、経皮、皮下、皮内、局所、経鼻、経肺、筋肉内、または腹腔内を例とする投与経路に依存する。

経口投与用の医薬組成物は、錠剤、ロゼンジ、カプセル、粉末、顆粒、または液体の剤形であってよい。錠剤またはその他の固体経口剤形は、通常、ゼラチン、デンプン、マンニトール、結晶セルロース、または医薬製造に一般的に用いられるその他の不活性物質などの固体キャリアを含有する。同様に、シロップまたはエマルジョンなどの液体医薬組成物は、一般に、水、石油類、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体キャリアを含有する。

静脈内、経皮、皮下、皮内、筋肉内、骨内、眼内、または腹腔内注射の場合、活性成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される溶液の形態である。

局所投与の場合、活性成分は、適切な皮膚軟化薬に溶解もしくは懸濁され、クリーム、回転塗布剤（ｒｏｌｌ‐ｏｎ）、ローション、スティック、スプレー、軟膏、ペースト、またはジェルの形態に製剤することができ、創傷部位に直接適用するか、またはパッドもしくはパッチなどの中間物を介して適用してよい。

経鼻または経肺投与の場合、活性成分は、微粉末、または吸入に適する溶液もしくは懸濁液の形態である。別の選択肢として、活性成分は、軟膏もしくはクリーム、経鼻スプレー、点鼻薬、またはエアロゾルなど、鼻粘膜への直接の適用に適する形態であってもよい。

治療用組成物は、脈絡叢（ＣＰ）によって分泌された単離または精製されたタンパク質（例：本明細書で示したものの２もしくは３つ以上）、および臨床的に許容される表層創傷治療用物品（例：陰圧治療デバイス、包帯、フィルム、および接着剤など）を含んでよい。そのようなデバイス、包帯、フィルム、および接着剤などは、本技術分野で公知であり、例として含まれる。さらにまた、本明細書の活性な化学療法薬の組み合わせを送達するためのパッチも本発明の範囲内である。パッチは、本明細書で示すように、材料層（例：高分子、布、ガーゼ、包帯）および本明細書の式の化合物を含む。材料層の一方の側は、化合物または組成物の透過を阻止するためにそこに接着させた保護層を有していてよい。パッチは、パッチを対象上の所定の場所に保持するための接着剤をさらに含んでいてよい。接着剤は、天然もしくは合成由来のものを含む組成物であり、対象の皮膚と接触すると一時的に皮膚に接着する。それは、耐水性であってよい。パッチを長時間にわたって対象の皮膚と接触した状態を保持するために、接着剤をパッチ上に配置してよい。接着剤は、偶発的に接触した場合にデバイスが所定の場所に保持されるが、しかし積極的な行動（例：裂く、剥がす、またはその他の意図的な除去）を行うと、デバイスまたは接着剤自体に掛けられた外部圧力に接着剤が屈して、接着による接触を破壊することができるような粘着力または接着力に作製してよい。接着剤は感圧性であってよく、すなわち、その場合、皮膚に対する接着剤（および皮膚に接着されるデバイス）の位置決めを、接着剤またはデバイスに圧力を印加することによって（例：押す、擦る）行うことが可能となる。

さらなる実施形態では、本発明は、治療計画に付加的なまたは相乗的な効果を付与するために、本発明の医薬組成物と共に共投与される１もしくは２つ以上の追加の化合物の使用を意図している。そのような化合物は、一般的に、創傷治癒の速度および質を向上させることを目的とする物質である。そのような物質の例としては、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾンなどのグルココルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、成長因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ‐ベータ、など）、抗生物質、トロフィックまたはトロピック化合物、ペプチド、模倣薬、オリゴヌクレオチド、抗体、阻害薬、ならびに第一および第二世代抗ＴＮＦα薬が挙げられる。そのような物質は、本明細書で述べるＣＰ分泌タンパク質組成物と別々に、順次に、または同時に投与してよく、当業者であれば理解されるように、治療すべき創傷の種類に依存する。

本発明はまた、組織の創傷治癒を改善する方法も提供し、その方法は、本発明の治療用組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。患者は、好ましくはヒトの患者であるが、本発明の方法はまた、非ヒト動物における創傷治癒の改善に用いることもできる。

本明細書で示す方法は、その対象が特定の指定された治療を必要とすると識別される場合の方法を含む。そのような治療を対象が必要とすることの識別は、対象の、または医療専門家の判断によるものであってよく、および主観的（例：意見）または客観的（例：試験もしくは診断方法によって測定可能）であってよい。本明細書で示す方法はまた、対象の治療が成功する、その状態／症状が良くなる、またはその状態／症状が改善する方法も含む。

ヒトまたは動物である患者の創傷治癒は、以下の機構の１もしくは２つ以上：
ａ）創傷回復の時間の短縮；
ｂ）炎症反応の加速および増加；ならびに、
ｃ）瘢痕組織形成の低減もしくは阻害、
を介して改善され、これによって、治療された組織の機能および美容的外観が改善される結果となる。

本明細書で述べるＣＰ分泌タンパク質を含む組成物の特に好ましい適用は、糖尿病性潰瘍などの慢性創傷の治療である。

本発明の別の好ましい適用は、皮膚の創傷の治療である。

ＣＰ分泌タンパク質を含む本発明の組成物が表層または深い皮膚創傷を治療する能力は、公知の方法^９に従って、および以下の実施例５に例示するようにして示すことができる。

本発明における別の好ましい適用は、熱傷の治療である。ＣＰ分泌タンパク質が熱傷による創傷を治療する能力は、公知の動物モデルで示すことができる。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ^１０に記載のようにして行う。

本発明の医薬組成物の投与は、好ましくは、「予防有効量」または「治療有効量」で行い、これは、個体に対して恩恵を示すのに十分な量である。実際の投与量、ならびに投与の割合および時間経過は、治療している創傷の種類の性質および重症度に依存する。用量の決定などを例とする治療の処方は、一般医およびその他の医師の責任の範囲内であり、通常は、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および医師に公知であるその他の因子が考慮される。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．（ｅｄ），１９８０、に記載されている。

本発明はまた、創傷治癒の改善をそれを必要とする患者に施すための医薬の製造におけるＣＰ分泌タンパク質の使用にも関する。ＣＰ分泌タンパク質は、ＣＰ条件培地から単離または精製することができる。

本発明はまた、創傷治癒の改善をそれを必要とする患者に施すための医薬の製造におけるＣＰ条件培地の使用にも関する。

医薬は、局所または全身投与用に製剤してよく、上述のように、例えば、医薬は、外部の創傷部位もしくは開放創部位への局所投与用に製剤してよく、または内部、もしくは深い創傷部位への注射用に製剤してもよい。

医薬は、創傷治癒に対する付加的なまたは相乗的な効果を得るために、上述の免疫反応性化合物の群から選択される１もしくは２つ以上の追加の免疫反応性化合物をさらに含んでよい。医薬は、ＣＰ分泌タンパク質／ＣＰ条件培地、および１もしくは２つ以上の免疫反応性化合物と別々に、順次に、または同時に投与するために製剤してよい。

本発明はまた、ＣＰ分泌タンパク質を含む治療用組成物の製造方法にも関し、前記の方法は、以下の工程：
ａ）ＣＰ細胞をインビトロで培養する工程；
ｂ）ＣＰ条件培地を抽出する工程；
ｃ）ＣＰ条件培地を凍結乾燥する工程；および、
ｄ）所望される場合は、工程ｃ）の前もしくは後にＣＰ条件培地を透析にかける工程、
を含む。

ＣＰ細胞は、ＣＰ細胞の精製された集団を含んでいてよく、または別の選択肢として、グリア細胞もしくはグリア由来細胞、上皮細胞、多能性神経前駆細胞、前駆細胞（ｐｒｏｇｉｎａｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）、および神経前駆細胞マーカー（Ｎｅｕ‐Ｎなど）に対して陽性である細胞、を含む群から選択されるＣＰ由来細胞を含んでいてもよい。

ＣＰ細胞は、適切な哺乳類ドナーから直接入手してよく、または、一次もしくは二次ＣＰ細胞培養物から、または不死化ＣＰ細胞株を含むＣＰ細胞株から、または上記の入手源のいずれかの組み合わせから入手してもよい。培養中のＣＰ細胞は、本技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて遺伝子組換えを施し、創傷治癒の促進に有用である１もしくは２つ以上の所望されるタンパク質を産生させるものであってよい。ドナーから直接入手したＣＰ細胞は、１もしくは２つ以上のＣＰ細胞を含有する脳脊髄液を含んでいてよい。適切なＣＰ細胞ドナーとしては、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ならびにアカゲザル、サル、およびヒトを含む霊長類が挙げられる。ＣＰ細胞は、例えば国際公開第００／６６１８８号に記載のような本技術分野で公知の方法を用いてドナーから単離してよい。

ＣＰ細胞は、単離された細胞または細胞のクラスターを含んでよく、および「そのままの状態（ｎａｋｅｄ）」であっても、または例えばアルギネートでカプセル化されていてもよい。ＣＰ細胞は、「そのままの状態」である場合、互いの直接の接触が「自由」に行われてよく、または分泌タンパク質のＣＰ細胞からの拡散を可能とする生体適合性の分離手段によって分離されていてもよい。ＣＰ細胞のカプセル化は、そのような生体適合性分離手段として機能してよい。ＣＰ細胞のカプセル化は、本技術分野で公知の方法を用いて行ってよい（例えば、国際公開第００／６６１８８号および米国特許第６３２２８０４号を参照）。

ＣＰ細胞の培養は、適切な培地中において、ＣＰ細胞から培地への成長因子などを含む数多くの分泌タンパク質の分泌が可能となる時間および条件下にて行われる。次に、条件培地が細胞から分離され、ＣＰ分泌タンパク質リッチである、細胞を含まないＣＰ製剤が得られる。

ＣＰ条件培地は、図５に示すように、所望される場合は凍結乾燥の前もしくは後に行ってよい透析の工程（塩の除去のため）を含む、治療用組成物を作製するための一連の公知の工程によって作製することができる。実施例４で述べるように、この処理工程により、ＶＥＧＦの濃度が６〜９倍である治療用組成物が得られた。創傷治癒の促進に有用であるその他のＣＰ分泌タンパク質もまた、凍結乾燥したＣＰ条件培地中で濃縮されることが期待される。

凍結乾燥したＣＰ条件培地は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせ、および本発明の方法に用いて、上述のように、創傷治癒を促進することができる。

