JP2016020328A - 抗がん剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＴＢ１の発現を十分に抑制することができる抗がん剤、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＴＢ１の発現を十分に抑制し、高い細胞増殖抑制活性を示す抗がん剤を提供することを目的とする。
【解決手段】ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む、抗がん剤によって上記課題が解決される。
【選択図】図９

Description

本発明は、抗がん剤に関する。より具体的には、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む、抗がん剤に関する。

厚生労働省の「人口動態統計」における日本人の主要死因別年齢調整死亡率において、昭和５６年から現在に至るまで悪性新生物（がん）が第一位となっており、がんによる死亡率は近年まで低下傾向を示さず、横ばいか、微増を示している。このため、がんの治療および症状の軽減に適した治療方法を開発するために多くの研究が行われている。化学治療の分野においては、抗生物質、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン剤などががん細胞に有効な抗がん剤として見いだされている。しかしながら、これらの抗がん剤は、がん細胞を攻撃するだけでなく正常細胞にも作用することから、嘔吐、悪心、食欲不振、脱毛などの副作用を引き起こす問題が発生しており、これらの副作用が少ない新規な治療薬の開発が望まれている。

がん細胞は、いわゆるワーバーグ（Ｗａｒｂｕｒｇ）効果として知られるように、解糖系を利用した嫌気的代謝を活発に行っていることが知られている。がん細胞が解糖系を優先的に利用する機構には不明な点もあるが、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する酵素であるピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２）が、そのアイソフォームであるピルビン酸キナーゼＭ１（ＰＫＭ１）よりも優位に機能している。これら２つのアイソフォームの比が、がん細胞において解糖系を優先的に利用する機構と関係しているのではないかと考えられている。ＰＫＭ１およびＰＫＭ２はピルビン酸キナーゼのスプライシングアイソフォームであり、ＰＫＭ１がエキソン８、９および１１を含むのに対し、ＰＫＭ２はエキソン８、１０および１１を含む。ピルビン酸キナーゼのスプライシングにはＰＴＢ１（Ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）を含む一群のタンパク質複合体（ＰＴＢ１／ｈｎＲＮＡＰＡ１／ｈｎＲＮＡＰＡ２）が関与していることが知られており、特にＰＴＢ１の機能により、がん細胞においてＰＫＭ２がＰＫＭ１に対して優位に発現するよう発現量調節の切り替えが行われていると考えられている。

近年、ｍｉＲ−１２４などのある種のマイクロＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてがん細胞におけるＰＴＢ１の発現を抑制し、アポトーシスを誘導しうるという報告がなされている（非特許文献１、２）。ＰＴＢ１の発現を効果的に抑制することができれば、がん細胞に特徴的な嫌気的代謝を抑え、副作用が少ない治療薬の開発につながる可能性がある。

Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２８：１３４６−１３５２（２０１２） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：４３１８−４３３２（２０１４）

ＰＴＢ１の発現を効果的に抑制する物質であれば、抗がん剤として活用することが期待できる。しかしながら、ｍｉＲ−１２４などのマイクロＲＮＡなどの従来公知の物質では、ＰＴＢ１の発現を十分に抑制することができず、その細胞増殖抑制活性は十分なものではなかった。特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、従来技術ではＰＴＢ１の発現を十分に抑制することが困難であった。

したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、ＰＴＢ１の発現を十分に抑制することができる抗がん剤、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＴＢ１の発現を十分に抑制し、高い細胞増殖抑制活性を示す抗がん剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む、抗がん剤によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明によれば、ＰＴＢ１の発現を十分に抑制することができる抗がん剤、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＴＢ１の発現を十分に抑制し、高い細胞増殖抑制活性を示す抗がん剤を提供することができる。

ｍｉＲ−１２４およびＰＴＢ１が、ＰＫＭ１およびＰＫＭ２の発現を調節する仕組みを図示する。 ２０ｎＭまたは４０ｎＭのｍｉＲ−１２４でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を示す。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を示す。 ２ｎＭまたは５ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１でＴＨＰ１細胞またはＭＫＮ４５細胞を処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を示す。 ２０ｎＭまたは４０ｎＭのｍｉＲ−１２４でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、ＰＴＢ１の発現をウェスタンブロットにて確認した図を示す。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、ＰＴＢ１、およびアポトーシス等に関わるタンパク質の発現をウェスタンブロットにて確認した図を示す。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、ＰＫＭ１およびＰＫＭ２の発現をウェスタンブロットにて確認した図を示す。 ５ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１でＤＬＤ−１細胞を７２時間処理した後、細胞をヘキスト核染色した顕微鏡像を示す（右）。ｓｉＲ−ＰＴＢ１処理をした群（右）ではアポトーシスによる核の分断化（矢印）が認められるが、対照群（左）では核の分断化は認められない。 ヌードマウスにＤＬＤ−１細胞を移植し、ｓｉＲ−ＰＴＢ１（図９Ａ）またはｍｉＲ−１２４（図９Ｂ）を腫瘍部位に局所注射した場合における、腫瘍体積の変動を示す。 ＤＬＤ−１細胞を移植して２４日間飼育したヌードマウスの腫瘍部位から摘出した組織（腫瘍が消失した場合はその相当組織）を撮影した像を示す。 ＤＬＤ−１細胞を移植して２４日間飼育したヌードマウスの腫瘍部位から摘出した組織（腫瘍が消失した場合はその相当組織）におけるタンパク質発現を、ウェスタンブロットにて確認した図を示す（図１１Ａ：ｓｉＲ−ＰＴＢ１、図１１Ｂ：ｍｉＲ−１２４）。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＫＭ２でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を示す。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＫＭ２でＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞を処理した場合における、ＰＫＭ２の発現をウェスタンブロットにて確認した図を示す。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＫＭ２でＴＨＰ１細胞またはＭＫＮ４５細胞を処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を示す。 ５ｎＭまたは１０ｎＭのｓｉＲ−ＰＫＭ２でＴＨＰ１細胞またはＭＫＮ４５細胞を処理した場合における、ＰＫＭ２の発現をウェスタンブロットにて確認した図を示す。 ｓｉＲ−ＰＴＢ１（５ｎＭ）とｓｉＲ−ＰＫＭ２（５ｎＭ）とを併用してＤＬＤ−１細胞を処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を示す。

