JP2016044153A - ブナシメジ培養菌体が生産する揮発性物質を含有する抗菌剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステルまたはその誘導体を含有する抗菌剤、
(2)2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステルまたはその誘導体を含有する農薬、および
(3)ブナシメジを培養して菌糸体を得て、菌糸体を有機溶媒にて抽出することを特徴とする、2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステルの製造方法。
<材料および方法>
(1)供試菌および胞子調製
鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センターの保有株であるブナシメジ(Hypsizygus marmoreus)TUFC11906菌株を用いた。
植物病原糸状菌として、ナシ黒斑病菌 (Alternaria alternata Japanese pear pathotype) O−276菌株、キャベツ黒すす病菌 (A. brassicicola) O−264菌株、ナス灰色かび病菌(Botrytis cinerea)ABC−001菌株、キュウリ炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare) C−14菌株およびトマト褐色輪紋病菌 (Corynespora cassiicola) LC−93020菌株の5菌株を用いた。
ブナシメジおよび植物病原菌類の菌株はすべて試験管中のジャガイモ煎汁寒天培地 [DifcoTM Potato Dextrose Agar 39g/蒸留水(以下DW)1リットル](以下PDA培地)上に25℃で保存し、適宜実験に使用した。
PDA培地上で生育したO−276菌株を、シャーレ(直径 9cm)のV−8寒天平板培地(V−8ジュース160ml/CaCO3 3g/寒天20g/DW800ml)(以下V−8培地)上に接種し密封した後、black−light−blue(以下BLB)を照射し、20℃で2週間静置培養した。培地表面に形成された胞子をDW中に筆で掻き取って懸濁し、2重キムワイプ(日本製紙クレシア株式会社、ワイパーS−200)で濾過して菌糸片を取り除いた。その後、吸引濾過により、濾紙(Whatman No.50)上に胞子を集め、室温で乾燥させた後、−80℃で保存した。濾紙上の乾燥胞子を適宜実験に使用した。
胞子使用時には濾紙上の乾燥胞子を筆で掻き取りDWに懸濁させ、遠心分離(800xg、5分)した。沈殿した胞子にDWを加え、Thoma血球計により胞子濃度をDWで調整して用いた。
PDA培地上で生育したO−264菌株をV−8培地上に接種し密封した後、25℃で2週間静置培養した。培地表面に形成された胞子をDW中に筆で掻き取って懸濁し、4重キムワイプで濾過して菌糸片を取り除いた。その後、吸引濾過により、濾紙上に胞子を集め、室温で乾燥させた後−80℃で保存した。濾紙上の乾燥胞子を適宜実験に使用した。胞子使用時には前述の方法と同様の操作を行った。
PDA培地上で生育したABC−001菌株はV−8培地上に接種し密封した後、BLBを照射し、20℃で2週間静置培養した。培養表面に形成された胞子をDW中に筆で掻き取って懸濁し、2重キムワイプで濾過して菌糸片を取り除いた。その後、遠心分離(800xg、5分)し、沈殿した胞子をDWに再懸濁しThoma血球計により胞子濃度を調整し用いた。
PDA培地上で生育したC−14菌株を米ぬか培地(米ぬか25g/スクロース10g/寒天10g/DW500ml)に接種し密封した。BLBを照射し、20℃で7日間静置培養した後、培養表面に形成された胞子をDW中に筆で掻き取って懸濁し、2重キムワイプで濾過して菌糸片を取り除いた。その後、遠心分離(800xg、5分)し、沈殿した胞子をDWに再懸濁しThoma血球計により胞子濃度を調整し実験に用いた。
PDA培地上で生育したLC−93020菌株をV−8培地上に接種し密封した後、BLBを照射し、20℃で3週間静置培養した。培地表面に形成された胞子をDW中に筆で掻き取って懸濁し、4重ガーゼで濾過して菌糸片を取り除いた。その後、吸引濾過により、濾紙上に胞子を集め、室温で乾燥させた後−80℃で保存した。濾紙上の乾燥胞子を適宜実験に使用した。胞子使用時には前述の方法と同様の操作を行った。
プラスチックシャーレ(直径9cm)のPDA培地上にブナシメジTUFC11906菌株の菌糸片を置床し培養した。暗下25℃でシャーレ一面に菌糸が生育した後、シャーレを上下逆にし、ブナシメジ菌糸を上面にして、下側に以下の各検定サンプルを置いた。なお、対照区として、ブナシメジを接種していないPDA培地の入ったシャーレを用いた。その概略を第1図に示す。
まず、各病原菌の菌糸生育に対する抗菌性を検定する場合はPDA培地上に培養しておいた植物病原菌類の菌糸をコルクボーラー(直径4mm)で打ち抜き、PDA培地を入れた小型シャーレ(直径3cm)の中央に接種した。ブナシメジを生育させたシャーレ(直径9cm)の下側に植物病原菌類を接種した蓋をしていない小型シャーレ3個を入れ、シャーレ(直径9cm)の蓋をしてパラフィルムで密封した。なお、対照区はブナシメジを接種していない培地のみのシャーレに、植物病原菌類を接種したシャーレを入れた。暗下25℃で3〜5日間静置し、対照区での植物病原菌類の菌糸がシャーレの8〜9割に広がった時点で小型シャーレを取り出し菌糸の伸長を測定した。菌糸の伸長は次式により求めた。
菌糸伸長(mm)=病原菌類コロニー直径(mm)−コルクボーラー直径(mm)
また、抑制率を次式により求めた。
胞子発芽率(%)=総発芽胞子数/総胞子数×100
また、抑制率を次式により求めた。