本発明はまた、ＣＰ細胞によってインビトロで分泌されたタンパク質のプロファイルを調節する方法も提供し、前記方法は、以下の工程：
ａ）適切な基本成長培地中、インビトロにてＣＰ細胞を培養する工程；
ｂ）カプセル状ＣＰの形成を開始させるのに十分な量のマトリックスタンパク質を含有する培地を添加する工程、
を含み、
ここで、このカプセル状ＣＰは、基本成長培地のみで成長させたＣＰ細胞（例：さらなる工程なし、さらなる追加の剤なし、工程（ｂ）なし）と比較して、非常に高いレベルのタンパク質分泌小胞を含んでいる。

マトリックスタンパク質を含有する培地は、実施例６で述べるように、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、およびその他のＥＣＭ成分が豊富である培地であり、カプセル状ＣＰが形成される結果となる。

カプセル状物の形成の結果として、タンパク質分泌小胞の数の増加、および対応する分泌タンパク質、特にＶＥＧＦのレベルの上昇が得られる。このタンパク質分泌の増加は、培地の組成およびカプセル状物形成によってもたらされるタンパク質発現の増加に起因するものである。本発明では、カプセル状ＣＰによって分泌されたタンパク質カクテルを調節して、治療潜在能を最大化することが可能であることも意図している。

理論に束縛されるものではないが、ＣＰ分泌タンパク質は、上記で述べた創傷治癒の認識されている３つすべてのフェーズ、すなわち炎症フェーズ、増殖フェーズ、および分化フェーズ、に作用することで、創傷治癒の改善に効果を示すと考えられる。厳密な機構は分かっていないが、ＣＰによって分泌された成長因子の組み合わせの結果である可能性が高く、そのうちのいくつかは創傷治癒に関与することが過去に示されている。そのような因子としては、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦ‐β、ＴＧＦ‐α、ＩＬ８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐２、シスタチン、ベータ‐２‐ミクログロブリン、多面的因子β、ＰＴＨＬＨ、ならびにその他の成長因子および細胞外マトリックス因子が挙げられる。そのような組み合わせは、これまで創傷治癒に用いられたことはなかった。さらに、ニューロトロフィン（ＮＴ）因子およびトランスサイレチンなどのＣＰによって分泌される多くのその他の因子は、創傷治癒に能動的に関与することは知られておらず、さらにレチノイン酸などのＣＰによって分泌されるその他の因子は、創傷治癒を阻害することが知られている（米国特許第５９７３００７号）。

従って、レチノイン酸、および創傷治癒を促進しないその他のタンパク質も恐らくは含んでいるＣＰ分泌タンパク質のカクテル（例：表４および５に示すものを含む）が、創傷治癒の改善、特に慢性創傷の治癒の向上に極めて効果的であることは驚くべきことである。

例えば、ＣＰ条件培地中のＣＰ分泌タンパク質は、マクロファージ動員に直接の効果を有する。特に、動物をＣＰ分泌タンパク質で処理すると、マクロファージの数、および恐らくは創傷部位への遊走時間の両方が向上する（結果示さず）。従って、創傷治癒の第一フェーズである炎症フェーズは大きく改善され、これによって創傷の清浄化および血管新生がより速く、効率的なものとなることが期待される。

さらに、ＣＰ条件培地中のＣＰ分泌タンパク質はまた、増殖フェーズにおけるコラーゲンの沈着を減少させる結果をもたらす（結果示さず）。ＣＰによって分泌されるタンパク質カクテルは、炎症細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞にとっての化学誘引物質であると考えられる。従って、ＣＰ分泌タンパク質の使用は、創傷部位への線維芽細胞の相対的な動員を比例して減少させ、それによって線維芽細胞の集団が減少したことによりコラーゲンの全体的な産生を低下させる結果になると考えられる。

ＣＰ分泌タンパク質は、さらに、創傷治癒の分化フェーズにおいて瘢痕組織形成の阻害に関与する。具体的には、ＣＰ分泌タンパク質を使用することで、回復した創傷組織における瘢痕組織形成が著しく低減される結果となる。さらに、機能組織の喪失も著しく低減され、すなわち、ＣＰ分泌タンパク質を使用することで、組織の再生が改善される結果にもなり、それによって、回復した組織は瘢痕を形成せずに置き換えられ、従って機能的なまたは美容的な障害はほとんどなかった。このことは、美容手術、または顔、首、手など容易に目に付く身体部分の創傷の治療において特に有益であり得る。

本発明は、皮膚の切創および掻爬創、皮膚および筋肉を通して広がる深い創傷（手術による切開を含む）、ならびに内部創傷（例えば、スポーツによる傷害または外傷に起因する筋肉および腱の創傷）、挫傷、血腫、筋膜、軟部組織の損傷、ヘルニア、腹壁の損傷、さらには熱傷、および潰瘍、特に従来の治療法を用いた治療が非常に困難である糖尿病性潰瘍などの慢性創傷など、あらゆる種類の創傷の治療に有用であると期待される。

説明したマイクロアレイを用いて、ブタＣＰ上皮のトランスクリプトームを調べ、次に、細胞単層、および全層皮膚創傷における分泌ＣＰ産物のインビトロおよびインビボでの再生能力を評価した。インビトロでは、ＣＰは、線維芽細胞およびケラチノサイトのスクラッチ培養物（ｓｃｒａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の空隙領域をそれぞれ７０％および３３％減少させ、これと比較して、空カプセルのコントロールによるその領域の減少は、それぞれ僅かに３５％および６％であった。インビボでは、１０日間の局所投与の後、抗生物質軟膏に分散させたＣＰ条件培地の凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ）は、軟膏単独と比較して切創の引っ張り強さを２倍に改善し、上皮付属物の再生を、創傷あたりおよそ５０から１５０箇所に増加させた。これらのデータを合わせて考えると、ＣＰは、局所創傷、および潜在的にはその他の類似の適応症の治癒を加速、ならびに改善させる分泌された再生分子の分泌源として識別される。創傷治癒プロセスの範囲内においてその成分が豊富であり、重要であることに基づき、ＣＰカクテル全体を同時に適用することで、適切な分子が「必要に応じて」提供され、自然治癒カスケードで発生する細胞、タンパク質、およびマトリックス要素の正確に段階分けされた作用に応じた送達を組み立てる必要性が回避される。インビトロでは、ヒドロゲルでカプセル化したブタＣＰを線維芽細胞またはケラチノサイトのスクラッチ単層（ｓｃｒａｔｃｈｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）と共に共培養し、ＣＰ分子によって引き起こされる遊走および増殖を評価した。インビボでは、ＣＰ条件培地の凍結乾燥物を用いて、全層開放創、および縫合した皮膚の切創を処理した。さらに、条件培地の作製に用いたＣＰからｍＲＮＡを回収して、この特定の培養系で発現された潜在的な再生因子に関連する遺伝子の識別を行った。

本発明はまた、広い意味では、本願の明細書にて言及もしくは示される部分、要素、および特徴の各々または全体から、ならびに前記の部分、要素、もしくは特徴のいずれか２つ以上のいずれのまたはすべての組み合わせからも構成されると考えることもでき、ならびに、本発明が関連する技術分野において公知の均等物を有する具体的な整数が本明細書で述べられる場合、そのような公知の均等物は、個々に示されているかのごとく本明細書に組み入れられると考えられる。

本発明は、前述のものから成り、および、以下の事項が例を与えるに過ぎないその構成も想定している。

物質および方法
脈絡叢の単離
７〜１０日齢の新生仔ヨークシャーブタをケタミン（５００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（０．１５ｍｇ／ｋｇ）で誘導し、次に制御された瀉血の間、３％イソフルランで維持した。開頭の後、脳を取り出し、正中線に沿って半側切断して、側脳室内のＣＰを露出させた。ＣＰを取り出し、シプロフラクソシン（ｃｉｐｒｏｆｌａｘｏｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，米国、３μｇ／ｍｌ）、２％ヒト血清アルブミンを添加したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、０〜４℃）中へ投入し、過去に報告されているようにして消化させた（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ， Ｃ．Ｖ．； ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｉｎ ａ ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １５：２５２１‐２５２５； ２００４； Ｅｍｅｒｉｃｈ， Ｄ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｎ ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｍｏｎｋｅｙｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ２３：４７１‐４８０； ２００６）。簡潔に述べると、ハサミで物理的に分解し、２０分間にわたる光酵素消化（リベラーゼＨＩ，Ｒｏｃｈｅ，ニュージャージー州）の後、ＣＰ上皮クラスターを遊離させた。上皮クラスターを洗浄し、２％新生仔ブタ血清および３μｇ／ｍＬのシプロフラクソシンを含むＲＰＭＩ‐１６４０（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ミズーリ州）（ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ）で維持し、５％ＣＯ_２下、３７℃にて非接着性フラスコ内に配置した。２４時間後、４８時間後、およびその後は１日おきに、培地の半分を除去して新鮮な培地に置換した。ＲＰＭＩ中に配置した０、２、および８日後に、クラスターを計数し、個々のフラスコに分離した。１０日後、培地を無血清内皮細胞培地（ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ，米国）に置換し、過去に報告されているように（Ｔｈａｎｏｓ， Ｃ．Ｇ．； ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ‐ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １３：７４７‐７５６； ２００７）、２４、７２、または９６時間の間隔で条件培地を作製するための実験を通してこれを用いた。

ＲＮＡの単離および遺伝子アレイ
培養ＣＰクラスターからのＲＮＡの単離は、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ組織培地中に配置した３日後または１６日後に行った（Ｎ＝３）。細胞クラスターを破壊し、ＱＩＡシュレッダー（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を用いてバッファーＲＬＴ中にてホモジナイズした。簡潔に述べると、７００μｌの細胞ライセートをＱＩＡシュレッダーに充填し、３０，０００×ｇで遠心分離し、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を用いてＲＮＡを精製した。精製した高品質ＲＮＡをリボヌクレアーゼフリー水（Ｇｉｂｃｏ，米国）で溶離した。Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマーでのプライミングにより一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次にＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼＨを用いてＲＮＡの分解および第二のｃＤＮＡ鎖の合成を同時に行うことにより、転写のための二本鎖ＤＮＡテンプレートへと変換した。ｃＤＮＡを精製し、続いてｃＲＮＡを合成し、インビトロ転写を用いて増幅した。ｃＲＮＡの最終的な精製の後、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）で得た電気泳動図上でサンプルの完全性を確認した。サンプルがアレイ分析に適することを確認後、全ゲノムブタマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，米国）を用いてブタゲノム全体を特徴付けた。ｌｏｇ_２発現レベルが＜７．５である遺伝子は分析から除外した。創傷治癒プロセスに関連する遺伝子を、その相対的な発現の大きさ、および統計的有意性（独立ｔ検定、ｐ＜０．０５）に基づいて表５に挙げた。経時で差異的に発現した遺伝子を、その変化の大きさ（＞＋／−１．８５倍）、および統計的有意性（独立ｔ検定、ｐ＜０．０５）に基づいて表６に挙げた。