以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。

また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味し、「重量」と「質量」、「重量％」と「質量％」及び「重量部」と「質量部」は同義語として扱う。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％の条件で測定する。

図１に、ｍｉＲ−１２４およびＰＴＢ１が、ＰＫＭ１およびＰＫＭ２の発現を調節する仕組みを図示する。ｍｉＲ−１２４はＰＴＢ１の上流に位置し、ＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡの転写因子であるｃ−Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ１およびＳＴＡＴ３の発現を抑制的に調節し、また、ＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡの翻訳を直接に抑制していると考えられている。ＰＴＢ１はスプライシングリプレッサーとして機能し、ＰＴＢ１の発現上昇によりエキソン９がスキップされてＰＫＭ１の発現が抑制される一方、ＰＫＭ２の発現が上昇すると考えられる。

本発明に係る抗がん剤は、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（以下、特に断りの無い限り、「ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ」を単に「二本鎖ｓｉＲＮＡ」とも称する。）または該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む。このような構成を有する本発明に係る抗がん剤によれば、ＰＴＢ１の発現を、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても十分に抑制することができ、高い細胞増殖抑制活性を示す。本発明の技術的範囲をなんら制限するものではないが、これは、以下のメカニズムによるものと推測される。ＰＴＢ１によってＰＫＭ２の発現が優位となっているがん細胞では、解糖系を介した嫌気的代謝が活発に行われる。このため、がん細胞の増殖に必要な核酸の合成が盛んとなり、また、ミトコンドリアにおける活性酸素発生が抑制される一因となっていると考えられる。一方、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ＲＮＡまたは該二本鎖ＲＮＡの発現ベクターによってＰＴＢ１の発現を抑制することにより、ＰＫＭ２優位であったがん細胞がＰＫＭ１優位となる。これによって嫌気的代謝が抑制され、がん細胞の増殖に必要な核酸の合成原料の供給が抑えられるとともに、ミトコンドリアにおいて活発に活性酸素が発生し、アポトーシス誘導の一因となるため、上記のような効果が得られるものと考えられる。ｓｉＲＮＡを用いた場合、相補性が１００％と高いこと、ＲＩＳＣ構成蛋白のプロフィールなどの理由により、成熟ｍｉＲ−１２４などのマイクロＲＮＡよりも高い活性が、特にｉｎ ｖｉｖｏにおいて、発揮されるものと推測される。

なお、本明細書では、二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、最終的に標的となる遺伝子のｍＲＮＡと対合する、当該ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖（または当該アンチセンス鎖を含むポリヌクレオチド）を「ガイド鎖」と表現する。一方、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖（または当該センス鎖を含むポリヌクレオチド）を「パッセンジャー鎖」と表現する。

本発明に係る抗がん剤において使用される「二本鎖ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）に関与し、配列特異的に標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを分解し、標的タンパク質の発現を特異的に抑制する活性を備える二本鎖のＲＮＡ分子である。生体内においてｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質複合体に組込まれ、パッセンジャー鎖が脱離する。その後、ガイド鎖が標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を認識して結合し、ガイド鎖が結合したｍＲＮＡはＲＩＳＣによって分解される。

二本鎖ｓｉＲＮＡは、通常は２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基のガイド鎖（アンチセンス鎖）と、ガイド鎖に相補的な２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基のパッセンジャー鎖（センス鎖）とからなる。ガイド鎖は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の連続する１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基に対して相補的な配列を含む（ガイド鎖と相補的な、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の領域を「標的配列」とも称する。）。また、パッセンジャー鎖は、標的配列と相同な配列を含む。

二本鎖ｓｉＲＮＡの末端構造は、平滑末端でもよいが、オーバーハング（突出）を有していても良い。パッセンジャー鎖とガイド鎖との３’末端が塩基対を形成せず、２〜５塩基、好ましくは２塩基突出したオーバーハング（例えば、ＵＵ）を有することにより、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を抑制する活性が向上することがある。ガイド鎖の塩基配列において標的配列に相補的な配列領域以外の領域は、オーバーハングであり得る。また、パッセンジャー鎖の塩基配列において標的配列に相同な配列領域以外の領域は、オーバーハングであり得る。

本発明における抗がん剤の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、標的配列（１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基）に相補的な配列を含むガイド鎖（２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基）と、ガイド鎖に相補的な配列を含むパッセンジャー鎖（２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基）と、がアニールした二本鎖ポリヌクレオチドが用いられても良い。

