JP2016070937A - 粒状多孔体、液体クロマトグラフィー用カラム、及び、粒状多孔体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ペプチド、タンパク質、または、核酸等の生体分子を分離対象とする高い分離性能を発揮し得る液体クロマトグラフィー用カラムを提供する。
【解決手段】カラムに使用される無機系の粒状多孔体１として、３次元連続網目構造の無機化合物からなる骨格体２を有し、更に、骨格体２の間隙に形成された貫通孔３と、骨格体２の表面から内部に向けて延伸する表面に分散して形成された細孔４からなる２段階階層的多孔構造を有し、細孔４の孔径分布の最頻孔径が、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、貫通孔３の孔径分布の最頻孔径が、細孔４の最頻孔径の５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあり、粒状多孔体１の粒子径が、貫通孔３の最頻孔径の５倍以上で、２０μｍ以上２５０μｍ以下の範囲内にある。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体クロマトグラフィー用カラムの充填剤として使用可能な無機系の粒状多孔体に関し、特に、ペプチド、タンパク質、または、核酸を分離対象とする液体クロマトグラフィー用カラムに好適な無機系の粒状多孔体に関し、更に、当該粒状多孔体を使用する液体クロマトグラフィー用カラム、及び、粒状多孔体の製造方法に関する。

化合物の精製法の一つである液体クロマトグラフィーでは、筒状のカラム容器に充填剤を詰め、そこに溶媒に溶かした反応混合物（移動相）を流し、化合物によって充填剤との親和性や分子の大きさが異なることを利用して分離を行う。液体クロマトグラフィー用の充填剤として、安価な多孔質シリカ粒子（シリカゲル）が汎用的に使用されている（例えば、下記の非特許文献１参照）。多孔質シリカ粒子には、例えば３〜３０ｎｍ程度の細孔が無数に開いており、分離対象分子は、分子拡散により粒子内に移動することによって分離精製される。低分子化合物やイオン等を分離する際には６〜１２ｎｍの細孔が汎用的に使用されるが、更に分子量の大きいペプチドやタンパク質・核酸といった生体分子の分離では、細孔径として２０ｎｍ以上のものが分離性能の点では好ましいと考えられる。

多孔質シリカ粒子は、細孔のみの１段階の多孔構造であるので、粒子強度を確保するために、細孔容積を一定に維持するので、細孔径と比表面積は反比例の関係となる。従って、細孔径を大きくすることで粒子内拡散は促進され分離性能は向上するが、比表面積が低下して対象分子の保持機能が弱くなる。逆に、細孔径を小さくすると比表面積の増大により対象分子の保持機能は強くなるが、粒子内拡散は抑制され分離性能が低下する。また、細孔径を大きくすることで、粒子の強度が弱くなって、加圧送液に耐えられず、粒子が壊れ易くなり、更には、製造コストも高騰し、２０ｎｍ以上の細孔径の多孔質シリカ粒子は実際にはあまり使用されていないというのが現状である。

多孔質シリカ粒子は、中・低圧クロマトグラフィーに使用される場合、粒径２０μｍ以上の粒子が一般的に用いられる。しかし、当該粒径２０μｍ以上の粒子では、分子量の大きな生体分子を分離する場合、粒子径の増大により粒子内での分子拡散による移動距離が長くなるため分離性能が一般的に悪化する。更に、分子量の大きな生体分子の分離では、拡散係数が低下して、分配平衡に達するのが遅くなり、対象分子が粒子内部まで十分に拡散することができずに分離性能が極端に悪化する等、実用上問題がある。

一方、多孔質シリカ粒子の表面にオクタデシルシリル基等の疎水性の官能基を化学修飾した逆相液体クロマトグラフィー充填剤が、上記生体分子の分離等に好適に使用されており、特に、粒子径が１．５μｍ〜５μｍのものが使用されており、近年、益々微粒子化が進んでいる（例えば、下記の非特許文献１参照）。当該微粒子化によって、上述の分子拡散の低下に起因する問題は解消されるが、高負荷圧のため、カラム長を短くするか、反応混合物の流速を遅くする必要があり、高性能化を阻害する別の問題が生じる。

他方、上述の分子拡散の低下に起因する問題を解消する別の充填剤として、０．６μｍ〜０．８μｍ程度の貫通孔と、数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度（例えば、８０ｎｍ〜１５０ｎｍ）の細孔を有する２段階階層的多孔構造の有機ポリマー粒子が知られている（例えば、下記の非特許文献２参照）。当該有機ポリマー粒子は、パーフュージョンクロマトグラフィー粒子と呼ばれており、貫通孔が分子量の大きな生体分子の拡散流路として機能し、細孔が分子レベルでの相互作用である吸着分離サイトとして機能するため、中・低圧クロマトグラフィーとして使用される場合でも、分子量の大きな生体分子に対する分離性能が良い。また、貫通孔の存在により粒子内部への拡散が早く、移動相の流量を上げて分離時間を短くしても応答性が良いため分離性能が低下せず精製時間を短縮できるというメリットがある。

但し、上記有機ポリマー粒子は、逆相液体クロマトグラフィー充填剤として使用する場合は移動相に有機溶剤が使用されるため、粒子が膨潤して粒子径、貫通孔径、及び、細孔径が変化する、高い圧力下で粒子が圧縮されて変形し易い、分離対象分子に合わせて貫通孔径及び細孔径の制御ができない等の問題が有り、分離条件が制約されるというデメリットを有する。

一方、多孔質粒子ではないが、液体クロマトグラフィー用カラムとして、３次元連続網目構造の骨格体を有する塊状のモノリス多孔体を筒状に成形し、筒状のカラム容器内に収容したモノリス多孔体カラムが存在する（例えば、下記の非特許文献３参照）。当該モノリス多孔体は、シリカや金属酸化物の無機系多孔体で、孔径が０．１μｍ〜１００μｍの貫通孔と、孔径が２ｎｍ〜２００ｎｍの細孔からなる２段階階層的多孔構造を有している。ここで、上述の２段階階層的多孔構造の有機ポリマー粒子と同様に、モノリス多孔体の貫通孔は、分離対象分子の拡散流路として機能し、細孔が吸着分離サイトとして機能するため、更に、貫通孔及び細孔の孔径を夫々独立に制御可能なため、モノリス多孔体カラムは、中・低圧クロマトグラフィーとして使用される場合でも、分子量の大きな生体分子に対して良好な分離性能を発揮する。

しかしながら、モノリス多孔体カラムは、液体クロマトグラフィー用カラムとして性能を十分に発揮するには、モノリス多孔体をカラム容器の内壁面にミクロンオーダーで密着させ、移動相の溶液がモノリス多孔体と容器間の隙間を流れないように精緻に実装する必要がある。

特開２００６−１９２４２０号公報

須藤良久、他、"逆相クロマトグラフィー用シリカ系カラム"、 ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．２（２０１１），ｐｐ．７３−７９ Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．，"Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： ａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，８８０（２０００），ｐｐ．１６９−１８７ Ｋ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，"Ｓｏｌ−Ｇｅｌ ｗｉｔｈ Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｌｙ Ｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ"，ＡＣＣＯＵＮＴＳ ＯＦ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．９，２００７，ｐｐ．８６３−８７３

上述の２段階階層的多孔構造を有するモノリス多孔体カラムを粉砕した粒子状の無機系充填剤を、カラム容器に充填し、分析用前処理カラムとして応用することが提案されている（例えば、上記特許文献１参照）。当該分析用前処理カラムは、クロマトグラフィー等で分析する際の前処理として、分析対象物質を含む溶液等を通過させ不要な成分を充填材に吸着させ除去するか、目的物質を充填材に吸着させて不要成分を除去したのちに吸着した目的物質を高濃度の塩や有機溶剤で洗い流して回収する用途に使用される。しかし、上記特許文献１では、当該粒子状の無機系充填剤が、分子量の大きいペプチドやタンパク質等の生体分子を分離対象とする液体クロマトグラフィー用途に使用できるか否かについては、全く検討されていない。更に、上記特許文献１に開示の粒子状の無機系充填剤は、粒径、貫通孔径、及び、細孔径が制御されておらず、当該有機化合物を分離対象とする液体クロマトグラフィー用途にそのまま使用した場合、十分な分離性能が得られない可能性が高い。

更に付言すれば、上記特許文献１の出願日から９年半（最先の優先日からは１０年半）が経過しているが、２段階階層的多孔構造を有する粒子状の無機系充填剤を液体クロマトグラフィー用カラムへ応用した実例、或いは、当該応用に関して検討或いは提案した先行技術文献は、本願発明者等の知る限り皆無である。

本発明は、上述の従来の液体クロマトグラフィー用カラムの問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、無機系の粒状多孔体を充填剤として使用し、ペプチド、タンパク質、または、核酸等の生体分子、特に、分子量が２００以上８００００以下の生体分子を分離対象とする高い分離性能を発揮し得る液体クロマトグラフィー用カラムを提供することにある。

本願発明者等は、２段階階層的多孔構造を有する無機系の粒状多孔体が、粒径、貫通孔及び細孔の孔径を適正な範囲内に制御することで、ペプチド、タンパク質、または、核酸等の生体分子、特に、分子量が２００以上８００００以下の生体分子を分離対象とする液体クロマトグラフィー用カラムの充填剤として使用できることを見出し、具体的な実験に基づいてその有効性を確認した。

即ち、本発明では、上記目的を達成するため、ペプチド、タンパク質、または、核酸を分離対象とする液体クロマトグラフィー用のカラムに使用される無機系の粒状多孔体であって、
前記粒状多孔体が、３次元連続網目構造の無機化合物からなる骨格体を有し、更に、前記骨格体の間隙に形成された貫通孔と、前記骨格体の表面から内部に向けて延伸する前記表面に分散して形成された細孔からなる２段階階層的多孔構造を有し、
前記細孔の孔径分布の最頻孔径が、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、前記貫通孔の孔径分布の最頻孔径が、前記細孔の最頻孔径の５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあり、前記粒状多孔体の粒子径が、前記貫通孔の最頻孔径の５倍以上で、２０μｍ以上２５０μｍ以下の範囲内にあることを特徴とする粒状多孔体を提供する。

