JP2016067231A - Primer for detection of enterococcusfaecium bio strain - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を検出するための、新規プライマー、および当該プライマーを用いるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の検出方法に関するものである。 The present invention relates to a novel primer for detecting Enterococcus faecium BIO strain, and E. coli using the primer . The present invention relates to a method for detecting faecium BIO strain.
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株（目黒研究所）は、プロバイオティクス（宿主の腸管内の環境を改善することで健康に好影響を及ぼす生菌製剤や菌成分含有食品等を指す）として、健康食品や動物用飼料に使用されている。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株は生菌のまま食品や飼料中に含有され、ヒトまたは動物内に摂取された後、腸管内の環境を改善することができるが、その体内動態についてはほとんど解明されていない。腸管内環境には多種多様なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が存在するため、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の体内動態を解明するには、他の常在しているＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属とＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株とを区別することが必須となる。そのため、常在する細菌およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が多数存在する環境下でＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を特異的にかつ定量的に検出する簡便な方法が望まれていた。また、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株は胃酸等の影響により死滅して分解されることもあるため、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を腸管内環境に生きたまま効率的に送達できる製品を開発するためにも、特異的かつ定量的に検出する手法が求められていた。 E. faecium BIO strain (Meguro Laboratories) is a probiotic (for live food preparations and foods containing fungi components that have a positive effect on health by improving the environment in the intestinal tract of the host). Used in feed. E. The faecium BIO strain is contained in foods and feeds as live bacteria and can improve the environment in the intestinal tract after being ingested in humans or animals, but its pharmacokinetics is hardly elucidated. Due to the presence of a wide variety of Enterococcus genus in the intestinal environment, E. To elucidate the pharmacokinetics of the faecium BIO strain, other resident Enterococcus spp . It is essential to distinguish it from faecium BIO strains. Therefore, in an environment where a large number of resident bacteria and Enterococcus are present, E. coli is used . A simple method for specifically and quantitatively detecting the faecium BIO strain has been desired. In addition, E.E. For faecium BIO lines, sometimes decomposed killed due to the influence of gastric acid, E. In order to develop a product that can efficiently deliver the faecium BIO strain to the intestinal environment while being alive, a technique for specific and quantitative detection has been required.
本発明は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を特異的に検出するためのプライマー、および当該プライマーを使用したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の検出方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to E.I. primers specifically detecting the faecium BIO strain, and E. coli using the primers . It aims at providing the detection method of faecium BIO stock | strain.
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討した結果、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株に特有な挿入配列（配列番号１１）を見出し、当該特有な配列に由来するプライマーがＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を極めて特異的に検出できることを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have made study to solve the above problems, E. An insertion sequence (SEQ ID NO: 11) unique to the faecium BIO strain was found, and a primer derived from the unique sequence was E. coli. The present invention was completed by finding that faecium BIO strain can be detected very specifically.
本発明は、下記：
（１） 配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（２） 配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（３） 配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（４） 配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；または
（５） 配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
から選択される、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を検出するためのプライマーセットを提供する。
The present invention includes the following:
(1) A primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(2) A primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(3) A primer set composed of an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(4) Primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8; or (5) Oligo consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 A primer set consisting of a nucleotide and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10;
A primer set for detecting an Enterococcus faecium BIO strain selected from:
本発明は、試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の検出方法を提供する。 The present invention provides a method for detecting an Enterococcus faecium BIO strain, characterized in that DNA extracted from a sample is used as a template, PCR is performed using the primer set described above, and the presence or absence of an amplification product is determined as an index. To do.
本発明は、上記に記載のプライマーセットを含む、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株検出用キットを提供する。 The present invention provides an Enterococcus faecium BIO strain detection kit comprising the primer set described above.
本発明にかかるプライマーセットは、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を特異的に検出することができるため、近縁種が多数存在する腸内環境のような環境下においても、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を簡易に検出することができる。 Primer set according to the present invention, E. it is possible to specifically detect faecium BIO lines, even in an environment such as the intestinal environment related species there are many, E. Faecium BIO strain can be easily detected.