インビトロ生物活性：スクラッチアッセイ
過去の報告にあるように、１０日間の培養後、同軸エアジェットシステムを用い、５０，０００クラスター／ｍＬにて、ＣＰクラスターをアルギネート‐ポリオルニチン‐アルギネート（ＡＰＡ）マイクロカプセルでカプセル化した（Ｅｍｅｒｉｃｈ， Ｄ．Ｆ．； ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｎ ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｍｏｎｋｅｙｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ２３：４７１‐４８０； ２００６）。直径６００μｍのカプセルを作製し、ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ中で５日間インキュベートし、その後、線維芽細胞またはケラチノサイトの培養物中へ移した。サンプルを新鮮なＲＰＭＩ‐ＣＰＮへ２４時間パルスし、分泌されたＶＥＧＦを定量した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｃａｍｂｒｅｘ，米国）または正常ヒト上皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ、Ｃａｍｂｒｅｘ，米国）を、Ｔ７５フラスコ中、添加細胞培地で増殖させた。ＮＨＥＫ細胞は、上皮成長因子、インスリン、およびヒドロコルチゾンを添加したケラチノサイト成長培地（ＫＧＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ，米国）中で成長させた。ＮＨＤＦ細胞は、ｈＦＧＦ‐Ｂおよびインスリンを添加した線維芽細胞成長培地（ＦＧＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ，米国）中で成長させた。数継代後、細胞を５０００細胞／ウェルで２４‐ウェルプレートに播種し（処理グループあたりＮ＝８）、９５％コンフルーエントまで成長させた。スクラッチアッセイを開始するために、培地を除去し、細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、２０μＬピペットチップで欠陥部（およそ９ｍｍ^２）を作製した。ＨＢＳＳを数回吸引して欠陥部周囲の細胞を解放し、次に基本培地で置換した。次に、欠陥部を４×の倍率で撮影した。細孔サイズ１０μｍのトランスウェルインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ）をウェルの上部に配置し、カプセル化ＣＰを、ウェルあたり５００、１５００、２５００、または５０００ＣＰクラスターに相当する用量で添加した。空のカプセルをコントロールとして用い、これもＲＰＭＩ‐ＣＰＮ中で５日間インキュベートし、次に、カプセルの体積１００μＬに相当するカプセル化細胞グループのピーク用量範囲でウェルに添加した。培養物を７時間（ＮＨＥＫ）または１４時間（ＮＨＤＦ）インキュベートし、カプセルおよびインサートを除去し、欠陥部を再度４×の倍率で撮影した。較正イメージ解析ソフトウェア（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｍｏｔｉｃ，中国）を用いて、カプセル化ＣＰへの曝露前後のスクラッチ領域の測定を行った。

局所適用のためのＣＰタンパク質の回収および製剤
ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ中のＣＰ条件培地（ＣＭ）を、２８ｍＬ培地中におよそ１００，０００ＣＰクラスターを含有するフラスコから９６時間の間隔で回収した。ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ中での最初の培養期間、および続いてのＥＮＤＯ‐ＳＦＭへの移行の後、２ヶ月間にわたってＣＭを繰り返し回収した。簡潔に述べると、細胞クラスターを重力で沈澱させ、次に条件培地を吸引し、３７℃に加温した新鮮なＥＮＤＯ‐ＳＦＭで置換した。ＣＭは、５０ｍＬのチューブに回収し、直ちに液体窒素中で急速凍結した。場合によっては、凍結前に、１０００Ｄａ ＭＷＣＯ膜で蒸留水に対してＣＭを透析にかけ、塩を除去した。処理前に、ＶＥＧＦ含有量測定のためのアリコートも取った。凍結ＣＭを９６時間凍結乾燥させ（Ｖｉｒｔｉｓ，米国）、使用まで−８０℃で保存した。新鮮な培地を平行して処理し、コントロール動物に用いた。

凍結乾燥ＣＭ（ＬＣＭ）、または透析凍結乾燥ＣＭ（ＤＬＣＭ）を、この凍結乾燥物をバシトラシン軟膏（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，米国）中に、高用量はおよそ５０ｍｇ ＬＣＭ／３５０ｍｇ 軟膏にて、低用量はおよそ１７ｍｇ ＬＣＭ／３５０ｍｇ 軟膏にて混合することで、適用の直前に局所投与用として製剤した。実際の量は、培地回収期間中に測定したＶＥＧＦの量に基づいて算出し、最終的な用量は、低用量は６ｎｇ、高用量は２０ｎｇのＶＥＧＦ用量に標準化した。

ＥＬＩＳＡを用いた血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の検出
過去の報告のように、効力の代替マーカーとして、培養物上清中のＶＥＧＦを測定した（Ｔｈａｎｏｓ， Ｃ．Ｇ．； ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ‐ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １３：７４７‐７５６； ２００７）。９６時間のインキュベーションの後（３７℃、５％ＣＯ_２）、上清を除去し、続いて行う分析のために凍結した。解凍したサンプルを、ヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を用いて３つの反復サンプルで分析した。ブタとヒトＶＥＧＦの間の配列相同性は９０％超である（２４）。条件培地のサンプル（２００μＬ）をアッセイ希釈剤（５０μＬ）と組み合わせ、発色後、ベックマンコールターＤＴＸ‐８８０分光計にて４５０ｎｍの光学濃度を測定した。得られた値を、対数曲線フィッティングを用い、遺伝子組換えヒトＶＥＧＦの標準曲線と比較した。数値はｐｇ／ｍＬで表した。

ＣＰＣＭ製剤のインビボ評価
ＣＰＣＭの評価は、およそ３ヶ月齢、体重２５０〜３５０ｇ、１２：１２時間の明暗サイクルでの温度制御環境下にて対で飼育した雄ロングエバンスラットの全層創傷で行った。研究グループはすべて８匹の動物で構成した。手順はすべてＮＩＨガイドラインを満たすかまたはそれを上回るものであり、ブラウン大学ＩＡＣＵＣ理事会（Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩＡＣＵＣ ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ ｂｏｄｙ）の事前承認を受けた。

手術の直前に、ラットをイソフルラン（３〜４％）で麻酔し、腹臥位でノーズコーン中に配置した。皮膚の欠陥部を作り出す前に、動物の毛を刈り、その領域周辺の皮膚をベタジンで消毒した。手術後、動物を鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．０２ｍｇ／ｋｇ 皮下）で処理し、麻酔から完全に回復するまで観察した。二酸化炭素ガスを用いて動物を安楽死させ、組織分析処理用に、示したように外植組織を除去した。簡潔に述べると、等張性４％パラホルムアルデヒド中で２〜３日間固定した後、組織セグメントをパラフィン中に横方向に埋め込み、厚さ４μｍのセクションを切り出し、続いてこれを、ヘマトキシリンおよびエオシン（開放創組織）、またはマッソントリクローム色素（切創）で染色した。イメージ解析ソフトウェア（Ｍｏｔｉｃ，中国）を用い、治癒する創傷の形態計測を行って発毛の周辺部内の治癒面積を測定し、ならびにプリズムソフトウウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，米国）により、信頼区間９５％での一元ＡＮＯＶＡ、およびポストホックダネット検定（ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を用い、コントロールグループとの比較に関する統計計算を行った。

（開放創）
８ｍｍのキーズ皮膚パンチ（Ｋｅｙｅｓ ｄｅｒｍａｌ ｐｕｎｃｈ）を用いて皮膚のパッチを完全に除去し、皮下組織の深さまでの全層皮膚欠陥部を肩甲骨間に作り出した。その処置後、局所ＣＭ軟膏を１０日間適用し、第１４日に動物を屠殺して組織を採取した。１つのコントロールグループ（凍結乾燥ＥＮＤＯ‐ＳＦＭを含むバシトラシン軟膏、Ｎ＝５）、および２つの処理グループ（高用量ＬＣＭを含むバシトラシン軟膏、Ｎ＝７、および高用量ＤＬＣＭを含むバシトラシン軟膏、Ｎ＝７）を観察した。研究の最後に、ＣＯ_２ガスでの安楽死後、創傷領域を含む皮膚の大きなセクションを除去し、周辺部に配置された一式のネジで張力をかけた状態で保持された２つのプラスチックリングから成るデバイスの中央に配置した。このデバイスは、固定プロセスの過程での皮膚の変形に付随する組織分析上の人為構造を克服するために作製されたものである（図２１Ａおよび２１Ｂ）。皮膚は、弛緩した状態を維持してデバイスへ挿入し、それによって創傷の張力に起因するさらなる人為的な影響を阻止した。皮膚サンプルを挿入したデバイスを等張性４％パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬して固定し、続いて組織分析および形態計測のための処理を行い、これには、創傷領域の断面測定、中央部の２ｍｍ^２領域の核計数、および全創傷領域内の上皮付属物の計数が含まれていた。

（切創）
６ｃｍの直線状全層切創を、直線性および長さを一定にするために設計されたプラスチックテンプレートにより、サイズ１５の新しいメスで肩甲骨間に形成した。この切創を、ＰＣ‐３角針を取り付けた６‐０シルクを用いて８針の断続縫合で直ちに閉じた。出願人らのグループでのこれまでの経験に基づき、シルクを選択することで、その他の剛毛様材料による刺激に起因する創傷治癒への干渉を最小限に抑えた。次の１０日間、以下のグループ：コントロールグループ（凍結乾燥ＥＮＤＯ‐ＳＦＭを含むバシトラシン軟膏、Ｎ＝５）および２つの処理グループ（ＬＣＭを含むバシトラシン軟膏、Ｎ＝５、およびＤＬＣＭを含むバシトラシン軟膏、Ｎ＝５）において、創傷部位を１日１回局所処理した。１４日後、二酸化炭素ガスによる安楽死を施した後に６ｃｍの創傷条片全体を除去した。領域の剪毛、および抜糸の後、創傷周囲の７×３ｃｍの領域を切除し、組織分析および張力試験のための処理を行った。パイロット研究では、皮膚採取に関連するサンプル間のばらつきが見られたため、専用の機器を設計して、横方向に切創が中心に位置する、均一な幅１ｃｍの皮膚の条片を新しい剃刀刃を用いて作製した（図２１ｃ）。各辺の外側０．５ｃｍは除いて、創傷のサイズあたり合計で５つの組織条片を作製した。皮膚のこの領域を、目視で治具の中央に位置させた厚板状歯科用ワックスの上に配置し、６つの新しい剃刀刃を写真に示した位置に挿入した。刃の上に載せたアルミニウムブロックにプレスを用いて圧力を印加することで、組織の平面に対して完全な垂直方向の均一に分配された圧力を発生させ、組織分析および物理分析用の精密な１ｃｍ幅の組織セグメントを得た。各動物について、中央の１ｃｍセグメントは組織分析用に処理し、各外側の２つには、インストロン張力計（Ｉｎｓｔｒｏｎ，米国）を用いた破断強度の分析を施した。皮膚サンプルの機器への移動は、そのワックス支持材上、氷に載せた状態で直ちに行った。サンプルからワックスを除去し、残留肉性被層（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｐａｎｎｉｃｕｌｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）をすべて創傷下側から移動させ、組織を機器の鋸歯状の掴み具に最大のクランプ圧で固定した。５０Ｎロードセルを所定の位置に配置し、組織を８ｍｍ／分の速度で破断するまで引っ張った。統計値の算出は、プリズムソフトウウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，米国）を用い、信頼区間９５％での一元ＡＮＯＶＡおよびポストホックダネット比較を用いて行った。