更に、上記特徴の粒状多孔体は、ゾルゲル法にて作製された塊状多孔体を粉砕して粒状化したものであり、
前記塊状多孔体が、３次元連続網目構造の前記無機化合物からなる骨格体を有し、更に、前記骨格体の間隙に形成された貫通孔と、前記骨格体の表面から内部に向けて延伸する前記表面に分散して形成された細孔を有する少なくとも２段階階層的多孔構造を有し、
前記塊状多孔体の細孔の孔径分布の最頻孔径が、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、前記塊状多孔体の貫通孔の孔径分布の最頻孔径が、前記塊状多孔体の細孔の最頻孔径の５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあることが好ましい。

更に、上記特徴の粒状多孔体は、前記分離対象の分子量が２００以上８００００以下の範囲内であることが好ましい。

更に、上記特徴の粒状多孔体は、前記粒状多孔体の表面に、前記分離対象の有機化合物と親和性を有する官能基が化学修飾されていることが好ましい。

更に、上記特徴の粒状多孔体は、前記無機化合物がシリカまたはチタニアであることが好ましい。

更に、上記特徴の粒状多孔体は、前記分離対象がペプチドであることが好ましく、更に、当該分離対象の分子量が２００以上１１００以下の範囲内であることがより好ましい。

更に、上記目的を達成するための本発明に係る液体クロマトグラフィー用カラムは、ペプチド、タンパク質、または、核酸を分離対象とする液体クロマトグラフィー用カラムであって、上記特徴の粒状多孔体が、カラム容器内に充填されていることを特徴とする。

更に、上記特徴の液体クロマトグラフィー用カラムは、前記分離対象がペプチドであることが好ましく、更に、当該分離対象の分子量が２００以上１１００以下の範囲内であることがより好ましい。

更に、上記目的を達成するための本発明に係る粒状多孔体の製造方法は、塊状多孔体をゾルゲル法にて作製する工程と、前記塊状多孔体を粉砕して粒状化して前記粒状多孔体を作製する工程を備え、
前記塊状多孔体が、３次元連続網目構造の前記無機化合物からなる骨格体を有し、更に、前記骨格体の間隙に形成された貫通孔と、前記骨格体の表面から内部に向けて延伸する前記表面に分散して形成された細孔を有する少なくとも２段階階層的多孔構造を有し、
前記塊状多孔体の細孔の孔径分布の最頻孔径が、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、
前記塊状多孔体の貫通孔の孔径分布の最頻孔径が、前記塊状多孔体の細孔の最頻孔径の５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあることを特徴とする。

上記特徴の粒状多孔体または液体クロマトグラフィー用カラムによれば、充填剤としての粒状多孔体の孔径、貫通孔径、細孔径が、夫々、分離対象のペプチド、タンパク質、または、核酸に、特に、分子量が２００以上８００００以下の分離対象分子に適合するよう制御されているため、当該分離対象のペプチド、タンパク質、または、核酸等に対して高性能な分離性能が発揮される。

特に、上記特徴の粒状多孔体では、孔径、貫通孔径、細孔径の上記所定の範囲内に制御することで、少なくとも分子量が２００以上８００００以下の広範な大きさのペプチド、タンパク質、または、核酸に対して等しく、高性能な分離性能が得られる。

上記特徴の粒状多孔体は、粒径が従来の多孔質シリカ粒子より大きくても、貫通孔径の存在により、分離対象分子のカラム粒子内への拡散が阻害されず、高性能化が図れる。更に、上記特徴の粒状多孔体は、無機系多孔体であり、従来の有機ポリマー粒子の有する、粒子が膨潤して粒子径、貫通孔及び細孔の孔径が変化する、高い圧力下で粒子が圧縮されて変形し易い、分離対象分子に合わせて貫通孔径および細孔径の制御ができない等の問題が存在せず、高性能化が容易に図れる。更に、上記特徴の粒状多孔体は、従来の多孔質シリカ粒子及び有機ポリマー粒子と同様に、粒子状の充填剤であるので、既存の液体クロマトグラフィーカラムと同じカラム容器を使用して、カラム性能の向上が図れる。

本発明に係る粒状多孔体の構造的特徴を模式的且つ平面的に示す断面図 本発明に係る粒状多孔体の貫通孔及び細孔の孔径分布の一例を示す図 シリカモノリス多孔体の３次元連続網目状構造の一例を示すＳＥＭ写真 実施例１〜１１と比較例１〜４の各カラムで使用する充填剤の粒子径、各孔径の条件を対比して一覧表示する対照表 実施例１ａ〜６ａと比較例１ａ，２ａの各カラムで使用する充填剤の粒子径、各孔径の条件、及び、理論段数を対比して一覧表示する対照表 ペプチドの分離性能を示す実施例１のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例２のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例３のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例４のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例５のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例６のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例７のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例８のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例９のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例１０のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す実施例１１のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す比較例１のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す比較例２のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す比較例３のクロマトグラム ペプチドの分離性能を示す比較例４のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例１のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例２のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例３のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例４のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例５のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例６のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例７のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例８のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例９のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例１０のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す実施例１１のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す比較例１のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す比較例２のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す比較例３のクロマトグラム タンパク質の分離性能を示す比較例４のクロマトグラム 実施例１２〜１４と比較例５〜６の各カラムで使用する充填剤の粒子径、各孔径の条件を対比して一覧表示する対照表 分離条件１でのペプチドの分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件１でのペプチドの分離性能を示す実施例１３のクロマトグラム 分離条件１でのペプチドの分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件２でのタンパク質の分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件２でのタンパク質の分離性能を示す実施例１３のクロマトグラム 分離条件２でのタンパク質の分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件１でのペプチドの分離性能を示す比較例６のクロマトグラム 分離条件２でのタンパク質の分離性能を示す比較例６のクロマトグラム 分離条件３でのペプチド（インスリンを含む）の分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件３でのペプチド（インスリンを含む）の分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件４でのペプチド及びタンパク質の分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件４でのペプチド及びタンパク質の分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件５でのペプチド及びタンパク質の分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件６でのペプチド及びタンパク質の分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件７でのペプチド（インスリンを含む）及びタンパク質の分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件７でのペプチド（インスリンを含む）及びタンパク質の分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件８でのペプチドの分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件８でのペプチドの分離性能を示す実施例１４のクロマトグラム 分離条件１を基準にしてサンプルインジェクション量を５段階に変化させた分離条件によるペプチドの分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件２を基準にしてサンプルインジェクション量を５段階に変化させた分離条件によるタンパク質の分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム 分離条件９による測定を１００回繰り返した場合の１回目、５０回目、１００回目のタンパクの分離性能を示す実施例１２のクロマトグラム

本発明に係る液体クロマトグラフィー用カラム（以下、適宜「本ＬＣカラム」という。）、及び、本ＬＣカラムに使用される粒状多孔体（以下、単に「粒状多孔体」という。）の実施の形態につき、図面に基づいて説明する。

先ず、本ＬＣカラムに使用される粒状多孔体１の構造的特徴について説明する。粒状多孔体１の各粒子は、図１に模式的且つ平面的に示すように、３次元連続網目構造の無機化合物からなる骨格体２を有し、更に、骨格体２の間隙に形成された貫通孔３と、骨格体２の表面から内部に向けて延伸する該表面に分散して形成された細孔４からなる２段階階層的多孔構造を有する。ところで、本明細書では、「骨格体の表面」は、貫通孔に向けて露出した骨格体の面を指し示し、骨格体に形成された細孔の内壁面は含まない。また、「骨格体の表面」と細孔の内壁面を合わせた骨格体の総表面は、「粒状多孔体の表面」と呼ぶ。尚、貫通孔と細孔は、夫々、マクロポア、メソポアと呼ばれることもある。

本実施形態では、骨格体２を形成する無機化合物として、シリカゲルまたはシリカガラス（ＳｉＯ_２）を想定する。粒状多孔体１の各粒子は、細孔４の孔径分布の最頻孔径φ０ｍが、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、貫通孔３の孔径分布の最頻孔径φ１ｍが、細孔４の最頻孔径φ０ｍの５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあり、粒子径Ｄｐが、貫通孔３の最頻孔径φ１ｍの５倍以上で、且つ、２０μｍ以上２５０μｍ以下の範囲内にある。

貫通孔３及び細孔４の各最頻孔径は、周知の水銀圧入法で測定した孔径分布の最頻値（モード値）である。尚、細孔４の孔径分布は、周知の窒素吸着測定によるＢＪＨ法により導出されたものを使用しても良い。また、貫通孔３の最頻孔径は、骨格体２の電子顕微鏡写真から任意の２０乃至３０程度の分散した箇所の貫通孔径の計測し、その平均値として導出される平均孔径と大差はない。図２に、水銀圧入法で測定した貫通孔３及び細孔４の孔径分布を示す。横軸が貫通孔３及び細孔４の孔径（単位：μｍ）で、縦軸が微分細孔容積（単位：ｃｍ^３／ｇ）である。但し、微分細孔容積は微分貫通孔容積も含む。左側のピークが細孔４の最頻孔径を示し、右側のピークが貫通孔３の最頻孔径を示している。図２の例では、貫通孔３及び細孔４の各最頻孔径は、約１．７６μｍと約７１ｎｍで、各半値幅は、約０．２９μｍと約２２ｎｍとなっている。尚、貫通孔３及び細孔４の孔径分布は、粒子状の粒状多孔体１に対して測定した結果と、後述する粒状化前の同じ２段階階層的多孔構造を有するモノリス多孔体に対して測定した結果は、実質的に同じである。従って、貫通孔３及び細孔４の孔径分布は、モノリス多孔体の状態で測定しても良い。