本発明における抗がん剤の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡには、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から誘導されたものが含まれる。ｓｈＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるパッセンジャー鎖相当領域とガイド鎖相当領域とが３〜１１塩基程度のループ領域を介して連結された一本鎖のポリヌクレオチドである。生体内で発現されたｓｈＲＮＡは、パッセンジャー鎖相当領域とガイド鎖相当領域とがハイブリダイズしたヘアピン構造を取るが、ＲＮａｓｅの一種（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングを受け、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。ｓｈＲＮＡの塩基長は、例えば４５〜７０塩基であり、好ましくは４５〜６０塩基である。

本発明における抗がん剤の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、分子構造の安定化、酵素耐性の向上、細胞への取り込みやすさの向上等を目的として、当業者に知られた手段によって化学的に修飾したものであっても良い。化学的修飾の例としては、ＬＮＡ（登録商標）などの架橋化した核酸、ホスホロチオエート化した核酸、２’−Ｏ−メチル化した核酸を用いても良い。また、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖の５’末端および／または３’末端が蛍光色素、コレステロール、ビオチン等で修飾されたものであっても良い。

二本鎖ｓｉＲＮＡは従来公知の核酸合成方法により合成することができる。本発明に係る抗がん剤には、ＰＴＢ１を標的とする単離された二本鎖ｓｉＲＮＡが使用される。

本発明における抗がん剤の有効成分としては、二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターも好ましく用いられる。かような発現ベクターとしては、適切なプロモーターを有するプラスミドベクター、ウイルスベクター等を、ベクターが導入される宿主に合わせて適宜選択し、プロモーターの下流に二本鎖ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを従来公知の手法により組込んだものを用いればよい。プロモーターとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が例示できる。

プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＳＩＮｓｉシリーズ、ｐＢＡｓｉシリーズ、ｐＳＩＲＥＮシリーズ（以上、タカラバイオ株式会社製）等が例示できる。プラスミドには、通常、アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が含まれる。

ウイルスベクターとしては、例えば、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等が例示できる。

二本鎖ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、パッセンジャー鎖をコードするＤＮＡとガイド鎖をコードするＤＮＡとが別々にプロモーターの下流にそれぞれ組込まれたもの（タンデム型）でもよく、パッセンジャー鎖相当領域をコードするＤＮＡとガイド鎖相当領域をコードするＤＮＡとがループ領域をコードするＤＮＡを介して連結されてひとつのプロモーターの下流に組込まれた上述のｓｈＲＮＡのようなもの（ショートヘアピン型）でもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの下流には、ターミネーターが含まれることが好ましい。

二本鎖ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡのベクターへの組換え方法は、当業者に知られた手段によって行うことができ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， ９．４７−９．５８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． ｐｒｅｓｓ（１９８９）等が参酌される。

本発明で用いられる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＰＴＢ１を標的とするものである。ＰＴＢ１が由来する生物種は特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ等に由来するＰＴＢ１であるが、好ましくはヒトである。

対象となる生物種のＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡ配列から任意の連続する１５〜２７塩基配列を選択し、標的配列とする。二本鎖ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は、当該標的配列に対して相同な塩基配列と、任意に含まれるオーバーハング配列とからなる。二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖は、当該標的配列に対して相補的な塩基配列と、任意に含まれるオーバーハング配列とからなる。

配列番号１は、ヒトＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡの配列を示す。本発明の好ましい態様においては、二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖が、配列番号１で示される塩基配列における連続する１６〜２７塩基、より好ましくは２１〜２５塩基に相補的な配列を含む。

上記配列番号１において、網掛け部分は、それぞれ実施例におけるｓｉＲ−ＰＴＢ１−１およびｓｉＲ−ＰＴＢ１−２の標的配列を示す。

標的配列の選定方法は、当業者に知られた手法により行うことができ、例えば、（ｉ）ガイド鎖の５’末端のヌクレオチドがＡまたはＵである、（ｉｉ）パッセンジャー鎖の５’末端がＧまたはＣである、（ｉｉｉ）ＧＣ含量が３５〜５５％である、（ｉｖ）ＧおよびＣが４塩基以上連続しない、ことを基準として選定することができる（例えば、Ｋ．Ｕｉ−Ｔｅｉら，Ｎｕｃｌｅｃｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４， ９３６−９４８； Ｍ．ＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉとＨ．Ｐｒｙｄｚ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｓｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２００４， １０５０−１０５８； Ｄ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３， ７１７４−７１８１； Ａ．Ｋｈｖｏｒｏｖａら，Ｃｅｌｌ ２００３， ２０９−２１６も参照される。）。標的配列は５’非翻訳領域でもよいが、開始コドンから５０〜１００塩基下流（すなわち、３’方向）のＯＲＦ領域または３’非翻訳領域であることが好ましい。

また、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｅｓｉｇｎ．ＲＮＡｉ．ｊｐ／）、ＡｓｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｓｂｉｏ．ｋｒｉｂｂ．ｒｅ．ｋｒ：８０８０／ＡｓｉＤｅｓｉｇｎｅｒ／ｍｅｎｕＤｅｓｉｇｎｅｒ．ｊｓｆ／）、またはＧｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ ｓｅｌｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｒｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）等のデータベースを利用し、標的配列を選定することもできる。

上記基準を満たす配列としては、例えば、配列番号１において、２１２位、２２１位、２２６位、４２５位、１８５７位、２４０６位または２４０７位を開始位置とする、以下の配列番号２〜８で示される配列を標的配列とする二本鎖ｓｉＲＮＡが例示できる。

