JP2016057288A - 分析方法および分析システム - Google Patents
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Abstract
【課題】 分析精度の向上が可能な分析方法および分析システムを提供すること。
【解決手段】 キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、試料と陰極性基含有化合物とを混合することにより混合試料を生成する混合工程Ｓ１と、前記試料の成分のうち分析対象である分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を前記混合試料から除去する除去工程Ｓ１１と、キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で前記分析成分と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する電気泳動工程Ｓ５と、を含む。
【選択図】 図４
【解決手段】 キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、試料と陰極性基含有化合物とを混合することにより混合試料を生成する混合工程Ｓ１と、前記試料の成分のうち分析対象である分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を前記混合試料から除去する除去工程Ｓ１１と、キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で前記分析成分と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する電気泳動工程Ｓ５と、を含む。
【選択図】 図４
Description
本発明は、分析方法および分析システムに関する。
生体の状態を示す指標として、各種タンパク質の糖化率が分析されている。中でも、血球中のヘモグロビン（Ｈｂ）の糖化率、特に安定型のＨｂＡ１ｃ（以下「ｓ−ＨｂＡ１ｃ」と略記することがある）は、生体内血糖値の過去の履歴を反映していることから、糖尿病の診断や治療などにおける重要な指標とされている。ＨｂＡ１ｃは、ＨｂＡ（α２β２）のβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化したものである。
ｓ−ＨｂＡ１ｃに代表されるＨｂの分析手法の一つとして、電気泳動法が用いられている。特許文献１，２，３，４，５では、分析の適正化や精度の向上を目的として、泳動液に追加成分を添加することが開示されている。特に特許文献４，５では、泳動液への添加成分の一例としてコンドロイチン硫酸が開示されている。また、特許文献６では、電気泳動法を利用した分析に用いるチップの小型化を意図して、電気泳動における試料の分離中も試料を連続的に供給する分析方法が記載されている。
試料の代表例である血液は、生体由来の試料である。このため、たとえば患者から採取した血液を試料として用いる場合、患者の病状や体質などによって、採取される血液は、様々な性状を取りうる。いかなる性状の血液であっても、これを試料として正確な分析が行われることが望ましい。しかしながら、上述した追加成分や分析方法の具体的な構成によってどのような分析阻害要因が生じうるかは、ほとんど明らかにされていないのが現状である。この点は、血液以外の試料を用いた場合であっても同様である。
本発明は、上記した事情のもとで考え出されたものであって、分析精度の向上が可能な分析方法および分析システムを提供することをその課題とする。
本発明の第一の側面によって提供される分析方法は、キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、試料と陰極性基含有化合物とを混合することにより混合試料を生成する工程と、前記試料の成分のうち分析対象である分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を前記混合試料から除去する工程と、キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で前記分析成分と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する工程と、を含む。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記除去する工程においては、濾過によって
前記凝集物を除去する。
前記凝集物を除去する。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記除去する工程においては、遠心分離によって前記凝集物を除去する。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類である。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記陰極性基含有多糖類が、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類である。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記硫酸化多糖類が、コンドロイチン硫酸である。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記分析成分が、ヘモグロビンである。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記副成分が、脂質である。