本発明のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株検出用プライマーセットは、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株のドラフトゲノム配列とＧｅｎＢａｎｋに登録されているＥ． ｆａｅｃｉｕｍのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列を比較することにより見出されたＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株に特有な挿入配列（配列番号１１）をもとに設計した。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株に特有な配列（配列番号１１）をもとに設計されたプライマーセットには、下記（１）〜（５）のプライマーセットが挙げられる：
（１）ＢＩＯ−１Ｆ（配列番号１）とＢＩＯ−１Ｒ（配列番号２）；
（２）ＢＩＯ−２Ｆ（配列番号３）とＢＩＯ−２Ｒ（配列番号４）；
（３）ＢＩＯ−３Ｆ（配列番号５）とＢＩＯ−３Ｒ（配列番号６）；
（４）ＢＩＯ−４Ｆ（配列番号７）とＢＩＯ−４Ｒ（配列番号８）；
（５）ＢＩＯ−５Ｆ（配列番号９）とＢＩＯ−５Ｒ（配列番号１０）。
E. Examples of the primer set designed based on a sequence unique to faecium BIO strain (SEQ ID NO: 11) include the following primer sets (1) to (5):
(1) BIO-1F (SEQ ID NO: 1) and BIO-1R (SEQ ID NO: 2);
(2) BIO-2F (SEQ ID NO: 3) and BIO-2R (SEQ ID NO: 4);
(3) BIO-3F (SEQ ID NO: 5) and BIO-3R (SEQ ID NO: 6);
(4) BIO-4F (SEQ ID NO: 7) and BIO-4R (SEQ ID NO: 8);
(5) BIO-5F (SEQ ID NO: 9) and BIO-5R (SEQ ID NO: 10).
上記のようにして得られたプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行うと、試料にＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株が含まれる場合は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株に特異的な増幅産物が得られる。これにより、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を他の微生物と区別して特異的に検出することができる。 When PCR amplification was performed using the primer set obtained as described above, E. coli was added to the sample . if it contains faecium BIO strain, E. An amplification product specific to the faecium BIO strain is obtained. As a result, E.I. The faecium BIO strain can be specifically detected by distinguishing it from other microorganisms.
上記のプライマーセットはキットとすることもできる。本発明のキットは、上記プライマーセットを含むものであればよい。必要に応じて、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ試薬、電気泳動用ゲル等の検出用試薬、ＰＣＲの陽性コントロールとなる標的配列を含むＤＮＡ分子、説明書などを含んでいてもよい。 The above primer set may be a kit. The kit of this invention should just contain the said primer set. If necessary, DNA extraction reagents, PCR reagents such as PCR buffers and DNA polymerases, real-time PCR reagents, detection reagents such as electrophoresis gels, DNA molecules containing target sequences that serve as PCR positive controls, Instructions etc. may be included.
本発明は、上記のプライマーセットを用いたＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の検出方法を提供する。本方法は、試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによる増幅産物の有無を指標として検出することを特徴とする。 The present invention relates to an E. coli using the above primer set . A method for detecting a faecium BIO strain is provided. This method is characterized in that a DNA extracted from a sample is used as a template, PCR is performed using the above primer set, and the presence or absence of an amplification product by the PCR is detected as an index.
試料は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株が含有され得るものであれば、限定されない。例えば、糞便中のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を検出することで、経口摂取したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株が腸管に到達したことを確認することができる。
また定量ＰＣＲ法、例えばリアルタイムＰＣＲ法により、試料中に含まれるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の細胞数を定量することができるため、試料中のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を定量的に把握することができる。
Samples were E. There is no limitation as long as the faecium BIO strain can be contained. For example, E. coli in feces . By detecting the faecium BIO strain, E. coli taken orally . It can be confirmed that the faecium BIO strain has reached the intestinal tract.
In addition, E. coli contained in the sample is obtained by quantitative PCR, for example, real-time PCR . Since the number of cells of the faecium BIO strain can be quantified, E. coli in the sample can be quantified . The faecium BIO strain can be grasped quantitatively.
