JP2016119846A - 培養用ポケット部材 - Google Patents

Abstract

【課題】培養液中の細胞等の培養対象を確実に凝集でき、かつ凝集物を容易に取り出し可能とする。【解決手段】培養用ポケット部材２０は、培養液を容れるポケット室２０ａと、底面２３ａに形成された微細孔２３ｃを有している。ポケット室２０ａの内周面は、底面２３ａへ向けて縮径するように延びるとともに全域に亘って滑らかな内周滑曲面部２５を含む。内周滑曲面部２５の下端部が、底面２３ａと交差して微細孔２３ｃに連なっている。【選択図】図４

Description

本発明は、例えば細胞や微生物等の生体の培養に用いる培養用ポケット部材に関し、特に培養液から細胞凝集体などの沈降物を得るのに適した培養用ポケット部材に関する。

例えば、特許文献１では、細胞培養容器のウェル内の培養液で細胞凝集体を作っている。ウェルの内底面が、漏斗状（逆さ円錐面状）や半球面状になっている。
特許文献２では、ウェルの内底面にくぼみが形成されている。
特許文献３では、ウェルの底部が、漏斗状（逆さ円錐面状）になっており、かつ内底面の中央部分は部分球面状になっている。

特許第３２７０２８６号公報 特開２００９−５０１９４号公報 国際公開ＷＯ２０１３／１８３７７７号公報

前掲特許文献１〜３の培養容器では、細胞凝集体を凝集させた後、取り出すのが容易でなかった。
本発明は、かかる事情に鑑み、培養液中の細胞等の培養対象を確実に凝集でき、かつ凝集物を容易に取り出し可能とすることを目的とする。

前記問題点を解決するために、本発明は、
培養液を容れるポケット室と、
底面に形成された微細孔と、
を有し、前記ポケット室の内周面が、前記底面へ向けて縮径するように延びるとともに全域に亘って滑らかな内周滑曲面部を含み、前記内周滑曲面部の下端部が、前記底面と交差して前記微細孔に連なっている培養用ポケット部材を特徴とする。

この培養用ポケット部材のポケット室に培養液を入れることで、培養液中の細胞や微生物等の培養対象をポケット室の底部まで沈降させて確実に凝集させることができる。滑らかな内周滑曲面部によって、培養対象がポケット室の内壁に引っ掛かるのを防止又は抑制できる。また、ポケット室から凝集物を取り出す際は、例えば、培養用ポケット部材に遠心力や内外気圧差等を加える。これによって、凝集物を微細孔から吐出させることができ、簡単かつ確実に取り出すことができる。
ここで、「全域に亘って滑らかな」とは、内周滑曲面部にはどこにも、段差、エッジ、稜線部、小突起、凸角部、凹角部、小凹部、角溝等の、接線が不連続的に変化する非滑部分が形成されていないことを言う。なお、表面粗さによる例えばミクロンオーダー〜ナノオーダー、若しくはオングストロームオーダーの微細凹凸（ないしは細胞等の培養対象が引っ掛からない程度の微細凹凸）は、前記非滑部分には該当せず、「滑らか」の範囲に含まれる。

前記ポケット室の上下方向の中間部より下側における前記内周滑曲面部が、前記底面に近づくにしたがって縮径されるとともに傾斜が漸次急になる下側滑曲面部分を含み、前記下側滑曲面部分の下端が、前記底面に達して前記微細孔を構成していることが好ましい。
これによって、培養対象をポケット室の底部へ確実に沈降させて凝集させることができる。かつ凝集物を微細孔から確実に取り出すことができる。

前記ポケット室の前記中間部より上側における前記内周滑曲面部が、前記下側滑曲面部分に近づくにしたがって縮径されるとともに傾斜が漸次緩やかになる上側滑曲面部分を含み、前記上側滑曲面部分及び前記下側滑曲面部分が、前記中間部における変曲部を介して滑らかに連なっていることが好ましい。
これによって、培養液をポケット室に容易に滴下できる。また、培養対象がポケット室の内壁に引っ掛かるのを確実に防止できる。

前記底面が、下方へ凸の曲面であり、かつ該底面の中央部に前記微細孔が配置されていることが好ましい。
これによって、微細孔から出た培養液が培養用ポケット部材の底面に付着して残ったり液ダレが出来たりするのを抑制又は防止できる。