本発明の第二の側面によって提供される分析システムは、キャピラリー電気泳動法による試料の分析システムであって、試料と陰極性基含有化合物とを混合することにより混合試料を生成する混合部と、前記試料の成分のうち分析対象である分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を前記混合試料から除去する除去部と、キャピラリー管を有し、該キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で前記分析成分と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する分析部と、を備える。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記除去部が、濾過手段を有する。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記キャピラリー管、該キャピラリー管の一端に繋がる導入槽および前記キャピラリー管の他端に繋がる排出槽を有するディスポーザブルタイプの分析チップを備えており、前記濾過手段が、前記分析チップにおける前記導入槽への導入経路に設けられている。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記混合部が、前記分析チップに形成された混合槽である。
本発明の好ましい実施の形態においては、前記除去部が、遠心分離手段を有する。
本発明によれば、前記副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を除去することにより、キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で電気泳動を実施する場合に、測定結果にノイズが現れることを抑制することが可能であり、分析精度を向上することができる。
本発明のその他の特徴および利点は、添付図面を参照して以下に行う詳細な説明によって、より明らかとなろう。
以下、本発明の好ましい実施の形態につき、図面を参照して具体的に説明する。
図１は、本発明の第１実施形態に基づく分析システムを示している。本実施形態の分析システムＡ１は、分析装置１および分析チップ２を備えて構成されている。分析システムＡ１は、試料Ｓａを対象として電気泳動法による分析方法を実行するシステムである。試料Ｓａは特に限定されないが、本実施形態においては、人体から採取された血液を例として説明する。試料Ｓａに含まれる成分のうち分析の対象となる成分を分析成分と定義する。
前記分析成分としては、ヘモグロビン（Ｈｂ）、アルブミン（Ａｌｂ）、グロブリン（α１、α２、β、γグロブリン）、フィブリノーゲン等が挙げられる。前記ヘモグロビンとしては、たとえば、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）、糖化ヘモグロビン、修飾ヘモグロビン、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）等が挙げられる。前記糖化ヘモグロビンとしては、たとえば、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、ＧＨｂＬｙｓ等が挙げられる。前記ヘモグロビンＡ１ｃとしては、たとえば、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−ＨｂＡ１ｃ）、不安定型ＨｂＡ１ｃ等が挙げられる。前記修飾ヘモグロビンとしては、たとえば、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等が挙げられる。以降の説明においては、前記分析成分が、安定型のＨｂＡ１ｃ（ｓ−ＨｂＡ１ｃ）である場合を例に説明する。ｓ−ＨｂＡ１ｃは、一般に糖尿病の診断や治療等における指標とされる。
分析チップ２は、試料Ｓａを保持し、且つ分析装置１に装填された状態で試料Ｓａを対象とした分析の場を提供するものである。本実施形態においては、分析チップ２は、１回あるいは特定回数の分析を終えた後に廃棄されることが意図された、いわゆるディスポーザブルタイプの分析チップとして構成されている。図２および図３に示すように、分析チップ２は、本体２１、混合槽２２、導入槽２３、フィルタ２４、排出槽２５、電極槽２６、キャピラリー管２７および連絡流路２８を備えている。図２は、分析チップ２の平面図であり、図３は、図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿う断面図である。
本体２１は、分析チップ２の土台となるものであり、その材質は特に限定されず、例えば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等があげられる。本実施形態においては、本体２１は、図３における上側部分と下側部分とが、互いに結合された構成であるが、本体２１を一体的に形成してもよい。
混合槽２２は、後述する試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する混合工程が行われる混合部
の一例である。混合槽２２は、たとえば、本体２１の前記上側部分に形成された貫通孔によって構成されている。導入槽２３は、混合槽２２における混合工程によって得られた混合試料Ｓｍが導入される槽である。導入槽２３は、たとえば、本体２１の前記上側部分に形成された貫通孔によって構成されている。
の一例である。混合槽２２は、たとえば、本体２１の前記上側部分に形成された貫通孔によって構成されている。導入槽２３は、混合槽２２における混合工程によって得られた混合試料Ｓｍが導入される槽である。導入槽２３は、たとえば、本体２１の前記上側部分に形成された貫通孔によって構成されている。