実施例１：適切な創傷モデルにおける脈絡叢条件培地のインビトロでの創傷治癒潜在能の評価
ヨークシャーブタから単離した新生仔ブタ脈絡叢を単離し、Ｔｈａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．^８によって過去に報告されているように培養して維持した。７〜１０日後、脈絡叢クラスターをアルギネートでカプセル化し、さらに７日間保持した。

創傷治癒に関連する細胞型の単層を、標準的な組織培養技術を用いて６ウェルプレート中に作製することで、過去に報告されているインビトロ創傷モデルを作製した。成人ヒト皮膚線維芽細胞またはケラチノサイトを９５％コンフルーエントまで成長させ、ここで、単層を専用のツールで物理的に破壊し、１０〜２０ｍｍ^２のオーダーの欠陥部を作製した。欠陥部の作製に続いて、培養物をＨＢＳＳで洗浄し、イメージ解析のための撮影を行い、適切な基本培地をプレートに戻した。第一の実験では、それぞれの細胞型が分泌タンパク質と直接接触するように、トランスウェルを用いてＣＰ含有カプセル（５００〜５０００ｅＣＰ当量／ウェル）を懸濁させた。その後、ＣＰ条件培地を別に回収し、他の種類の培地と共に種々の濃度で添加することで、効果の用量設定を試みた。適切な曝露時間の後、処理を終了してイメージ解析用に再度撮影した。Ｍｏｔｉｃソフトウェアを用いて創傷面積を測定し、（面積_開始時−面積_開始時）により治癒％を算出した。

トランスウェル膜インサートで分離した場合、カプセル化脈絡叢は、線維芽細胞（図１）およびケラチノサイト（図２）の損傷した単層の両方の治癒において用量依存的増加を示した。ケラチノサイトモデルにより、ＣＰは、２５００ｅＣＰ／ｍＬの用量にて、空カプセルのコントロールと比較してほぼ３０％の治癒の改善を示すことが明らかとなった。

実施例２：ＣＰ条件培地のインビトロでの効果
ＣＰ条件培地を、ＣＰ細胞培養物の７日間培養後に９６時間回収し、次に線維芽細胞培地に添加した。ＣＰ条件培地および線維芽細胞創傷モデルの治療効果を図３に示す。条件培地（ＣＭ）を栄養と共に含有する各グループは、基本培地コントロールと比較して改善を示した。重要なことは、特に、新鮮な線維芽細胞基本成長培地（ＦＢＭ）と比較して、ＣＭは、健全な細胞培養物を維持するために必要である必須栄養を枯渇していると考えられることである。それでも、ＣＭは、各条件で、特に最少量の栄養を添加する条件において恩恵をもたらした。

実施例３： 毎日または２回／週で培地を交換する培養物中におけるＶＥＧＦ（創傷治癒潜在能の指標）の長期的な産生の評価および最適化
ＣＰによるＶＥＧＦの分泌が無血清内皮成長培地中で増加することを示した過去の研究に基づいて^８、ＣＰクラスターをＥＮＤＯ‐ＳＦＭ培養で３ヶ月まで維持し、創傷研究のための治療培地を連続的に回収した。このプロセスでは、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦ分析のために、ほとんどの回収培地でアリコートを保存した。図４ａに示す結果は、ＶＥＧＦの分泌が長期間にわたって安定であることを示している。最少治療用量である２ｎｇ／日に基づく等価用量産生能を図４ｂに示し、平均すると、各ドナーブタＣＰあたり、１日に約２５用量分が産生された。重要なことは、このことが、長期間にわたる培養でのその強健性および安定性のために、脈絡叢分泌因子によって産生源の問題が指数関数的に低減されることを意味するということである。

実施例４：ＣＰ分泌タンパク質の治療用組成物の作製
ＣＰ条件培地を、透析による塩の除去および凍結乾燥、または直接の凍結乾燥により、治療用に製剤した。抽出したＣＰタンパク質を処理にかけ、ＥＬＩＳＡを用いたＶＥＧＦの分析を行った。試験した以下の具体的な処理グループを図５に示す。

各最終産物を１０．８ｍｇ／ｍＬで再構築し、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで分析した。

ここで示すように、条件培地の処理は、ＶＥＧＦレベルの大きな低下に関連することはなかった。実質的にはそのままである条件培地のグループＩは、その他のグループＩＩ〜Ｖの各々においておよそ６〜９×に濃縮された。

実施例５： カプセル化ＣＰ細胞から分泌された脈絡叢タンパク質の、マクロファージ、コラーゲン、平滑筋細胞、および内皮細胞の遊走へのインビボでの効果
カプセル化脈絡叢クラスター（５０Ｋ／ｍＬ）または空のカプセルを、生理食塩水により５０％に希釈したマトリゲルＨＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へ、０．１：１．０のカプセル：マトリゲル比、全注射体積１．１ｍＬで充填した。この注射液は、注射するまで氷上で保存し、注射は１６ゲージの針を通して、２〜３％イソフルラン麻酔下のロングエバンスラット（オス、２５０〜３００ｇ）の肩甲骨間の皮下空間へ行った。２週間後、厚板状の皮下ゲル（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｇｅｌ ｓｌａｂｓ）を外植し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈ＆Ｅ組織分析のための処理を行った。

全体として、カプセル化脈絡叢を含有する外植片は、血管新生、コラーゲン除去、および周囲組織の構造組織化の増加と関連していた。これには、マトリゲルマトリックスのほぼ完全な破壊で示されるリモデリングが含まれていた。これと比較して、空カプセルのインプラントでは、線維芽細胞の浸潤が非常に少なく、マトリゲルマトリックスは完全に無傷であり、血管新生または化学遊走の証拠はほとんど見られなかった。この２つのグループの対比は、図６から明らかであり、図中、空カプセルのインプラント（図６Ａおよび６Ｄ）をカプセル化脈絡叢を含有するインプラント（図６Ｂおよび６Ｅ）の次に示す。図６Ａ中の顆粒状のエオシン染色物（ｇｒａｎｕｌａｒ ｅｏｓｉｎｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ）はマトリゲルビヒクルであり、これは、カプセル化ＣＰのグループではほとんど存在しない（図６Ｂ）。さらに明らかであるのは、細胞浸潤が、カプセル化ＣＰと比較して空のコントロールグループでは最小限であることであり、カプセル化ＣＰが、線維芽細胞、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、およびその他の再生細胞型のこの領域への遊走を引き起こしたものと考えられる。図６Ｃは、カプセル化ＣＰのグループの高倍率の図であり、移植マトリゲルの喪失および層形成された細胞組織と共に、カプセル周辺部での血管新生が促進されたさらなる証拠を示すものである。

実施例６： 全層創傷の２つの動物モデルにおける、濃縮または製剤された脈絡叢タンパク質のインビボでの効果
脈絡叢条件培地を上記の実施例２で述べるようにして回収し、上記の実施例４で考察し、図５のグループＩＩで示すようにして凍結乾燥した。凍結乾燥したＣＰ条件培地は、全層創傷の処理用には蒸留水で再構築し、または６ｃｍ切創への局所投与用には疎水性軟膏に分散させた。

ロングエバンスラットにて、皮膚自家移植によるある種の全層慢性創傷を、皮下組織のレベルまで８ｍｍの生検パンチを用いて作製した。各々１０匹の動物を含む２つのグループを、処理（凍結乾燥ＣＰ条件培地）およびコントロール（凍結乾燥ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ）を含めて用いた。各動物において、左右相称の欠陥部を作製し、切除した皮膚を反対側に移植し、移植毛の生存能力の評価、ならびに注入物を封じ込めるための生物学的封入部の形成を行った。このラットの系統が白黒の斑点模様を持つことから、領域の選択は、色が逆である部分が並置して移植され、生存毛包の検出が最適化されるように行った。８針の断続縫合（６‐０シルク）を用いて移植片を所定の位置に固定した。合計でおよそ６ｎｇ ＶＥＧＦ／日に相当する２００μＬのｄＨ_２Ｏ中２５ｍｇの凍結乾燥ＣＭを、１４日間毎日創傷部位へ直接投与した。マクロ写真撮影を毎日行って創傷領域を評価および測定した。４週間後、動物を安楽死させ、組織分析用に創傷領域を回収した。

同じ系統の動物でこれとは別に、直線状６ｃｍ切創を、新しいサイズ１５のメスで形成した。切創は、６‐０シルクの断続縫合で直ちに閉じ、動物を別々の檻で回復させた。毎日、１０日間にわたって、２５０ｍｇの軟膏を凍結乾燥ＣＰ条件培地と混合して、およそ１８ｎｇのＶＥＧＦを含有するピンク色の粘稠ペーストを作製した。第１４日に、動物を安楽死させ、６ｃｍ創傷の周囲の領域を切除し、インストロン引っ張り強度測定用に５つの１ｃｍ幅の条片に切断した。

慢性創傷モデルでは、ＣＰ条件培地で処理したグループで、２．５倍のオーダーでの統計的に有意である創傷領域の減少が観察された（図７ａおよび図７ｃ）。図７ｂに示すように、創傷は反対の色の毛の領域を含んでおり、全体として非常により小さく健全であった。図７ｄおよび７ｅに示すように、組織分析により、処理グループでは非常に健全で組織化された皮膚の形態が得られ、一方、コントロール（または未処理創傷）では、ほとんどが血管新生のない線維状物を示し、正常な皮膚構造の証拠がまったくないことが示される。このレベルの治癒は、通常、数ヶ月のオーダーのより長い期間を伴うが、ＣＰタンパク質による処理では、僅かに３０日間以内で達成された。

切創治癒もまた、ＣＰ分泌タンパク質の存在で大きく加速された。特に、処理した創傷は、軟膏単独で処理したものと比較して、およそ２倍の強度の増加を示した（図８）。このレベルの強度の改善および創傷の加速は、ＣＰタンパク質カクテルに独特のものである。