試料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に知られる方法を用いて行うことができる。例えば、フェノール／クロロホルム法、ガラスビーズによる物理的破砕、界面活性剤による細胞溶解、プロテアーゼ酵素による細胞溶解などにより行うことができる。市販の各種ＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。 Extraction of DNA from a sample can be performed using a method known to those skilled in the art as a nucleic acid extraction method. For example, it can be performed by a phenol / chloroform method, physical disruption with glass beads, cell lysis with a surfactant, cell lysis with a protease enzyme, or the like. Various commercially available DNA extraction kits may be used.
試料から得られたＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を検出する。ＰＣＲ条件（温度サイクル、サイクルの回数等）やＰＣＲ反応液の組成は、プライマーの長さやその塩基組成などに応じて適宜設定することができる。一連のＰＣＲ操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その説明書に従って行ってもよい。 Using the DNA obtained from the sample as a template, PCR is performed using the above primer set to detect the presence or absence of an amplification product. The PCR conditions (temperature cycle, number of cycles, etc.) and the composition of the PCR reaction solution can be appropriately set according to the length of the primer and its base composition. A series of PCR operations may be performed according to the instructions using a commercially available PCR kit or PCR apparatus.
ＰＣＲで標的の増幅産物が得られたかどうかは、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡハイブリダイゼーション、増幅産物に特異的な標識プローブを用いる等の公知の方法を用いて確認することができる。標的の増幅産物のサイズは、挿入配列（配列番号１１）の内、両プライマーの塩基数と当該両プライマーに挟まれる範囲の塩基数を合わせた数となる。 Whether or not a target amplification product is obtained by PCR can be confirmed using a known method such as agarose gel electrophoresis, DNA hybridization, or using a labeled probe specific to the amplification product. The size of the target amplification product is a number obtained by adding the number of bases of both primers and the number of bases in a range between the primers in the insertion sequence (SEQ ID NO: 11).
下表に本発明のプライマーセット（１）〜（５）、およびその増幅産物のサイズを示す。
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in more detail, this invention is not limited to these examples.
実施例１
プライマーの設計
（１）Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株ドラフトゲノム配列の比較解析
８８のコンティグ配列からなるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株のドラフトゲノム配列を作成し、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている４株のＥ．ｆａｅｃｉｕｍのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列とＢＩＯ株のドラフトゲノム配列を比較した。
使用したＥ．ｆａｅｃｉｕｍのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列情報は以下の通りである。
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ Ａｕｓ００８５（ＰＲＪＮＡ２１４４３２）；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＤＯ（ＰＲＪＮＡ５５３５３）；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ Ａｕｓ０００４（ＰＲＪＮＡ８７０２５）；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＮＲＲＬ Ｂ−２３５４（ＰＲＪＮＡ１８８４７７）；
［（）内はＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔのＩＤ］。
これらのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列をレファレンス配列として、ＧｅｎｏｍｅＭａｔｃｈｅｒ（http://www.ige.tohoku.ac.jp/joho/gmProject/gmhomeJP.html）のＣｏｎｔｉｇＡｌｉｇｎｅｒを用いて、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株のドラフトゲノム配列と比較した。
その結果、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ Ａｕｓ０００４における遺伝子番号ＥＦＡＵ００４＿００２３３とＥＦＡＵ００４＿００２３４の遺伝子間領域に関し、４つのレファレンス配列ではその対応する領域は約１８０ｂｐ程度であるのに対し、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の染色体上では、５４９５ｂｐの挿入配列の存在が見出された。
この挿入配列について、Ｂｌａｓｔ（Basic Local Alignment Search Tool）検索を用いて、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている既知配列と比較し、最も相同性の低かった約８００ｂｐ（配列番号１１）を抽出し、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株特異的なプライマーの設計に利用した。
この配列より下記の５つのプライマーセット
（１）ＢＩＯ−１ＦＲ：ＢＩＯ−１Ｆ（配列番号１）／ＢＩＯ−１Ｒ（配列番号２）；
（２）ＢＩＯ−２ＦＲ：ＢＩＯ−２Ｆ（配列番号３）／ＢＩＯ−２Ｒ（配列番号４）；
（３）ＢＩＯ−３ＦＲ：ＢＩＯ−３Ｆ（配列番号５）／ＢＩＯ−３Ｒ（配列番号６）；
（４）ＢＩＯ−４ＦＲ：ＢＩＯ−４Ｆ（配列番号７）／ＢＩＯ−４Ｒ（配列番号８）；
（５）ＢＩＯ−５ＦＲ：ＢＩＯ−５Ｆ（配列番号９）／ＢＩＯ−５Ｒ（配列番号１０）；
を設計した。
Example 1
The design of primers (1) E. Comparative analysis of faecium BIO strain draft genome sequence E. coli consisting of 88 contig sequences . A draft genome sequence of faecium BIO strain was prepared, and four strains of E. coli registered in GenBank were registered . The complete genome sequence of faecium and the draft genome sequence of the BIO strain were compared.