本実施形態では、粒状多孔体１は、以下で詳細に説明するスピノーダル分解ゾルゲル法で合成された塊状の３次元連続網目状構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなるシリカモノリス多孔体を、焼結前または焼結後に粉砕して粒状化することで作製される。図３に、尚、シリカモノリス多孔体の３次元連続網目状構造を示すＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真の一例を示す。粉砕直後の粒状多孔体１の各粒子の粒子径は大小混在しているため、篩掛けして分級することで、所望の粒径範囲の粒状多孔体１が得られる。従って、上述の粒子径の範囲の上限値と下限値は、分級処理に使用する２種類の篩の目開きの値である。

次に、粒状多孔体１の作製方法について説明する。粒状多孔体１の作製方法は、粒状多孔体１の原料となる２段階階層的多孔構造を有するモノリス多孔体の合成工程と、その後の粒状化工程に、大きく分類される。

先ず、３次元連続網目状構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなるモノリス多孔体のスピノーダル分解ゾルゲル法による合成工程について説明する。当該合成工程は、更に、ゾル調製工程、ゲル化工程、及び、除去工程に区分される。

ゾル調製工程では、酸またはアルカリ性水溶液中に、シリカゲルまたはシリカガラスの原料となるシリカ前駆体と、ゾルゲル転移と相分離を並行して誘起する働きを有する共存物質を添加して、例えば５℃以下のゾルゲル転移が進行し難い低温下で攪拌し、加水分解反応を起こさせて、均一な前駆体ゾルを調製する。

シリカ前駆体の主成分として、水ガラス（ケイ酸ナトリウム水溶液）、或いは、無機または有機シラン化合物が使用できる。無機シラン化合物の一例として、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラ−イソプロポキシシラン、テトラ−ｎ−ブトキシシラン、テトラ−ｔ−ブトキシシラン等のテトラアルコキシシラン類が挙げられる。また、有機シラン化合物の一例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ドデシル、フェニル、ビニル、ヒドロキシル、エーテル、エポキシ、アルデヒド、カルボキシル、エステル、チオニル、チオ、アミノ等の置換基を有するトリメトキシシラン、トリエトキシシラン、トリイソプロポキシシラン、トリフェノキシシラン等のトリアルコキシシラン類、メチルジエトキシシラン、メチルジメトキシシラン、エチルジエトキシシラン、エチルジメトキシシラン等のジアルコキシシラン類、ジメチルエトキシシラン、ジメチルメトキシシラン等のモノアルコキシシラン類等が挙げられる。また、モノアルキル、ジアルキル、フェニルトリエトキシ等の架橋反応速度制御基置換体を含むアルコキシシリケートやその二量体であるジシラン、三量体であるトリシランといったオリゴマー等もシリカ前駆体として想定される。上述の加水分解性シランは、種々の化合物が市販されており、容易且つ安価に入手可能であり、ケイ素−酸素結合からなる３次元架橋体を形成するゾルゲル反応を制御することも容易である。

酸またはアルカリ性水溶液は、溶媒である水にシリカ前駆体の加水分解反応を促進する触媒として機能する酸または塩基が溶解した水溶液である。上記酸の具体例として、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、ギ酸、シュウ酸、及び、クエン酸等が、また、上記塩基の具体例として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリメチルアンモニウム等のアミン類、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムヒドロキシド等のアンモニウムヒドロキシド類、及び、ソディウムメトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類等が想定される。また、上記共存物質の具体例として、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシドポリプロピレンオキシドブロック共重合体等のブロック共重合体、セチルトリメチルアンモニウムクロリド等の陽イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等のノニオン系界面活性剤等が想定される。尚、溶媒として水を使用するが、メタノールやエタノール等のアルコール類としても良い。

ゲル化工程では、ゾル調製工程で調製された前駆体ゾルを、ゲル化容器内に注入し、例えば４０℃程度のゾルゲル転移が進行し易い温度下でゲル化させる。ここで、前駆体ゾル内には、ゾルゲル転移と相分離を並行して誘起する働きを有する共存物質が添加されているため、スピノーダル分解が誘起され、３次元連続網目状構造を有するシリカヒドロゲル（湿潤ゲル）相と溶媒相の共連続構造体が徐々に形成される。

ゲル化工程において、シリカヒドロゲル層が形成された後も、当該湿潤ゲルの重縮合反応が緩やかに進行して、ゲルの収縮が起こるため、ゲル化工程の後工程（ゲル化後工程）として、ゲル化工程でゾル収容体の空孔内に形成されたシリカヒドロゲル相と溶媒相の共連続構造体を、アンモニア水等の塩基性水溶液に浸漬し、加圧容器内で加熱処理することにより、シリカヒドロゲル相の加水分解反応、重縮合反応、及び、溶解再析出反応を更に進行させ、シリカヒドロゲル相の骨格構造をより強固なものにすることが可能となる。尚、当該ゲル化後工程は、必要に応じて行えば良い。尚、当該加熱処理は、必ずしも加圧容器や密閉容器内で行わなくても差し支えないが、加熱によりアンモニア成分等が生成または揮発する場合があるので、密閉容器内、或いは、耐圧性を有する加圧容器内で処理するのが好ましい。

シリカヒドロゲル相の骨格体を形成するシリカ微粒子の溶解再析出反応の進行により、当該骨格体に形成される細孔径が拡大される。更に、水熱処理により、当該溶解再析出反応を繰り返すことにより、細孔径を更に拡大する制御が可能となる。尚、細孔径の制御は、前駆体ゾル内に上記触媒及び共存物質以外に尿素を添加することによっても実現できる。尿素は６０℃以上の温度下で加水分解してアンモニアを生成し、当該アンモニアにより、ゲル化工程で合成された湿潤ゲルの骨格体に形成される細孔の孔径が拡張されるため、尿素の添加により当該細孔径の制御が可能となる。一方、貫通孔の構造及び孔径の制御は、ゾル調製工程で前駆体ゾルに添加する水やシリカ前駆体の量、或いは、共存物質の組成及び添加量等の調整により可能となる。

引き続き、除去工程において、湿潤ゲルの洗浄と乾燥或いは乾燥のみを行い、添加剤や未反応物等を含む溶媒相を除去する。溶媒相除去後の空間が貫通孔となる。洗浄により、溶媒相内に残留した添加剤や未反応物等によって生ずる乾燥時の表面張力を解消し、乾燥時にゲルに歪みや割れが生じるのを抑制できる。洗浄液は、有機溶剤や水溶液等の液体が望ましい。また、有機化合物や無機化合物を溶解させた液体を用いることもできる。更に、洗浄液として酸やアルカリ等のゲルの等電点と異なるｐＨの溶液を用いても、ゲル内に残留した添加材等を容易に除去することができる。具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、フッ酸、酢酸、ギ酸、炭酸、クエン酸、リン酸を始めとする各種の酸、及び、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水溶性アミン、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを始めとする各種の塩基を用いることができる。湿潤ゲルの乾燥は、自然乾燥を採用しても良く、更に湿潤ゲルを乾燥させる際に生ずる歪みや割れを解消するために、湿潤ゲル内の溶媒を、イソプロパノール、アセトン、ヘキサン、ハイドロフルオロカーボン等の水より表面張力が低い低表面張力溶媒に置換してから行う乾燥、凍結昇華による乾燥、更に、湿潤ゲル内の溶媒を超臨界状態の二酸化炭素に交換してから無表面張力状態で行う超臨界乾燥等を採用するのも好ましい。

引き続き、得られた乾燥ゲルは焼成により焼結させシリカガラスとすることが可能である。尚、焼成温度が、シリカのガラス転移温度（約１０００℃）より低温の場合は、シリカガラスには成らない。

以上のゾル調製工程、ゲル化工程、及び、除去工程を経て、２段階の階層的多孔構造を有する３次元連続網目状構造の乾燥シリカゲルまたはシリカガラスのモノリス多孔体が得られる。

粒状化工程は、上述のゾル調製工程、ゲル化工程、及び、除去工程を経て得られた塊状のモノリス多孔体を破砕して粒状化する工程である。粒状化工程の粉砕処理は、人手によって行っても良く、乳鉢等を用いても良く、また、ボールミル等の破砕装置を使用しても良い。また、粒状化工程は、上記除去工程で得られた乾燥ゲルを焼結させる場合、当該焼結前及び後の何れで行っても良い。

粒状化工程後の粒状化されたモノリス多孔体は、目開きがＸμｍとＹμｍ（但し、Ｄ０≦Ｘ＜Ｙ≦２５０）の篩で篩掛けして分級することで、粒子径Ｄｐが所望の粒径範囲内（Ｄ０μｍ以上２５０μｍ以下）にある粒状多孔体１として回収される。但し、所望の粒径範囲の下限値Ｄ０（μｍ）は、２０（μｍ）または貫通孔の最頻孔径φ１ｍ（μｍ）の５倍の何れか大きい方の値である。

本実施形態において、細孔径、貫通孔径、及び、粒子径は、上述のように、夫々独立して制御可能ではあるが、貫通孔３の孔径分布の最頻孔径φ１ｍが、細孔４の最頻孔径φ０ｍの５倍以上、粒子径Ｄｐが、貫通孔３の最頻孔径φ１ｍの５倍以上として規定されているのは、粒状多孔体１の各粒子の骨格体２が、粒状化後も２段階階層的多孔構造の３次元連続網目構造を保持するために、細孔径と貫通孔径の間、貫通孔径と粒子径の間で、夫々、少なくとも５倍程度の寸法比が必要であることが、経験的に把握されていることに基づいている。