上記標的配列のなかでも、２１２位または１８５７位を開始位置とするものが好ましい。

二本鎖ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は、配列番号９（配列番号６と相同な配列を含む）または配列番号１０（配列番号２と相同な配列を含む）で示される塩基配列からなるものが、ＰＴＢ１の発現を抑制する活性の観点からさらに好ましい。なお、下記配列中、３’末端のＵＵはオーバーハングを表す。

上記の配列番号９で示されるパッセンジャー鎖に相補的な配列とオーバーハングからなるガイド鎖を配列番号１１として、および配列番号１０で示されるパッセンジャー鎖に相補的な配列とオーバーハングからなるガイド鎖を配列番号１２として以下に示す。本発明の好ましい一実施形態では、ＰＴＢ１を標的とし、ガイド鎖が配列番号１１または配列番号１２で示される塩基配列からなる二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む、抗がん剤が提供される。なお、下記配列中、３’末端のＵＵはオーバーハングを表す。

なかでも、配列番号９で示されるパッセンジャー鎖と配列番号１１で示されるガイド鎖とからなる二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む抗がん剤が、ＰＴＢ１の発現抑制活性の観点から特に好ましい。

二本鎖ｓｉＲＮＡは市販のものを用いても良く、ライフテクノロジーズ社、ダーマコン社、ジェンスクリプト社等から購入できる。

二本鎖ｓｉＲＮＡはオフターゲット効果を有しないものが好ましい。「オフターゲット効果」とは、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡが、ｓｉＲＮＡによって認識・分解されることを言う。オフターゲット効果は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡとそれ以外の遺伝子との配列相同性が認められる場合に発生するため、上記の手段により選択した標的配列について、データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／））により相同性検索を行うか、マイクロアレイ実験等によりあらかじめ交差性を確認することで回避することができる。オフターゲット効果を有しない二本鎖ｓｉＲＮＡを用いることにより、二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖がＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡに特異的に結合できるため、標的タンパク質であるＰＴＢ１の発現が特異的に抑制される。本発明の一実施形態では、配列番号１で示される塩基配列に相補的な配列を含み、ＰＴＢ１の発現を特異的に抑制する二本鎖ｓｉＲＮＡを含む抗がん剤が提供される。

ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む抗がん剤を用いることにより、がん細胞においてＰＴＢ１の発現量が抑制され、がん細胞の増殖が抑制される。ＰＴＢ１の発現量や細胞増殖抑制活性については、実施例に記載の手法により評価することができる。

本発明に係る抗がん剤には、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターが有効成分として、すなわち、所望の効果を発揮するのに充分な量（有効量）で用いられる。「有効量」とは、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、何らかの所望の治療効果を生じるために有効な作用物質または組成物の量を意味する。例えば、本発明に係る抗がん剤の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、用量は対象となる者の体重等の条件によって容易に変動しうるため、当業者によって適宜選択されうる。

本発明に係る抗がん剤は、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターからなるものであっても良いが、ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターをさらに含んでも良い。抗がん剤がＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターをさらに含むことにより、より高い抗がん活性が期待しうる。

ＰＫＭ２が由来する生物種も制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ等、ＰＴＢ１が由来する生物種と同一の生物種である。

ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＰＫＭ１を標的とせず、ＰＫＭ２の発現を特異的に抑制するものが好ましい。従って、ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＰＫＭ２をコードするｍＲＮＡのエキソン１０に由来する配列を含む連続する１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基を標的配列とするものが好ましい。

配列番号１３は、ヒトＰＫＭ２遺伝子の配列を示す。また、ヒトＰＫＭ２遺伝子のうち、エキソン１０に由来する配列を配列番号１４として以下に示す。

特に、パッセンジャー鎖が配列番号１５で示され、ガイド鎖が配列番号１６で示される、ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡが、ＰＫＭ２の発現を抑制する活性の観点からさらに好ましい。なお、下記配列中、３’末端のＵＵはオーバーハングを表す。

配列番号１４における下線部は、パッセンジャー鎖が配列番号１５で示され、ガイド鎖が配列番号１６で示される二本鎖ｓｉＲＮＡの標的配列を示す。

ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡや、該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターについてのその他の事項は、ＰＴＢ１について上述した事項が適用され、ＰＴＢ１と同様の手段により設計、入手することができる。本発明で使用されるＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡは、単離されたものである。

ＰＴＢ１またはＰＫＭ２をそれぞれ標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターは、それぞれ任意の割合で抗がん剤に含まれていればよいが、たとえば、コピー数の比として１：１０００〜１０００：１であり、好ましくはコピー数の比として１：１００〜１００：１である。

本発明に係る抗がん剤は、がんの治療、予防、低減、および／または処置のため、医薬として患者に投与される。ここで、本発明に係る抗がん剤が使用されるがんは、がん細胞の増殖が抑制される限り特に制限されるものではないが、例えば大腸がん、胃がん、食道がん、乳がん、白血病、肺がん、前立腺がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、脳腫瘍、造血器腫瘍、悪性黒色腫などが挙げられ、このうち大腸がん、胃がん、食道がん、乳がん、および白血病からなる群から選択されるがんに好適に適用され、特に、大腸がんに好適に用いられる。がんは、原発性がんまたは転移性がんでありうる。また、「患者」とは、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ等が含まれるが、特にヒトに対して好適に用いられる。ＰＴＢ１またはＰＫＭ２をそれぞれ標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、生物種に応じて適宜選択される。