上端部に環状の鍔部が形成され、前記鍔部に通気路が形成されていることが好ましい。
この種の培養用ポケット部材は、例えばマルチプレート等の細胞培養容器のウェルの上端部に装着されて使用される。培養用ポケット部材とウェルの内周面との間に培養室が形成される。この培養室が前記通気路を介して外部と連通される。これによって、培養液及び凝集物を微細孔から培養室に移す際に、培養室の内圧が上昇するのを回避できる。したがって、培養液及び凝集物を培養室に確実に移送させることができる。

本発明によれば、培養液中の細胞等の培養対象を確実に凝集でき、かつ凝集物を容易に取り出すことができる。

図１（ａ）は、本発明の第１実施形態に係る培養用ポケット部材を含む培養モジュールの平面図である。図１（ｂ）は、前記培養モジュールの斜視図である。 図２は、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿う、前記培養モジュールの断面図である。 図３（ａ）は、前記培養用ポケット部材の平面図である。図３（ｂ）は、前記培養用ポケット部材の正面図である。図３（ｃ）は、前記培養用ポケット部材の底面図である。 図４は、図３（ｂ）のＩＶ−ＩＶ線に沿う、前記培養用ポケット部材の断面図である。 図５は、前記培養用ポケット部材の下側部分を拡大して示す断面図である。 図６は、前記培養用ポケット部材の鍔をマルチプレートの上面に載せた状態における、図３（ａ）のＶＩ−ＶＩ線に沿う拡大断面図である。 図７は、本発明の第２実施形態に係る培養用ポケット部材を含む培養モジュールの断面図である。

以下、本発明の一実施形態を図面にしたがって説明する。
図１は、培養モジュール１を示したものである。培養モジュール１は、マルチプレート１０（細胞培養容器）と、複数の培養用ポケット部材２０，２０…とを備えている。マルチプレート１０の材質は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の透明な樹脂であり、好ましくはポリスチレンである。マルチプレート１０は、複数のウェル１１，１１…を有している。図１（ａ）に示すように、複数のウェル１１，１１…は、縦横に整列して配置されている。
なお、同図のマルチプレート１０におけるウェル１１の縦横の各並び数は、作図の便宜を考慮したものであり、実際のウェル１１の縦横の各並び数は、図示した数より多くてもよく少なくてもよく、もちろん図示した数と同数でもよい。

図２に示すように、各ウェル１１は、周壁部１１ａ及び底面部１１ｂを有する有底穴である。周壁部１１ａは、マルチプレート１０の上面に開口するとともに真っ直ぐ下方への延びる円筒状になっている。周壁部１１ａの下端部が、底面部１１ｂにて塞がれている。底面部１１ｂは、下方へ凸の半球面状になっている。

図２に示すように、各ウェル１１の上端部に培養用ポケット部材２０が着脱可能に装着されている。培養用ポケット部材２０の材質は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の透明な樹脂であり、好ましくはポリスチレンである。図３（ｂ）に示すように、培養用ポケット部材２０は、周壁２１と、鍔部２２と、隆起部２３と、側突起２４を有している。周壁２１は、下方へ向かって先細の概略逆さ円錐筒形状ないしは擂鉢形状になっている。

図４に示すように、周壁２１の内部にポケット室２０ａが形成されている。ポケット室２０ａは、上方へ向かって拡開されるとともに、下方へ向かうにしたがって縮径されている。図３（ａ）に示すように、培養用ポケット部材２０の上面に開口部２０ｅが形成されている。開口部２０ｅは、円形になっており、その直径は、ウェル１１の大きさにも依るが、例えば５ｍｍ〜１０ｍｍ程度、好ましくは７ｍｍ程度である。図２に示すように、ポケット室２０ａには培養液９が容れられる。培養液９には培養対象の細胞８が多数分散されている。細胞８の大きさは、例えば数μｍ〜数十μｍ程度であり、小さいもので１０μｍ程度である。

図３（ａ）に示すように、培養用ポケット部材２０の上端の外周部には、鍔部２２が形成されている。鍔部２２は、周壁２１から径方向外側へ突出されるとともに、周壁２１の全周にわたる環状になっている。図３（ｃ）に示すように、鍔部２２には、３つ（複数）の通気路２２ｂが形成されている。これら通気路２２ｂは、鍔部２２の周方向に好ましくは等間隔置きに離れて配置されている。各通気路２２ｂは、鍔部２２の下面及び外端面に開口する溝状になっている。
なお、通気路２２ｂの数は、３つに限られず、１つだけでもよく、２つでもよく、４つ以上でもよい。