The E. used . The complete genome sequence information of faecium is as follows.
Enterococcus faecium Aus0085 (PRJNA214432);
Enterococcus faecium DO (PRJNA55353);
Enterococcus faecium Aus0004 (PRJNA87025);
Enterococcus faecium NRRL B-2354 (PRJNA188477);
[Inside () is BioProject ID].
These complete genome sequence as a reference sequence, using the ContigAligner of GenomeMatcher (http://www.ige.tohoku.ac.jp/joho/gmProject/gmhomeJP.html), E. Comparison was made with the draft genome sequence of the faecium BIO strain.
As a result, E.I. Regarding the intergenic region of gene numbers EFAU004_00233 and EFAU004_00234 in faecium Aus0004, in the four reference sequences, the corresponding region is about 180 bp . The presence of an insertion sequence of 5495 bp was found on the chromosome of faecium BIO strain.
About this inserted sequence, about 800 bp (SEQ ID NO: 11) having the lowest homology was extracted using Blast (Basic Local Alignment Search Tool) search and compared with a known sequence registered in GenBank . This was used to design primers specific to faecium BIO strain.
From this sequence, the following five primer sets (1) BIO-1FR: BIO-1F (SEQ ID NO: 1) / BIO-1R (SEQ ID NO: 2);
(2) BIO-2FR: BIO-2F (SEQ ID NO: 3) / BIO-2R (SEQ ID NO: 4);
(3) BIO-3FR: BIO-3F (SEQ ID NO: 5) / BIO-3R (SEQ ID NO: 6);
(4) BIO-4FR: BIO-4F (SEQ ID NO: 7) / BIO-4R (SEQ ID NO: 8);
(5) BIO-5FR: BIO-5F (SEQ ID NO: 9) / BIO-5R (SEQ ID NO: 10);
Designed.
実施例２
＜プライマーの特異性の評価＞
ＤＮＡ抽出
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を１ｍＬのＢＨＩ（Brain Heart Infusion）培地にて３７℃一晩静置培養した。抽出液＜（ＴＥ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ｐＨ８．０］）飽和フェノール５００μＬ；溶菌Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸［ｐＨ８．０］）２５０μＬ；１０％ ＳＤＳ ５０μＬ；および、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇ＞に上記の培養液２００μＬを添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ２４（ＭＰ）を用いて、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうし、菌体を破砕した。遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを用いてタンパク質を変性した後、イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを析出させ、１００μＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ｐＨ８．０］）に溶解して、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の鋳型ＤＮＡとして使用した。
加えて、ヒト糞便（一般的にＥ．ｆａｅｃｉｕｍ属細菌が多数存在する）よりＤＮＡを抽出し、鋳型ＤＮＡとして使用した。抽出方法は健常人糞便０．１ｇを１ｍＬの生理食塩水（０．８％ ＮａＣｌ）に懸濁したものをサンプル液として、上記のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株ＤＮＡの抽出方法のうち培養液を該サンプル液と置き換えて、同様にＤＮＡ抽出を行った。
Example 2
<Evaluation of primer specificity>
DNA extraction
E. The faecium BIO strain was statically cultured overnight at 37 ° C. in 1 mL of BHI (Brain Heart Infusion) medium. Extract <(TE10 mM Tris-HCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid [pH 8.0]) saturated phenol 500 μL; Lysis Buffer (1 M Tris-HCl, 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid [pH 8.0]) 250 μL; 10% SDS 50 μL; Then, 200 μL of the above culture solution is added to 0.3 g> of glass beads (φ0.1 mm), and vigorously shaken in the vertical direction for 30 seconds at a power level of 5.0 using FastPrep24 (MP). It was crushed. The supernatant was collected by centrifugation, the protein was denatured using phenol, chloroform, and isoamyl alcohol, and then DNA was precipitated by isopropanol precipitation. 100 μL of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid [pH 8.0]) E. Used as template DNA for faecium BIO strain.