本発明に係る抗がん剤による細胞増殖の抑制効果は、例えば、各種のがん細胞を、被験対象となる試料の存在下に培養し、生細胞の数の経時的な変化を観察することにより評価できる。ここで、生細胞の数が経時的に減少する場合、該試料が、がん細胞の増殖抑制効果を有することの指標にすることができる。

本発明に係る抗がん剤は、固体または液体での投与形態に応じて処方することができる。経口投与としては、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、カプセル剤、粉末薬、顆粒剤、舌に塗布するためのペーストが例示される。非経口投与としては、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液として例えば皮下、腹腔内、筋内もしくは静脈内注射のための製剤、あるいは、局所用として、または、膣内または直腸内へ投与するための剤形へと製剤化されうる。本発明に係る抗がん剤の有効成分がＲＮＡ分子である点を考慮して、好ましくは注射剤の形態として製剤化され、なかでもリポソーム−ＲＮＡが複合体化した形態に処方されることがさらに好ましい。

リポソームを用いることでｓｉＲＮＡの細胞への取り込みが促進され、ｓｉＲＮＡの血中半減期を長期化することもできる。リポソームを調製する方法としては公知のものを採用することができ、例えばＦ．Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８０）９：４６７−５０８等が参酌される。

本発明に係る抗がん剤は、所望の製品形態に応じた製薬上許容されうる担体や、他の添加剤などとともに組成物を構成してもよい。また、本発明に係る抗がん剤は、賦形剤などの添加剤と混合して非経口投与、経口投与または外部投与に適した形態で使用することができる。

「製薬上許容されうる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために使用される。

「製薬上許容されうる担体」とは、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明に係る抗がん剤を運搬または輸送することに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤またはカプセル化材料のような、製薬上許容されうる材料、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、剤形の他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で「許容されうる」ものでなければならない。製薬上許容されうる担体として機能しうる材料のいくつかを以下に例示すると、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような補形薬；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油脂；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬物処方で使用される他の非毒性の適合物質を含む。

その他、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた組成物中に存在してもよい。

製薬上許容されうる酸化防止剤の例には以下のものがある：アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤も必要に応じて含有させることができる。

非経口投与に好適な形態に処方（製剤化）された本発明に係る抗がん剤は、二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターとともに、１つまたは複数の製薬上許容されうる溶媒、滅菌等張水溶液、非水溶液、分散剤、懸濁液、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、調剤を目的レシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは濃縮剤を含みうる。非経口投与用とする場合には、二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理食塩水、リンガー溶液（リンゲル液）、ロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、グリセリンおよび界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマルジョンとして製剤化され得る。好ましくは注射用滅菌水溶液として、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内等に投与される。この際、液状製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨであることが好ましい。また、ローション剤、懸濁剤、乳剤等の液状製剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤、散剤、粉剤（粉状）もしくは用時溶解（液状）して塗布するための顆粒剤等の固形製剤として、または貼付剤などの外用剤として、標的部位およびその周辺部位に経皮的に投与してもよい。さらに、ペレットによる埋め込み、または坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。上述したうち、好ましい製剤や投与形態等は、担当の医師によって選択される。前記医薬品のローション剤、クリーム剤及び軟膏などの半固形製剤は、前記医薬品を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤及び懸濁化剤などよりなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。

これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬や、微生物の活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることもできる。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質を用いることにより、吸収持続性のある製剤になり得る。

本発明に係る抗がん剤を投与する場合、本発明に係る有効成分の投与量は、患者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定されうる。本発明においては、少なくとも細胞増殖抑制効果を得るために必要な１日あたりの有効成分の量を投与できるように、１日あたりの投与量を考慮し、抗がん剤または組成物中の含有量を適宜設定することが好ましい。なお、本発明による抗がん剤は、有効成分である二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを、当該有効成分換算で成人（６０ｋｇ換算）一人に１日あたり好ましくは１ｎｇ／６０ｋｇ〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ、より好ましくは１０ｎｇ／６０ｋｇ〜１００ｍｇ／６０ｋｇ、さらに好ましくは１００ｎｇ／６０ｋｇ〜１０ｍｇ／６０ｋｇの範囲で提供される量を含む。

本発明の別の実施形態においては、ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを使用する、がんの治療方法に関する発明が提供される。本実施形態においては、抗がん剤に関する上述の説明が参酌される。有効成分であるＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターは、注射剤の形態で患部へ投与されることが好ましい。本発明に係る治療方法は、外科的治療、化学療法、免疫療法および／または放射線治療と組み合わせて行われても良い。