フィルタ２４は、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられており、本発明で言う除去部（濾過手段）の一例である。フィルタ２４の具体的構成は、後述する除去工程を適切に実行しうるものであれば限定されず、好適な例として、たとえばセルロースアセテート膜フィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．４５μｍ）が挙げられる。
排出槽２５は、電気泳動法における電気浸透流の下流側に位置する槽である。排出槽２５は、たとえば、本体２１の前記上側部分に形成された貫通孔によって構成されている。電極槽２６は、電気泳動法による分析工程において、電極３１が挿入される槽である。電極槽２６は、たとえば、本体２１の前記上側部分に形成された貫通孔によって構成されている。連絡流路２８は、導入槽２３と電極槽２６とを繋いでおり、導入槽２３と電極槽２６との導通経路を構成している。
キャピラリー管２７は、導入槽２３と排出槽２５とを繋いでおり、電気泳動法における電気浸透流が生じる場である。キャピラリー管２７は、たとえば本体２１の前記下側部分に形成された溝によって構成されている。なお、本体２１には、キャピラリー管２７への光の照射およびキャピラリー管２７を透過した光の出射を促進するための凹部等が形成されていてもよい。キャピラリー管２７のサイズは特に限定されないが、その一例を挙げると、その幅が２５μｍ〜１００μｍ、その深さが２５μｍ〜１００μｍ、その長さが５ｍｍ〜１５０ｍｍである。分析チップ２全体のサイズは、キャピラリー管２７のサイズおよび混合槽２２、導入槽２３、排出槽２５および電極槽２６のサイズや配置等に応じて適宜設定される。
分析装置１は、試料Ｓａが点着された分析チップ２が装填された状態で、試料Ｓａを対象とした分析処理を行う。分析装置１は、電極３１，３２、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３、スリット４４、検出器５、分注器６、ポンプ６１、希釈液槽７１、泳動液槽７２および制御部８を備えている。
電極３１および電極３２は、電気泳動法においてキャピラリー管２７に所定の電圧を印加するためのものである。電極３１は、分析チップ２の電極槽２６に挿入されるものであり、電極３２は、分析チップ２の排出槽２５に挿入されるものである。電極３１および電極３２に印加される電圧は特に限定されないが、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。
光源４１は、電気泳動法において吸光度測定するための光を発する部位である。光源４１は、たとえば所定の波長域の光を出射するＬＥＤチップを具備する。光学フィルタ４２は、光源４１からの光のうち所定の波長の光を減衰させつつ、その余の波長の光を透過させるものである。レンズ４３は、光学フィルタ４２を透過した光を分析チップ２のキャピラリー管２７の分析箇所へと集光するためのものである。スリット４４は、光学フィルタ４２によって集光された光のうち、散乱などを引き起こしうる余分な光を除去するためのものである。
検出器５は、分析チップ２のキャピラリー管２７を透過してきた光を受光するものであり、たとえばフォトダイオードやフォトＩＣなどを具備して構成されている。
分注器６は、所望の量の希釈液Ｌｄや泳動液Ｌｍおよび混合試料Ｓｍを分注するもので
あり、たとえばノズルを含む。分注器６は図示しない駆動機構によって分析装置１内の複数の所定位置を自在に移動可能である。ポンプ６１は、分注器６への吸引源および吐出源である。また、ポンプ６１は、分析装置１に設けられた図示しないポートの吸引源および吐出源として用いてもよい。これらのポートは、泳動液Ｌｍの充填などに用いられる。また、ポンプ６１とは別の専用のポンプを備えてもよい。
あり、たとえばノズルを含む。分注器６は図示しない駆動機構によって分析装置１内の複数の所定位置を自在に移動可能である。ポンプ６１は、分注器６への吸引源および吐出源である。また、ポンプ６１は、分析装置１に設けられた図示しないポートの吸引源および吐出源として用いてもよい。これらのポートは、泳動液Ｌｍの充填などに用いられる。また、ポンプ６１とは別の専用のポンプを備えてもよい。
希釈液槽７１は、希釈液Ｌｄを貯蔵するための槽である。希釈液槽７１は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の希釈液Ｌｄが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。泳動液槽７２は、泳動液Ｌｍを貯蔵するための槽である。泳動液槽７２は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の泳動液Ｌｍが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。
希釈液Ｌｄは、試料Ｓａと混合されることにより、混合試料Ｓｍを生成するためのものである。希釈液Ｌｄの主剤は特に限定されず、水、生理食塩水が挙げられ、好ましい例として後述する泳動液Ｌｍと類似の成分の液体が挙げられる。また、希釈液Ｌｄは、前記主剤に、陰極性基含有化合物が添加されたものである。前記陰極性基含有化合物は、たとえば、陰極性基含有多糖類である。前記陰極性基含有多糖類は、たとえば、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類である。前記カルボン酸化多糖類は、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が好ましい。前記硫酸化多糖類は、たとえば、コンドロイチン硫酸である。コンドロイチン硫酸は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋの七種類があり、いずれを用いてもよい。以降の説明においては、希釈液Ｌｄが、泳動液Ｌｍと同成分である主剤にコンドロイチン硫酸が添加されたものである場合を例に説明する。前記陰極性基含有化合物（コンドロイチン硫酸）の濃度は、例えば、０．０１〜５重量％の範囲である。