本ＬＣカラムは、上記要領で作製された粒状多孔体１を、所定の形状（例えば、円筒状）のガラス製またはステンレス製等のカラム容器内に密に充填して構成される。カラム容器は、従来の細孔のみの単層多孔構造の多孔質シリカ粒子、或いは、有機ポリマー粒子を充填剤として使用する既存の液体クロマトグラフィー用カラムのカラム容器を使用することができる。また、粒状多孔体１のカラム容器内への充填は、従来の多孔質シリカ粒子と同様に行えば良い。尚、カラム容器の形状及び材質は、特定の形状及び材質に限定されるものではない。

本実施形態では、本ＬＣカラムによる分離対象として、ペプチド、タンパク質、または、核酸を想定している。このため、上記要領で作製された粒状多孔体１の表面に、これらの生体分子と親和性を有する官能基を化学修飾して、分離性能の向上を図っている。具体的には、当該官能基として、逆相液体クロマトグラフィーで一般的に使用される疎水性のオクタデシル基を採用した。

次に、本ＬＣカラムの液体クロマトグラフィー用カラムとしての分離性能を評価した測定結果について説明する。先ず、当該分離性能の評価用に作製した本ＬＣカラムの実施例１〜１１，１ａ〜６ａと、比較例１〜４，１ａ，２ａの各カラムについて説明する。

実施例１〜１１，１ａ〜６ａの本ＬＣカラムに使用される粒状多孔体は、何れも、上述の作製方法、つまり、モノリス多孔体のスピノーダル分解ゾルゲル法による合成工程と粒状化工程を経て作製されたシリカ粒状多孔体である。実施例１〜１１では、更に、粒状多孔体の表面にオクタデシル基が化学修飾されており、実施例１ａ〜６ａでは、当該官能基の化学修飾が行われていない。実施例１〜１１の相互間、及び、実施例１ａ〜６ａの相互間では、夫々、粒子径の粒径範囲、貫通孔の最頻孔径、細孔の最頻孔径の組み合わせが異なっている。

各実施例に使用される粒状多孔体は、より具体的には、以下の要領で作製した。０．０１ｍｏｌ／Ｌの酢酸水溶液１０ｍＬ（ミリリットル、ｃｍ^３）中に、共存物質であるポリエチレングリコール（分子量１００００）０．９ｇを溶解させ、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ、シリカ前駆体）５ｍＬを加え、攪拌して均一溶液とした後、４０℃でゲル化させた。その後、当該ゲルを０．１Ｍアンモニア水に浸して密閉容器内で１００℃にて２４時間加熱した後、６００℃で５時間焼結した。得られたシリカモノリス多孔体を乳鉢で粉砕し、ＪＩＳ標準篩を用いて、実施例毎の所定の粒径範囲となるよう分級し、シリカ粒状多孔体を得た。尚、各実施例において、貫通孔径は、添加するポリエチレングリコールの量を増減させて制御し、細孔径は、０．１Ｍアンモニア水で加熱する温度と時間を調整して制御した。

更に、実施例１〜１１のシリカ粒状多孔体は、１０％ジメチルオクタデシルクロロシランを含有するピリジン／トルエン（体積比１：４）溶液で一晩加熱還流し、更にその後、５０％の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンのトルエン溶液で一晩加熱還流して、表面をオクタデシルシリル化した。

上記要領で作製された実施例１〜１１，１ａ〜６ａの粒状多孔体は、夫々、エタノールに分散させ、ステンレス製の円筒状のカラム容器（内径４．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）内に、片方の端部から注射器を使い注入して充填し、各実施例の本ＬＣカラムを作製した。

比較例１〜３，１ａ，２ａで使用される充填剤は、従来の細孔のみの単層多孔構造の多孔質シリカ粒子であり、株式会社ワイエムシィ製のシリカ充填剤を使用している。比較例１〜３の充填剤は、実施例１〜１１と同様に、オクタデシル基が化学修飾されており、比較例１ａ，２ａでは、実施例１ａ〜６ａと同様に、当該官能基の化学修飾が行われていない。比較例１〜３の相互間、及び、比較例１ａ，２ａの相互間では、夫々、粒子径の粒径範囲が異なっている。

比較例４で使用される充填剤は、従来の２段階階層的多孔構造を有する有機ポリマー粒子であり、アプライドバイオシステムズ社製のポリスチレン−ジビニルベンゼン系の有機ポリマー粒子である。粒子径、貫通孔径、細孔径の各分布範囲（カタログ値）は、夫々、４０〜６０μｍ、０．６〜０．８μｍ、８０〜１５０ｎｍである。比較例４の有機ポリマー粒子の官能基はスチレン基で、オクタデシル基と同様に疎水性を呈する。

比較例１〜３，１ａ，２ａの多孔質シリカ粒子、及び、比較例４の有機ポリマー粒子も、実施例１〜１１，１ａ〜６ａと同様に、夫々、エタノールに分散させ、ステンレス製の円筒状のカラム容器（内径４．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）内に、片方の端部から注射器を使い注入して充填し、各比較例のカラムを作製した。

図４に、実施例１〜１１と比較例１〜３の各カラムで使用する充填剤の粒子径Ｄｐの粒径範囲、貫通孔の最頻孔径φ１ｍ、細孔の最頻孔径φ０ｍ、及び、比較例４のカラムで使用する充填剤の粒子径Ｄｐの粒径範囲、貫通孔径φ１の範囲、細孔径φ０の範囲を、一覧表示する。図５に、実施例１ａ〜６ａと比較例１ａ，２ａの各カラムで使用する充填剤の粒子径Ｄｐの粒径範囲、貫通孔の最頻孔径φ１ｍ、細孔の最頻孔径φ０ｍ、及び、後述する基本性能の評価結果である理論段数を、夫々、一覧表示する。

次に、実施例１〜１１と比較例１〜４に対して行ったペプチドの分離性能の評価結果について説明する。ペプチドの分離性能の評価は、シグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（グリシン−チロシン：分子量２３８．２）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（バリン−チロシン−バリン：分子量３７９．５）、Ｍｅｔ−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（メチオニン−エンケファリン：分子量５７３．７）、Ｌｅｕ-ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ロイシン−エンケファリン：分子量５５５．６）、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ Ａｃｅｔａｔｅ（アンジオテンシンＩＩアセテート：分子量１０４６．２））が夫々、０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、アセトニトリル：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、アセトニトリル：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝９５：５（体積比）から６０分時点でＡ：Ｂ＝７０：３０（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬの条件で行った。

図６〜図２０に、実施例１〜１１と比較例１〜４の各カラムを用いたペプチド分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸は検出信号強度（任意単位）で、横軸は時間（分）である。各図中の数字１〜５は、１の近傍のピークがグリシン−チロシン、２の近傍のピークがバリン−チロシン−バリン、３の近傍のピークがメチオニン−エンケファリン、４の近傍のピークがロイシン−エンケファリン、５の近傍のピークがアンジオテンシンＩＩアセテートであることを、夫々示している。

図４に示すように、実施例１〜７は、粒子径Ｄｐの粒径範囲が１００〜１５０μｍで、貫通孔の最頻孔径φ１ｍと細孔の最頻孔径φ０ｍの組み合わせ（φ１ｍ，φ０ｍ）が、順番に、（１．５μｍ，１２ｎｍ）、（１．５μｍ，２ｎｍ）、（１．５μｍ，８０ｎｍ）、（０．１μｍ，１２ｎｍ）、（１０μｍ，１２ｎｍ）、（１．０μｍ，３０ｎｍ）、（２．０μｍ，３０ｎｍ）となっている。また、実施例８〜１０は、粒子径Ｄｐの粒径範囲が６４〜２１２μｍで、貫通孔の最頻孔径φ１ｍと細孔の最頻孔径φ０ｍの組み合わせ（φ１ｍ，φ０ｍ）が、順番に、（１．５μｍ，１２ｎｍ）、（１．５μｍ，２０ｎｍ）、（１．５μｍ，３０ｎｍ）となっている。実施例１１は、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜２５０μｍで、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが１．５μｍで、細孔の最頻孔径φ０ｍが１２ｎｍである。

図６〜図１６に示す実施例１〜１１のクロマトグラムでは、上記ペプチド標準混合物の５成分のピークが分離しており、本実施形態で設定した粒子径Ｄｐの範囲内（２０μｍ以上２５０μｍ以下）、貫通孔の最頻孔径φ１ｍの範囲内（０．１μｍ以上１０μｍ以下）、及び、細孔の最頻孔径φ０ｍの範囲内（２ｎｍ以上８０ｎｍ以下）では、本ＬＣカラムがペプチドに対して良好な分離性能を有していることが分かる。

但し、実施例１〜３のクロマトグラムを比較すると、細孔の最頻孔径φ０ｍが１２ｎｍ（下限値２ｎｍの６倍、上限値８０ｎｍの約６．７分の１）の実施例１では、上記５成分の各ピークが、裾野が重ならずに明確に分離しているのに対して、細孔の最頻孔径φ０ｍが２ｎｍ（下限値）の実施例２では、上記５成分の内、分子量の大きいロイシン−エンケファリンとアンジオテンシンＩＩアセテートの各ピーク（４番目と５番目）が近接して裾野が一部重なっており、分離性能の低下が見られ、細孔の最頻孔径φ０ｍが８０ｎｍ（上限値）の実施例３では、上記５成分の内、分子量の小さいグリシン−チロシンとバリン−チロシン−バリンの各ピーク（１番目と２番目）が近接して裾野が一部重なっており、分離性能の低下が見られる。実施例３の場合、細孔径が大きくなって細孔比表面積が、実施例１と比較して約８分の１程度に減少するため、分子量の小さい成分ほど早く溶出して、ピーク間の分離が低下して、分離性能の低下として現れる。これらの結果より、細孔の最頻孔径φ０ｍが２ｎｍ程度から細孔径が小さくなるほど分子量の大きなペプチドの分離性能が低下し、細孔の最頻孔径φ０ｍが８０ｎｍ程度から細孔径が大きくなるほど分子量の小さなペプチドの分離性能が低下することが分かる。更に、当該評価結果より、ペプチドの吸脱着現象が専ら細孔内で起きていることが明らかであり、分離対象がペプチドである場合は、細孔の最頻孔径φ０ｍが、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましいことが分かる。