In addition, DNA was extracted from human feces (generally a large number of bacteria belonging to the genus E. faecium ) and used as template DNA. The extraction method was performed by using the above-mentioned E.I. In the method of extracting faecium BIO strain DNA, the culture solution was replaced with the sample solution, and DNA was extracted in the same manner.
ＰＣＲ増幅
上記で抽出したＤＮＡについて、市販のＰＣＲ用試薬（タカラバイオ（株）製）とＭｙ ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて、ＰＣＲを行った。
１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファ２．０μＬ、ｄＮＴＰ溶液（原液２．５ｍＭ）１．６μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．８μＬ、抽出したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株ＤＮＡ１０ｎｇおよび糞便ＤＮＡ５０ｎｇ、ならびにＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ）０．１Ｕを混合し、プライマーセットを０．５ｍＭの濃度となるように添加し、滅菌蒸留水を用いて総反応液量２０μＬにして反応液を調製した。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株ＤＮＡを添加せず糞便ＤＮＡを６０ｎｇ添加した反応液を陰性コントロールとして使用した。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株以外のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ由来ＤＮＡも増幅するプライマーとして、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍの種特異的なプライマー：ＥＭ１ＡおよびＥＭ１Ｂ（Cheng S1, McCleskey FK, Gress MJ, Petroziello JM, Liu R, Namdari H, Beninga K, Salmen A, DelVecchio VG., Journal of Clinical Microbiology1997 May;35(5):1248-50）を使用した。
全てのプライマーセットについて同条件でＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応条件を、表３に示す。
10 × Ex Taq buffer 2.0 μL, dNTP solution (stock solution 2.5 mM) 1.6 μL, 25 mM MgCl 2 0.8 μL, extracted E. coli . 10 ng of faecium BIO strain DNA, 50 ng of fecal DNA, and 0.1 U of DNA polymerase (TaKaRa Ex Taq) are added, the primer set is added to a concentration of 0.5 mM, and the total reaction volume is made 20 μL using sterilized distilled water. To prepare a reaction solution.
E. A reaction solution in which 60 ng of fecal DNA was added without adding faecium BIO strain DNA was used as a negative control.
E. E. coli other than faecium BIO strain As primers faecium derived DNA is also amplified, E. faecium species-specific primers: EM1A and EM1B (Cheng S1, McCleskey FK, Gress MJ, Petroziello JM, Liu R, Namdari H, Beninga K, Salmen A, DelVecchio VG., Journal of Clinical Microbiology 1997 May; 35 (5) : 1248-50) was used.
PCR reaction was carried out under the same conditions for all primer sets.
PCR reaction conditions are shown in Table 3.
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、検出を行った。
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を図１に示す。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株ＤＮＡ＋ヒト糞便ＤＮＡでは、本願発明にかかる５つのプライマーセットおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍの種特異的なプライマーセットで、増幅が確認された。
ヒト糞便ＤＮＡ単独では、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍの種特異的なプライマーセットでのみ増幅が確認され、本願発明にかかる５つのプライマーセットでは増幅が確認されなかった。
PCR amplification products were separated by 1.5% agarose gel electrophoresis and detected.