泳動液Ｌｍは、電気泳動法による分析工程において、排出槽２５およびキャピラリー管２７に充填され、電気泳動法における電気浸透流を生じさせる媒体である。泳動液Ｌｍは、特に制限されないが、酸を用いたものが望ましい。前記酸は、例えば、クエン酸、マレイン酸、酒石酸、こはく酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸がある。また、泳動液Ｌｍは、弱塩基を含むことが好ましい。前記弱塩基としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。泳動液ＬｍのｐＨは、例えば、ｐＨ４．５〜６の範囲である。泳動液Ｌｍのバッファーの種類は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等がある。また、泳動液Ｌｍにも、希釈液Ｌｄの説明で述べた前記陰極性基含有化合物が添加される。前記陰極性基含有化合物（コンドロイチン硫酸）の濃度は、例えば、０．０１〜５重量％の範囲である。
制御部８は、分析装置１における各部を制御するものである。制御部８は、たとえばＣＰＵ、メモリおよびインターフェースなどを具備する。
次に、分析システムＡ１を用いた本発明の第１実施形態に基づく分析方法について、以下に説明する。図４は、本実施形態の分析方法を示すフロー図である。本分析方法は、試料採取工程Ｓ１、混合工程Ｓ２、泳動液充填工程Ｓ３、導入工程Ｓ４、除去工程Ｓ１１および電気泳動工程Ｓ５を有する。
＜試料採取工程Ｓ１＞
まず、試料Ｓａを用意する。本実施形態においては試料Ｓａは、人体から採取された血液である。血液としては、全血、または溶血処理が施された溶血等であってもよい。そして、試料Ｓａが分注された分析チップ２を分析装置１に装填する。
まず、試料Ｓａを用意する。本実施形態においては試料Ｓａは、人体から採取された血液である。血液としては、全血、または溶血処理が施された溶血等であってもよい。そして、試料Ｓａが分注された分析チップ２を分析装置１に装填する。
＜混合工程Ｓ２＞
次いで、試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する。具体的には、図５に示すように、所定量の試料Ｓａが分析チップ２の混合槽２２に点着されている。次いで、分注器６によって希釈液槽７１の希釈液Ｌｄを所定量吸引し、図６に示すように、所定量の希釈液Ｌｄを分析チップ２の混合槽２２に分注する。そして、ポンプ６１を吸引源および吐出源として、分注器６から希釈液Ｌｄの吸引および吐出を繰り返す。これにより、混合槽２２において試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合され、混合試料Ｓｍが得られる。試料Ｓａと希釈液Ｌｄとの混合は、分注器６の吸引および吐出以外の方法によって行ってもよい。この混合工程Ｓ２により、前記分析成分であるｓ−ＨｂＡ１ｃとコンドロイチン硫酸とが結合した複合体が生成される。
次いで、試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する。具体的には、図５に示すように、所定量の試料Ｓａが分析チップ２の混合槽２２に点着されている。次いで、分注器６によって希釈液槽７１の希釈液Ｌｄを所定量吸引し、図６に示すように、所定量の希釈液Ｌｄを分析チップ２の混合槽２２に分注する。そして、ポンプ６１を吸引源および吐出源として、分注器６から希釈液Ｌｄの吸引および吐出を繰り返す。これにより、混合槽２２において試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合され、混合試料Ｓｍが得られる。試料Ｓａと希釈液Ｌｄとの混合は、分注器６の吸引および吐出以外の方法によって行ってもよい。この混合工程Ｓ２により、前記分析成分であるｓ−ＨｂＡ１ｃとコンドロイチン硫酸とが結合した複合体が生成される。
なお、発明者らの試験研究の結果、混合工程Ｓ２において、試料Ｓａである血液に含まれる成分のうち前記分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物の一例であるコンドロイチン硫酸との凝集物が生成される場合があることが判明した。また、この副成分の具体例としては、たとえば脂質が挙げられるという知見が得られた。
＜泳動液充填工程Ｓ３＞
次いで、分注器６によって泳動液槽７２の泳動液Ｌｍを所定量吸引し、図７に示すように、所定量の泳動液Ｌｍを分析チップ２の排出槽２５に分注する。そして、上述したポートからの吸引や吐出を適宜実施するなどの手法により、排出槽２５およびキャピラリー管２７に泳動液Ｌｍを充填する。
次いで、分注器６によって泳動液槽７２の泳動液Ｌｍを所定量吸引し、図７に示すように、所定量の泳動液Ｌｍを分析チップ２の排出槽２５に分注する。そして、上述したポートからの吸引や吐出を適宜実施するなどの手法により、排出槽２５およびキャピラリー管２７に泳動液Ｌｍを充填する。
＜導入工程Ｓ４および除去工程Ｓ１１＞