本発明に係る抗がん剤は、必要に応じて、他の抗がん剤と組み合わせて用いられてもよい。他の抗がん剤としては、例えば、フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、アザシチジン、デシタビン、フロクスウリジン、エチニルシチジン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、ネララビン、６−チオグアニン、クラドリビン、クロファラビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、ノラトレキセド、プララトレキサート、トリメトレキサート、イダトレキサート、ヒドロキシカルバミド、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ミリプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、イプロプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、グルフォスファミド、マフォスファミド、エストラムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、トラベクテジン、アパジコン、アルトレタミン、ベンダムスチン、ミトラクトール、アントラサイクリン系抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、アムルビシン、ゾルビシン、バルルビシン、リポソーマルドキソルビシン、ピクサントロン、およびミトキサントロン）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、アクチノマイシンＤ、ジノスタチンスチマラマー、トポテカン、イリノテカン、エキサテカン、ノギテカン、エトポシド、テニポシド、ゾブゾキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、モノメチルアウリスタチンＥ、エポチロンＢ、エリブリン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ボロゾール、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、ゲストノロン、メピチオスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、クロルマジノン、エストラムスチン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、リン酸ポリエストラジオール、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ミトタン、ゴセレリン、リュープロレリン、ブセレリン、トリプトレリン、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ＭＶ８３３、セツキシマブ、ペガプタニブ、パゾパニブ、ＣＢＯ−Ｐ１１、スニチニブ、ソラフェニブ、ラニビズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、ザクティマ、ＮＸ１８３８、アンジオザイム、セマキサニブ、レスタウルチニブ、ＴＳＵ−６８、ＺＤ４１９０、テムシロリムス、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＮＰ−４７０、ＣＰ−５４７６３２、ＣＰＥ−７０５５、ＫＲＮ６３３、ＡＥＥ７８８、ＩＭＣ−１２１１Ｂ、ＰＴＣ−２９９、Ｅ７８２０、レンバチニブ、マリマスタット、ネオバスタット、プリノマスタット、メタスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、ＭＭＩ２７０、Ｓ−３３０４、ビタキシン、オロチン酸カルボキシアミドトリアゾール、サリドマイド、ゲニステイン、インターフェロンα、およびインターロイキン１２等が挙げられる。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。

＜１．試験方法＞
（細胞培養）
ヒト大腸がん細胞株（ＤＬＤ−１細胞およびＷｉＤｒ細胞）は、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ（シグマ−アルドリッチ株式会社）および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ_２の雰囲気のインキュベーター内で培養した。ヒト単球細胞株（ＴＨＰ１細胞）およびヒト胃がん細胞株（ＭＫＮ４５細胞）は、ＤＬＤ−１細胞やＷｉＤｒ細胞と同じ培地中で、同様の条件下で培養した。なお、細胞はすべてＪＣＲＢ生物資源バンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｒｃｅｓ）より購入した。

（トランスフェクション）
各細胞は、トランスフェクションの前日に０．５×１０^５細胞／ウェル（１０〜３０％コンフルエント）となるように６ウェルプレートに播種した。成熟ｍｉＲ−１２４（ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ、アンビオン社製）、またはＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ−ＰＴＢ１、ライフテクノロジーズ社製）および／若しくはＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ−ＰＫＭ２、ライフテクノロジーズ社製）を細胞へのトランスフェクションに用いた。成熟ｍｉＲ−１２４の配列を、配列番号１７に示す。ｓｉＲ−ＰＴＢ１としては、ヒトＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれる領域を標的配列とするｓｉＲ−ＰＴＢ１−１（上記配列番号９と配列番号１１とがアニールした二本鎖ポリヌクレオチドからなる）、およびヒトＰＴＢ１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦ領域に含まれる領域を標的配列とするｓｉＲ−ＰＴＢ１−２（上記配列番号１０と配列番号１２とがアニールした二本鎖ポリヌクレオチドからなる）を用いた。ｓｉＲ−ＰＫＭ２としては、上記配列番号１５と配列番号１６とがアニールした二本鎖ポリヌクレオチドを用いた。また、対照群としては配列番号１８に示す非特異対照ｍｉＲＮＡを用いた。

マイクロＲＮＡおよび二本鎖ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにはカチオン性リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ、ライフテクノロジーズ社）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。マイクロＲＮＡおよび二本鎖ｓｉＲＮＡのトランスフェクションから４８時間後または７２時間後、トランスフェクションによる効果を確認した。

（細胞増殖抑制活性）
生存細胞の数は、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。対照群における生存細胞数を１００（％）とし、対照群の細胞数に対する試験群の生存細胞数の割合（細胞生存率）を求めた。細胞生存率が低い群ほど、細胞増殖抑制活性が高いことを示す。

（ヒトがん細胞異種移植モデル）
動物実験プロトコルは、岐阜大学の動物実験福祉委員会によって承認された。

ＢＡＬＢ／ｃＳＬＣ−ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、日本ＳＬＣ社から入手した。

ヒト結腸がんＤＬＤ−１細胞を、各マウスの背部に、２．０×１０^６細胞／１００μｌで各部位に移植した。移植の日を０日目とした。移植後１０日目に、腫瘍の生着が確認された。

５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社）に溶解したｓｉＲ−ＰＴＢ１−１、またはｍｉＲ−１２４（１投与あたり０．２ナノモル）を、１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸと共にインキュベートして混合物（リポソーム−ＲＮＡの複合体）を調製した。なお、対照群の対照ｓｉＲＮＡおよび対照ｍｉＲＮＡとしては、非特異ノンコーディングｓｉＲＮＡ（ダーマコン社から購入）および上記の非特異対照ｍｉＲＮＡをそれぞれ用いた。移植後１０日目から、調製した混合物を腫瘍内に週２回または３回注射した（５匹／各群）。混合物の調製は、投与直前に都度行った。

腫瘍が消失した場合は、注射を停止した。移植後２４日目に腫瘍部位から組織（腫瘍が消失した場合はその相当組織）を摘出し、腫瘍体積を測定するとともに、上記の手法によりタンパク質発現を確認した。腫瘍体積は、以下の数式１によって算出した。

数式１において、Ｌ_１は腫瘍の長軸の長さであり、Ｌ_２は腫瘍の短軸の長さである。

（ウェスタンブロット）
細胞または移植部位の組織を、氷冷した溶解バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０、０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％（ｗ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ−アルドリッチ社）中でホモジナイズし、氷上で２０分間静置した。ホモジネートを１３，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離した後、上清を全細胞タンパク質試料として採取した。試料中のタンパク質含有量は、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用いて測定した。