図２に示すように、培養用ポケット部材２０の周壁２１をウェル１１の上端部に挿し入れると、鍔部２２が、マルチプレート１０の上面に引っ掛かる。これによって、培養用ポケット部材２０がマルチプレート１０によって支持される。ウェル１１の内周面と周壁２１の外周面との間には、培養室１２が画成される。また、図６に示すように、通気路２２ｂの下部開口の一部（外周側の部分）が、マルチプレート１０の上面によって塞がれる。これによって、マルチプレート１０の上面が通気路２２ｂの底面を構成する。この通気路２２ｂを介して、培養室１２が外部と連通される。したがって、培養室１２の内圧は、常時、大気圧に維持されている。

図３（ｃ）に示すように、培養用ポケット部材２０の周側部には、３つ（複数）の側突起２４が形成されている。側突起２４は、周壁２１の外周面から突出されるとともに、上下方向へ延びている。３つの側突起２４は、周壁２１の周方向に好ましくは等間隔置きに離れて配置されている。図２に示すように、周壁２１をウェル１１の上端部に挿し入れると、側突起２４の上側部分がウェル１１の内周面に圧接される。これによって、培養用ポケット部材２０がマルチプレート１０に安定的に保持される。
なお、側突起２４の数は、３つに限られず、１つだけでもよく、２つでもよく、４つ以上でもよい。

図３（ｂ）に示すように、培養用ポケット部材２０の先細の下端部には、隆起部２３が設けられている。図３（ｃ）に示すように、隆起部２３の外径は、培養用ポケット部材２０全体の外径（鍔部２２の外径）に対して十分に小さい。図５に示すように、隆起部２３は、中央部に向かうにしたがって下方へ隆起している。隆起部２３の外表面が底面２３ａを構成している。底面２３ａは、下方へ凸の曲面になっている。底面２３ａの中央部に微細孔２３ｃが形成されている。

追って詳述するように、ポケット室２０ａの下端部が微細孔２３ｃに連なっている。したがって、ポケット室２０ａの底部は開口されている。微細孔２３ｃは、開口部２０ｅに比べて十分に小さい。好ましくは、図５に示すように、微細孔２３ｃの大きさは、ポケット室２０ａの底部に集まった細胞８（細胞凝集物８Ａ）が自然落下するのを阻止でき、かつ遠心力や吸引力や押出気圧等を加えることで細胞凝集物８Ａを吐出し得る程度に設定されている。具体的には、微細孔２３ｃの直径は、０．０５ｍｍ〜５ｍｍ程度が好ましく、０．３ｍｍ程度がより好ましい。

図４に示すように、ポケット室２０ａの内周面には、内周滑曲面部２５が設定されている。内周滑曲面部２５は、その全域に亘って滑らかになっている。好ましくは、ポケット室２０ａの内周面の全体が、内周滑曲面部２５となっている。すなわち、ポケット室２０ａの内周面（内周滑曲面部２５）には、どこにも、エッジ、稜線部、小突起、凸角部、凹角部、小凹部、角溝、段差等の、接線が不連続的に変化する非滑部分が形成されていない。

ポケット室２０ａの内周面すなわち内周滑曲面部２５は、下端の隆起部２３へ向けて縮径するように延びており、概略逆さ円錐面形状になっている。詳しくは、図４に示すように、内周滑曲面部２５は、上側滑曲面部分２５ａと、下側滑曲面部分２５ｂを含む。上側滑曲面部分２５ａは、ポケット室２０ａの上下方向の中間部より上側に配置されている。下側滑曲面部分２５ｂは、ポケット室２０ａの上下方向の中間部より下側に配置されている。

上側滑曲面部分２５ａは、環状をなし、その上端部が開口部２０ｅに連なっている。上側滑曲面部分２５ａは、開口部２０ｅから下方の下側滑曲面部分２５ｂへ向かって漸次縮径されている。しかも、上側滑曲面部分２５ａの傾斜は、下方へ向かう（下側滑曲面部分２５ｂに近づく）にしたがって漸次緩やかになっている。したがって、上側滑曲面部分２５ａは、上下方向（経線方向）に沿って径方向外側へ凸となる環状曲面となっている。

ポケット室２０ａの上下方向の中間部における内周滑曲面部２５は、変曲部２５ｃとなっている。この変曲部２５ｃにおいて、内周滑曲面部２５が変曲している。上側滑曲面部分２５ａ及び下側滑曲面部分２５ｂが、変曲部２５ｃを介して滑らかに連なっている。なお、変曲部２５ｃは、ポケット室２０ａの上下方向のちょうど中間の高さに配置されている必要はなく、多少上下にずれていてもよい。

下側滑曲面部分２５ｂは、環状をなし、かつ変曲部２５ｃから下方の微細孔２３ｃへ向かって漸次縮径されている。下側滑曲面部分２５ｂの傾斜は、下方へ向かう（微細孔２３ｃに近づく）にしたがって急になっている。したがって、下側滑曲面部分２５ｂは、上下方向（経線方向）に沿って径方向内側へ凸となる環状曲面となっている。

図５に拡大して示すように、下側滑曲面部分２５ｂの下側部分の傾斜は、ほぼ垂直になっている。かつ、下側滑曲面部分２５ｂの下側部分は、十分に縮径され、微細径の円筒面形状に収束している。この下側滑曲面部分２５ｂの下端が、底面２３ａの中央部に達して開口している。下側滑曲面部分２５ｂの下端開口が、微細孔２３ｃを構成している。言い換えると、内周滑曲面部２５の下端部が、底面２３ａと交差して、微細孔２３ｃに連なっている。内周滑曲面部２５の下端部と底面２３ａとは略直交（交差）している。ポケット室２０ａには、底面が設けられていない。別言すれば、ポケット室２０ａの底面には、これと同じ大きさの微細孔２３ｃが形成されており、これによって、ポケット室２０ａの底面の全体が開口されている。

培養用ポケット部材２０は、外周面及び内周面共にアンダーカット部が無いから射出成型用金型の作製が容易である。ひいては、培養用ポケット部材２０を容易に成形することができる。

培養モジュール１は、例えば次のようにして使用される。
＜滴下工程＞
マルチプレート１０の各ウェル１１の上端部に培養用ポケット部材２０を装着する。そして、各培養用ポケット部材２０のポケット室２０ａに培養液９を滴下する。上側滑曲面部分２５ａが、開口部２０ｅに向かって拡開されるとともに径方向外側へ凸の曲面になっているため、ピペット等の滴下器具の先端を開口部２０ｅからポケット室２０ａに差し入れやすい。これによって、滴下操作を容易に行なうことができる。

＜凝集工程＞
図５に示すように、ポケット室２０ａにおける培養液９中の細胞８は、自重によって培養液９内を沈降する。
培養液９は、表面張力や粘性によって微細孔２３ｃからの流出を阻止され、ポケット室２０ａ内に溜まるようになっている。
細胞８は、沈降しながら内周滑曲面部２５に沿って集められる。集まった細胞８は、微細孔２３ｃを塞ぐことで、ポケット室２０ａの下側部分に溜まる。これによって、ポケット室２０ａの下側部分に細胞凝集物８Ａを確実に形成することができる。

ポケット室２０ａの内周面を滑らかな内周滑曲面部２５とすることによって、細胞８を内周滑曲面部２５に沿ってスムーズに沈降させることができる。すなわち、細胞８が、ポケット室２０ａの途中でエッジや角部等の非滑部分に引っ掛かって残留するのを防止できる。さらに、ポケット室２０ａの下側滑曲面部分２５ｂが、下方に向かうにしたがって急傾斜になり、かつ十分に縮径されているため、細胞８をより確実に沈降させて凝集させることができる。これによって、細胞凝集物８Ａをより確実に形成することができる。

＜排出工程＞
その後、培養モジュール１を遠心分離機（図示せず）にセットして、ウェル１１の底部へ向かう遠心力Ｆをかける。この遠心力Ｆによって、ポケット室２０ａ内の細胞凝集物８Ａを、微細孔２３ｃから排出させることができる。これによって、培養用ポケット部材２０から細胞凝集物８Ａを容易かつ確実に取り出すことができる。
また、細胞凝集物８Ａの上側の培養液９（上澄み）も、前記遠心力によって微細孔２３ｃから排出できる。
培養用ポケット部材２０の最下端が、微細孔２３ｃの周縁の狭小な面積に狭められているため、微細孔２３ｃから出た培養液９が培養用ポケット部材２０の下端に付着して残ったり液ダレが出来たりするのを防止又は抑制できる。

微細孔２３ｃから排出された細胞凝集物８Ａ及び培養液９は、培養室１２内に移される。培養室１２は、通気路２２ｂを介して外部と連通しているために、常時、大気圧に維持されている。したがって、培養室１２内に細胞凝集物８Ａや培養液９が導入されても、培養室１２の内圧が上昇することはない。よって、細胞凝集物８Ａを培養用ポケット部材２０から一層確実に排出させることができる。

次に、本発明の他の実施形態を説明する。以下の実施形態において、既述の形態と重複する構成に関しては、図面に同一符号を付して、説明を簡略化する。
図７は、本発明の第２実施形態を示したものである。第２実施形態では、一列に並ぶ複数の培養用ポケット部材２０，２０…によって培養用ポケットアレイ２０Ａが構成されている。培養用ポケットアレイ２０Ａにおける、隣接する培養用ポケット部材２０，２０の鍔部２２どうしが、連結部２６を介して一体に連なっている。ひいては、培養用ポケットアレイ２０Ａの培養用ポケット部材２０，２０…どうしが一列に連なっている。この培養用ポケットアレイ２０Ａが、マルチプレート１０の一列をなすウェル１１，１１…に装着されている。

第２実施形態によれば、培養モジュール１の部品点数を少なくできる。また、培養用ポケット部材２０のマルチプレート１０への着脱を効率的に行うことができる。
なお、図７においては、培養用ポケットアレイ２０Ａを構成する培養用ポケット部材２０の数は、５つであるが、これに限られず、２つ〜４つでもよく、６つ以上であってもよい。

本発明は、前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲内で種々の改変をなすことができる。
例えば、培養用ポケット部材２０のポケット室２０ａの内周面の全体が、内周滑曲面部２５を構成していなくてもよく、ポケット室２０ａの内周部の一部（好ましくは中間部より下側部分）だけが内周滑曲面部２５を構成していてもよい。ポケット室２０ａの例えば上側の内周面には、エッジや稜線部等の非滑部分が設けられていてもよい。
通気路２２ｂは、溝状に限られず、鍔部２２の内部を貫通する貫通孔状であってもよい。
第２実施形態（図７）の変形例として、複数の培養用ポケットアレイ２０Ａどうしが横方向（図７の紙面直交方向）にも一体に連なっていてもよい。
排出工程では、ポケット室２０ａの内圧を培養室１２の内圧より高くすることで、細胞凝集物８Ａを微細孔２３ｃから吐出するようにしてもよい。
培養対象は、細胞８に限られず、細菌、その他の微生物であってもよい。

本発明は、例えば細胞凝集物を生成する技術に適用できる。

９ 培養液
２０ 培養用ポケット部材
２０ａ ポケット室
２０ｅ 開口部
２２ 鍔部
２２ｂ 通気路
２３ａ 底面
２３ｃ 微細孔
２５ 内周滑曲面部（内周面）
２５ａ 上側滑曲面部分
２５ｂ 下側滑曲面部分
２５ｃ 変曲部

Claims (5)

1. 培養液を容れるポケット室と、
   底面に形成された微細孔と、
   を有し、前記ポケット室の内周面が、前記底面へ向けて縮径するように延びるとともに全域に亘って滑らかな内周滑曲面部を含み、前記内周滑曲面部の下端部が、前記底面と交差して前記微細孔に連なっていることを特徴とする培養用ポケット部材。
2. 前記ポケット室の上下方向の中間部より下側における前記内周滑曲面部が、前記底面に近づくにしたがって縮径されるとともに傾斜が漸次急になる下側滑曲面部分を含み、前記下側滑曲面部分の下端が、前記底面に達して前記微細孔を構成していることを特徴とする請求項１に記載の培養用ポケット部材。
3. 前記ポケット室の前記中間部より上側における前記内周滑曲面部が、前記下側滑曲面部分に近づくにしたがって縮径されるとともに傾斜が漸次緩やかになる上側滑曲面部分を含み、前記上側滑曲面部分及び前記下側滑曲面部分が、前記中間部における変曲部を介して滑らかに連なっていることを特徴とする請求項２に記載の培養用ポケット部材。
4. 前記底面が、下方へ凸の曲面であり、かつ該底面の中央部に前記微細孔が配置されていることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の培養用ポケット部材。
5. 上端部に環状の鍔部が形成され、前記鍔部に通気路が形成されていることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の培養用ポケット部材。

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