An agarose gel electropherogram of the PCR amplification product is shown in FIG.
E. For faecium BIO strain DNA + human fecal DNA, five primer sets according to the present invention and E. coli. Amplification was confirmed with a faecium species-specific primer set.
In human fecal DNA alone, E. Amplification was confirmed only with the species-specific primer set of faecium , and amplification was not confirmed with the five primer sets according to the present invention.
実施例３
＜ヒト糞便中からのＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の定量＞
被験者（４名）に、一粒あたりＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を６．５×１０９ｃｆｕ含むタブレットを、１個／１日、７日間摂取させた。摂取７日目の被験者の糞便中に含まれるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の菌数を、リアルタイムＰＣＲにより定量した。ＰＣＲ用試薬として、市販のリアルタイムＰＣＲ用試薬（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＹＯＢＯ製）を使用した。
プライマーセットＢＩＯ−１ＦＲで増幅したＰＣＲ産物を精製カラム（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ製）で精製し、濃度からコピー数を計算したものを、菌数の定量のスタンダードサンプルとして使用した。
ＢＩＯ−１ＦＲプライマーセットを使用して、上記実施例２の方法と同様にＰＣＲを行った。
結果を表４に示す。
４名の被験者全員について、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株含有タブレット摂取前には糞便からＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株は検出されなかったのに対し、摂取後（摂取期間７日）にはＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株が検出された。
また、当該摂取期間（７日間）終了の翌日から３日後には、糞便からＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株は検出されなくなった。
< E. From human feces Quantification of faecium BIO strain>
Subject (4 people) received E.E. A tablet containing 6.5 × 10 9 cfu of faecium BIO strain was ingested 1 tablet / day for 7 days. E. contained in feces of subject on
The PCR product amplified with the primer set BIO-1FR was purified with a purification column (Wizard (registered trademark) SV Gel and PCR Clean-Up System, manufactured by Promega), and the copy number calculated from the concentration was used to determine the number of bacteria. Used as a standard sample.
PCR was performed in the same manner as in Example 2 above using the BIO-1FR primer set.
The results are shown in Table 4.
For all subjects of 4 people, E. faecium BIO stock containing tablet intake before the E. from feces Although no faecium BIO strain was detected, E. coli was observed after ingestion (
In addition, from 3 days after the end of the intake period (7 days), E. The faecium BIO strain was no longer detected.
上記の結果は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の特異的プライマーがＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株の定量に利用できることを立証するものである。
腸内に存在する糞便等の量は数リットルといわれる。投与したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株（６．５×１０９ｃｆｕ／日、７日間）が腸内環境では数千倍に希釈されることを考慮すると、４名中２名の被験者の糞便から１０８ｃｆｕもの細胞数が検出されたことは、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株が腸内で増殖したためと考えられる。少なくともこの２名については、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株が生きたまま腸管内に到達したと判断した。
The above results are as follows . The specific primer of the faecium BIO strain is E. coli . This proves that it can be used for quantification of faecium BIO strain.
The amount of feces etc. present in the intestine is said to be several liters. E. administration Considering that the faecium BIO strain (6.5 × 10 9 cfu / day, 7 days) is diluted several thousand times in the intestinal environment, the number of cells as many as 10 8 cfu from the stool of 2 out of 4 subjects That E. is detected . This is probably because the faecium BIO strain grew in the intestine. At least for this two people is, E. It was determined that the faecium BIO strain reached the intestine alive.
Claims (3)
（２） 配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（３） 配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（４） 配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；または
（５） 配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
から選択される、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＢＩＯ株を検出するためのプライマーセット。 (1) A primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(2) A primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(3) A primer set composed of an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(4) Primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8; or (5) Oligo consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 A primer set consisting of a nucleotide and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10;
A primer set for detecting Enterococcus faecium BIO strain selected from
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