ブナシメジTUFC11906菌株の培養菌糸体が生産する揮発性物質は、キャベツ黒すす病菌O−264菌株の菌糸生育および胞子発芽に対して抑制活性を示した。さらに、O−264菌株による病斑形成も顕著に抑制した(表1)。なお、この際、揮発性物質におけるキャベツ切り取り葉への障害は見られなかった。
<方法>
ブナシメジTUFC11906菌株をMalt液体培地(マルトエキス(Oriental yeast CO.Ltd.)15g/寒天20g/DW1リットル)(以下MA液体培地)25℃下で振とう培養および静置培養した。一定期間の培養液をろ紙(Whatman No.2)で吸引ろ過し、培養ろ液を得た。一定期間培養後培養ろ液が生産する揮発性物質の抗菌活性をA.brassicicola O−264胞子発芽抑制で検定した。検定方法は、培養ろ液1mlをろ紙(直径9cm)に滴下し、シャーレの下側に貼付けてシャーレを上下逆にし、ろ紙を上面にして、下側にDWで湿らせたろ紙(直径6cm)を敷き、その上にスライドグラスを置き、胞子濃度を5.0×105 個/mlに調整した0−264菌株の胞子懸濁液を1枚につき2カ所、30μlずつ滴下した。パラフィルムでシャーレを密封し、暗下、25℃で24時間静置後、胞子発芽を測定し、前述した式により抑制率を算出した。
ブナシメジTUFC11906菌株を接種したMA液体培地を振とうし、2および3週間培養した結果、希釈倍率20倍でそれぞれ68.3%と85.3%の胞子発芽抑制率を示した(表.2)。一方、菌株を接種したMA液体培地を静置し、4および5週間培養した場合では、希釈倍率10倍でそれぞれ71.6%と78.3%の抑制率を示した(表.3)。振とう培養2週間後に得られた培養ろ液が、希釈倍率80倍で39.3%の抑制率を示したことより、この培養ろ液中に最も強い抗菌活性物質が産出されている可能性が示唆された。今後は、ブナシメジTUFC11906菌株を接種したMA液体培地を振とう2週間培養し、得られた培養ろ液を用いて実験を行うことにした。
<方法>
ブナシメジTUFC11906菌株をMA液体培地で2週間振とう培養し、得られた培養ろ液および培養ろ液からのジエチルエーテル(Et2O)抽出画分と非抽出画分の揮発性物質の抗菌活性を上述と同様の方法を用い、O−264胞子発芽抑制で検定した。また、抗菌活性の強さを各画分の希釈倍率により評価した。
次に、培養ろ液からのEt2O抽出画分における各種植物病原菌類の胞子発芽抑制および菌糸生育抑制について前述と同様な方法で検定を行った。全ての菌の胞子懸濁液の濃度は5×105個/mlとした。
ブナシメジの振とう培養ろ液は希釈倍率16倍で抑制率61%を示し、一方、培養ろ液よりのEt2O抽出画分では希釈倍率16倍で抑制率83%と高い抗菌活性を示した。しかしながら、非抽出画分において全く抗菌活性は見られなかった(表4)。
<方法>
Et2O抽出画分(培養ろ液と同濃度)を染込ませたろ紙を貼付けたシャーレにO−264胞子懸濁液(106個/ml)を滴下したスライドグラスを入れて密封した。1日または2日後に処理したEt2O抽出画分を除去するため、スライドグラスをEt2O抽出画分のないシャーレに移し密封して1日後に胞子発芽率を測定した。また、Et2O抽出画分連続処理および無処理の密封シャーレ内に置いたスライドグラスの胞子発芽率を測定し、無処理の胞子発芽率よりEt2O抽出画分処理による胞子発芽抑制率を算出した。
ブナシメジ揮発性抗菌物質を含むEt2O抽出画分処理により、O−264菌株の胞子発芽は顕著に抑制され、密閉状態で3日間においても抗菌活性は持続した(表7)。また、処理1日後に揮発性物質を除去した場合、1日後には6割の胞子は発芽を開始し、処理2日後に除去した場合でも同様の結果となり、ブナシメジ揮発性物質の抗菌作用は静菌的であることを示した。そのため、ブナシメジ揮発性物質は、耐性菌が生じにくい、人や動物に対して安全性が高い、残留性を考慮しなくてもよい等の利点を有する。
<方法>
ブナシメジ揮発性抗菌物質の精製の概略を図2に示す。精製した画分において上述と同様の方法を用い、O−264胞子発芽抑制で検定し、抗菌活性を評価した。活性が見られた画分においてGC−MS解析を行い、揮発性抗菌物質の同定を行った。
図2の方法で揮発性抗菌物質を精製し、最終的に得られた画分において抗菌活性の検定を行った結果(表8)、ヘキサン:酢酸エチル=90:10の2〜4画分において抑制率100%を示した。これらの活性画分における抗菌活性の強さを各画分の希釈倍率により評価した結果(表9)、活性画分3において希釈倍率4倍で抑制率83%を示した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分の3つにおいてGC−MSで分析した結果、全ての画分において検出されるのは1つのピーク(RT:15.661min)のみであった(図3)。最も活性が強かった画分3においてこのピークは顕著に検出された(図3)。さらに、MS解析により、本ピークは2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステル(分子量216.319)と同定された。
Claims (3)
- 2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステルまたはその誘導体を含有する抗菌剤。
- 2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステルまたはその誘導体を含有する農薬。
- ブナシメジを培養して菌糸体を得て、菌糸体を有機溶媒にて抽出し、精製することを特徴とする、2−メチルプロパン酸2,2−ジメチル−1−(2−ヒドロキシ−1−メチルエチル)プロピルエステルの製造方法。
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