実施例７： 全層重度欠陥部の精製ＣＰＣＭを用いた局所処理
脈絡叢条件培地を上記の実施例２で述べたように回収し、１０００Ｄａ ＭＷＣＯセルロース膜に対する透析で精製し、実施例５のグループＩＩで示し、上記の実施例４で考察したようにして凍結乾燥した。

ロングエバンスラットにて、重度欠陥部を、皮下組織のレベルまで８ｍｍの生検パンチを用い、包帯または自家移植を用いずに形成した。１０匹の動物を含む２つのグループは、処理（透析条件培地）およびコントロール（凍結乾燥ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ）を含んでいた。各動物において、欠陥部は肩甲骨間に形成し、切除した皮膚は除去した。動物はブプレネックスの術中注射を受け、回復過程をモニタリングした。両グループに対して、透析凍結乾燥ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ組織培地、または透析凍結乾燥ＣＰ条件培地（ＤＬＣＭ）のいずれかを、およそ２０ｎｇ ＶＥＧＦのＶＥＧＦローディングに基づく用量で局所投与した。処理は１０日間毎日行い、第１４日に、組織分析評価用に創傷を外植した。マクロ写真撮影を毎日行って創傷領域を評価および測定した。４週間後、動物を安楽死させ、組織分析用に創傷領域を回収した。

マクロ写真のイメージ解析から、処理グループおよびコントロールグループ共に創傷の収縮過程で直径が減少した創傷を含んでいたが、処理グループで僅かに有意な改善が見られたことが明らかとなった（図９Ａ）。しかし、図９Ｂおよび９Ｃに示すように、全組織分析から、処理グループにおいて、毛包、血管、および濾胞関連上皮の発生を含む皮下組織化が著しく増加したことが分かる。コントロールグループの創傷は（図９Ｂ）、炎症を起こすか、または重度の線維化および瘢痕を示す領域を有している。図９Ｄに示す高倍率（１０×）では、完全に治癒していることが分かる。左側のパネルはコントロール創傷近傍の正常皮膚のセクション、中央はＤＬＣＭ処理皮膚のセクション、そして右側のパネルはコントロールを示す。マクロレベルで示される治癒の度合いの１つの明らかな局面は、少量の血管新生と共に高いレベルの新しいコラーゲンおよび線維芽細胞を含む一番右のパネルと比較した、中央パネルに示す処理に起因する改良されたリモデリング細胞型の組織化および浸潤の度合いである。処理グループは、主に、上皮からの発毛がまだであり、毛包発達の初期段階であるという点で正常組織と異なっている。各セクションの最上部のケラチノサイト層もまた、処理および正常グループにおけるより厚い隆起状の形態と比較して、コントロールは非常に浅い平坦な層で存在することから、改善された治癒を示している。

実施例８： 培地組成の操作による、脈絡叢によって産生されたタンパク質カクテルの調節
脈絡叢クラスターを単離し、ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ、またはＩＶ型コラーゲン、ラミニン、およびその他のＥＣＭ成分が豊富であるマトリックス物質の範囲内であるＲＰＭＩ‐ＣＰＮで培養した。ＣＰクラスターの外観は、通常、外側に向いた繊毛を有し、結合組織およびその他の細胞型から成るマトリックスと内部で接着する球状の上皮である（図１０）。外周周辺の細胞は、多くが密着結合であり、タンパク質の放出に関連する分泌小胞を僅かに示している。

細胞外マトリックス組成物を用いて、この形態を調節し、内側に向いた繊毛、および液体で満たされた内部ポケットを取り巻く微絨毛を有する中空の小胞、またはカプセル状物を形成させた（図１１）。このようなカプセル状物のサイズは、元のＣＰクラスターのサイズに応じて様々であり、６〜１０日間にわたる時間経過で拡大した（図１２ａおよび１２ｂ）。このプロセスでは、上皮が再組織化されて、密着結合が豊富である特異な層を形成し、一方、線維芽細胞などの混入細胞は、マトリックス内で分離された。この構成では、分泌されたＶＥＧＦのレベルが２倍超であり（図１３）、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭを添加した場合は、コントロールカプセル状物（図１４ａ）と比較してさらにより高いレベルのタンパク質小胞形成が観察された（図１４ｂ）。さらに、遺伝子発現のレベルでは、マイクロアレイにより、血清含有ＲＰＭＩ培地中の典型的なＣＰ培養物と比較して何千という変化が明らかにされた。観察された変化は、培地組成（表２）および第３日（図１５ａおよび図１５ｂ）から第１６日（図１５ｃおよび図１５ｄ）までのカプセル状物形成に関係する発現レベル、ならびに以下の表１に示すものであった。

表１は、ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ培地中で３日間成長させたカプセル状物の、同一培地で成長させたＣＰクラスターと比較した遺伝子の変化倍数を示し、表２は、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ培地中で３日間成長させたＣＰクラスターの、ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ培地中で成長させたＣＰクラスターと比較した遺伝子の変化倍数を示す。以下の表３は、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭの存在下で上方制御される創傷治癒と関連する遺伝子のいくつかを抜粋して示すものである。

実施例９： 凍結乾燥脈絡叢条件培地のナノカプセル化、およびＥＬＩＳＡで評価したタンパク質完全性の実証
ラクチド‐グリコリドコポリマーを用いて、微粒子化した凍結乾燥脈絡叢条件培地（ＬＣＰＣＭ）をカプセル化した。前述のＬＣＰＣＭを蒸留水の過飽和溶液として再構築した（２ｍＬ中２３６．７２ｍｇ）。これとは別に、２５ｍＬの酢酸エチルを、コポリマー比５０：５０および重量平均分子量９ｋＤａであり、比較的分解が速いと考えられる生分解性ポリエステルであるＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０３Ｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）の４１３ｍｇに添加した。この２つの溶液を激しくボルテックス攪拌し、プローブソニケーターによる超音波処理を施してマイクロエマルジョンを作製し、これを液体窒素中で速やかに凍結し、続いて凍結乾燥した。酢酸エチルと水との混和性が低いことと、用いた激しい混合技術との組み合わせにより、ＣＰＣＭは、非常に小さい液滴として親油性ポリマー‐クロロホルムマトリックスと共に凍結した。凍結乾燥によって完全に乾燥させた後、ＰＬＧＡの固体マトリックスに囲まれた凍結乾燥条件培地のマイクロ化微粒子が得られた。

このマイクロ化技術を用いて製剤の均質性を向上させることで、ミクロスフィアの全体のサイズを低下させ、得られた治療微粒子の体積に対する表面積の比が増加することで溶解度を高めた。次に、このポリマー‐ＣＰＣＭの組み合わせを４０ｍＬの酢酸エチルに溶解し、これによってＰＬＧＡ成分は完全に溶解したが、マイクロ化ＣＰＣＭは不溶性マイクロ微粒子として残った。この溶液を２Ｌのヘプタンに素早く分散し、マイクロ化ＣＰＣＭの周囲にポリマーを急速に析出させた。得られた治療ミクロスフィアは、３６．５重量／重量％のＣＰＣＭローディング、またはおよそ１２７ｐｇ ＶＥＧＦ／ｍｇ ミクロスフィア製剤、から構成されていた。

ミクロスフィアの評価は、表面形態については走査電子顕微鏡を、サイズ分布についてはコールター粒子サイズ分析を、およびＣＰＣＭタンパク質の１つ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が用いた溶媒への曝露後に依然として検出可能な状態であり潜在的に活性であるかどうかの判定については有機抽出をそれぞれ用いて行った。

ＶＥＧＦの抽出は、２０ｍｇのミクロスフィアを酢酸エチルに溶解し、タンパク質を水性バッファーに抽出し、ＥＬＩＳＡを用いてＶＥＧＦを測定することで行った。この方法により、２０ｍｇのミクロスフィアが１５０９＋／−６５ｐｇ ＶＥＧＦ、または７５．５ｐｇ／ｍｇ ミクロスフフィア、を含有することが分かった。これは、処理または非効率な抽出によるＶＥＧＦの４０％の損失と相関している。

コールター粒子サイズ分析および走査電子顕微鏡により、ミクロスフィアがおよそ３００ｎｍのサイズであり、分散液中で凝縮を起こして、それぞれおよそ４および１０ミクロンの平均径を持つクラスターを形成していることが明らかとなった（図１６および１７）。

実施例１０： 条件培地を作製する培養物中のＣＰのトランスクリプトームの分析
上記実施例８で述べたようにＥＮＤＯ‐ＳＦＭ培地を用いて作製した凍結乾燥ＣＰ条件培地を分泌する細胞のマイクロアレイ分析を行い、分泌タンパク質の発現レベルを測定した。ブタマイクロアレイから得られた２４０００を超える発現値のうち、創傷治癒プロセスに関与するいくつかの遺伝子を以下の表４にまとめる。これらの遺伝子でコードされる分泌タンパク質の各々は、創傷治癒プロセスを形成する工程と関連していた。

実施例１１： 脈絡叢共培養物中での内皮管形成
ヨークシャーブタから単離された脈絡叢上皮クラスターを、成長因子リッチである３次元ヒドロゲル中、２％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０組織培地で７日間インキュベートした（２５００クラスター／ｃｍ^２）。他所で述べるように、クラスターの形態は、中実の球形細胞物から中空カプセル状物へと変化した。これとは別に、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ｔ７５フラスコ中のＭｅｄｉｕｍ２００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で９５％コンフルーエントまで成長させた。培地は毎日交換した。次に、ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、３次元脈絡叢培養物のウェルへＲＰＭＩ１６４０／ＦＢＳ中２．５×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で、またはマトリックスのみを含有するウェルへ添加した。２４時間のインキュベーションの後、カプセル状ＣＰと共に共培養したＨＵＶＥＣは、以下の図１９Ａおよび１９Ｂに示すように、卵形の上皮細胞から管状構造への表現型の変化を示した。重要なことは、各々の細胞物質のほとんどが血管ネットワークの結節点となっていることから、内皮管で形成されたネットワークが、カプセル状ＣＰの配置によって誘導されると考えられることである。対照的に、同じ条件下だが脈絡叢が存在しない状態で培養されたＨＵＶＥＣは、未分化のままであった（図２０）。この挙動は、血管新生刺激物質への曝露を示唆するものであり、それは、脈絡叢によって提供される成長因子のカクテル内で分泌されるものである。