試料（１０μｇのタンパク質量）を１０．０または１２．５％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（パーキンエルマーライフサイエンス社）に転写した。５％（ｗ／ｖ）脱脂乳液（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で調製）中で１時間インキュベートして非特異的結合をブロックした。その後、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ−Ｔで適度に希釈した抗ＰＴＢ１抗体、抗ＰＡＲＰ−１抗体、抗ＬＣ３Ｂ抗体、抗ｐＡｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体（以上、セルシグナリングテクノロジー社）、抗ＰＫＭ１抗体、または抗ＰＫＭ２抗体（以上、ノバスバイオロジカルズ社）と共に、４℃で膜を一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄し、ＨＲＰ−結合ヤギ抗ウサギ抗体またはウマ抗マウスＩｇＧ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）と共に室温でさらにインキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄した。免疫ブロットは、アマシャムＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化した。タンパク質量は、抗β−アクチン抗体（シグマ−アルドリッチ社）を用いて同じ膜を再インキュベートすることによって確認した。β−アクチンを内部標準として用いた。

（ヘキスト核染色）
細胞のアポトーシスによる形態学的特徴を評価するため、ＤＬＤ−１細胞を、トランスフェクション後７２時間で回収した。ヘキスト（５μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を３７℃で１時間染色し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後に再懸濁し、ガラススライド上にピペットで滴下し、顕微鏡（オリンパス社）を用いた蛍光顕微鏡法により検査した。顕微鏡観察の結果、凝縮および／または断片化した核を持つ細胞は、アポトーシスを起こしているものと評価した。

（統計解析）
統計分析はグラフパッドプリズムソフトウェアシステム（グラフパッドソフトウェア社）を用いて行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験については、両側スチューデントｔ検定により統計有意性を評価した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験（ヌードマウス実験）については、マンホイットニーＵ検定によりデータを比較した。値は平均±標準偏差として示した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。

＜２．結果＞
（細胞増殖抑制活性）
ＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞をｍｉＲ−１２４で７２時間処理した場合の、対照群（図中の「Ｃ」）に対する生存細胞の割合を図２に示す。また、ＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞をｓｉＲ−ＰＴＢ１−１で７２時間処理した場合の、対照群（図中の「Ｃ」）に対する生存細胞の割合を図３に示す。図２および図３に示すように、ＤＬＤ−１細胞およびＷｉＤｒ細胞のいずれにおいても、ｓｉＲ−ＰＴＢ１はｍｉＲ−１２４よりも細胞増殖抑制活性が高いことがわかる。なお、ｓｉＲ−ＰＴＢ１−２で処理した場合も同様の傾向が認められた。特にＤＬＤ−１細胞においては、ｓｉＲ−ＰＴＢ１の効果は顕著であり、４０ｎＭのｍｉＲ−１２４よりも５ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１の方が細胞増殖抑制活性が高いことがわかる。

ＴＨＰ１細胞またはＭＫＮ４５細胞をｓｉＲ−ＰＴＢ１−１で７２時間処理した場合の、対照群（図中の「Ｃ」）に対する生存細胞の割合を図４に示す。図４より、大腸がん以外のがん細胞においてもｓｉＲ−ＰＴＢ１が高い細胞増殖抑制活性を示すことが分かる。

（タンパク質発現解析）
ＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞をｍｉＲ−１２４で７２時間処理した場合の、ＰＴＢ１の発現をウェスタンブロットにて確認した結果を図５に示す。また、ＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞をｓｉＲ−ＰＴＢ１−１で７２時間処理した場合の、ＰＴＢ１、アポトーシス関連タンパク質、またはオートファジー関連タンパク質をウェスタンブロットにて確認した結果を図６に示す。図５と図６との比較から、ＤＬＤ−１細胞およびＷｉＤｒ細胞のいずれにおいても、ｓｉＲ−ＰＴＢ１では、ｍｉＲ−１２４よりも低濃度でＰＴＢ１の発現を強く抑制していることが分かる。なお、ｓｉＲ−ＰＴＢ１−２で処理した場合も同様の傾向が認められた。

また、図６より、ｓｉＲ−ＰＴＢ１で処理した細胞では、ＰＡＲＰ−１の切断が進行し、Ａｋｔの発現が減少していることから、アポトーシスが進行していることを示している。さらに、ＬＣ３Ｂの発現が上昇していることから、オートファジーが進行していることを示している。

ＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞をｓｉＲ−ＰＴＢ１−１で７２時間処理した場合の、ＰＫＭ１およびＰＫＭ２の発現をウェスタンブロットにて確認した結果を図７に示す。図７より、ｓｉＲ−ＰＴＢ１処理によってＰＫＭ１の発現が上昇し、ＰＫＭ２の発現が減少していることが分かる。従って、ＰＫＭ２優位であったがん細胞が、ＰＫＭ１優位となっていることが分かる。これにより、がん細胞における嫌気的代謝が抑制され、核酸合成の原料物質の供給が抑えられるとともに、ミトコンドリアにおいて活発に活性酸素が発生し、アポトーシスが誘導される一因となっているものと推測される。

（ヘキスト核染色）
５ｎＭのｓｉＲ−ＰＴＢ１−１でＤＬＤ−１細胞を７２時間処理し、ヘキスト核染色を行って撮影した顕微鏡像（１００倍）を図８に示す。ｓｉＲ−ＰＴＢ１処理をした群（右）ではアポトーシスによる核の分断化（矢印）が認められるが、対照群（左）では核の分断化は認められない。