次いで、図８に示すように、混合槽２２から所定量の混合試料Ｓｍを分注器６によって採取する。そして、分注器６から導入槽２３に所定量の混合試料Ｓｍを導入する。この導入においては、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられたフィルタ２４を混合試料Ｓｍが通過する。この際、混合試料Ｓｍに含まれる前記副成分（たとえば脂質）と前記陰極性基含有化合物（本実施形態においてはコンドロイチン硫酸）との凝集物が、フィルタ２４によって除去される。この工程が、除去工程Ｓ１１である。また、この除去工程Ｓ１１と並行して、導入槽２３への混合試料Ｓｍの導入である導入工程Ｓ４が実行される。また、本実施形態においては、混合試料Ｓｍが導入槽２３から連絡流路２８を通じて電極槽２６へと充填される。
次いで、図８に示すように、混合槽２２から所定量の混合試料Ｓｍを分注器６によって採取する。そして、分注器６から導入槽２３に所定量の混合試料Ｓｍを導入する。この導入においては、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられたフィルタ２４を混合試料Ｓｍが通過する。この際、混合試料Ｓｍに含まれる前記副成分（たとえば脂質）と前記陰極性基含有化合物（本実施形態においてはコンドロイチン硫酸）との凝集物が、フィルタ２４によって除去される。この工程が、除去工程Ｓ１１である。また、この除去工程Ｓ１１と並行して、導入槽２３への混合試料Ｓｍの導入である導入工程Ｓ４が実行される。また、本実施形態においては、混合試料Ｓｍが導入槽２３から連絡流路２８を通じて電極槽２６へと充填される。
＜電気泳動工程Ｓ５＞
次いで、図１に示すように、電極槽２６に電極３１を挿入し、排出槽２５に電極３２を挿入する。続いて、制御部８からの指示により電極３１および電極３２に電圧を印加する。この電圧は、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。これにより電気浸透流を生じさせ、導入槽２３から排出槽２５へとキャピラリー管２７中において混合試料Ｓｍを徐々に移動させる。この際、導入槽２３に混合試料Ｓｍが充填されているため、キャピラリー管２７において混合試料Ｓｍが連続的に供給されている状態で、前記分析成分であるｓ−ＨｂＡ１ｃとコンドロイチン硫酸とが結合した複合体を電気泳動させることとなる。また、光源４１からの発光を開始し、検出器５による吸光度の測定を行う。そして、電極３１および電極３２からの電圧印加開始時から経過時間と吸光度との関係を測定する。ここで、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的速い成分に対応した吸光度ピークは、前記電圧印加開始時からの経過時間が比較的短い時点で現れる。一方、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的遅い成分に対応した吸光度ピークは、前記電圧印加開始時からの経過時間が比較的長い時点で現れる。これにより、混合試料Ｓｍ中の各成分の分析（分離測定）が行われる。さらに、測定された前記吸光度を演算処理（たとえば、制御部８による微分処理、差分処理等）することによりエレクトロフェログラムを作成する。このエレクトロフェログラムのピーク高さやピークの面積を計算することにより、混合試料Ｓｍ中の成分比率等を求める。
次いで、図１に示すように、電極槽２６に電極３１を挿入し、排出槽２５に電極３２を挿入する。続いて、制御部８からの指示により電極３１および電極３２に電圧を印加する。この電圧は、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。これにより電気浸透流を生じさせ、導入槽２３から排出槽２５へとキャピラリー管２７中において混合試料Ｓｍを徐々に移動させる。この際、導入槽２３に混合試料Ｓｍが充填されているため、キャピラリー管２７において混合試料Ｓｍが連続的に供給されている状態で、前記分析成分であるｓ−ＨｂＡ１ｃとコンドロイチン硫酸とが結合した複合体を電気泳動させることとなる。また、光源４１からの発光を開始し、検出器５による吸光度の測定を行う。そして、電極３１および電極３２からの電圧印加開始時から経過時間と吸光度との関係を測定する。ここで、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的速い成分に対応した吸光度ピークは、前記電圧印加開始時からの経過時間が比較的短い時点で現れる。一方、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的遅い成分に対応した吸光度ピークは、前記電圧印加開始時からの経過時間が比較的長い時点で現れる。これにより、混合試料Ｓｍ中の各成分の分析（分離測定）が行われる。さらに、測定された前記吸光度を演算処理（たとえば、制御部８による微分処理、差分処理等）することによりエレクトロフェログラムを作成する。このエレクトロフェログラムのピーク高さやピークの面積を計算することにより、混合試料Ｓｍ中の成分比率等を求める。
次に、本分析方法の実施例について説明する。
＜実施例１＞