実施例１２： ＣＰの単離および培養
ブタ新生仔からの単離に成功したＣＰを、およそ５０〜２５０μｍのサイズ範囲のＣＰクラスターへ消化した。このクラスターを非接着性フラスコ中のＲＰＭＩ‐ＣＰＮで８日間培養した後、手作業での計数により、仔ブタあたりの収量が１２８，８５４±１６，１５９から５０，９６２±５，６９０個のＣＰクラスターへと減少したことが分かった。このことは、小凝集物がより大きなクラスターへと次第に合着することに加えて、付着または死に起因する細胞の非上皮クラスターの時間による喪失と一致している（図２２）。１０日後に無血清培地へ移した後、ＣＭを、同一条件下で保持された新しい培地と平行して回収した。実験を通して作製されたＣＭから採取したアリコート（図２３）、ならびにコントロール培地にてＶＥＧＦレベルを測定した。単離の１０日後、ＣＰあたりの分泌された１日のＶＥＧＦレベルは、およそ４１ｎｇから２週間目の約７０ｎｇへと増加し、その後は比較的安定に維持された。プールされた精製凍結乾燥物を作製するための条件培地の処理の後、ＶＥＧＦレベルを調べて、この分子が処理の間を通して保存されたことを確認した。

実施例１３： ＣＰ遺伝子アレイ
マイクロアレイ分析専用に、同一の動物グループからのＣＰコホートを、ＲＰＭＩ‐ＣＰＮ中にて１０日間、ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ中にてさらに３または１６日間培養した。ブタの全ゲノムアレイを実施して、ＣＰ発現パターンの特徴付け、ならびに培地移行後の最初の１６日間にわたるＣＰトランスクリプトームの可塑性の評価を行った。分泌分子のためのｍＲＮＡの転写能、組織再生における関連性、発現レベル、および統計的有意性に基づいて、このマイクロアレイデータを選別、分類した。表５には、創傷治癒において役割を有し得る因子を、その考えられる役割を説明するマトリックスと共に列挙して示す。予想されるように（Ｔｈａｎｏｓ， Ｃ．Ｇ．； ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ‐ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １３：７４７‐７５６； ２００７； Ｔｈｏｕｖｅｎｏｔ， Ｅ．； ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｈｉｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６：５９４１‐５９５２； ２００６）、トランスサイレチンが組織培養物中にて極めて高いレベルで発現され、数多くのその他の因子も同様の高いレベルで発現された。一般に、列挙した再生遺伝子は、成長因子、血管新生因子、細胞外マトリックスリモデリング成分、および再生特性を有するその他の因子をコードする。ＥＮＤＯ‐ＳＦＭ中にてＣＰクラスターによって発現される再生因子補体（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）は相当数存在し、いくつかの関連する因子（略語については表を参照）：ＣＴＧＦ（１４．０１）、ＶＥＧＦ（１１．６６）、ＴＧＦ‐β（１１．３９）、ＩＧＦ‐２（１１．２６）、ＰＥＤＦ（１１．０７）、ＢＭＰ‐７（１０．９６）、ＰＤＧＦ（１０．５９）、ソマトスタチン（１０．０３）、Ｉｌ‐６（９．６７）、組織因子（９．５０）、ＷＩＳＰ‐１（８．８５）、ＦＧＦ‐２（８．７９）、ＴＧＦ‐α（８．５１）、Ｗｎｔ‐１０Ｂ（８．２７）、ＥＧＦ（７．５７）など、が含まれていた。第３日と第１６日の間のこれらの再生成分のほとんどの発現レベルの相違はほぼ認められず、それぞれ３．５８倍および２．０８倍の減少を示したＣＸＣＬ‐１４ケモカインおよびアドレノメデュリン以外、ほとんどの因子は非常に狭い範囲に維持されていた。続いて全アレイデータベースを分類し、第３日と第１６日の間のすべての発現レベルにおいて、１．８倍超の統計的に有意な変化を比較し、結果を表６に示す。一時的な発現の最も高い変動を示すこれらの遺伝子は、ＣＰの組織培養への順化に関与し得るものであり、主たる再生候補を含まない。

実施例１４： 単層スクラッチアッセイ
新生児ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞の培養した単層を粉砕し、基本培地中、種々の用量のカプセル化ＣＰと共にインキュベートした。両細胞型共にインキュベーションの間に創傷領域が減少し、＞１５００カプセル化ＣＰで処理したグループでは著しく小さくなっていた。図２４に示すこのデータは、化学遊走効果が用量依存性であり、ピーク効果が、ＮＨＤＦ培養物においてはコントロールに対して３５．２％の領域減少、ＮＨＥＫ培養においてはコントロールに対して２７．９％の領域減少と関連したことを示している。ＮＨＥＫ培養では、２５００カプセル化ＣＰが最小の創傷領域と関連し、一方ＮＨＤＦ細胞は、最大用量である５０００カプセル化ＣＰまで反応の増加を示した。カプセル化ＣＰによって分泌されるＶＥＧＦのレベルを測定するために、２５００の方のサンプル（Ｎ＝９）を記述のようにして評価した（Ｔｈａｎｏｓ， Ｃ．Ｇ．； ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ‐ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １３：７４７‐７５６； ２００７）。２５００カプセル化ＣＰ／ウェルの用量では、２４時間の間におよそ２．４ｎｇのＶＥＧＦが分泌された。

実施例１５： 全層開放創
被覆されていない開放創を、感染の徴候なく、１０日間毎日処理した。第３日までに、すべての創傷上に痂皮が形成し、グループ間に明らかな違いは見られず；８日後には、下部の創傷が収縮するに従って痂皮が脱離し始めた。２週間後、創傷の表面は、痂皮の痕跡がほとんどなく、 比較的平滑な外観となった。表層上は、この時点までにすべての創傷が良好に治癒したように見え、中央の創傷領域にて毛包の存在下ではある程度の変動が見られた。図２１は、コントロール処理（図２１Ａ）およびＬＣＭ処理（図２１Ｂ）を施した創傷領域を含む外植皮膚を示し、これは、創傷領域内により多くの毛包を含んでいる。この観察は、図２５に示すように、組織分析上ではより明らかである。ここでは、創傷幅の１／３に位置する一連の代表的なセクションを示す。図２５Ａは正常皮膚を示し、皮脂腺に付随する毛包、高密度のコラーゲン、および明確に形成された上皮突起（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｒｅｔｅ ｐｅｇｓ）を含む上皮付属物を有する。これと比較して、図２５Ｂに示すバシトラシン単独で処理された創傷は、新たに形成された血管を多く含む真皮内に密に充填された線維芽細胞、および薄く平坦なケラチノサイトの層の表皮を含む。ＬＣＭで処理された創傷（図２５Ｃ）は、より高い組織化レベルの組織を含み、形成中の上皮付属物、より低い細胞密度、および上皮突起を示唆するより隆起したプロファイルを有する。同様に、ＤＬＣＭで処理した創傷は（図２５Ｄ）、上皮付属物が多く、これには、表皮を通過して伸びて視認される毛として出現する場合もあった皮脂腺が含まれていた。これらの創傷はまた、その密度およびコラーゲンに対する細胞の比において、正常組織の形態に類似してもいた。図２６に示すように、ＣＰ産物で処理した創傷は、上皮付属物の密度が著しく高まっており（ＤＬＣＭおよびＬＣＭについてそれぞれ５倍および５．８倍高い）、全体として断面積が小さくなっていた。しかし、中央部の細胞密度は、形態計測上、グループ間での違いは認められなかった。

直線状切創
６ｃｍの切創を軟膏の局所投与で１０日間処理し、４日後の第１４日に皮膚を採取した。創傷はすべて実験期間中に完全に治癒し、８日後には完全に閉鎖した（図２７）。ＣＰタンパク質で処理した切創は、切創の美容という点で著しい改善を示し、ＬＣＭ（図２７Ｂ）およびＤＬＣＭ（図２７Ｃ）は、コントロールグループ（図２７Ａ）よりも周辺部が狭く、より対称性が良好に見えた。この結果は、創傷中央部の線維化帯（ｂａｎｄｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）がかなり薄いと共に周辺部の上皮付属物の密度がより高いことを示した組織分析と一致するものであった（図２８）。コントロールグループ（図２８Ａ）は、治癒中の切創における線維化の領域が大きく、一方ＬＣＭ（図２８Ｂ）およびＤＬＣＭ（図２８Ｃ）は、この領域を劇的に低減した。興味深いことに、ＬＣＭが最も強力な効果を示し、中央部の瘢痕幅が、ＤＬＣＭ処理に比べておよそ２倍、コントロールグループに比べておよそ５倍低減した。末端間の（ｅｎｄ‐ｔｏ‐ｅｎｄ）張力試験で示されるように、このことによって、組織の強度へと引き継がれる美容的なパフォーマンスも改善された。図２９に示すように、ＣＰタンパク質で処理した両グループ共に、コントロールに対して統計的に有意であるピーク破断強度の改善を伴っていた。ＬＣＭは、コントロールに対して３．７＋／−０．５Ｎから７．７＋／−０．８Ｎの強度の増加を示し、一方ＤＬＣＭは、９．５＋／−１．６Ｎまでのさらなる強さの増加を伴っていた。

考察
ＣＰは、脳およびＣＮＳの健全性および機能を維持するのに有用であるタンパク質を分泌する。そのような分泌されたタンパク質は、神経障害の治療に役立つものであり得る。驚くべきことに、本結果は、ＣＰ分泌タンパク質が、炎症反応の制御、ならびに創傷治癒の改善および瘢痕組織形成の低減にも関与していることを示している。通常の創傷治癒プロセスの一部分として、創傷発生後すぐにマクロファージが創傷部位へ浸潤し、ケモカインを放出することで、上皮形成（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｓａｔｉｏｎ）の制御、組織のリモデリング、および皮膚^１１およびその他の組織での血管新生などの治癒における重要なプロセスに寄与する。創傷治癒プロセスの概略を図１８に示す。

本実施例では、組織分析データより、マクロファージおよび線維芽細胞の創傷領域への浸潤が増加および加速され、それによって線維性瘢痕組織が形成される結果となることが示される（図７ｄおよび７ｅ‐コントロール）。ＣＰ分泌タンパク質で処理した創傷では、線維性結合組織の蓄積が減少し（図７ｄおよび７ｅ‐処理）、破断強度の改善に裏付けられるように組織機能が維持されている（図８）。創傷治癒の過程で、傷害を受けた壊死領域は、小血管、単核細胞、および活性マクロファージに侵入される。このような活性リンパ球は、いくつかのサイトカインおよび成長因子を同時に分泌し、これらは、化学遊走およびそれに続く創傷治癒プロセスに不可欠である。ＣＰ分泌タンパク質はまた、数多くのサイトカインおよび成長因子も含み、創傷治癒プロセスを促進することで組織修復を加速し、それによって治癒が加速されると考えられる。恐らく、これは、内在性成長因子と、ＣＰ分泌タンパク質の投与によって供給される外来性成長因子との相乗効果に起因するものである。本実施例で見られる結果は、ＶＥＧＦ単独の存在に起因するものではない。ＣＰ分泌タンパク質を含む組成物は、創傷治癒の加速において、組換えＶＥＧＦ単独（結果示さず）よりも効果的であった。