実施例１，４及び５のクロマトグラムを比較すると、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが、１．５μｍ（下限値０．１μｍの１５倍、上限値１０μｍの約６．７分の１）の実施例１では、上記５成分の各ピークが明確に分離しているのに対して、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが０．１μｍ（下限値）の実施例４と、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが１０μｍ（上限値）の実施例５では、上述の実施例２ほどではないが、上記５成分の内、分子量の大きいロイシン−エンケファリンとアンジオテンシンＩＩアセテートの各ピーク（４番目と５番目）が近接して裾野が一部重なっており、分離性能の低下が若干見られる。この結果より、貫通孔径もペプチドの分離性能に影響していることが明らかであり、最頻孔径φ１ｍが０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあることが好ましいと分かる。

実施例１，６及び７のクロマトグラムを比較する。実施例６は、実施例１より貫通孔の最頻孔径φ１ｍが１．０μｍと小さくなり、実施例７は、実施例１より貫通孔の最頻孔径φ１ｍが２．０μｍと大きくなり、何れも、実施例１より細孔の最頻孔径φ０ｍが３０ｎｍと大きくなっている。実施例６及び７では、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが実施例１より変化しているが、設定した下限値及び上限値には余裕があるため、上記５成分の各ピークが明確に分離しており、実施例４及び５のような分離性能の低下は見られない。一方、実施例６及び７では、実施例１より細孔の最頻孔径φ０ｍが３０ｎｍと大きくなっているため、上記５成分の内、分子量の小さいグリシン−チロシンとバリン−チロシン−バリンの各ピーク（１番目と２番目）が、実施例１と比較して近接しているが、まだ十分に分離しており、実施例３のような分離性能の低下は見られない。

実施例１，８及び１１のクロマトグラムを比較する。実施例１，８及び１１では、何れも、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが１．５μｍで、細孔の最頻孔径φ０ｍが１２ｎｍと共通しているが、粒子径Ｄｐの粒径範囲は、１００〜１５０μｍ、６４〜２１２μｍ、及び、２０〜２５０μｍと広がっている。何れの実施例においても、上記５成分の各ピークが明確に分離しており、良好な分離性能を呈している。粒子径Ｄｐの粒径範囲が広がるに従い、各ピークの間隔が徐々にではあるが近接する傾向は見られるが、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜２５０μｍと広範であっても、十分な分離性能が得られることが明らかとなった。

実施例８〜１０のクロマトグラムを比較すると、何れも、上記５成分の各ピークが明確に分離しており、良好な分離性能を呈しているが、細孔の最頻孔径φ０ｍが、１２ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍと大きくなるにつれ、上記５成分の内、分子量の小さいグリシン−チロシンとバリン−チロシン−バリンの各ピーク（１番目と２番目）間が近接する傾向が見られるが、細孔の最頻孔径φ０ｍが８０ｎｍの実施例３のような分離性能の低下は表れていない。従って、分離対象がペプチドである場合は、細孔の最頻孔径φ０ｍが、約１０ｎｍ以上約３０ｎｍ以下の範囲では、より安定した分離性能が得られることが明らかである。

比較例１〜３の単層多孔構造の多孔質シリカ粒子は、図４に示すように、細孔の最頻孔径φ０ｍが、実施例１と同じ１２ｎｍであり、粒子径Ｄｐの粒径範囲が、２０〜３０μｍ、５０〜１００μｍ、１００〜２００μｍと互いに重複せずに異なっている。

図１７〜図１９に示す比較例１〜３のクロマトグラムでは、上記ペプチド標準混合物の５成分の内、分子量の大きいロイシン−エンケファリンとアンジオテンシンＩＩアセテートの各ピーク（４番目と５番目）が重なっており、４番目と５番目の成分が完全に分離できておらず、カラムの分離性能が明らかに低下している。比較例１〜３のクロマトグラムを比較すると、相対的に粒子径Ｄｐの小さい比較例１では、辛うじて４番目と５番目の成分が分離し始めているが、十分な分離を得るには、更に、粒子径Ｄｐの小径化を図る必要があり、上述したように、高負荷圧の問題が別途生じる。更に、上述のように、ペプチドの分離には、分離性能の点では、細孔の最頻孔径φ０ｍは１２ｎｍより２０ｎｍ以上が好ましいと考えられるが、細孔径を大きくし過ぎると、上述した比表面積の減少による保持機能の低下、粒子強度の低下等の問題が生じ得るとともに、分子量の小さいペプチドに対する分離性能が不十分となる可能性もある。よって、単層多孔構造の多孔質シリカ粒子において十分なペプチドの分離性能を得るには、粒子径Ｄｐの粒径範囲、細孔径の分布を、精細に制御する必要があると言える。

比較例４の有機ポリマー粒子は、図４に示すように、粒子径、貫通孔径、細孔径の各分布範囲（カタログ値）は、夫々、４０〜６０μｍ、０．６〜０．８μｍ、８０〜１５０ｎｍである。図２０に示す比較例４のクロマトグラムでは、上記ペプチド標準混合物の５成分は、一応明確に分離されているが、分子量の大きい３番目から５番目の成分のピークが近接している。当該傾向は、細孔径の範囲が近い実施例３（細孔の最頻孔径φ０ｍが８０ｎｍ）において、分子量の小さいグリシン−チロシンとバリン−チロシン−バリンの各ピーク（１番目と２番目）が近接する傾向とは異なり、貫通孔径の範囲が近い実施例４（貫通孔の最頻孔径φ１ｍが０．１μｍ）において、分子量の大きいロイシン−エンケファリンとアンジオテンシンＩＩアセテートの各ピーク（４番目と５番目）が近接する傾向と類似している。上述のように、有機ポリマー粒子は、変形し易く、粒子径、貫通孔径、及び、細孔径が変化し易いので、カタログ値から大幅に変化している可能性が高いと推察される。

これらに対して、本ＬＣカラムでは、実施例１〜１１のように、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０μｍ以上２５０μｍ以下、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが０．１μｍ以上１０μｍ以下、細孔の最頻孔径φ０ｍが２ｎｍ以上８０ｎｍ以下と、夫々、上記各比較例に対して比較的広範な範囲内で設定しても、十分なペプチドの分離性能が得られ、しかも、上述の高負荷圧の問題も生じず、低いカラム圧で十分な分離性能が得られ、更に、粒子径、貫通孔径、及び、細孔径が変化しないので、安定したペプチドの分離性能が発揮され得る。

次に、実施例１〜１１と比較例１〜４に対して行ったタンパク質の分離性能の評価結果について説明する。実施例１〜１１と比較例１〜４は、ペプチドの分離性能の評価に使用したものと同じであり、重複する説明は省略する。タンパク質の分離性能の評価は、シグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ（リボヌクレアーゼＡ：分子量１３７００）、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ、（シトクロムｃ：分子量１２０００）、Ｈｏｌｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ホロ−トランスフェリン：分子量８００００）、Ａｐｏｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（アポミオグロビン：分子量１６９５０））が夫々、１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、アセトニトリル：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、アセトニトリル：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝７０：３０（体積比）から５０分時点でＡ：Ｂ＝２０：８０（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬの条件で行った。

図２１〜図３５に、実施例１〜１１と比較例１〜４の各カラムを用いたタンパク質分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸は検出信号強度（任意単位）で、横軸は時間（分）である。各図中の数字６〜９は、６の近傍のピークがリボヌクレアーゼＡ、７の近傍のピークがシトクロムｃ、８の近傍のピークがホロ−トランスフェリン、９の近傍のピークがアポミオグロビンであることを、夫々示している。

図２１〜図３１に示す実施例１〜１１のクロマトグラムでは、上記タンパク質標準混合物の４成分の各ピークが、裾野が重ならずに明確に分離しており、本実施形態で設定した粒子径Ｄｐの範囲内（２０μｍ以上２５０μｍ以下）、貫通孔の最頻孔径φ１ｍの範囲内（０．１μｍ以上１０μｍ以下）、及び、細孔の最頻孔径φ０ｍの範囲内（２ｎｍ以上８０ｎｍ以下）では、本ＬＣカラムが、ペプチドのみならずタンパク質に対しても良好な分離性能を有していることが分かる。但し、実施例４及び５では、１番目の成分（リボヌクレアーゼＡ）のピークより前に別の小さなピークが存在するが、移動相の溶媒或いは不純物が検出されたものと考えられ、タンパク質の分離性能の上記評価結果を左右するものではない。

尚、タンパク質の分離では、ペプチドの分離の場合と異なり、細孔の最頻孔径φ０ｍが２ｎｍ（下限値）の実施例２、及び、細孔の最頻孔径φ０ｍが８０ｎｍ（上限値）の実施例３においても、上記４成分の各ピークは、裾野が重ならずに明確に分離しており、分離性能の低下は生じていない。上記タンパク質標準混合物の４成分の分子量（１２０００〜８００００）は、上記ペプチド標準混合物の５成分の分子量（２３８〜１０４６）の約５０〜１００程度大きい。よって、細孔の最頻孔径φ０ｍが２ｎｍ（下限値）及び８０ｎｍ（上限値）の実施例２及び３において、分離性能の低下が見られないのは、分子量の大きなタンパク質においては、細孔径の小さい実施例２では、専ら貫通孔の表面において分離対象分子の吸脱着現象が起こり、貫通孔の表面に沿ってタンパク質分子が分離されていくと考えられ、貫通孔が、ペプチドに対する細孔のように機能し、細孔径の大きい実施例３では、細孔及び貫通孔の両方の表面において分離対象分子の吸脱着現象が複合して起こり、複雑な分離機構になっているものと考えられる。

ところで、本実施形態で設定した粒子径Ｄｐの範囲（２０μｍ以上２５０μｍ以下）、貫通孔の最頻孔径φ１ｍの範囲（０．１μｍ以上１０μｍ以下）、及び、細孔の最頻孔径φ０ｍの範囲（２ｎｍ以上８０ｎｍ以下）は、ペプチドに対する分離性能を基準に設定されているが、タンパク質の分離においても、十分に有効であることが、上記評価結果より明らかとなった。

一方、図３２〜図３４に示す比較例１〜３のクロマトグラムでは、上記４成分の各ピークは、夫々の裾野が広がり分離が不十分となっている。特に、分子量の大きい３番目の成分（ホロ−トランスフェリン）と４番目の成分（アポミオグロビン）の裾野の広がりが顕著である。また、図３５に示す比較例４のクロマトグラムでは、上記タンパク質標準混合物の４成分は、明確に分離されているが、上記４成分の内、２番目の成分（シトクロムｃ）において裾野の広がりが確認できる。これらに対して、実施例１〜１１では、何れの実施例も、４成分の夫々において鋭いピークを示している。

図２１〜図３１に示す実施例１〜１１のクロマトグラムから、本ＬＣカラムが、ペプチドのみならずタンパク質に対しても良好な分離性能を有していることが分ったが、粒状多孔体１の表面に化学修飾されたオクタデシル基は、ペプチド及びタンパク質と同様に、核酸に対しても相互作用するので、本ＬＣカラムは、タンパク質と同程度の分子量の核酸、その他の生体分子に対しても分離性能を有する。

次に、本ＬＣカラムの基本性能（化学修飾を行っていないシリカ表面の分離性能）の評価について説明する。当該基本性能の評価は、高速液体クロマトグラフィーにて、実施例１ａ〜６ａと比較例１ａ，２ａを用いて行った。具体的には、当該基本性能の評価は、シリカ表面と相互作用するｏ−ニトロアニソール（１００ｐｐｍ）を分離対象の試料とし、移動相をヘキサン：２−プロパノール＝９８：２（体積比）とし、流量１．０ｍＬ／分、検出波長２５４ｎｍ、カラム温度３０℃、サンプルインジェクション量１μＬの条件で分離分析を行い、ｏ−ニトロアニソールの理論段数を導出し、実施例１ａ〜６ａと比較例１ａ，２ａの各カラム性能を比較した。図５に、実施例１ａ〜６ａと比較例１ａ，２ａの各理論段数を示す。

一般的に、理論段数が高いと分離性能が良いとされているが、理論段数は、シリカ表面の表面積に比例する値であるので、粒子径が小さいほど、細孔径が小さいほど高くなる。図５より、粒子径Ｄｐの粒径範囲が近似する実施例１ａ〜５ａと比較例２ａでは、平均するとほぼ同等の性能が示されている。

図５に示す理論段数による評価は、分子量１５３のｏ−ニトロアニソールに対する化学修飾を行っていないシリカ表面での分離性能を確認したもので、上述した本ＬＣカラムのペプチド及びタンパク質の分離性能との直接の相関性はない。

しかしながら、図５に示す評価結果より、本ＬＣカラムのシリカ表面が、本実施形態で設定した粒子径Ｄｐの範囲（２０μｍ以上２５０μｍ以下）、貫通孔の最頻孔径φ１ｍの範囲（０．１μｍ以上１０μｍ以下）、及び、細孔の最頻孔径φ０ｍの範囲（２ｎｍ以上８０ｎｍ以下）で、分子量１５３のｏ−ニトロアニソールの分離性能を有することが確認された。これより、上述した本ＬＣカラムのペプチドの分離性能の評価では、分子量が概ね２００〜１１００の範囲に分布するペプチドに対する分離性能が確認されたが、分子量が２００以下のペプチドに対する分離性能も十分に期待できる。更に、ペプチドは、分子量が６０００を超えるものも存在するので、上述の本ＬＣカラムのタンパク質の分離性能の評価結果より、分子量が１０００を超えるペプチドに対する分離性能も十分に期待できる。

上記実施例１〜１１は、図４に示すように、本ＬＣカラムで使用する粒状多孔体の粒子径Ｄｐの粒径範囲の広狭に応じて、実施例１〜７（Ｄｐ＝１００〜１５０μｍ）、実施例８〜１０（Ｄｐ＝６４〜２１２μｍ）、実施例１１（Ｄｐ＝２０〜２５０μｍ）の３通りに分類されていた。以下において、粒子径Ｄｐの粒径範囲を相互に重複しないように排他的に細分化した３つの実施例１２〜１４に対して、実施例１〜１１に対して行ったペプチド及びタンパク質の分離性能の評価と全く同じ条件及び要領で、ペプチド及びタンパク質の分離性能の評価を行った結果について説明する。図３６に示すように、粒子径Ｄｐの粒径範囲は、実施例１２が２０〜６３μｍ、実施例１３が６４〜１５０μｍ、実施例１４が１５０〜２５０μｍであり、貫通孔の最頻孔径φ１ｍと細孔の最頻孔径φ０ｍは、実施例１２〜１４間で共通で、１．５μｍと１２ｎｍである。以下、適宜、実施例１〜１１に対して行ったペプチドの分離性能の評価の条件を「分離条件１」、タンパク質の分離性能の評価の条件を「分離条件２」と称す。

図３７〜図３９に、実施例１２〜１４の本ＬＣカラムを用いた分離条件１によるペプチド分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５は、図６〜図２０に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。図４０〜図４２に、実施例１２〜１４の本ＬＣカラムを用いた分離条件２によるタンパク質分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字６〜９は、図２１〜図３５に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜６３μｍの実施例１２の場合、図３７及び図４０に示すように、ペプチド及びタンパク質の何れの分離性能評価においても、実施例１，８及び１１の評価結果（図６、図１３、図１６、図２１、図２８、図３１参照）と比較して、ピークがよりシャープとなり分離性能が高くなっている。何れのピークも明確に分離している。これは、粒子径Ｄｐの粒径範囲が小さくなるとカラムの理論段数が向上して分離性能が上がることによるものである。

実施例１３の場合、粒子径Ｄｐの粒径範囲が、実施例１の１００〜１５０μｍから６４〜１５０μｍに拡張しているが、図６と図３８、図２１と図４１を対比して分かるように、ペプチド及びタンパク質の何れの分離性能評価においても、実施例１と同様に各成分が分離している。特に、粒子径Ｄｐの小さい方へ粒径範囲を拡張すると、粒子の充填効率が実施例１の場合と比べて変化するため、本ＬＣカラムの分離性能の変化が想定され得るが、明確な分離性能の低下は見られない。

実施例１４の場合、粒子径Ｄｐの粒径範囲が、実施例１の１００〜１５０μｍから１５０〜２５０μｍへと重複せずに大きくなっているが、図６と図３９、図２１と図４２を対比して分かるように、ペプチド及びタンパク質の何れの分離性能評価においても、実施例１と同様に各成分が分離している。

以上の実施例１２〜１４に対するペプチド及びタンパク質の分離性能の評価結果より、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜２５０μｍの範囲内であれば、当該範囲内で細分化された粒径範囲でも、当該細分化された粒径範囲の位置に拘わらず、ペプチド及びタンパク質の何れの分離性能も十分に発揮し得ることが明らかとなった。

尚、粒子径Ｄｐの粒径範囲が、上記２０〜２５０μｍの範囲外の１０μｍ以上２０μｍ未満で、貫通孔の最頻孔径φ１ｍと細孔の最頻孔径φ０ｍが、実施例１２〜１４と同じ、１．５μｍと１２ｎｍの充填剤を使用した比較例５のカラムの場合、当該充填剤をカラムに充填する際に、充填時の圧力で粒子が崩壊して使用不能となった。また、圧力を掛けずに充填した場合は、分離のためにアセトニトリルを１ｍＬ／分の流量でカラムに通流させたところ、カラムの圧力が１５Ｍｐａを超えるまで上昇して使用不能となった。アセトニトリルを通流後に充填した粒子を取り出して観察すると、粒子が圧縮されて粉砕していた。即ち、粒子径Ｄｐが２０μｍ未満になると充填剤として使用できないため、粒子径Ｄｐの粒径範囲は２０μｍ以上である必要がある。

次に、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜２１２μｍであり、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが１０μｍを超えて１０〜２０μｍであり、細孔の最頻孔径φ０ｍが１２ｎｍの充填剤を使用した比較例６のカラムを使用して、上記分離条件１及び２により、ペプチド及びタンパク質の分離性能の評価を行った結果について説明する。図４３に、比較例６のカラムを用いたペプチド分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５は、図６〜図２０等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。図４４に、比較例６のカラムを用いたタンパク質分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字６〜９は、図２１〜図３５等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

図４３及び図４４に示すように、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが１０μｍを超えると、ペプチド及びタンパク質の何れの分離性能の評価結果においても、各成分のピークが極端に広がり分離性能が極端に低下することが分かる。特に、ペプチドの分離性能の評価において顕著である。

また、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが０．１μｍ未満の粒状多孔体を作製した場合、その貫通孔径を維持することができず、細孔径の分布と重なってしまい、結果的に、細孔のみの１段階の多孔構造となる。つまり、貫通孔の最頻孔径φ１ｍが０．１μｍ未満の２段階階層的多孔構造の粒状多孔体の製造ができず、制御可能な貫通孔の最頻孔径φ１ｍは０．１μｍ以上である。

一方、上述のように、実施例１，４及び５のクロマトグラムを比較することで、ペプチド及びタンパク質の各分離性能に対して、貫通孔の最頻孔径φ１ｍの好適範囲は０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内であることが分かる。このことは、上記比較例６に対するペプチド及びタンパク質の各分離性能の評価結果、及び、制御可能な貫通孔の最頻孔径φ１ｍは０．１μｍ以上である点と符合する。