試料Ｓａとして、健常者から採取された全血９５μＬに、たとえば高脂血症の患者の血液に含まれ得る脂質の代替品として静注用脂肪乳剤（イントラリポス（大塚製薬株式会社：登録商標）輸液２０％）を５μＬ添加したものを用いた。泳動液Ｌｍとして、４０ｍＭクエン酸、１．２５％（ｗ／ｖ）コンドロイチン硫酸Ｃ−ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＳ−１１０（花王株式会社製）、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．０２５％（ｗ／ｖ）プロクリン９５０（シグマ・アルドリッチ社：登録商標）を用いて調製し、ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）を用いてｐＨ５．０としたものを用いた。希釈液Ｌｄとして、４０ｍＭクエン酸、１．０％（ｗ／ｖ）コンドロイチン硫酸Ｃ−ナトリウム、５００ｍＭ ＮＤＳＢ−２０１（Ａｎａｔｒａｃｅ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＳ−１１０（花王株式会社製）、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．０２５％（ｗ／ｖ）プロクリン９５０（シグマ・アルドリッチ社：登録商標）を用いて調製し、ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）を用いてｐＨ６．０としたものを用いた。
試料Ｓａとして、健常者から採取された全血９５μＬに、たとえば高脂血症の患者の血液に含まれ得る脂質の代替品として静注用脂肪乳剤（イントラリポス（大塚製薬株式会社：登録商標）輸液２０％）を５μＬ添加したものを用いた。泳動液Ｌｍとして、４０ｍＭクエン酸、１．２５％（ｗ／ｖ）コンドロイチン硫酸Ｃ−ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＳ−１１０（花王株式会社製）、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．０２５％（ｗ／ｖ）プロクリン９５０（シグマ・アルドリッチ社：登録商標）を用いて調製し、ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）を用いてｐＨ５．０としたものを用いた。希釈液Ｌｄとして、４０ｍＭクエン酸、１．０％（ｗ／ｖ）コンドロイチン硫酸Ｃ−ナトリウム、５００ｍＭ ＮＤＳＢ−２０１（Ａｎａｔｒａｃｅ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＳ−１１０（花王株式会社製）、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．０２５％（ｗ／ｖ）プロクリン９５０（シグマ・アルドリッチ社：登録商標）を用いて調製し、ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）を用いてｐＨ６．０としたものを用いた。
分析チップ２については、容量１０μＬの導入槽２３および容量１０μＬの排出槽２５と幅４０μｍ、深さ４０μｍ、全長３０ｍｍ（分離長２０ｍｍ）のキャピラリー管２７を用意した。キャピラリー管２７の内壁には、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＡＤＭＡＣ：Ｓｉｇｍａ社製）をコーティングした。フィルタ２４としては、セルロースアセテート膜フィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．４５μｍ）を用いた。
混合工程Ｓ２においては、試料Ｓａを希釈液Ｌｄによって４１倍に希釈し、混合試料Ｓｍを得た。泳動液充填工程Ｓ３における泳動液Ｌｍの充填量は９μＬである。導入工程Ｓ４および除去工程Ｓ１１においては、９μＬに電極槽２６および連結流路２８の容積相当分を加えた量の混合試料Ｓｍを導入した。電気泳動工程Ｓ５においては、電極３１および電極３２の電圧は０．５ｋＶ〜２０ｋＶ、電流は７６μＡであった。検出器５においては、波長４１５ｎｍの吸光度を測定し、前記エレクトロフェログラムを得た。電気泳動の実施時間は、３０秒であった。かかる測定を５回実施し、同時再現性を評価した。
＜比較例＞
フィルタ２４を用いた除去工程Ｓ１１を実施しない点のみを除き、実施例１と同様の測定を行った。そして、この測定を５回実施し、同時再現性を評価した。
フィルタ２４を用いた除去工程Ｓ１１を実施しない点のみを除き、実施例１と同様の測定を行った。そして、この測定を５回実施し、同時再現性を評価した。
実施例１によって得られたエレクトロフェログラムを図９に、比較例によって得られたエレクトロフェログラムを図１０に、それぞれ示す。これらのエレクトロフェログラムにおいては、横軸が検出時間（単位：秒）、縦軸が吸光度変化率（単位：ｍＡｂｓ／ｓｅｃ）である。また、実施例１および比較例のｓ−ＨｂＡ１ｃの分析結果の同時再現性評価結果を表１に示す。表中の各測定における数値は、総ヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンｓ−ＨｂＡ１ｃ濃度の比率（％）である。図９における２１秒〜２２秒付近のピークと、図１０における２０秒〜本体２１秒付近のピークとが、分析成分であるｓ−ＨｂＡ１ｃの吸光度ピークである。
次に、分析システムＡ１および本分析方法の作用について説明する。
図９および図１０に示すように、ｓ−ＨｂＡ１ｃの吸光度ピークは、ほぼ同じ時間帯に現れている。このｓ−ＨｂＡ１ｃの吸光度ピークが現れた前後の時間帯におけるエレクトロフェログラムの形状は、図１０の比較例と比べると、図９の実施例１の形状が顕著に滑らかである。言い換えると、図１０のエレクトロフェログラムは、多数の微小な凹凸を含む形状となっている。また、表１に示すように、ｓ−ＨｂＡ１ｃの分析結果は、実施例１の方が比較例よりも標準偏差および変動係数（ＣＶ）が小さい。これらより、実施例１は、比較例よりも再現性に優れるといえる。この差異について、発明者らが検討した結果、実施例１においては、除去工程Ｓ１１で混合試料Ｓｍがフィルタ２４を通過していることにより、混合試料Ｓｍに含まれる前記副成分（たとえば脂質）と前記陰極性基含有化合物としてのコンドロイチン硫酸との凝集物が除去されていることに起因するという知見が得られた。即ち、除去工程Ｓ１１を実施する前には、混合試料Ｓｍ中に前記凝集物が認められたのに対し、除去工程Ｓ１１を実施した後は、混合試料Ｓｍ中の前記凝集物がほとんど認められなかった。そして、発明者らは、電気泳動においては、前記凝集物が図１０における微小な凹凸、すなわちノイズとしてエレクトロフェログラムに現れるとの結論に至った。このような凝集物が除去されたことから、実施例１の再現性が高められたと考えられる。また、測定結果の平均値が実施例１と比較例とで異なっており、この点については、実施例１の平均値の信頼性がより高いと考えられる。したがって、分析システムＡ１および本分析方法によれば、分析精度を向上させることができる。