出願者らの結果は、凍結乾燥ＣＰ条件培地が、創傷治癒プロセスの強力な刺激薬であり、これによって創傷強度の増加および創傷瘢痕形成の低減が得られることを示している。

線維化は、創傷治癒プロセスの一部であるが、過剰の線維化は、瘢痕形成および組織機能の低下を引き起こす。線維芽細胞は、コラーゲンの沈着、従って創傷での瘢痕形成に主たる役割を果たしている。過去の研究により、線維芽細胞の蓄積の度合いと皮膚の熱傷における瘢痕形成とが相関関係にあることが示されている^１０。ＣＰ分泌タンパク質は、創傷部位での線維芽細胞の蓄積を減少させ、その結果として治癒した創傷での瘢痕形成が低減されることで瘢痕形成を抑えるように作用すると考えられる。重要なことは、ここで提示されるデータが、ＣＰ分泌タンパク質をインビボで創傷部位へ投与することによって、創傷治癒を受けた組織でのコラーゲン蓄積および瘢痕形成の低減が引き起こされることを示しているということである。このことに対する証拠は、上記の実施例７および図９ですでに示されている。コラーゲンは、数多くの線維症における主たる病理学的所見であることが明らかにされているが^１２、同時に、非線維化組織再生の極めて重要な初期成分である。創傷治癒療法における細胞外マトリックス産生、化学遊走、および有糸分裂誘発のこの良好なバランスは、多くの個々の因子治療薬の同時または段階的な送達によってのみ達成することができるが、本研究では、ＣＰ由来カクテルがすべての態様を提供することが明らかである。

ここで提示する研究は、ＣＰによって分泌される因子の創傷治癒プロセスへ介入する能力を示すものである。インビトロでは、この活性は、ヒト線維芽細胞およびケラチノサイトのスクラッチ単層培養物と共培養したカプセル化ＣＰにより、化学遊走または細胞増殖に起因する創傷領域減少の加速として現れた。これらのモデルでは、条件培地中のＶＥＧＦの用量と関連して、治癒の量が増加した。インビボでは、ＣＰＣＭを含む軟膏で処理した開放創は、創傷領域断面積の著しい減少と共に、１４日後には上皮付属物の補充においてコントロールと比較して５から６倍の増加を示した。そして、ＣＰＣＭで処理した手術で閉じた切創は、治癒組織の引っ張り強度の２倍を超える上昇、ならびに中央部瘢痕の低減、および創傷周辺部周りの上皮付属物のより良好な保存および／または再増殖による全体的により良好な美容的外観、を伴っていた。

ＣＰタンパク質と関連する正確な治癒機構は依然として不明であるものの、理論に束縛されるものではないが、それは、発現された因子の組み合わせの相乗的活性に関連する可能性が高いと思われる。ＣＰのトランスクリプトームは、創傷の自然治癒反応のメディエーターをコードする数多くの遺伝子を含有している。本明細書で述べる組織培養系でこれらの因子の補体すべてがＣＰから分泌されるかどうかは不明であるが、マウスＣＰのプロテオミクス分析により、分泌されたタンパク質が豊富であることが裏付けられている（Ｔｈｏｕｖｅｎｏｔ， Ｅ．； ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｈｉｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６：５９４１‐５９５２； ２００６）。これらの研究において効力の代替マーカーとして選択されたＶＥＧＦは、生物学的に有効なレベルで送達され（Ｏｚａｗａ， Ｃ．Ｒ．； ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＶＥＧＦ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｎｏｔ ｔｏｔａｌ ｄｏｓｅ， ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ａ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１３：５１６‐５２７； ２００４）、ＰＤＧＦ（Ｇａｌｉａｎｏ， Ｒ．Ｄ．； ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＶＥＧＦ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｎｏｔ ｔｏｔａｌ ｄｏｓｅ， ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ａ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６４：１９３５‐１９４７； ２００４）、ｂＦＧＦ（Ｇａｌｉａｎｏ， Ｒ．Ｄ．； ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＶＥＧＦ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｎｏｔ ｔｏｔａｌ ｄｏｓｅ， ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ａ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６４：１９３５‐１９４７； ２００４）、ＴＧＦ‐β１（Ｌｉ， Ｚ．‐Ｄ．； ｅｔ ａｌ． ＶＥＧＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ＴＧＦ‐β１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｍｉｔｏｇｅｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３‐ｋｉｎａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３３４：１０４９‐１０６０； ２００５）、および創傷治癒に関与するその他のものなどの内因子を上方制御する能力を有する。それでも、ＣＰカクテルの全体としての効果は、ＣＰトランスクリプトーム内には同様に高いレベルで作用するその他の高発現因子が数多く含まれていることから、ＶＥＧＦ単独を超えるものであると考えられる。

例えば、ＣＴＧＦは、遺伝子アレイ（Ｔｈａｎｏｓ， Ｃ．Ｇ．； ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ‐ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １３：７４７‐７５６； ２００７）およびプロテオミクス分析（Ｔｈｏｕｖｅｎｏｔ， Ｅ．； ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｈｉｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６：５９４１‐５９５２； ２００６）において最も高い発現レベルを示す因子であるトランスサイレチンと同様の高いレベルでＣＰによって発現される。ＣＴＧＦは、線維芽細胞の化学遊走および増殖、肉芽組織の形成、再上皮化、およびマトリックスのリモデリングを促進する（Ｉｇａｒａｓｈｉ， Ａ．； ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ４：６３７‐６４５； １９９３）。ＣＴＧＦの創傷治癒における主たる役割は、線維化を通しての組織再構築の促進だが、ネガティブフィードバックを通してＶＥＧＦ媒介血管新生を制御することも示されており（Ｊａｎｇ， Ｈ．Ｓ．； ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ９：４６４‐４７４； ２００４）、および角膜血管新生のモデルではそれ単独で血管新生の性質を有する（Ｓｈｉｍｏ， Ｔ．； ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２６：１３７‐１４５； １９９９）。同様にＣＰによって高発現されるＴＧＦ‐βは、皮膚創傷治癒の最もよく知られたメディエーターの１つであり、炎症フェーズから組織リモデリングおよび再上皮化までに関与している（Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ， Ｓ．； ｅｔ ａｌ． Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ． １６：５８５‐６０１； ２００８）。これは、静脈うっ血性潰瘍への局所投与において治療効果の可能性を示し（Ｒｏｂｓｏｎ， Ｍ．Ｃ； ｅｔ ａｌ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ‐ｂｅｔａ（２） ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｅｎｏｕｓ ｓｔａｓｉｓ ｕｌｃｅｒｓ． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ． ３：１５７‐１６７； １９９５）、切創の強度を高めるために用いられている（Ｗｒｉｇｈｔ， Ｔ．Ｅ．； ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＴＧＦ‐ｂｅｔａ２ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｏｎ ｉｎｃｉｓｉｏｎａｌ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． ２：１３３‐１４３； ２０００）。ＩＧＦ‐２、ＢＭＰ‐７、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ‐２、ＥＧＦ、およびＣＰによって発現され表５に列挙したその他の因子もまた、文献で引用され、および表で示すように、創傷治癒効果を持つ可能性がある。

これらの研究で観察された最も興味深い事の１つは、ＣＰ因子の投与後に創傷周辺部で毛包密度が高まることである。両方のモデルにおいて毛包が新たに形成されたかどうかは明らかではないが、治癒した開放創に存在する毛包は新生の結果であると考えられる。成熟度は様々であるが２週間が経過する前に治癒過程にある組織で見られるこれらの毛包は、ＣＰによって中程度のレベルで発現されるＷｎｔ１０ｂが関与するＷｎｔ依存性シグナル伝達の結果として発達した可能性がある。インビボでは、Ｗｎｔ１０ｂは、皮膚上皮の分化および毛包の形成において重要であり（Ｉｔｏ， Ｍ．； ｅｔ ａｌ． Ｗｎｔ‐ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅ ｎｏｖｏ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ ａｆｔｅｒ ｗｏｕｎｄｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ４４７：３１６‐３２０； ２００７）、組換えＷｎｔ１０ｂを用いた最近の研究では、インビトロでの毛幹の成長および毛包の形成に対するポジティブな効果が示された（Ｏｕｊｉ， Ｙ．； ｅｔ ａｌ． Ｗｎｔ‐１０ｂ， ｕｎｉｑｕｅｌｙ ａｍｏｕｎｔ Ｗｎｔｓ， ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈａｆｔ ｇｒｏｗｔｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３６７：２９９‐３０４； ２００８）。恐らくはＣＰカクテルの成分として、Ｗｎｔ１０ｂは、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ‐βなどを例とする創傷治癒の初期段階に関与する因子と共同して作用し、血管新生、ならびに線維芽細胞およびケラチノサイトの移動と合わせて上皮分化を誘導し、胚発生の場合と同様に、発生のきっかけを効果的に提供する。

さらに、これらの研究で観察された効果は、中枢神経系の外での治療ＣＰ産物の役割を支持するものである。それらは、個別の分子として適用された場合、創傷治癒の改善と関連する種々の因子の容易な供給源である。例えば、組換えＰＤＧＦは、糖尿病性潰瘍を治療するためにそれ単独で広く研究されており（Ｒｏｂｓｏｎ， Ｍ．Ｃ； ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｔｅｌｅｔ‐ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＢＢ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３３９：２３； １９９２）、局所での使用についてＦＤＡに認可されている。ＴＧＦ‐β２もまた、臨床試験が行われており（Ｒｏｂｓｏｎ， Ｍ．Ｃ； ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β２ ｏｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｆｏｏｔ Ｕｌｃｅｒｓ： Ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｄｏｓｅ‐Ｒａｎｇｉｎｇ Ｔｒｉａｌ． ＪＡＲＣＥＴ ２（２）； ２００２）、依然として製品開発の可能性の高い領域である。必要に応じて治療過程の組織によって利用されるように、これらのおよびその他の因子を同時に適用することで、創傷治癒カスケードのたった１つの局面のみを標的とすることに関連する問題に対処し、送達動態学的影響、および創傷でのフィードバックを介する因子の制御を低減することになる。そのような因子の組み合わせはまた、血液供給の回復から始まって表層再構築で終わる、より順序良く整理された組織の再構築を要する深部虚血性潰瘍などのより重症である創傷に有用であることも示され得る。

