JP2016103997A - メラニン制御剤の探索方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、ケラチノサイトから放出されるエクソソームがメラノサイトに対して如何なる作用を示すのかは全く知られていない。
a)ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
b)培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
c)エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程
故に、ケラチノサイトからのエクソソームの分泌レベルを変化させることによって、メラニンの制御が可能であり、当該エクソソームの分泌レベルの増加はメラニン量を増加させ、逆に当該エクソソームの分泌レベルの低減はメラニン量を低下させると云え、実際に、エクソソームの放出促進剤によりメラニン生成が促進され(図9〜11)、エクソソームの放出抑制剤によりメラニン生成が抑制される(図12〜15)。
したがって、ケラチノサイトにおけるエクソソームの分泌レベルを指標とすることにより、メラニン制御剤を評価又は選択することができる。
各種測定は、当該分野で通常使用される任意の解析方法を用いればよく、遺伝子発現解析には、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、RNaseプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、RT−PCR法、DNAマイクロアレイ等を、タンパク質発現解析には、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ELISA、バインディングアッセイ等を用いることができる。また、市販のキット(例えばCD63 ExoELISA Kit(System Biosciences社、#EXOEL-CD63A-1)等)やナノ粒子解析装置(NanoSight LM10(NanoSight社))を用いることもできる。
<1>以下の工程a)〜c)を含むメラニン制御剤の探索方法。
a)ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
b)培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
c)エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程
<2>b)工程における分泌レベルの測定が、エクソソーム画分のタンパク質量を測定し、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出する、<1>の方法。
<3>エクソソームの分泌レベルを増強又は増加させる被験物質を、メラニン産生促進剤、デンドライト伸長促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防若しくは治療剤、又は白髪予防若しくは改善剤として評価及又は選択する<1>又は<2>の方法。
<4>エクソソームの分泌レベルを低下又は減少させる被験物質を、メラニン産生抑制剤、デンドライト伸長抑制剤又は美白剤としてとして評価又は選択する<1>又は<2>の方法。
<5>前記被験物質の濃度は、通常0.00001質量%以上、好ましくは0.0001質量%以上で、1質量%以下、好ましくは0.1質量%以下であり、また0.00001〜1質量%、好ましくは0.0001〜0.1質量%である<1>〜<4>の方法。
<6>前記細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、12〜120時間であり、好ましくは48〜72時間である<1>〜<5>の方法。
実施例1:ケラチノサイト由来エクソソームの単離とその特徴付け
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入した。ケラチノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
ケラチノサイトを2.5×106cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor)以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を使用した。3日間の培養後、培養上清を回収し、300gで10分間、2,000gで20分間、10,000gで30分間と段階的に遠心分離することにより、余分な細胞(破片)を除去した。この操作を終えた後の培養上清に対し、100,000gで70分間の遠心分離を行った後で上清を除去し、Phosphate Buffered Saline (PBS)にて一度洗浄した。さらに、100,000gで70分間遠心分離した後に完全に上清を除去し、沈殿物をPBSにて懸濁した。100mLの培養上清から遠心分離した場合、最終沈殿物は200μLのPBSにて懸濁し、これを原液として評価に用いた。また、100,000g遠心後の上清はAmicon(R) Ultra Centrifugal Filters Ultra(R)-3K (Millipore)に供し、4,800rpmで45分間遠心処理を行った。遠心処理後にフィルター上部に残留した液を培養上清濃縮物として回収した。また、細胞非培養の培地に対して同様の処理を施した液を培地濃縮物として回収した。
単離したエクソソーム画分をPBSもしくはHEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) bufferにて適宜希釈した。その溶液を親水化処理したコロジオン膜貼付メッシュ 400メッシュ(日新EM)に5μL滴下し、5分間静置した。膜上の水分を吸い取った後、2% Sodium Dodecatungsto(VI) phosphate n-Hydrate (wako)もしくはEMステイナー(日新EM)を10μL滴下し、1分間もしくは30分間静置することにより、ネガティブ染色を行った。膜上の水分を除いた後、精製水を10μL滴下した。余分な水分を除いた後、H7650透過型電子顕微鏡(日立)を用いて加速電圧100kVで観察した。その結果、既報と同様に、エクソソームに特徴的なサイズ (直径30-100nm)と形態(cup-shaped) を示す小胞を確認した(図1)。
単離したエクソソーム画分をResuspension buffer (ambion)にて溶解し、その溶液についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク質定量を行った後、細胞抽出物、培養上清濃縮物及び培地濃縮物と共に、タンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-CD9 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-CD63 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-Calnexin (Cell Signaling, 1:1000)抗体、anti-HSP70 (Cell Signaling, 1:1000)抗体、あるいはanti-β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)抗体を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)あるいはanti-rabbit IgG HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Donkey (GE Healthcare Life Science) を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(富士フィルム)を用いて可視化した。その結果、エクソソームに特徴的に発現するマーカーとされるタンパク質群、すなわち、細胞質に存在するHeat shock protein 70、細胞骨格タンパク質であるActin、また、テトラスパニン(CD9、CD63)の発現がエクソソーム画分に確認され、さらにエクソソームには含有されないとして知られるCalnexinの発現が認められないことも確認された(図2)。それと同時に、ケラチノサイトの培養上清濃縮物(図2; lane2)には、Hsp70を除くエクソソームマーカータンパク質の発現が認められなかったことから、エクソソームがその濃縮過程で除去されていることを確認した。なお、Hsp70の発現が培養上清濃縮物で認められたことは既報(Chavez-Munoz C. et al., 2008, J.Cell. Biochem. 104:2165-2173)と同様の結果である。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologiesより購入した。メラノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
メラノサイトを1.0×104 cells/well (100μL/well)、1.0×105 cells/well (500μL/well)及び1.5×105 cells/well (1.5mL/well)の細胞密度で96-well plate、12-well plate及び6-well plateにそれぞれ播種した。この時の試験用培地としては、Medium254 (増殖添加剤(HMGS)のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含)を用いた。2日後、PBSにて懸濁したエクソソーム画分を添加した後、さらに、96-well plateにおいては5日間、12-well plateにおいては3日間もしくは4日間培養し、それぞれドーパオキシダーゼ活性の計測及び定量的RT-PCR解析に用いた。6-well plateにおいては5日間培養した後に、細胞数の計測及び形態観察、ウェスタンブロッティング解析、さらに、細胞内メラニン定量に用いた。
96-well plateでの培養終了後、培地を全量置換し(100μL/well)、アラマーブルー(Bio-Rad AbD Serotec Limited)試薬を10μL/wellになるように添加した。37℃、5Vol%CO2の条件下で1時間インキュベートした後、培地の蛍光強度 (Ex544nm/Em590nm)を測定することで細胞呼吸鎖(増殖)活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer (0.1M Tris-HCL (pH:7.2)、1% NP-40、0.01% SDS)を20μL/well、Assay Buffer (4%ジメチルホルムアミド、100mM Sodium phosphate-buffered (pH:7.1))を20μL/well添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法(Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326)を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各wellに、上記Assay Bufferを80μL、20.7mM MBTH (3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)溶液を60μL、基質として5mM L-DOPA (L-ジヒドロキシフェニルアラニン)溶液を40μL加え、37℃にて30〜60分間反応させた後、その吸光度を505nmの測定波長で測定した。その結果、PBSのみを添加したコントロールと比較して、同画分添加による両活性の有意な上昇を確認した(図3A、B)。
12-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄した後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて定法に従いtotal RNAを抽出した。その抽出したtotal RNAを鋳型とし、High Capacity RNA to cDNA Kit (Life Technologies)を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。反応には、MH Research社製のPeltier Thermal Cyclerを用いた。続いて合成したcDNA及びTaqMan(R)probeを用いて、定量的PCR法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なprobe及びprimerは、Life Technologies社製のTaqMan(R)Gene Expression Assays (P/N 4331182)を使用した。各々の発現量は、内部標準遺伝子であるribosomal protein, large, P0 (RPLP0)の発現量により補正した。反応条件は定法に従い、アプライドバイオシステムズ社製のシークエンスディテクター(ABI PRISM 7500 Real Time PCR System)を用いて行った。その結果、エクソソーム画分を添加して72時間後にMITFの発現上昇を確認し(図4A)、96時間後にはTYR、TYRP1、Dopachrome tautomerase (DCT) /TYRP2の発現上昇を確認した(図4B)。
6-well plateでの培養終了後、顕微鏡観察をおこない、画像を記録した。その後、0.25% Trypsin-EDTA 溶液(Life Technologies)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、細胞数の有意な増加を確認すると共に(図5A)、デンドライトの顕著な伸長を確認した(図5B)。
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-MITF (Santacruz, 1:200)、anti-Tyrosinase related protein (TRP) 1 (Santacruz, 1:1000)、anti-TRP2 (Santacruz, 1:200)、あるいはanti-Tyrosinase (Zymed, 1:1000)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)、あるいはanti-goat IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。上記タンパク質の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、PBSを添加したコントロールに対して、全てのタンパク質が有意に発現上昇していることを確認した(図6)。
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、メラニン産生が促進傾向にあることを確認した(図7)。
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。人種の異なる7名の被験者由来の皮膚組織から外科的に脂肪及び真皮の除去を行った後でタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット解析により、メラノソーム特異的なタンパク質であるPmel17の発現を検出し、それらのバンド強度を画像解析により定量した(図8A)。一方、10mLのhomogenization buffer (20mM Sodium phosphate、 pH6.5、0.15M NaCl、10mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、1mM dithiothreitol (DTT)、Halt protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific))中でガラス製ホモジナイザーを用いて組織破砕を行った。続いて、300gで10分間、2,000gで20分間、遠心分離することにより、余分な組織(破片)を除去した。この破砕液の上清を回収してタンパク質量を定量した後、約6mg分のタンパク質を含む液に調製し、10,000gで30分間、100,000gで70分間の遠心処理を行った。上清を除去し、PBSにて一度洗浄してから、さらに100,000gで70分間遠心処理を行い、完全に上清を除去して沈殿物をPBSに懸濁することで、エクソソーム画分を単離した。そして、そのタンパク質定量を行うことで、表皮組織中のエクソソーム含有量を算出した(図8B)。双方の結果から、Pmel17の発現量と表皮組織中のエクソソーム含有量の間に統計学的に有意な正の相関が見出された(図8C)。
このことより、実際のヒト皮膚組織において、エクソソームの量に応じてメラニン合成が正に制御され、皮膚色に影響を与えている可能性が示された。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5%CO2の環境下で培養した。
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出促進剤として報告(国際特許公開第2013/054534号)されているD609 (トリシクロデカン-9-イルキサントゲン酸カリウム;Tocris Bioscience社)を終濃度で5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分のタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、D609の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に増加することが確認された(図9)。
ケラチノサイトを6-well plateに1×105 cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105 cells/well (1mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、D609を終濃度で5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、有意にメラニン産生が促進していることが確認され、また、細胞の黒化は視覚的にも認められた(図10)。
メラノサイトを2×105 cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、D609を終濃度で1、5、10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (増殖添加剤(HMGS)のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含))を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、D609を5μM添加した際にはメラニン産生量の有意な増加は確認されなかった(図11)。
以上のことより、D609はケラチノサイトに作用して、エクソソームの放出を促し、放出されたエクソソームがメラノサイトを活性化させることによって、メラニン産生を促進したものと考えられる。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5%CO2の環境下で培養した。
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出抑制剤として報告(国際特許公開第2013/054534号)されているNeutral Sphingomyelinaseの阻害剤GW4869 (N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、Sigma Aldrich)を終濃度で20μM(溶媒はDMSO)になるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、GW4869の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に減少することが確認された(図12)。
ケラチノサイトを6-well plateに1×105cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105cells/well (1mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてhEGF以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はanti-Pmel17 (Dako, 1:250)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。Pmel17の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を20μM処理した際に、それが有意に発現低下していることを確認した(図13)。Pmel17はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、GW4869処理によりメラニン量が減少したものと考えられる。
メラノサイトを2×105cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (増殖添加剤(HMGS)のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含)を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を添加した際にメラニン産生量に対する影響は確認されなかった(図14)。
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約1 cm×1 cmの大きさに小片化し、6-well plateを使用して37℃ 5Vol%CO2の環境下にて培養した。培養には、Fetal Bovine Serum (FBS)を10% (v/v)含むAdvanced DMEM培地 (いずれもLife Technologies)を使用した。ヒト皮膚組織を6-well plateに静置し、GW4869を終濃度で20μMになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。2〜3日毎に培地を交換しながら、培養開始から7日間経過後に皮膚組織を回収、定法に従って凍結組織切片を作成後にフォンタナマッソン染色を実施し(図15A)、その染色像に関して、Image Jソフトウェアを用いて二値化を行うことにより、画像解析を行った。表皮と真皮の境界における単位長あたりの表皮メラニン量を算出した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を処理した皮膚では、有意にメラニン量が低下していることが確認された(図15B)。
Claims (4)
- 以下の工程a)〜c)を含むメラニン制御剤の探索方法。
a)ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
b)培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
c)エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程 - b)工程における分泌レベルの測定が、エクソソーム画分のタンパク質量を測定し、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出する、請求項1記載の方法。
- エクソソームの分泌レベルを増強又は増加させる被験物質を、メラニン産生促進剤、デンドライト伸長促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防若しくは治療剤、又は白髪予防若しくは改善剤として評価又は選択する請求項1又は2記載の方法。
- エクソソームの分泌レベルを低下又は減少させる被験物質を、メラニン産生抑制剤、デンドライト伸長抑制剤、又は美白剤としてとして評価又は選択する請求項1又は2記載の方法。
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