上記実施例１〜１４に対するペプチド及びタンパク質の各分離性能の評価では、分子量が概ね２００〜１１００の範囲内の５成分を含むシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣペプチド標準混合物と、分子量が１２０００〜８００００の範囲内の４成分を含むシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣタンパク質標準混合物を使用した。従って、本ＬＣカラムのペプチド及びタンパク質の各分離性能の評価結果より、当該評価に使用したＨＰＬＣペプチド標準混合物とＨＰＬＣタンパク質標準混合物の各分子量範囲（概ね２００〜１１００と１２０００〜８００００）の間の分子量（１１００〜１２０００）のペプチドまたはタンパク質に対しても、本ＬＣカラムが分離性能を有することは、上述の如く十分に期待でき、十分に推測可能である。

次に、本ＬＣカラムが、分子量が１１００〜１２０００の範囲内のペプチドまたはタンパク質についても分離性能を有する点を、実施例１２及び１４の本ＬＣカラムを使用して、以下の分離条件３〜７により評価した結果について説明する。

分離条件３は、分離条件１で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分に、ペプチドの一種である分子量５８０７のインスリンを加えて６成分とし、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分が夫々、０．５ｍｇ／ｍＬとなり、インスリンが１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、アセトニトリル：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、アセトニトリル：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝９５：５（体積比）から１２０分時点でＡ：Ｂ＝４５：５５（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬとするものである。分離条件３のリニアグラジエント条件の濃度勾配は、分離条件１のリニアグラジエント条件の濃度勾配と同じである。

分離条件４は、分離条件１で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分に、分離条件２で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分を加えて９成分とし、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分が夫々、０．５ｍｇ／ｍＬとなり、ＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分が夫々、１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、アセトニトリル：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、アセトニトリル：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝１００：０（体積比）から７０分時点でＡ：Ｂ＝３０：７０（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬとするものである。

分離条件５は、上記分離条件４の総流量を１．０ｍＬ／分から３．０ｍＬ／分に増加させたものである。

分離条件６は、上記分離条件４のリニアグラジエント条件を、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝１００：０（体積比）から１４０分時点でＡ：Ｂ＝３０：７０（体積比）となるように変更したものである。

分離条件７は、分離条件１で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分に、ペプチドの一種である分子量５８０７のインスリンと、分離条件２で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分を加えて１０成分とし、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分が夫々、０．５ｍｇ／ｍＬとなり、インスリンとＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分が夫々、１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、アセトニトリル：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、アセトニトリル：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝１００：０（体積比）から７０分時点でＡ：Ｂ＝３０：７０（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬとするものである。分離条件７のリニアグラジエント条件は、分離条件４のリニアグラジエント条件と同じである。

図４５及び図４６に、実施例１２及び１４の本ＬＣカラムを用いた、分離条件３によるペプチド分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５は、図６〜図２０等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。また、各図中の文字Ｍは、Ｍの近傍のピークがインスリンであることを示している。

図４５及び図４６に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が、２０〜６３μｍ（実施例１２）と１５０〜２５０μｍ（実施例１４）の何れの場合も、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分とインスリンの計６成分が分離していることが分かる。分子量が１１００〜１２０００の範囲の略中間のインスリンのピークは８５分前後に検出されている。また、実施例１２の場合、各ピークがシャープになって分離性能が向上していることが確認できる。分離条件３のグラジエント時間を１２０分まで延長しているのは、分離条件１のグラジエント時間（６０分）では、インスリンが本ＬＣカラムから溶出せずにピークが検出されないためである。図４５及び図４６に示す分離条件３のクロマトグラムより、分子量が２００〜６０００の範囲のペプチド、更に、分子量が１１００〜１２０００の範囲のペプチドまたはタンパク質に対しても、本ＬＣカラムが分離性能を有することが、より確実に示されている。

図４７及び図４８に、実施例１２及び１４の本ＬＣカラムを用いた、分離条件４によるペプチド及びタンパク質の一斉分離のクロマトグラムを示す。図４９に、実施例１４の本ＬＣカラムを用いた、分離条件５によるペプチド及びタンパク質の一斉分離のクロマトグラムを示す。図５０に、実施例１４の本ＬＣカラムを用いた、分離条件６によるペプチド及びタンパク質の一斉分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５及び６〜９は、図６〜図２０、及び、図２１〜図３５等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

図４７に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜６３μｍ（実施例１２）の場合、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分とＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分が、同一のクロマトグラムで９個のピークとして分離している。７０分のグラジエント時間内で、分子量が２００〜８００００の範囲内のペプチドとタンパク質を含む混合物の分子を一斉に分離できることが分かる。

一方、図４８に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が１５０〜２５０μｍ（実施例１４）の場合、ペプチドの４番目のピークを除き、各ピークの検出時間は、図４７に示すクロマトグラムと同じであるが、粒子径が大きくなったことで本ＬＣカラムの分離性能が低下し、ペプチドの４番目のピークと５番目のピークの裾野が重なり合っているのが確認できる。しかし、同じ実施例１４の本ＬＣカラムにおいて、分離条件を変えることで、分離性能を改善することが可能である。

図４９に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が１５０〜２５０μｍの実施例１４において、分離条件４の総流量を１．０ｍＬ／分から３．０ｍＬ／分に増加させたことで、ペプチドの４番目と５番目のピークが分離し、その結果、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分とＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分が、同一のクロマトグラムで９個のピークとして分離しており、分離性能の向上が確認できる。

また、図５０に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が１５０〜２５０μｍの実施例１４において、分離条件４のリニアグラジエント条件を、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝１００：０（体積比）から１４０分時点でＡ：Ｂ＝３０：７０（体積比）となるように変更したことで、ペプチドの４番目と５番目のピークが分離し、その結果、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分とＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分が、同一のクロマトグラムで９個のピークとして分離しており、分離性能の向上が確認できる。

図５１及び図５２に、実施例１２及び１４の本ＬＣカラムを用いた、分離条件７によるペプチド、インスリン及びタンパク質の一斉分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５，６〜９及び文字Ｍは、図６〜図２０、図２１〜図３５、及び、図４５〜図４６等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

図５１に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜６３μｍ（実施例１２）の場合、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分とインスリンとＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分の計１０成分が、同一のクロマトグラムで１０個のピークとして分離している。７０分のグラジエント時間内で、分子量が２００〜８００００の範囲内のペプチドとインスリンとタンパク質を含む混合物の分子を一斉に分離できることが分かる。尚、図５１に示すクロマトグラムと図４７に示すクロマトグラムを対比すると、インスリンは約４５分の時点で検出されている。インスリンの分子量は５８０７で、ＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分の分子量より小さいが、インスリンの疎水性がＨＰＬＣタンパク質標準混合物のシトクロムｃ（ピーク７）に近いため、逆相クロマトグラフィーにおける分離条件７では、インスリンのピーク（Ｍ）が、シトクロムｃのピーク（７）と近接する時間に検出されている。

一方、図５２に示すクロマトグラムより、粒子径Ｄｐの粒径範囲が１５０〜２５０μｍ（実施例１４）の場合、各ピークの検出時間は、図５１に示すクロマトグラムと同じであるが、各ピークの幅が広がっており、粒子径が大きくなったことで本ＬＣカラムの分離性能が低下し、ペプチドの４番目と５番目のピークの裾野が相互に重なり、インスリンのピークとタンパク質の２番目のピークの裾野が相互に重なっているのが確認できる。分離条件７は分離条件４と同じであるので、図４８に示すクロマトグラムと同様の現象が起きている。従って、分離条件４と同様に、上記分離条件７に対して、総流量を増加させる、リニアグラジエント条件の濃度勾配を低下させてグラジエント時間を延長する等の分離条件の変更によって、ペプチドの４番目と５番目のピークの重なりが改善されることは容易に推測される。

上述したペプチド及びタンパク質の分離性能の評価で用いた分離条件１〜７では、移動相にアセトニトリルを使用しているが、アセトニトリル以外の移動相を用いてペプチド及びタンパク質の分離は可能である。

図５３及び図５４に、実施例１２及び１４の本ＬＣカラムを用いた、移動相にメタノールを用いた下記の分離条件８によるペプチド分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５は、図６〜図２０、及び、図３７〜図３９等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

分離条件８は、分離条件１で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分が夫々、０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、メタノール：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、メタノール：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝９５：５（体積比）から１２０分時点でＡ：Ｂ＝４５：５５（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬとするものである。分離条件８のリニアグラジエント条件の濃度勾配は、分離条件１のリニアグラジエント条件の濃度勾配と同じであるが、グラジエント時間を１２０分まで延長している。

図５３及び図５４に示すクロマトグラムより、図３７及び図３９に示すクロマトグラムと対比することで、移動相にアセトニトリルを使用した場合と同様に、ＨＰＬＣペプチド標準混合物の５成分が分離していることが確認できる。逆相クロマトグラフィーの原理上、インジェクション時に疎水性の高いペプチドがカラム入口に吸着されて、移動相中の有機溶剤濃度をリニアグラジエントで上げていることでカラム入口に吸着されたペプチドが疎水性の強さに応じて溶出してくる。アセトニトリルとメタノールで極性が異なるために溶出力が異なるが、何れもペプチド分離には移動相として使用できる。また、ペプチドより高分子であるタンパク質も、ペプチドと同様のアミノ酸から構成されており、ペプチドと同様の原理で分離するため、ペプチドと同様に移動相にメタノールを使用できることが、図５３及び図５４に示すペプチドの分離性能の評価結果より、容易に推測されるとともに、後述する移動相にメタノールを使用した図５７に示すタンパク質分離のクロマトグラムによって、より確実に裏付けられる。

上述したペプチド及びタンパク質の分離性能の評価で用いた分離条件１〜８では、サンプルインジェクション量は１０μＬで固定であるが、サンプルインジェクション量を増大させた場合でも同一条件での分離が可能である。