本分析方法の電気泳動工程Ｓ５においては、混合試料Ｓｍを連続的に供給した状態で、電気泳動を行う。このため、たとえば、キャピラリー管２７に供給される混合試料Ｓｍを所定量に定量する必要がない。混合試料Ｓｍの定量を行う分析方法では、定量のための比較的複雑な機構を備えることが強いられる。本分析方法および分析システムＡ１においては、混合試料Ｓｍの定量を行う必要が無いため、分析チップ２を比較的小型に構成することができる。これは、分析チップ２をディスポーザブルタイプの分析チップとして使用するのに有利である。
導入槽２３の導入経路である導入槽２３の開口部にフィルタ２４を設けることにより、導入工程Ｓ４と除去工程Ｓ１１とを並行して行うことができる。また、フィルタ２４は、ディスポーザブルタイプである分析チップ２に設けられているため、ある分析が終了すると分析チップ２とともに廃棄される。これにより、前記凝集物の除去に用いられたフィルタ２４が分析装置１に残存することがなく、複数回の本分析方法を手際よく、清潔な状態で行うことができる。
なお、上述した構成とは異なり、フィルタ２４は、導入槽２３への導入経路に適宜設けることができる。たとえば、混合槽２２と導入槽２３とが流路によって連結された構成においては、前記流路の途中、あるいは前記流路と前記混合槽２２または導入槽２３との接続部に、フィルタ２４を設けることができる。混合槽２２において生成された混合試料Ｓｍは、前記流路を通じて混合槽２２から導入槽２３へと導入される際に、フィルタ２４によって前記凝集物が除去される。
また、前記凝集物を構成する前記副成分は、たとえば高脂血症の患者から採取された血液において脂質である場合が高頻度であると想定されるが、前記副成分の具体例は脂質に限定されない。前記副成分としては、血液をはじめとする試料Ｓａに含まれる前記分析成分以外の成分であって、前記陰極性基含有化合物と凝集しうるあらゆる成分が該当しうる。
図１１および図１２は、本発明の他の実施形態を示している。なお、これらの図において、上記実施形態と同一または類似の要素には、上記実施形態と同一の符号を付している。
図１１は、本発明の第２実施形態に基づく分析システムを示すシステム概略図である。図１２は、本実施形態の分析方法を示すフロー図である。
図１１に示すように、分析システムＡ２は、分析装置１、分析チップ２、希釈液槽７１、混合槽Ｔｍおよび遠心分離器Ｃｓを備えている。
分析装置１は、上述した実施形態と異なり、希釈液槽７１およびフィルタ２４を備えていない。それ以外の分析装置１の構成は、上述した分析システムＡ１における分析装置１と同様である。
本実施形態においては、希釈液Ｌｄを貯蔵する希釈液槽７１が分析装置１外に設けられている。また、分析装置１外に、混合槽Ｔｍが設けられている。
遠心分離器Ｃｓは、分析システムＡ２を用いた本実施形態の分析方法において、除去工程Ｓ１１を実施するためのものであり、本発明で言う除去部（遠心分離手段）の一例である。遠心分離器Ｃｓとしては、たとえば血液を対象とする遠心分離処理を行う機器が適宜採用される。
図１２に示すように、本実施形態の分析方法においては、試料採取工程Ｓ１、混合工程Ｓ２、除去工程Ｓ１１、泳動液充填工程Ｓ３、導入工程Ｓ４および電気泳動工程Ｓ５の順で実行される。
図１１に示す試料Ｓａを採取した後に、混合槽Ｔｍに試料Ｓａと希釈液槽７１から所定量の希釈液Ｌｄとを分注する。混合槽Ｔｍにおいて試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する混合工程Ｓ２を行う。これにより、混合試料Ｓｍが得られる。次いで、所定量の混合試料Ｓｍを所定の容器に採取し、あるいは混合槽Ｔｍに貯蔵した状態で、遠心分離器Ｃｓに装填する。遠心分離器Ｃｓによる遠心分離処理により、混合試料Ｓｍ内において、前記副成分（脂質）と前記陰極性基含有化合物（コンドロイチン硫酸）との凝集物が底部に沈殿する（除去工程Ｓ１１）。続いて、前記凝集物の沈殿領域から混合試料Ｓｍの液面側に離間した領域から所定量の混合試料Ｓｍを採取し、分析チップ２の導入槽２３に導入する（導入工程Ｓ４）。また、泳動液充填工程Ｓ３を行っておく。この後は、上述した内容の電気泳動工程Ｓ５を実施する。
＜実施例２＞
分析システムＡ２を用いた本実施形態の実施例（便宜上、実施例２とする）について説明する。本実施例においては、除去工程Ｓ１１にて、遠心分離器Ｃｓを用いて８０００Ｇで１０分間の遠心分離処理を混合試料Ｓｍに施した。その他の条件は、上述した実施例１および比較例と同様である。実施例２によって得られたエレクトロフェログラムを図１３に示す。また、実施例２および上述した比較例のｓ−ＨｂＡ１ｃの分析結果の同時再現性評価結果を表２に示す。
分析システムＡ２を用いた本実施形態の実施例（便宜上、実施例２とする）について説明する。本実施例においては、除去工程Ｓ１１にて、遠心分離器Ｃｓを用いて８０００Ｇで１０分間の遠心分離処理を混合試料Ｓｍに施した。その他の条件は、上述した実施例１および比較例と同様である。実施例２によって得られたエレクトロフェログラムを図１３に示す。また、実施例２および上述した比較例のｓ−ＨｂＡ１ｃの分析結果の同時再現性評価結果を表２に示す。