本明細書で示すように生物学的に決定された比および組成で送達されるＣＰからの因子を用いて、皮膚創傷の治癒を改善することが可能である。ＣＰカクテルによって付与される、血管新生から組織再構築におよぶ広範囲にわたることが考えられる効果により、研究に適するその他の適応症も存在し得る。治療効果は、神経変性疾患の動物モデルで既に報告されており、その他の考えられる適応症としては、心血管系の疾患などの虚血および壊死を起こしている組織の治療に段階的な介入を要する疾患、筋消耗および修復、再発毛、抗シワ治療、軟骨修復、およびその他の類似の領域が挙げられる。

結論
ＣＰ分泌タンパク質を含む治療用組成物は、複数の重要なプロセスを加速および促進することによって創傷治癒の速度を速めることが本明細書で示された。ＣＰ分泌タンパク質の適用はまた、最終的な治癒創傷部位におけるコラーゲンの沈着を低減することも示され、これは、組織機能（強度）の喪失または瘢痕による美容的損傷を防止するものである。

上述の実施例のみに本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば理解されるように、（添付の請求項に示す）本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形が可能である。

参考文献
１． Ｓｅｄｌａｒｉｋ Ｋ．Ｍ； Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ． Ｗｕｎｇ Ｆｏｒｕｍ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ‐ｌｉｎｅ： ｈａｒｔｍａｎｎ＿ｏｎｌｉｎｅ， １９９４
２． Ｌａｕｒｅｎｃｅ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ； Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ‐ｌｉｎｅ： ｅＭｅｄｉｃｉｎｅ． １５ Ｍａｙ ２００３
３． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍｅｒｃａｎｄｅｔｔｉ； Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ， Ｈｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ‐ｌｉｎｅ： ｅＭｅｄｉｃｉｎｅ． １ Ａｕｇｕｓｔ ２００５
４． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｅ． （１９９８）． Ｍｕｒｒａｙ Ｌ． Ｂａｒｒ Ａｗａｒｄ Ｌｅｃｔｕｒｅ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃａｍｅ ｂａｃｋ！ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌ Ｂｉｏｌ ７６， １３‐２６．
５． Ｐｏｏｒ／Ｓｌｏｗ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ． Ｏｎ‐ｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ： Ｄｉａｇｎｏｓｅ‐ｍｅ．ｃｏｍ． ２２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５．
６． Ａｌｅｓｈｉｒｅ ＳＬ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ａｓ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ．” Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ６３：５９３‐７， １９８５）
７． Ｊｏｈａｎｓｏｎ ＣＥ ｅｔ ａｌ． （２０００）， ”Ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ： ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．” Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２０：１９７‐２１６． ８． Ｔｈａｎｏｓ， ＣＧ ｅｔ ａｌ．， （２００７）． Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ‐ｐｏｌｙ‐ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． １３（４） ７４７‐７５６．
９． Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ Ｒ． ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌｅｒ Ｍ． （２００１）． Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６９（４）： ５１３‐２１．
１０． Ｙａｎｇ Ｌ．， Ｓｃｏｔｔ Ｐ．Ｇ．， Ｄｏｄｄ Ｃ．， Ｍｅｄｉｎａ Ａ．， Ｊｉａｏ Ｈ．， Ｓｈａｎｋｏｗｓｋｙ Ｈ．Ａ．，Ｇｈａｈａｒｙ Ａ． ａｎｄ Ｔｒｅｄｇｅｔ Ｅ．Ｅ． （２００５）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐｏｓｔｂｕｒｎ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １３（４）： ３９８‐４０４． １１． Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ Ｒ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌｅｒ Ｍ， （２００１）． Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ６９， ５１３‐２１
１２． Ｂｈｏｇａｌ ＲＫ， Ｓｔｏｉｃａ ＣＭ， ＭｃＧａｈａ ＴＬ ａｎｄ Ｂｏｎａ ＣＡ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． （２００５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２５（６） ５９２‐６０３．

引用特許
国際公開第００／６６１８８号、国際公開第０６／１３２５４８号、米国特許第５９７３００７号、米国特許第６３２２８０４号。

参考文献および引用特許はすべて参照することで本明細書に組み入れられる。

産業的応用
本発明は、ＣＰ分泌タンパク質を含む治療用組成物を全身的または局所的に投与することによって創傷治癒を改善する方法を提供する。この方法は、創傷治癒時間の改善、ならびに瘢痕組織形成の低減および組織機能喪失の抑制を提供する。この方法は特に美容的治療に有用である。

Claims (18)

1. 組織創傷の治癒の改善において用いるための、脈絡叢（ＣＰ）分泌タンパク質を含む治療用組成物であって、ここで前記ＣＰ分泌タンパク質は、ＣＰ条件培地から混合物として単離または精製され、
   前記ＣＰ分泌タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦβ、ＴＧＦ‐α、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐１、シスタチン、α‐２ミクログロブリン、多面的因子β、ＮＧＦ、ＮＴ、トランスサイレチン、レチノイン酸、ＰＴＨＬＨ、ハプトコリン、トロポモジュリン３、ＰＥＤＦ、β‐２‐ミクログロブリン、ソマトスタチン、フィブロネクチン、ラミニンβ１、および分泌された細胞外マトリックス因子、のうち少なくとも２つの混合物を含む、治療用組成物。
2. グルココルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、およびＴＮＦ‐αアンタゴニストから成る群より選択される１もしくは２つ以上の免疫賦活化合物をさらに含む、請求項１に記載の治療用組成物。
3. 全身投与または局所投与のために製剤される、請求項１または２に記載の治療用組成物。
4. 経口、静脈内、皮膚、皮内、局所、経鼻、筋肉内、または腹腔内投与のために製剤される、請求項３に記載の治療用組成物。
5. 請求項１に記載の単離または精製されたＣＰ分泌タンパク質を含む美容用組成物。
6. 組織創傷の治癒を改善するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
7. 切創および掻爬創を含む表層皮膚の創傷；手術による切開を含む、皮膚および筋肉を通して広がる深い創傷；スポーツによる傷害または外傷に起因する筋肉および腱の創傷、挫傷、および血腫を含む内部創傷；熱傷；ならびに糖尿病性潰瘍を含む慢性創傷の治癒を改善するためのものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療用組成物。
8. ＣＰ条件培地から混合物として単離または精製された脈絡叢（ＣＰ）分泌タンパク質を含む美容用組成物であって、
   前記ＣＰ分泌タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦβ、ＴＧＦ‐α、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐１、シスタチン、α‐２ミクログロブリン、多面的因子β、ＮＧＦ、ＮＴ、トランスサイレチン、レチノイン酸、ＰＴＨＬＨ、ハプトコリン、トロポモジュリン３、ＰＥＤＦ、β‐２‐ミクログロブリン、ソマトスタチン、フィブロネクチン、ラミニンβ１、および分泌された細胞外マトリックス因子、のうち少なくとも２つの混合物を含む、美容用組成物。
9. 表層皮膚創傷後の皮膚の外観を改善するための美容用組成物であって、請求項８に記載の組成物の有効量を含む、美容用組成物。
10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療用組成物を、薬学的に許容されるキャリアと共に含む医薬組成物。
11. 組織創傷の治癒の改善において用いるための、追加的または相乗的効果を与える１もしくは２つ以上の化合物をさらに含む医薬組成物であって、ここで、前記化合物は、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾンなどのグルココルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、成長因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＴＧＦ‐ベータ）、抗生物質、トロフィックまたはトロピック化合物、ペプチド、模倣薬、オリゴヌクレオチド、抗体、阻害薬、ならびに第一および第二世代抗ＴＮＦα薬から成る群より選択され、ならびに、前記組成物は、ＣＰ分泌タンパク質と別々に、順次に、または同時に投与するために製剤される、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. ＣＰ条件培地から混合物として単離されたＣＰ分泌タンパク質を含む請求項１に記載の治療用組成物の製造方法であって、前記方法は：
    ａ）ＣＰ細胞を、基本成長培地中、前記ＣＰ細胞が前記培地中へタンパク質を分泌するのに十分な時間インビトロにて培養する工程；
    ｂ）ＣＰ条件培地を抽出する工程；
    ｃ）前記ＣＰ条件培地を凍結乾燥する工程；および、
    ｄ）所望される場合は、工程ｃ）の前もしくは後に前記ＣＰ条件培地を透析する工程、
    を含む、方法。
13. ＣＰ条件培地から混合物として単離されたＣＰ分泌タンパク質を含む請求項１０に記載の医薬組成物の製造方法であって、前記方法は：
    ａ）ＣＰ細胞を、基本成長培地中、前記ＣＰ細胞が前記培地中へタンパク質を分泌するのに十分な時間インビトロにて培養する工程；
    ｂ）ＣＰ条件培地を抽出する工程；
    ｃ）前記ＣＰ条件培地を凍結乾燥する工程；
    ｄ）所望される場合は、工程ｃ）の前もしくは後に前記ＣＰ条件培地を透析する工程、および、
    ｅ）工程ｃ）の前記凍結乾燥したＣＰ条件培地、または工程ｄ）の凍結乾燥および透析したＣＰ条件培地を、薬学的に許容される賦形剤またはキャリアと混合する工程、
    を含む、方法。
14. 創傷の治癒の増進において用いるための、請求項１２に記載の方法で作製された治療用組成物。
15. 創傷の治癒の増進において用いるための、請求項１３に記載の方法で作製された医薬組成物。
16. ＣＰ条件培地から混合物として単離または精製された２つ以上の脈絡叢（ＣＰ）分泌タンパク質、およびそれを必要とするヒトまたは非ヒト患者において組織創傷の治癒の改善のために用いられる薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であって、ここで、前記ＣＰ分泌タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ２、トランスサイレチン、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ‐７、ＦＧＦ‐２、ＴＧＦ‐α、ＩＬ‐６、ＩＬ−８／ＣＸＣケモカイン、ＩＧＦ‐１、ＩＧＦ‐２、シスタチン、α‐２ミクログロブリン、多面的因子β、ＮＧＦ、ＮＴ、レチノイン酸、ＰＴＨＬＨ、ハプトコリン、トロポモジュリン３、ＰＥＤＦ、β‐２‐ミクログロブリン、ソマトスタチン、フィブロネクチン、ラミニンβ１、ガレクチン―１、テネイシンＣ、クラスタリン、上皮成長因子、アドレノメデュリン、アキソトロフィン、Ｗｎｔ−１０Ｂ、ＩＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、および分泌された細胞外マトリックス因子からなる群から選択される、医薬組成物。
17. 前記組織創傷が、腹腔、ヘルニア、または筋膜内のものである、請求項６または７に記載の治療用組成物。
18. ＣＰ条件培地から混合物として単離または精製された２つ以上の脈絡叢（ＣＰ）分泌タンパク質、および臨床的に許容可能な表層創傷治療用物品を含む、それを必要とするヒトまたは非ヒト患者において組織創傷の治癒の改善のために用いられる、治療用組成物。