図５５に、実施例１２の本ＬＣカラムを用いた、分離条件１を基準にして、サンプルインジェクション量を１０μＬから５０μＬまで、１０μＬ刻みで５段階に変化させた分離条件によるペプチド分離のクロマトグラムを示す。また、図５６に、実施例１２の本ＬＣカラムを用いた、分離条件２を基準にして、サンプルインジェクション量を１０μＬから５０μＬまで、１０μＬ刻みで５段階に変化させた分離条件によるタンパク質分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字１〜５及び６〜９は、図６〜図２０、及び、図２１〜図３５等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

図５５及び図５６に示すクロマトグラムより、インジェクション量を増加させることでピーク強度が増大しているが、各ピークは重なることなく分離している。この傾向はペプチドとタンパク質で共通である。インジェクション量の増大に伴い、カラム体積当たりのサンプル負荷量が増減する場合においても、各成分は分離することが可能である。

上述したペプチド及びタンパク質の分離性能の各評価は、何れも１回の測定による分析結果であった。測定を複数回繰り返すことによってカラムの劣化等が想定されるため、下記の分離条件９による測定を１００回繰り返した場合について、タンパク質の分離性能の評価を行った。

図５７に、実施例１２の本ＬＣカラムを用いた、移動相にメタノールを用いた下記の分離条件９による測定を１００回繰り返した場合の１回目、５０回目、１００回目のタンパク質分離のクロマトグラムを示す。各図の縦軸及び横軸、並びに、各図中の数字６〜９は、図２１〜図３５、及び、図４０〜図４２等に示すクロマトグラムと同様であり、重複する説明は割愛する。

分離条件９は、分離条件２で使用したシグマアルドリッチ社製のＨＰＬＣタンパク質標準混合物の４成分が夫々、１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解し、メタノール：蒸留水＝５：９５の移動相Ａと、メタノール：蒸留水＝７５：２５の移動相Ｂ（何れも０．１％トリフルオロ酢酸含有）を準備し、移動相比が０分時点でＡ：Ｂ＝７０：３０（体積比）から２０分時点でＡ：Ｂ＝３０：７０（体積比）、更に、２５分時点でＡ：Ｂ＝３０：７０（体積比）となるリニアグラジエント条件にて、総流量を１．０ｍＬ／分、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、サンプルインジェクション量１０μＬとするものである。

尚、本繰り返し測定では、各成分のピークをシャープにして、カラムの劣化によりピーク幅が広がることを確認し易くするために、粒子径Ｄｐの粒径範囲が２０〜６３μｍの実施例１２の本ＬＣカラムを用いた。また、本繰り返し測定では、ペプチドではなく、タンパク質の分離性能を評価した。これは、繰り返し測定が１００回で２５００分と長時間に及ぶことを考慮すると、タンパク質が、長時間の測定でペプチドよりも変性し易く、またカラムの劣化等の変化に対してピーク位置の変化等として反応することによる。図５７に示す１回目、５０回目、１００回目の各測定時のタンパク質分離のクロマトグラムより、ピーク幅及びピーク位置の変化は見られず、再現性の良い分離が確認できた。

以下に、本ＬＣカラム及び粒状多孔体の別実施形態につき説明する。

〈１〉 上記実施形態では、粒状多孔体１の骨格体２を構成する無機化合物として、シリカ（シリカゲルまたはシリカガラス）を想定したが、当該無機化合物は、シリカに限定されるものではなく、アルミニウム、リン、ゲルマニウム、スズ等の典型金属元素や、チタン、ジルコニウム、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀、金、亜鉛等を始めとする遷移金属元素を含む酸化物多孔体も、利用可能である。更に、これらに、リチウム、ナトリウム等のアルカリ金属元素や、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属元素、ランタン、セリウム等のランタン系元素を含む複合体からなる無機酸化物多孔体も、利用可能である。

一例として、粒状多孔体１の骨格体２がチタニア（ＴｉＯ_２）の場合における、粒状化前のチタニアモノリス多孔体の合成法の一例を簡単に説明する。

ポリエチレングリコール（平均分子量１００００）０．４ｇを含有する１−プロパノール２．５ｍＬとアセト酢酸エチル２．５ｍＬの混合溶液にチタン酸テトラｎ−プロピル５．０ｍＬを加えた後、１ｍｏｌ／Ｌの硝酸アンモニウム水溶液１．０ｍＬを攪拌しながら加えて均一溶液とし、密閉容器内に移して４０℃で１日間静置してゲル化させる。得られたゲルを、水・エタノールの混合溶媒に１日浸して洗浄した後、自然乾燥させ５００℃で５時間焼結すると、チタニアモノリス多孔体が得られる。

骨格体２を構成する無機化合物がチタニアの場合、シリカと比べて、耐酸性・耐アルカリ性に優れており、シリカはｐＨ２以下またはｐＨ１１以上の水溶液中で溶解するのに対し、チタニアは溶解することなく使用できる。

〈２〉 上記実施形態では、モノリス多孔体の合成方法に関して、具体的な数値（分量、温度、時間等）を明示した実施例を説明したが、当該合成方法は、当該実施例で例示された数値条件に限定されるものではない。

〈３〉 上記実施形態では、本ＬＣカラムに使用される粒状多孔体１が、貫通孔３と細孔４からなる２段階階層的多孔構造を有するため、粒状多孔体１の作製過程のモノリス多孔体も、同様の２段階階層的多孔構造を有する場合を想定した。しかし、粒状化前のモノリス多孔体が、貫通孔３と細孔４以外に、貫通孔３より大きな孔径の空孔を有する３段階階層的多孔構造を有していても良い。この場合、モノリス多孔体を粉砕して粒状化し、粒状多孔体１を作製する際に、当該空孔に沿って骨格体２が粉砕されるため、空孔の形成過程において、当該空孔に囲まれた骨格体２の径をある程度均一化することで、粉砕後の粒状多孔体１の粒子径Ｄｐを、一定範囲内に効率良く揃えることが可能となる。

〈４〉 上記実施形態では、粒状多孔体１の表面に化学修飾する官能基として、オクタデシル基を採用したが、当該官能基は、オクタデシル基に限定されるものではない。ペプチド、タンパク質、または、核酸の分離用の官能基として、炭化水素系化合物、ハロゲンを含むハロゲン化合物、アルコール・ジオール・フェノール等のヒドロキシル基、ケトン・アルデヒド・カルボン酸・エステル・アミド・エノン・酸塩化物・酸無水物等のカルボニル基やシアノ基を含むカルボン酸誘導体、芳香環や複素環を含む官能基、及び、これらの複合体が使用できる。例えば、メチル基、エチル基、ブチル基、オクチル基、ドデシル基、トリアコンチル基、及び、フェニル基等の炭化水素系リガンド、アルキルアンモニウム等の４級アミン基、アミノプロピルやジエチルアミノエチル等の１〜３級アミン基、スルホン酸基、リン酸基、及び、カルボキシメチル基等からなるイオン交換系リガンド、更に、ニトロ基、チオール、糖鎖、糖タンパク、アミノ酸、ペプチド、タンパク質等を含むリガンドが、利用可能である。

本発明に係る粒状多孔体及び液体クロマトグラフィー用カラムは、ペプチド、タンパク質、または、核酸を分離対象とする液体クロマトグラフィーに利用可能である。

１： 粒状多孔体
２： 骨格体
３： 貫通孔
４： 細孔

Claims (10)

1. ペプチド、タンパク質、または、核酸を分離対象とする液体クロマトグラフィー用カラムに使用される無機系の粒状多孔体であって、
   前記粒状多孔体が、３次元連続網目構造の無機化合物からなる骨格体を有し、更に、前記骨格体の間隙に形成された貫通孔と、前記骨格体の表面から内部に向けて延伸する前記表面に分散して形成された細孔からなる２段階階層的多孔構造を有し、
   前記細孔の孔径分布の最頻孔径が、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、
   前記貫通孔の孔径分布の最頻孔径が、前記細孔の最頻孔径の５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあり、
   前記粒状多孔体の粒子径が、前記貫通孔の最頻孔径の５倍以上で、且つ、２０μｍ以上２５０μｍ以下の範囲内にあることを特徴とする粒状多孔体。
2. 前記分離対象の分子量が２００以上８００００以下の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の粒状多孔体。
3. 前記粒状多孔体の表面に、前記分離対象の有機化合物と親和性を有する官能基が化学修飾されていることを特徴とする請求項１または２に記載の粒状多孔体。
4. 前記無機化合物がシリカまたはチタニアであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の粒状多孔体。
5. 前記分離対象がペプチドであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の粒状多孔体。
6. 前記分離対象の分子量が２００以上１１００以下の範囲内であることを特徴とする請求項５に記載の粒状多孔体。
7. ペプチド、タンパク質、または、核酸を分離対象とする液体クロマトグラフィー用カラムであって、
   請求項１〜４の何れか１項に記載の粒状多孔体が、カラム容器内に充填されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
8. 前記分離対象がペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
9. 前記分離対象の分子量が２００以上１１００以下の範囲内であることを特徴とする請求項８に記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
10. 請求項１〜６の何れか１項に記載の粒状多孔体の製造方法であって、
    塊状多孔体をゾルゲル法にて作製する工程と、
    前記塊状多孔体を粉砕して粒状化して前記粒状多孔体を作製する工程を備え、
    前記塊状多孔体が、３次元連続網目構造の前記無機化合物からなる骨格体を有し、更に、前記骨格体の間隙に形成された貫通孔と、前記骨格体の表面から内部に向けて延伸する前記表面に分散して形成された細孔を有する少なくとも２段階階層的多孔構造を有し、
    前記塊状多孔体の細孔の孔径分布の最頻孔径が、２ｎｍ以上８０ｎｍ以下の範囲内にあり、
    前記塊状多孔体の貫通孔の孔径分布の最頻孔径が、前記塊状多孔体の細孔の最頻孔径の５倍以上で、且つ、０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内にあることを特徴とする粒状多孔体の製造方法。