図１３の実施例２のエレクトロフェログラムと図１０の比較例のエレクトロフェログラムとを比べると、実施例２のエレクトロフェログラムには、凝集物に起因すると想定されるノイズが顕著に少なく、実施例１のエレクトロフェログラムと同等であることが分かる。また、表２に示すように、実施例２の標準偏差およびＣＶは、比較例よりも小さく、実施例２が再現性に優れるといえる。なお、実施例１と実施例２とは、比較例とくらべると、平均値が近い値であり、標準偏差およびＣＶがともに小さい値である。
本発明に係る分析方法および分析システムは、上述した実施形態に限定されるものではない。本発明に係る分析方法および分析システムの各部の具体的な構成は、種々に設計変更自在である。
濾過手段は、分析チップ２に内蔵されるフィルタ２４に限定されず、たとえば、分析システムＡ２におけるＣｓに代えて、所定のフィルタを備えた濾過手段が分析装置１外に設けられた構成であってもよい。また、濾過手段および遠心分離手段は、本発明における除去部の例示であり、上述した電気泳動法においてエレクトロフェログラムなどの結果にノイズを生じさせ得る凝集物等の不要物を適切に除去可能な構成であれば種々の機構を採用することができる。
Ａ１，Ａ２ 分析システム
Ｃｓ 遠心分離器
Ｓａ 試料
Ｓｍ 混合試料
Ｌｄ 希釈液
Ｌｍ 泳動液
Ｔｍ 混合槽
１ 分析装置
２ 分析チップ
２１ 本体
２２ 混合槽
２３ 導入槽
２４ フィルタ
２５ 排出槽
２６ 電極槽
２７ キャピラリー管
２８ 連絡流路
３１，３２ 電極
４１ 光源
４２ 光学フィルタ
４３ レンズ
４４ スリット
５ 検出器
６ 分注器
６１ ポンプ
７１ 希釈液槽
７２ 泳動液槽
８ 制御部
Ｓ１ 試料採取工程
Ｓ２ 混合工程
Ｓ３ 泳動液充填工程
Ｓ４ 導入工程
Ｓ５ 電気泳動工程
Ｓ１１ 除去工程
Ｃｓ 遠心分離器
Ｓａ 試料
Ｓｍ 混合試料
Ｌｄ 希釈液
Ｌｍ 泳動液
Ｔｍ 混合槽
１ 分析装置
２ 分析チップ
２１ 本体
２２ 混合槽
２３ 導入槽
２４ フィルタ
２５ 排出槽
２６ 電極槽
２７ キャピラリー管
２８ 連絡流路
３１，３２ 電極
４１ 光源
４２ 光学フィルタ
４３ レンズ
４４ スリット
５ 検出器
６ 分注器
６１ ポンプ
７１ 希釈液槽
７２ 泳動液槽
８ 制御部
Ｓ１ 試料採取工程
Ｓ２ 混合工程
Ｓ３ 泳動液充填工程
Ｓ４ 導入工程
Ｓ５ 電気泳動工程
Ｓ１１ 除去工程
Claims (13)
- キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、
試料と陰極性基含有化合物とを混合することにより混合試料を生成する工程と、
前記試料の成分のうち分析対象である分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を前記混合試料から除去する工程と、
キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で前記分析成分と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する工程と、を含む、分析方法。 - 前記除去する工程においては、濾過によって前記凝集物を除去する、請求項１に記載の分析方法。
- 前記除去する工程においては、遠心分離によって前記凝集物を除去する、請求項１に記載の分析方法。
- 前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類である、請求項１ないし３のいずれかに記載の分析方法。
- 前記陰極性基含有多糖類が、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類である、請求項４に記載の分析方法。
- 前記硫酸化多糖類が、コンドロイチン硫酸である、請求項５に記載の分析方法。
- 前記分析成分が、ヘモグロビンである、請求項１ないし６のいずれかに記載の分析方法。
- 前記副成分が、脂質である、請求項７に記載の分析方法。
- キャピラリー電気泳動法による試料の分析システムであって、
試料と陰極性基含有化合物とを混合することにより混合試料を生成する混合部と、
前記試料の成分のうち分析対象である分析成分以外の副成分と前記陰極性基含有化合物との凝集物を前記混合試料から除去する除去部と、
キャピラリー管を有し、該キャピラリー管中において、前記混合試料が連続的に供給されている状態で前記分析成分と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する分析部と、を備える、分析システム。 - 前記除去部が、濾過手段を有する、請求項９に記載の分析システム。
- 前記キャピラリー管、該キャピラリー管の一端に繋がる導入槽および前記キャピラリー管の他端に繋がる排出槽を有するディスポーザブルタイプの分析チップを備えており、
前記濾過手段が、前記分析チップにおける前記導入槽への導入経路に設けられている、請求項１０に記載の分析システム。 - 前記混合部が、前記分析チップに形成された混合槽である、請求項１１に記載の分析システム。
- 前記除去部が、遠心分離手段を有する、請求項９に記載の分析システム。
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2015
- 2015-08-04 JP JP2015153971A patent/JP6466799B2/ja active Active
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