（ヒトがん細胞異種移植モデル）
ヒトがん細胞を移植したヌードマウスを用い、ｓｉＲ−ＰＴＢ１−１によるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖抑制活性およびＰＴＢ１の発現抑制を評価した結果を図９〜１１に示す。

図９より、対照群のヌードマウスでは、移植後経時で腫瘍体積が増加した。一方、ｓｉＲ−ＰＴＢ１を投与した群では腫瘍体積の増加がみられないばかりか、投与開始（１０日目）から腫瘍体積が減少した。２４日の飼育期間終了後、ｓｉＲ−ＰＴＢ１を投与した群では５個体中３個体において腫瘍が消失し、残りの２個体においても腫瘍サイズは対照群よりも遥かに小さかった（図１０）。従って、ｓｉＲ−ＰＴＢ１は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても高い細胞増殖抑制活性を示すことが確認された。ｍｉＲ−１２４を投与した群においても対照群と比較して腫瘍体積の減少が認められたが、腫瘍体積はｓｉＲ−ＰＴＢ１投与群の２倍ほど大きかった。

飼育期間終了後、移植部位の各種タンパク質発現を確認した結果を図１１に示す。ｓｉＲ−ＰＴＢ１は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＰＴＢ１の発現を十分に抑制することが確認された。また、ＰＴＢ１抑制に伴い、ＰＫＭ１の発現上昇およびＰＫＭ２の発現抑制も確認された。さらに、ｓｉＲ−ＰＴＢ１を投与した群ではＰＡＲＰ−１の発現が減少していることから、アポトーシスが進行していることも示された。

（ｓｉＲ−ＰＫＭ２単体の効果）
ＤＬＤ−１細胞またはＷｉＤｒ細胞をｓｉＲ−ＰＫＭ２で７２時間処理した場合の、対照群に対する生存細胞の割合を図１２に、ＰＫＭ２の発現をウェスタンブロットにて確認した結果を図１３に示す。ｓｉＲ−ＰＫＭ２処理によりＰＫＭ２の発現が抑制されることが確認された。図３と図１２との比較により、ＤＬＤ−１細胞およびＷｉＤｒ細胞において、ｓｉＲ−ＰＴＢ１の細胞増殖抑制活性は、ｓｉＲ−ＰＫＭ２よりも高いことが分かる。

ＴＨＰ１細胞またはＭＫＮ４５細胞をｓｉＲ−ＰＫＭ２で処理した場合の、対照群に対する生存細胞の割合を図１４に、ＰＫＭ２の発現をウェスタンブロットにて確認した結果を図１５に示す。ｓｉＲ−ＰＫＭ２処理によって、ＭＫＮ４５細胞においてはＰＫＭ２の発現が大幅に抑制され、ＴＨＰ１細胞でもＰＫＭ２の発現が抑制されていた。ＴＨＰ１細胞およびＭＫＮ４５細胞においても、ｓｉＲ−ＰＫＭ２処理によって細胞増殖が一定程度抑制された。図４と図１４との比較により、ＴＨＰ１細胞およびＭＫＮ４細胞において、ｓｉＲ−ＰＴＢ１の細胞増殖抑制活性は、ｓｉＲ−ＰＫＭ２よりも高いことが分かる。

（ｓｉＲ−ＰＴＢ１とｓｉＲ−ＰＫＭ２との併用効果）
ＤＬＤ−１細胞をｓｉＲ−ＰＴＢ１（５ｎＭ）、ｓｉＲ−ＰＫＭ２（５ｎＭ）、または併用（ｓｉＲ−ＰＴＢ１（５ｎＭ）およびｓｉＲ−ＰＫＭ２（５ｎＭ））で４８時間処理した場合における、対照群に対する生存細胞の割合を図１６に示す。４８時間処理でも、ｓｉＲ−ＰＴＢ１−１、ｓｉＲ−ＰＴＢ１−２またはｓｉＲ−ＰＫＭ２処理群では対照群と比較して生存細胞の割合が低下していた。驚くべきことに、ｓｉＲ−ＰＴＢ１とｓｉＲ−ＰＫＭ２とを併用することにより、各々を単独で処理した場合よりもさらに生存細胞の割合が低下していた。ｓｉＲ−ＰＴＢ１−１とｓｉＲ−ＰＫＭ２とを併用した群の生存細胞の割合と、ｓｉＲ−ＰＴＢ１−１単独で処理した群の生存細胞の割合には統計的に有意な差があり、併用効果が確認された。

〔配列番号：９〕
ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖である。
〔配列番号：１０〕
ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖である。
〔配列番号：１１〕
ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖である。
〔配列番号：１２〕
ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖である。
〔配列番号：１５〕
ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖である。
〔配列番号：１６〕
ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖である。
〔配列番号：１８〕
陰性対照ｍｉＲＮＡである。

Claims (5)

1. ＰＴＢ１を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含む、抗がん剤。
2. 前記二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列における連続する１６〜２７塩基に相補的な配列を含む、請求項１に記載の抗がん剤。
3. 前記二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖が配列番号１１または配列番号１２で示される塩基配列からなる、請求項１または２に記載の抗がん剤。
4. 前記がんが、大腸がん、胃がん、食道がん、乳がん、および白血病からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗がん剤。
5. ＰＫＭ２を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたは該二本鎖ｓｉＲＮＡの発現ベクターをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗がん剤。