JP2016013124A - エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド断片、及びそれらの使用 - Google Patents

エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド断片、及びそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットがオルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のものである、ポリペプチド断片又はその変異体の提供。
【解決手段】ＰＡサブユニットのアミノ末端断片は、特定のアミノ末端断片又はその断片の全長と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつエンドヌクレアーゼ活性を保持する。（ｉ）Ｘ線結晶学を使用する上記ポリペプチド断片の構造決定に好適なポリペプチド断片の結晶、並びに（ｉｉ）上記ポリペプチドの構造座標を使用して該ポリペプチド断片内のヌクレオチド鎖切断活性部位を変調させるか、好ましくは阻害する化合物のスクリーニング、及び、化合物を同定する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、エンドヌクレアーゼ活性（endonuclease activity）を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片又はその変異体であって、上記ＰＡサブユニットがオルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のものである、ポリペプチド断片又はその変異体に関する。本発明は、（ｉ）Ｘ線結晶学を使用する上記ポリペプチド断片の構造決定に好適なポリペプチド断片の結晶、並びに（ｉｉ）上記ポリペプチドの構造座標を使用して該ポリペプチド断片内のヌクレオチド鎖切断活性部位を変調させ、好ましくは阻害する化合物をスクリーニング及び設計する演算方法にも関する。加えて、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を有するＰＡポリペプチド断片と結合し、好ましくは上記ヌクレオチド鎖切断活性（endonucleolytic activity）を阻害する化合物を、好ましくはハイスループット設定において同定する方法に関する。本発明は、オルトミクソウイルス科のウイルスにより引き起こされるウイルス感染に起因する疾患状態の治療のための化合物及び該同定された化合物を含む薬学的組成物にも関する。
インフルエンザは、世界中での高い罹患率及び死亡率に関与し、多くの人により、ヒトにとって最も重大なウイルスの脅威に属すると考えられている。例年、インフルエンザの流行が地球を襲い、時折新しい毒性株が、破壊力の大きな世界的大流行を引き起こす。現在のところインフルエンザウイルスの流行を制御する主要な手段はワクチン接種である。しかし、ワクチン接種の効果を回避する突然変異インフルエンザウイルスが、迅速に発生する。新しいインフルエンザワクチンを作り出すのに約６ヶ月かかるという事実に照らすと、特に迅速に拡散する流行病に対する防御の第一線として、代替的な治療手段（すなわち抗ウイルス薬）が必要である。
抗ウイルス薬の開発のための優れた出発点は、必須ウイルスタンパク質の構造データである。したがって、インフルエンザウイルス表面抗原ノイラミニダーゼの結晶構造決定（非特許文献１）は、細胞からのウイルスの放出を防止する（しかしウイルス産生は防止しない）抗ウイルス活性を有するノイラミニダーゼ阻害剤の開発を直接もたらした。これら及びそれらの誘導体は、その後抗インフルエンザ薬ザナミビル（Glaxo）及びオセルタミビル（Roche）へと発展し、これらは現在、最終的な流行病に対する防御の第一線として多くの国により貯蔵されている。しかし、これらの薬物は、臨床疾患の期間の低減をもたらすのみである。代替的に、アマンタジン及びリマンタジン等の他の抗インフルエンザ化合物は、ウイルス膜において、イオンチャネルタンパク質（すなわちＭ２タンパク質）を標的とし、細胞内のウイルスの脱殻（uncoating）を妨げる。しかしそれらは、その副作用と、耐性ウイルス突然変異体の迅速な発生とのために広範には使用されていない（非特許文献２）。加えて、より非特異的なウイルス剤（リバビリン等）が、インフルエンザ感染症の治療のために有効であることが示されている（非特許文献３）。しかし、リバビリンは、おそらく重度の副作用のために、数カ国でしか承認されていない（非特許文献４）。明らかに、好ましくは様々な標的を対象とする、新しい抗ウイルス化合物が必要とされている。
インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス及びイサウイルス並びにトゴトウイルスは、ハンタウイルス、ナイロウイルス、オルトブニヤウイルス、フレボウイルス及びトスポウイルスを含むブニヤウイルス（Bunyaviridae）科と同様にマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科に属する。それらのゲノムは分節され、（ｉ）一本鎖ビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のウイルスｍＲＮＡへの初期コピーと、（ｉｉ）ｖＲＮＡ複製とを実施するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むリボ核タンパク質粒子となる。ウイルスｍＲＮＡの生成のために、ポリメラーゼは、いわゆる「キャップ・スナッチング」機構を使用する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ポリメラーゼは、ＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質）、ＰＢ２及びＰＡの３つのサブユニットから構成される。キャップ・スナッチング機構に関して、ウイルスポリメラーゼはそのＰＢ２サブユニットを介して、ポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性によりヌクレオチド１０〜１３で切断される細胞ｍＲＮＡ分子の５’ＲＮＡキャップと結合する。キャップされたＲＮＡ断片は、ＰＢ１サブユニットにおけるヌクレオチジルトランスフェラーゼ中心によるウイルスｍＲＮＡの合成のためのプライマーとして機能する（非特許文献９）。最終的に、ウイルスｍＲＮＡは、鋳型の５’末端のオリゴＵモチーフにおけるポリメラーゼのスタッタリング（stuttering）により、３’末端をポリアデニル化される。近年の研究により、キャップ結合に関与するＰＢ２の構造ドメインが正確に規定された（非特許文献１０、非特許文献１１）。ポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性は現在まで、ＰＢ１サブユニットに存在すると考えられていた（非特許文献９、上記）。
ポリメラーゼ複合体は、ウイルスｍＲＮＡの合成とウイルス複製とに必須であり、また宿主細胞タンパク質中に見出されるものと顕著に異なる可能性がある幾つかの機能的活性部位を含有するので、適当な抗ウイルス剤の標的であると考えられる（非特許文献２、上記）。したがって例えば、ＰＢ１内のＰＡ結合ドメインと類似するアミノ酸数２５のペプチドにより、ポリメラーゼサブユニットの集合化を妨げることが試みられている（非特許文献１２）。また、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシン等のヌクレオシド類似体によりウイルス転写を妨げることが試みられており（非特許文献１３）、置換ピラジン化合物であるＴ−７０５が、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤として機能し得ることが示されている（非特許文献４、上記）。さらに、ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性が標的とされており、一連の４−置換２，４−ジオキソブタン酸化合物が、インフルエンザウイルスにおけるこの活性の選択的阻害剤として同定されている（非特許文献１４）。加えて、真菌の種であるデリツチア・コンファータスポラ（Delitschia confertaspora）の抽出物中で同定されたフルチミド（flutimide）（置換２，６−ジケトピペラジン）が、インフルエンザウイルスのエンドヌクレアーゼを阻害することが示されている（非特許文献１５）。しかしながら、ウイルスポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性に対する化合物の阻害作用は、現在まで、ポリメラーゼの三量体複合体全体との関連でしか研究されていない。
ポリメラーゼのＰＡサブユニットは、キャップ結合及びエンドヌクレアーゼ活性の両方、ｖＲＮＡ複製、並びに議論の余地があるもののプロテアーゼ活性に関与するが、機能的には特徴付けが最も不十分である。ＰＡ（インフルエンザＡウイルスポリメラーゼ中における７１６残基）は、トリプシン処理により残基２１３で分離可能である。近年決定されたＰＢ１のＮ末端ペプチドと結合したＰＡのＣ末端側の３分の２の結晶構造により、ＰＡサブユニットの大部分（しかしその機能は依然として不明なままである）、及び重要なサブユニット間相互作用のうちの１つの正確な性質の両方に関する最初の構造上の洞察がもたらされた（非特許文献１６、非特許文献１７）。ＰＡアミノ末端ドメインにおける保存残基の系統的突然変異により、ポリメラーゼ複合体のタンパク質の安定性、プロモーター結合、キャップ結合、及びエンドヌクレアーゼ活性に重要な残基が特定された（非特許文献１８）。無傷の（intact）ウイルスリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）との関連内におけるエンドヌクレアーゼの酵素学が広範に研究されている。
しかしながら現在まで、どのドメインが上記活性に関与するかが知られていなかったため、ヌクレオチド鎖切断活性を有するポリペプチド断片との関連でＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を研究することはできなかった。本発明者らは驚くべきことに、この分野における一般的な見解とは反対に、ヌクレオチド鎖切断活性がＰＡサブユニットのアミノ末端領域内にのみ存在することを見出した。本発明者らは、Ｘ線結晶学により上記ドメインを構造的に特徴付けることに成功し、アミノ末端ＰＡポリペプチド断片内におけるヌクレオチド鎖切断活性中心を特定した。
したがって、本発明は、ポリペプチド断片との関連でウイルスポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性を研究する独特な好機を提供し、これにより、ウイルスポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を標的とする新たな抗ウイルス化合物の開発、及び過去に同定された化合物の最適化が大幅に簡略化される。ウイルスポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡポリペプチド断片を組換え技術により作製する本発明者らの驚くべき成果により、簡単な発現系により容易に取得可能な材料を使用してウイルスポリメラーゼ上の機能的部位の阻害剤に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイスループットスクリーニングを行うことが可能となる。さらに、ヌクレオチド鎖切断ＰＡポリペプチド断片、及びその内部の酵素活性中心の構造データにより、狙いを定めた阻害剤の設計、及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの有望な治療用化合物に関するスクリーニングが可能となる。
von Itzstein et al., 1993, Nature 363:418-423 Magden et al., 2005, Appl. Microbiol.Biotechnol. 66:612-621 Eriksson et al., 1977, Antimicrob. Agents Chemother. 11:946-951 Furuta et al., 2005, Antimicrob. Agents Chemother. 49:981-986 Plotch et al., 1981, Cell 23:847-858 Kukkonen et al., 2005, Arch. Virol.150:533-556 Leahy et al., 1997, J. Virol. 71:8347-8351 Noah and Krug, 2005, Adv. Virus Res. 65:121-145 Li et al., 2001, EMBO J. 20:2078-2086 Fechter et al., 2003, J. Biol. Chem.278:20381-20388 Guilligay et al., 2008 Nat. Struct. Mol. Biol. 15:500-506 Ghanem et al., 2007, J. Virol. 81:7801-7804 Tisdale et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:2454-2458 Tomassini et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38:2827-2837 Tomassini et al., 1996, Antimicrob. Agents Chemother. 40:1189-1193 He et al., 2008, Nature 454:1123-1126 Obayashi et al., 2008, Nature 454:1127-1131 Hara et al., 2006, J. Virol. 80:7789-7798
（ｉ）Ｘ線結晶学によるウイルスポリメラーゼのＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断アミノ末端ドメインの高分解能構造データ、（ｉｉ）好ましくはハイスループット設定において、好ましくはＰＡサブユニット内のヌクレオチド鎖切断活性部位をブロックすることにより、ウイルスポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくは阻害することができる化合物を同定する演算方法、及びｉｎ ｖｉｔｒｏの方法、並びに（ｉｉｉ）ウイルスｍＲＮＡの合成にキャップ・スナッチング機構を使用するウイルスにより引き起こされる感染性疾患の治療のための、このような化合物を含む薬理学的組成物を提供することが、本発明の目的である。
第１の態様では、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、上記ＰＡサブユニットがオルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のものである、ポリペプチド断片に関する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明による単離ポリペプチド断片をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチド又は本発明による組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
さらなる一態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）表２に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標により規定される活性部位のコンピュータモデルを構築する工程、
（ｂ）有望な変調させる化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させて上記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）上記化合物の新規リガンド設計
からなる群から選択される方法により有望な変調させる化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を利用する工程であって、該活性部位における上記化合物のエネルギーを最小化した立体配置を提供するために、上記化合物と上記活性部位とのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、利用する工程、並びに
（ｄ）上記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、上記化合物と該活性部位モデルとの間の会合を定量化し、それにより上記活性部位と会合する上記化合物の能力を評価する、評価する工程
を含む、方法に関する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明による方法により同定可能な化合物であって、上記化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくは阻害することができる、化合物に関する。
さらなる一態様では、本発明は、ＰＡサブユニット又はそのポリペプチド変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、（ｉ）本発明によるポリペプチド断片又は本発明による組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程、及び（ｉｉ）上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる上記試験化合物の能力を分析する工程を含む、方法に関する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明によるｉｎ ｖｉｔｒｏの方法により製造可能な薬学的組成物に関する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明によるｉｎ ｖｉｔｒｏの方法により同定可能な化合物であって、上記化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくは阻害することができる、化合物に関する。
さらなる一態様では、本発明は、ＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位を対象とする抗体に関する。
さらなる一態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、本発明による化合物、本発明による薬学的組成物、又は本発明による抗体の使用に関する。
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒを使用するＰＡ−Ｎｔｅｒの構造の熱安定性のアッセイを示す図である。種々の金属イオンを用いて熱シフトアッセイを行った。明確化のために、金属イオンの非存在下で得られた結果（黒色の実線）、又は１ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下で得られた結果（破線）のみを示す。矢印は見かけの融解温度Ｔｍを示す。図中縦軸は蛍光強度、横軸は温度、no metal:金属なしを意味する ＰＡ−Ｎｔｅｒの熱安定性に対する種々の金属イオンの効果を示す図である。種々の金属イオンを用いるｐＨ８．０での熱シフトアッセイから抽出された種々の融点（Ｔｍ）の要約。ｐＨ７．０でのタンパク質の安定性に対するＣｏＣｌ２の効果を調査したが、金属によるクエンチング（quenching）により解釈不可能であった。図中、Type of metal:金属の種類、No metal:金属なしを意味する。 遠紫外ＣＤスペクトルにより観察されたＰＡ−Ｎｔｅｒの構造に対するマンガンの効果を示す図である。１ｍＭ ＭｎＣｌ２の非存在下（実線）又は存在下（破線）でＰＡ−Ｎｔｅｒの二次構造含有量（content）をモニタリングした。図中、縦軸は楕円率、横軸は波長、No metal:金属なしを意味する。 ２，４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（ＤＰＢＡ）を用いる熱安定性のアッセイを示す図である。種々の濃度のＤＰＢＡを用いる熱シフトアッセイ。ＤＰＢＡは、ＭｎＣｌ２の存在下でＰＡ−Ｎｔｅｒをさらに安定化する。図中、縦軸は蛍光強度、横軸は温度を意味する。 時系列のＰＡ−Ｎｔｅｒのエンドヌクレアーゼ活性を示す図である。１０μＭ 精製パンハンドルＲＮＡ（ｐｈ−ＲＮＡ）を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２を加えた１３μＭ ＰＡ−Ｎｔｅｒと共にインキュベートした。５分後、１０分後、２０分後、４０分後及び８０分後（それぞれレーン４〜レーン８）に２０ｍＭ ＥＧＴＡを添加することにより、３７℃でのインキュベーションを停止した。対照として、ｐｈ−ＲＮＡを、ＰＡ−Ｎｔｅｒのみ（レーン１）、ＭｎＣｌ２のみ（レーン２）、又は２０ｍＭ ＥＧＴＡを加えたＰＡ−Ｎｔｅｒ及びＭｎＣｌ２と共に３７℃で８０分間インキュベートした。反応生成物を、８％ アクリルアミド／８Ｍ 尿素ゲル上に装荷し、メチレンブルーで染色した。図中、min:分を意味する。 ＰＡ−Ｎｔｅｒエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性に対する二価の陽イオンの効果を示す図である。上側のパネル（Ａ）では、ＰＡ−Ｎｔｅｒを加えた精製ｐｈ−ＲＮＡを、β−メルカプトエタノール及び１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２又はＣｏＣｌ２の存在下でｐＨ８でインキュベートした。下側のパネル（Ｂ）では、ｐｈ−ＲＮＡ及びＰＡ−Ｎｔｅｒを、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮｉＣｌ２又はＣｏＣｌ２と共にｐＨ７でインキュベートした。３０分後、２０ｍＭ ＥＧＴＡを添加することにより反応を停止した。表示したように塩又はＰＡ−Ｎｔｅｒを単独で使用して対照操作を行った。反応生成物を、８％又は１５％（下側のパネルに関して）アクリルアミド／８Ｍ 尿素上に装荷し、メチレンブルーで染色した。ｐＨ７ではＣｏＣｌ２がＭｎＣｌ２より強くエンドヌクレアーゼを刺激したことに留意されたい。ｐＨ８ではＣｏＣｌ２は沈殿し、したがってエンドヌクレアーゼ活性を活性化しない。図中、min:分、mercaptoethanol:メルカプトエタノールを意味する。 種々のＲＮＡ基質に対するＰＡ−Ｎｔｅｒのエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性を示す図である。ＳＲＰ Ａｌｕ−ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＵリッチＲＮＡ、ｐｈ−ＲＮＡ、又は短鎖ｐｈ−ＲＮＡを、１ｍＭ ＭｎＣｌ２を加えたＰＡ−Ｎｔｅｒと共に（レーン２、レーン４、レーン６、レーン８及びレーン１０）、又はＰＡ−Ｎｔｅｒの非存在下で（レーン１、レーン３、レーン５、レーン７及びレーン９）インキュベートした。消化を３７℃で行った。４０分後、２０ｍＭ ＥＧＴＡを添加することにより反応を停止した。反応生成物を、１５％ アクリルアミド／８Ｍ 尿素ゲル上に装荷し、メチレンブルーで染色した。図中、U-rich RNAはＵリッチＲＮＡ、short-ph-RNAは短鎖ｐｈ−ＲＮＡ、min:分を意味する。 一本鎖ＤＮＡに対するＰＡ−Ｎｔｅｒのエンドヌクレアーゼ活性を示す図である。一本鎖ＤＮＡプラスミドＭ１３ｍｐ１８（１００ｎｇ／μｌ）（Fermentas）を、ＭｎＣｌ２を加えたＰＡ−Ｎｔｅｒの存在下で３７℃で６０分間インキュベートした（レーン４）。２０ｍＭ ＥＧＴＡを添加することにより反応を停止した。対照として、Ｍ１３ｍｐ１８を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２のみ（レーン２）、又はＭｎＣｌ２及び２０ｍＭ ＥＧＴＡを加えたＰＡ−Ｎｔｅｒ（レーン３）と共にインキュベートした。反応生成物を、０．８％ アガロースゲル上に装荷し、エチジウムブロマイドで染色した。図中、min:分を意味する。 ２，４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（ＤＰＢＡ）によるＰＡ−Ｎｔｅｒのエンドヌクレアーゼ活性の阻害を示す図である。ＰＡ−Ｎｔｅｒによるｐｈ−ＲＮＡ（Ａ）又はＭ１３ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡ（Ｂ）の切断を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２及び漸増濃度のＤＰＢＡ（０μＭ、６．５μＭ、１３μＭ、２０μＭ、２６μＭ、４０μＭ、６５μＭ、１３０μＭ及び１０００μＭ）の存在下で、３７℃で４０分の間試験した。対照として、ｐｈ−ＲＮＡ又はｓｓＤＮＡを、１ｍＭ ＭｎＣｌ２のみと共にインキュベートした（レーン１）。反応生成物を、８％ アクリルアミド／８Ｍ 尿素上に装荷しメチレンブルーで染色した（Ａ）、又は０．８％ アガロースゲル上に装荷しエチジウムブロマイドで染色した（Ｂ）。図中、min:分を意味する。 ＰＡ−Ｎｔｅｒの三次元構造を示す図である。αヘリックス（中位の灰色）及びβ鎖（薄い灰色）を有するインフルエンザＰＡ−Ｎｔｅｒの構造のリボン図。主要な活性部位の残基を、棒表示で示す。 代表的なインフルエンザ株のＰＡサブユニット：Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５（ヒトＨ３Ｎ２；配列番号２のアミノ酸残基１〜２０９）、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｖｉｅｔｍａｎ／１／２００７（トリＨ５Ｎ１；配列番号８のアミノ酸残基１〜２０９）、Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／１９６６（配列番号４のアミノ酸残基１〜２０６）及びＣ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／１／１９６６（配列番号６のアミノ酸残基１〜１８９）由来のポリペプチド断片の配列アライメントを示す図である。Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５の二次構造を配列アライメントの上に示す。箱で囲んだ配列は、４つの配列間の配列類似性を示す。背景がベタ塗りの黒色である残基は、４つの配列間で同一である。三角形は、主要な活性部位の残基を示す。 図１１に示す配列アライメントに基づく残基保存に従って、灰色（保存されていない）、灰色（同等の残基）及び黒色（１００％保存されている）の影を付したＰＡ−Ｎｔｅｒを表示する図である。 ＰＡ−Ｎｔｅｒの静電的表面ポテンシャルを示す図である。方向（orientation）は図１２におけるものと同様である。金属イオンの非存在下におけるＰＡ−Ｎｔｅｒの静電的表面ポテンシャル。ポテンシャルのスケールは、−１０．０ｋＴ／ｅ（中位の灰色、酸性残基Ａｓｐ（Ｄ）及びＧｌｕ（Ｅ））から３．０ｋＴ／ｅ（濃い灰色、塩基性残基Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ））までの範囲である。 ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫスーパーファミリーの他のヌクレアーゼとＰＡ−Ｎｔｅｒの比較を示す図である。保存されるコア活性部位の構造モチーフを重ね合わせた後における、ＰＡ−Ｎｔｅｒ（左、Ａ）、ピロコッカス・フリオスス（P. furiosus）のホリデイジャンクションリゾルバーゼＨｊｃ（ＰＤＢエントリー １ＧＥＦ）（中央、Ｂ）、及び大腸菌ＥｃｏＲＶ制限酵素（ＰＤＢエントリー １ＳＴＸ、ＤＮＡ及びマンガンによる生成物複合体）（右、Ｃ）の比較。二乗平均平方根偏差（root mean square deviation）は、Ｈｊｃの７７個の整列させたＣα原子に関しては２．９Åであり、ＥｃｏＲＶの５５（７２）個の整列させたＣα原子に関しては２．４６（３．１）Åである。二次構造の要素は図１０におけるものと同様であり、主要な活性部位の残基を棒表示で示す。 インフルエンザＰＡ−Ｎｔｅｒ（分子Ａ）（左、Ａ）及び大腸菌ＥｃｏＲＶ制限酵素（生成物複合体）（右、Ｂ）の活性部位とのマンガンイオンの相互作用の詳細を示す図である。活性部位の要素及び残基を、それぞれ薄い（leight）灰色及び濃い灰色（左）並びに濃い灰色（右）で示す。マンガンイオン及び水分子は、それぞれ中位の灰色及び濃い灰色の球である。マンガンＫ端（波長１．８９）回折データ及びモデル相を使用して算出した３σで輪郭を付した異常差異（anomalous difference）のマップは、濃い灰色で示す。ピーク高さは、Ｍｎ１、Ｍｎ２、及びＣｙｓ４５の硫黄に関してそれぞれ１４．１σ、１０．１σ及び５．０σである。金属依存性ヌクレアーゼにおいては、金属イオン及び酸性側鎖の正確な立体配置は、反応座標にわずかに依存することに留意されたい。 インフルエンザＰＡ−Ｎｔｅｒ及び大腸菌ＥｃｏＲＶ制限酵素の活性部位の重ね合わせを示す図である。ＰＡ−Ｎｔｅｒの二次構造要素及び活性部位の残基（「ＰＡ」を付して示す）を薄い灰色で、マンガンイオンを中位の（medim）灰色で示す。ＥｃｏＲＶ（ＰＤＢエントリー １ＳＴＸ）（Horton and Perona, 2004, Biochemistry 43:6841-6857）の同等の要素を重ね合わせており、タンパク質に関しては濃い灰色（「Ｅ」を付して示す）で、マンガンイオンに関しては濃い灰色で示す。２つのタンパク質の主要な活性部位の金属結合及び触媒性官能基が整列している。 ＥｃｏＲＶ生成物複合体（Ｂ）と隣接する分子由来のＧｌｕ６６を伴うＰＡ−Ｎｔｅｒ（Ａ）との比較を示す図である。ＰＡ−Ｎｔｅｒ（分子Ａ）の活性部位の要素及び残基を薄い灰色で、マンガンイオンを中位の灰色で、隣接分子のＧｌｕ６６含有ループを薄い灰色で示す。同じ方向で２つの構造を重ね合わせた後、大腸菌ＥｃｏＲＶ制限酵素（ＰＤＢエントリー １ＳＴＸ）（Horton and Perona、上記）を濃い灰色で、ＤＮＡ塩基を薄い灰色で、マンガンイオンを中位の灰色で示す。Ｇｌｕ５９のカルボキシル官能基（function）はｄＡ７の切断されやすいリン酸に重ね合わせられ、ＰＡ−Ｎｔｅｒの活性部位に見出される整列した（well-ordered）硫酸イオンはｄＴ８のリン酸部分の位置を占有する。
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中で説明する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
以下では、本発明の要素を記載する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、任意の様式及び任意の数でこれらを組み合わせて、さらなる実施形態を作り出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態を、明示的に記載される実施形態にのみ本発明を限定するものと解釈すべきではない。この記載を、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持及び包含するものと理解すべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の置換及び組合せが、文脈上他に示されぬ限り、本出願の記載により開示されるものと考えるべきである。例えば、好ましい一実施形態では本発明のポリペプチド断片が配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０９に対応し、別の好ましい実施形態では本発明によるＰＡポリペプチド断片を、好ましくはＴＥＶプロテアーゼを使用して、好ましくはＰＡポリペプチド断片から切断可能であるペプチドタグによりタグ付けすることができる場合、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０９に対応するポリペプチド断片をＴＥＶプロテアーゼを使用してＰＡポリペプチドから切断可能であるペプチドタグによりタグ付けすることは、本発明の好ましい一実施形態である。
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel and H. Koelbl, Eds.,Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載されているように規定される。
本発明を実施するために、特に明示のない限り、当該技術分野の文献（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J.Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1989を参照されたい）において説明される、従来の化学、生化学の方法及び組換えＤＮＡ法を利用する。
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容（content）が明らかに他の指示を与えるものでない限り、複数の指示対象を含む。
複数の文書が、本明細書の文章を通じて引用される。本明細書中で引用される文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくこのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
定義
「ポリペプチド断片」という用語は、単一のアミノ酸鎖から構成されるタンパク質の一部分を表す。「タンパク質」という用語は、二次構造及び三次構造を回復するポリペプチド断片を含み、複数のアミノ酸鎖、すなわち複数のサブユニットから構成され、四次（quartenary）構造を形成するタンパク質をさらに表す。「ペプチド」という用語は、アミノ酸数が最大５０であり二次構造又は三次構造を必ずしもとらない短いアミノ酸鎖を表す。「ペプトイド」は、Ｎ−置換グリシンのオリゴマー集合化から得られるペプチド模倣物質である。
２つ以上のポリペプチドにおける残基は、その残基がポリペプチド構造における類似の位置を占有する場合、互いに「対応する」と言う。当該技術分野では既知であるように、２つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列又は構造的類似性に基づきポリペプチド配列を整列させることにより確定することができる。このようなアライメントツールは当業者に既知であり、例えば、ワールドワイドウェブ、例えば標準的な設定（好ましくはＡｌｉｇｎに関してはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）において、得ることができる。当業者は、満足なアライメントを生成するためにいずれかの配列にギャップを導入することが必要な場合があることを理解する。例えば、インフルエンザＡウイルスＰＡサブユニットにおける残基１〜１９６は、インフルエンザＢウイルスＰＡサブユニットにおける残基１〜１９５、及びインフルエンザＣウイルスＰＡサブユニットにおける残基１〜１７８に、それぞれ対応する。２つ以上のＰＡサブユニットにおける残基が最良の配列アライメントにおいて整列する場合、それらの残基が「対応する」と言う。２つのポリペプチドの間の「最良の配列アライメント」は、整列する同一残基の数が最大となるアライメントと定義される。２つの整列させた配列の間の配列類似性、好ましくは配列同一性が、１０個、２０個又は３０個のアミノ酸の長さにわたり３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満に低下した場合には、「最良の配列アライメントの領域」は途切れ、それにより類似性スコアの確定のための比較配列の長さの境界及び範囲（metes and bounds）が確定する。インフルエンザＡウイルス（アミノ酸１〜２０９）、インフルエンザＢウイルス（アミノ酸１〜２０６）及びインフルエンザＣウイルス（アミノ酸１〜１８９）のＰＡサブユニットのアミノ酸配列に関する最良の配列アライメントの一部分を、図１１に示す。
例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列（インフルエンザＡウイルスのＰＡサブユニット）のアミノ酸Ｔｙｒ２４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９、Ｉｌｅ１２０、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３、Ｌｙｓ１３４及びＬｙｓ１３７は、配列番号４に示すアミノ酸配列（インフルエンザＢウイルスのＰＡサブユニット）のアミノ酸Ｐｈｅ２４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８１、Ａｒｇ８５、Ｌｅｕ１０７、Ａｓｐ１０９、Ｇｌｕ１２０、Ｖａｌ１２１、Ｔｙｒ１３１、Ｌｙｓ１３４、Ｌｙｓ１３５及びＬｙｓ１３８、並びに配列番号６に示すアミノ酸配列（インフルエンザＣウイルスのＰＡサブユニット）のアミノ酸Ａｌａ２４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ６５、Ａｒｇ６９、Ｌｅｕ９１、Ａｓｐ９３、Ｇｌｕ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｔｙｒ１１５、Ｓｅｒ１１８、Ｌｙｓ１１９及びＬｙｓ１２２にそれぞれ対応する。
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を有する、インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット断片を含む。「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ」という用語は、好ましくは配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されたアミノ酸配列を有する、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス又はインフルエンザＣウイルスのＰＡサブユニットを表すことが好ましい。「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ変異体」は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示すアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。天然のＰＡ変異体を配列番号２、配列番号４又は配列番号６によるＰＡサブユニットと整列させる場合、そのアライメントが２つのタンパク質の全長にわたること、したがってアライメントスコアがこれに基づき確定されることが好ましい。しかし、天然の変異体が、例えばＮ末端又はＣ末端の融合を通じて、Ｃ末端／Ｎ末端の又は内部の欠失又は付加を含み得ることも考え得る。この場合には、類似性及び同一性のそれぞれの評価のために、最も良く整列した領域のみが使用される。好ましくは、また以下でより詳細に示すように、これらの変異体由来の断片は、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性に必要とされる領域内において、それぞれ表示した類似性及び同一性を示す。したがって、配列番号２、配列番号４又は配列番号６とＰＡ変異体との間の任意のアライメントが、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性部位を含むはずである。したがって、配列番号２、配列番号４又は配列番号６との上記の配列類似性及び同一性のそれぞれが、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性部位を含む、少なくとも１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１６５個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、３００個又はそれ以上のアミノ酸の長さにわたり生じる。配列番号２、配列番号４又は配列番号６による配列の多数の天然のＰＡ変異体が既知であり、文献で説明されている。これらのＰＡ変異体の全てが本発明のポリペプチド断片に含まれ、その基礎であり得る。配列番号２が参照配列として使用される場合には、インフルエンザＡウイルスＰＡサブユニットに関する好ましい例は、位置Ｐｈｅ４、Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２８、Ｇｌｕ３１、Ｖａｌ４４、Ｔｙｒ４８、Ａｓｎ５５、Ｇｌｎ５７、Ｇｌｙ５８、Ｖａｌ６２、Ｌｅｕ６５、Ａｓｐ６６、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｙ９９、Ａｌａ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｉｌｅ１１８、Ｉｌｅ１２９、Ａｓｎ１４２、Ｉｌｅ１４５、Ｇｌｕ１５４、Ｌｙｓ１５８、Ａｓｐ１６４、Ｉｌｅ１７１、Ｌｙｓ１７２、Ｉｌｅ１７８、Ａｓｎ１８４及び／又はＡｒｇ２０４の１つ又は複数での突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記変異体は以下の突然変異：Ｐｈｅ４Ｌｅｕ、Ａｌａ２０Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２８Ｐｒｏ、Ｇｌｕ３１Ｌｙｓ、Ｖａｌ４４Ａｌａ、Ｔｙｒ４８Ｈｉｓ、Ａｓｎ５５Ａｓｐ、Ｇｌｎ５７Ａｒｇ、Ｇｌｙ５８Ｓｅｒ、Ｖａｌ６２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ６５Ｓｅｒ、Ａｓｐ６６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ８５Ａｌａ、Ｇｌｙ９９Ｌｙｓ、Ａｌａ１００Ｖａｌ、Ｇｌｕ１０１Ａｓｐ、Ｉｌｅ１１８Ｔｈｒ、Ｉｌｅ１２９Ｔｈｒ、Ａｓｎ１４２Ｌｙｓ、Ｉｌｅ１４５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１５４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１５８Ｇｌｎ、Ａｓｐ１６４Ｖａｌ、Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１７２Ａｒｇ、Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ、Ａｓｎ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８４Ａｒｇ及び／又はＡｒｇ２０４Ｌｙｓの１つ又は複数を含む。配列番号４が参照配列として使用される場合には、インフルエンザＢウイルスＰＡサブユニットの好ましい変異体は、以下のアミノ酸位置：Ｔｈｒ６０、Ａｓｎ８６、Ａｒｇ１０５、Ａｓｎ１５８、Ｈｉｓ１６０及び／又はＩｌｅ１９６の１つ又は複数での突然変異を含む。好ましい一実施形態では、インフルエンザＢウイルスＰＡサブユニット変異体は以下の突然変異：Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ａｓｎ８６Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０５Ｌｙｓ、Ａｓｎ１５８Ａｓｐ、Ｈｉｓ１６０Ｓｅｒ及び／又はＩｌｅ１９６Ｖａｌの１つ又は複数を含む。配列番号６が参照配列として使用される場合には、インフルエンザＣウイルスＰＡサブユニットの好ましい変異体は、以下のアミノ酸位置：Ｔｈｒ１１、Ｌｅｕ５３、Ｓｅｒ５８、Ｇｌｙ７０及び／又はＡｌａ１１１の１つ又は複数での突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記突然変異は、以下の通りである：Ｔｈｒ１１Ａｌａ、Ｌｅｕ５３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ５８Ａｓｎ、Ｇｌｙ７０Ａｒｇ及び／又はＡｌａ１１１Ｔｈｒ。
したがって、本発明のポリペプチド断片は、上で規定されるようなＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ又はその変異体に基づく。したがって以下の説明においては、「ポリペプチド断片（複数可）」及び「ＰＡポリペプチド断片」という用語は常に、エンドヌクレアーゼ活性を有する、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に記載されるようなＰＡタンパク質由来のこのような断片、及び上で記載されるようなそのＰＡタンパク質変異体由来の断片の両方を含む。しかし、本明細書は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ変異体に由来する、エンドヌクレアーゼ活性を有するＰＡ断片を具体的に表すために、「ＰＡポリペプチド断片変異体」又は「ＰＡ断片変異体」という用語も使用する。したがって本発明のＰＡポリペプチド断片は、好ましくは、天然のウイルスＰＡサブユニット、好ましくはインフルエンザウイルスＰＡサブユニットの配列を含むか、これから本質的になるか、又はこれからなる。しかし、ＰＡ断片変異体が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又はそれ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸置換をさらに含有し、かつ配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有することも想定される。本発明のＰＡ断片が、ＰＡ由来でない付加的なアミノ酸（例えばタグ、酵素等）を含むことがあり、このような付加的なアミノ酸はこのようなアライメントにおいては考慮されない（すなわち、アライメントスコアの算出から除外される）ことが理解される。好ましい一実施形態では、上で示したアライメントスコアは、少なくとも７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１６５個、１７０個、１８０個又は１９０個のアミノ酸の長さにわたり、断片の配列を配列番号２、配列番号４又は配列番号６（ここで配列番号２、配列番号４又は配列番号６のそれぞれの配列は、エンドヌクレアーゼ活性部位を含むことが好ましい）と整列させると得られる。
好ましい一実施形態では、ＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜１９６に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜１９６（配列番号２由来）からなり、配列番号２に示した配列のアミノ酸残基１〜１９６と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜２０９に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜２０９（配列番号２由来）からなり、かつ配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２０９と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜２１３に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜２１３（配列番号２由来）からなり、かつ配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２１３と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。好ましい実施形態では、本発明のインフルエンザＡウイルスＰＡポリペプチド断片変異体は、配列番号２と比較して以下のアミノ酸残基：Ｐｈｅ４、Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２８、Ｇｌｕ３１、Ｖａｌ４４、Ｔｙｒ４８、Ａｓｎ５５、Ｇｌｎ５７、Ｇｌｙ５８、Ｖａｌ６２、Ｌｅｕ６５、Ａｓｐ６６、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｙ９９、Ａｌａ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｉｌｅ１１８、Ｉｌｅ１２９、Ａｓｎ１４２、Ｉｌｅ１４５、Ｇｌｕ１５４、Ｌｙｓ１５８、Ａｓｐ１６４、Ｉｌｅ１７１、Ｌｙｓ１７２、Ｉｌｅ１７８、Ａｓｎ１８４及び／又はＡｒｇ２０４の１つ又は複数での突然変異等の、突然変異、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記変異体は、以下の突然変異：Ｐｈｅ４Ｌｅｕ、Ａｌａ２０Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２８Ｐｒｏ、Ｇｌｕ３１Ｌｙｓ、Ｖａｌ４４Ａｌａ、Ｔｙｒ４８Ｈｉｓ、Ａｓｎ５５Ａｓｐ、Ｇｌｎ５７Ａｒｇ、Ｇｌｙ５８Ｓｅｒ、Ｖａｌ６２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ６５Ｓｅｒ、Ａｓｐ６６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ８５Ａｌａ、Ｇｌｙ９９Ｌｙｓ、Aｌａ１００Ｖａｌ、Ｇｌｕ１０１Ａｓｐ、Ｉｌｅ１１８Ｔｈｒ、Ｉｌｅ１２９Ｔｈｒ、Ａｓｎ１４２Ｌｙｓ、Ｉｌｅ１４５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１５４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１５８Ｇｌｎ、Ａｓｐ１６４Ｖａｌ、Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１７２Ａｒｇ、Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ、Ａｓｎ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８４Ａｒｇ及び／又はＡｒｇ２０４Ｌｙｓの一つ又は複数を含む。
好ましい一実施形態では、ＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜１９５に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜１９５（配列番号４由来）からなり、かつ配列番号４に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９５と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜２０６に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜２０６（配列番号４由来）からなり、かつ配列番号４に示した配列のアミノ酸残基１〜２０６と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜２１０に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜２１０（配列番号４由来）からなり、かつ配列番号４に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２１０と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。好ましい実施形態では、本発明のインフルエンザＢウイルスＰＡポリペプチド断片変異体は、配列番号４と比較して以下のアミノ酸位置：Ｔｈｒ６０、Ａｓｎ８６、Ａｒｇ１０５、Ａｓｎ１５８、Ｈｉｓ１６０及び／又はＩｌｅ１９６の１つ又は複数での、突然変異、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましい一実施形態では、インフルエンザＢウイルスＰＡサブユニット変異体は、以下の突然変異：Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ａｓｎ８６Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０５Ｌｙｓ、Ａｓｎ１５８Ａｓｐ、Ｈｉｓ１６０Ｓｅｒ及び／又はＩｌｅ１９６Ｖａｌの１つ又は複数を含む。
好ましい一実施形態では、ＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜１７８に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜１７８（配列番号６由来）からなり、かつ配列番号６に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１７８と、断片の全長にわたり、少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列類似性を有し、より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜１８９に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜１８９（配列番号６由来）からなり、かつ配列番号６に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１８９と、断片の全長にわたり、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％の配列類似性を有し、より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＡのアミノ酸残基１〜１９３に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はアミノ酸残基１〜１９３（配列番号６由来）からなり、かつ配列番号６に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９３と、断片の全長にわたり、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％の配列類似性を有する。好ましい実施形態では、本発明のインフルエンザＣウイルスＰＡポリペプチド断片変異体は、配列番号６と比較して以下のアミノ酸残基：Ｔｈｒ１１、Ｌｅｕ５３、Ｓｅｒ５８、Ｇｌｙ７０及び／又はＡｌａ１１１の１つ又は複数における突然変異等の、突然変異、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記突然変異は、以下の通りである：Ｔｈｒ１１Ａｌａ、Ｌｅｕ５３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ５８Ａｓｎ、Ｇｌｙ７０Ａｒｇ及び／又はＡｌａ１１１Ｔｈｒの１つ又は複数を含む。
本発明との関連では、「ＰＡ−Ｎｔｅｒ」という用語は、さらなるアミノ末端リンカー、すなわちＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号１９）を有する配列番号２に示すようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２０９からなるポリペプチド断片を表す。
本発明のＰＡポリペプチド断片が上で概説したアミノ酸残基のうちの１つを含む場合、他のアミノ酸残基がインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス又はインフルエンザＣウイルスのそれぞれのＰＡタンパク質由来のものでないことが好ましい。
「配列類似性」という用語は、最良の配列アライメントの同じ位置でのアミノ酸が同一又は類似である、好ましくは同一であることを意味する。「類似のアミノ酸」は、類似の特性、例えば極性、溶解性、親水性、疎水性、電荷又はサイズを有する。類似のアミノ酸は好ましくは、ロイシン、イソロイシン及びバリン；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン；リジン、アルギニン及びヒスチジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；グリシン、アラニン及びセリン；トレオニン、アスパラギン、グルタミン及びメチオニンである。当業者は、例えばワールドワイドウェブ（例えばwww.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html）上で利用可能な、配列類似性検索ツールを十分に認識している。
本明細書中で使用する場合の「可溶性の（soluble）」という用語は、有効濃度のグアニジン又は尿素等の変性剤の非存在下における、例えば０．１４Ｍ塩化ナトリウム又はスクロースのような生理学的等張条件下、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５００μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の水性緩衝液中で１０００００×ｇでの３０分間の遠心分離後にポリペプチド断片が上清中に残存する状態を表す。その溶解性に関して試験されるタンパク質断片は、以下で示される細胞発現系の１つにおいて発現されることが好ましい。
ポリペプチドに関して「精製（purified）」という用語は、均質調製物のように絶対的に純粋であることを要求せず、むしろそのポリペプチドが自然環境中の状態よりも相対的に純度が高いことを表す。概して、精製したポリペプチドは、好ましくは機能的に顕著なレベルで、例えば少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度で、該ポリペプチドが自然状態で会合する他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の材料を実質的に有しない。「結晶化に好適な程度まで精製されている」という表現は、純度が８５％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％、より好ましくは９５％〜１００％であり、沈殿することなく３ｍｇ／ｍｌ超、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ超、より好ましくは１８ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮され得るタンパク質を表す。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技法を使用して、ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主バンドを生じる。
本発明の方法で化合物を同定する文脈において使用されるところの「会合する（associate）」という用語は、或る分子部分（moiety）（すなわち、化学的物質若しくは化合物又はその一部分（portions）若しくはその断片）とＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性部位との間の近接状態を表す。会合は、非共有的であり得る（すなわち、例えば水素結合性相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用又は疎水的相互作用により、近接位置（juxtaposition）がエネルギー的に有利である場合には）か、又は共有的であり得る。
「エンドヌクレアーゼ活性」又は「ヌクレオチド鎖切断活性」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内におけるホスホジエステル結合の切断をもたらす酵素活性を表す。本発明との関連では、ポリペプチド断片は、（好ましくはポリヌクレオチドの種類に関して選択的でない）ヌクレオチド鎖切断活性を有し、すなわち本発明によるポリペプチド断片は、好ましくはＤＮＡ及びＲＮＡに対する、好ましくは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に対するヌクレオチド鎖切断活性を示す。この関連で、「一本鎖」は、ポリヌクレオチド鎖内における好ましくは少なくとも３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドのストレッチが一本鎖である、すなわち別のヌクレオチドと塩基対を形成していないことを意味する。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性は、認識部位、すなわち特異的なヌクレオチド配列に依存せず、ポリヌクレオチド鎖の非特異的な切断をもたらす。例えば、当業者は、それぞれのポリペプチド断片の存在下又は非存在下で、例えば３７℃で或る特定の期間、例えば５分間、１０分間、２０分間、４０分間、６０分間又は８０分間、ＲＮＡ基質又はＤＮＡ基質、例えばパンハンドルＲＮＡ又は線状若しくは環状一本鎖ＤＮＡ、例えば環状Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ（MBI Fermentas）をインキュベートすることにより、本発明によるポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性に関して試験することができ、例えばゲル電気泳動により、ポリヌクレオチドの完全性（integrity）に関して試験することができる。
本明細書中で使用する場合の「ヌクレオチド」という用語は、例えばKornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed.（Freeman, San Francisco, 1992）において説明されるように、１’位でペントースと連結した、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン等のプリン、デアザプリン又はピリミジンヌクレオシド塩基からなる化合物（２’−デオキシ型及び２’−ヒドロキシル型を含む）を表し、例えばScheit, Nucleotide Analogs （John Wiley, N.Y., 1980）により概説される修飾塩基分子部分及び／又は修飾糖分子部分を有する合成ヌクレオシドをさらに含むがこれらに限定されない。
「単離（isolated）ポリヌクレオチド」という用語は、（ｉ）その自然環境から単離した、（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した、又は（ｉｉｉ）全体的に若しくは部分的に合成したポリヌクレオチドを表し、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む。この用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び組換えＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体又はその一部分からなり得る。
本明細書中で使用する場合の「組換えベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む当業者に既知の任意のベクターを含む。上記ベクターは、発現ベクター及びクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み、概して、所望のコード配列と、特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳動物）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系における操作可能に連結したコード配列の発現に必要な適当なＤＮＡ配列とを含有する。クローニングベクターは概して、或る特定の所望のＤＮＡ断片を操作及び増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要とされる機能的配列を欠くことがある。
本明細書中で使用する場合の「組換え宿主細胞」は、対象のポリペプチド断片、すなわち本発明によるＰＡポリペプチド断片又はその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を表す。このポリヌクレオチドは、（ｉ）それ自体が自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクター中に取り込まれて、又は（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡ中に組み込まれて、宿主細胞内に見出され得る。組換え細胞は、対象のポリヌクレオチドの発現のために、又は本発明のポリヌクレオチド若しくは組換えベクターの増幅のために、使用することができる。「組換え宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチド又は組換えベクターで形質転換するか、トランスフェクトするか、又は感染させた元の細胞の子孫を含む。組換え宿主細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）若しくはピキア・パストリス（Pichiapastoris）等の酵母細胞、植物細胞、ＳＦ９細胞若しくはＨｉ５細胞等の昆虫細胞、又は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨＥＬＡ細胞等である。
本明細書中で使用する場合の「結晶（crystal）」又は「結晶性（crystalline）」という用語は、平面が一定の角度で交差し（faces intersect）、構成要素である化学種の規則的な構造（内部構造等）が存在する、構造（三次元固体集合体（aggregate）等）を意味する。「結晶」という用語は、以下のいずれか１つを含み得る：実験的に調製した結晶等の固体の物理的結晶形態、結晶から誘導可能な結晶構造（二次構造要素及び／又は三次構造要素及び／又は四次構造要素を含む）、結晶構造に基づく２Ｄモデル及び／又は３Ｄモデル、その略式表示若しくはその図式表示等のその表示、又はコンピュータ用のそのデータセット。一態様では、結晶はＸ線結晶学技法において使用可能である。ここで、使用する結晶は、Ｘ線ビームへの曝露に耐えることができ、Ｘ線結晶学的構造を解明するのに必要な回折パターンデータを作製するために使用される。結晶は、T. L. Blundell and L. N. Johnson, "ProteinCrystallography", Academic Press, New York（1976）に示される結晶形態の１つにより規定されるパターンで、Ｘ線を回折することができることを特徴とし得る。
「単位格子」という用語は、基本的な平行六面体形状のブロックを表す。結晶の全体積は、このようなブロックの規則的な集合化により構築され得る。各単位格子は、その繰り返しが結晶を構築するパターンの単位の完全な表示を含む。
「空間群」という用語は、結晶の対称要素の配置を表す。空間群の指定においては、大文字は格子形を示し、他の記号は、その外観を変化させることなく非対称単位の内容（contents）に関して実施され得る対称操作を表す。
「構造座標」という用語は、軸の系との関連で１つ又は複数のアミノ酸残基の位置を規定する一組の値を表す。この用語は、分子（単数又は複数）の三次元構造を規定するデータセット（例えばデカルト座標、温度因子及び占有率）を表す。構造座標は、わずかに修正してもよいが、それでもほぼ同一の三次元構造をもたらす。構造座標の特有の一組の尺度は、得られた構造の二乗平均平方根偏差である。３Å、２Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満の二乗平均平方根偏差で互いに離れる三次元構造（特に酵素活性中心の三次元構造）をもたらす構造座標は、当業者により非常に類似のものとみなされ得る。
「二乗平均平方根偏差」という用語は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向又は目標（object）からの偏差又は変動を表現する方法である。本発明の目的のために、「二乗平均平方根偏差」は、表２によるＰＡポリペプチド断片ＰＡ−Ｎｔｅｒの構造座標により規定されるような、ＰＡポリペプチド断片又はその中の酵素活性中心の骨格からの、ＰＡポリペプチド断片の変異体又はその中の酵素活性中心の骨格の変動を規定する。
本明細書中で使用する場合の「コンピュータモデルを構築すること」という用語は、原子構造情報及び相互作用モデルに基づく分子の構造及び／又は機能の定量的分析及び定性的分析を含む。「モデリング」という用語は、従来の数値基準の分子動的モデル及びエネルギー最小化モデル、相互作用的コンピュータグラフィックモデル、改変（modified）分子力学モデル、距離幾何学法、並びに他の構造基準制約モデルを含む。
「フィッティングプログラム操作」という用語は、化学的物質を酵素活性中心、結合ポケット、分子若しくは分子複合体又はその一部分と会合させるために、化学的物質、酵素活性中心、結合ポケット、分子若しくは分子複合体又はその一部分の構造座標を利用する操作を表す。これは、化学的物質を酵素活性中心中で位置決め、回転又は平行移動し、酵素活性中心の形状及び静電的相補性を適合させることにより、達成することができる。共有的相互作用と、水素結合相互作用、静電的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用等の非共有的相互作用と、反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用及び電荷−双極子相互作用等の非相補的な静電的相互作用とが、最適化され得る。代替的に、化学的物質と酵素活性中心との結合の変形エネルギーを最小化することができる。
本明細書中で使用する場合の「試験化合物」という用語は、対象のポリペプチド断片、すなわち本発明のＰＡポリペプチド断片、又はヌクレオチド鎖切断活性（acitvity）を有するその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を阻害するその能力に関して試験される化合物、分子又は複合体を含む作用物質を表す。試験化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド、核酸、有機小分子若しくは無機小分子、化学的化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン並びにその組合せ及び誘導体を含むがこれらに限定されない任意の作用物質であり得る。「小分子」という用語は、５０ダルトン〜約２５００ダルトンの分子量、好ましくは２００ダルトン〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を表す。加えて、本発明による試験化合物は、検出可能な標識を任意に含み得る。このような標識は、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物及び生物発光化合物を含むがこれらに限定されない。このような検出可能な標識を試験化合物に結合するために、既知の方法が使用され得る。本発明の試験化合物は、天然生成物、又は混合コンビナトリアル合成の生成物を含有する抽出物等の、物質の複雑な混合物も含み得る。これらも試験することができ、標的ポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性を阻害する成分を、その後の工程で混合物から精製することができる。試験化合物は、合成又は天然の化合物のライブラリから誘導するか、又は選択することができる。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall,UK）、ChemBridge Corporation（SanDiego, CA）又はAldrich（Milwaukee,WI）から市販されている。天然化合物ライブラリは、例えば、TimTec LLC（Newark, DE）から入手可能である。代替的に、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞並びに組織抽出物の形態の天然化合物のライブラリを使用することができる。さらに、試験化合物を、個々の化合物として、又は混合物としてコンビナトリアルケミストリを使用して、合成的に製造することができる。コンビナトリアルケミストリを使用して作製した化合物のコレクションは、本明細書中でコンビナトリアルライブラリと称される。
本発明との関連では、「ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる化合物」は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの（or）ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を増大又は減少させることができ、好ましくは阻害することができる。好ましくは、このような化合物は、ウイルスＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性に対して特異的であり、他のエンドヌクレアーゼ、特に哺乳動物のエンドヌクレアーゼのヌクレオチド鎖切断活性を変調させず、好ましくは減少させない。
「ヌクレオチド鎖切断活性を減少させる化合物」という用語は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を、上記化合物の非存在下における、しかしそれ以外は同じ反応条件、すなわち緩衝剤条件、反応時間及び反応温度によるＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性と比較して５０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは１００％減少させる化合物を意味する。ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を減少させる化合物が、上記活性を阻害する、すなわち上記活性を、化合物の非存在下における活性と比較して少なくとも９５％、好ましくは１００％減少させることが最も好ましい。ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を減少させる又は阻害する化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を特異的に減少させる又は阻害するが、他のエンドヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ又は制限エンドヌクレアーゼのヌクレオチド鎖切断活性を同じ程度までは阻害せず、好ましくは全く阻害しないことが特に好ましい。例えば、当業者は、緩衝剤条件及び反応条件並びに基質濃度及びエンドヌクレアーゼ濃度を同じものとしながら、以下の試料を設定することができる：（１）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、ヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡポリペプチド断片又はその変異体、（２）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、ヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡポリペプチド断片又はその変異体、試験化合物、（３）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、参照エンドヌクレアーゼ、例えばＲＮＡｓｅ Ｈ、（４）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、参照ヌクレオチド、例えばＲＮＡｓｅ Ｈ、試験化合物。試料のインキュベーション後、当業者は、例えばゲル電気泳動により、基質を分析することができる。試料（２）において基質の切断、試料（４）において無傷の基質をもたらす試験化合物が好ましい。
「ハイスループット設定において」という用語は、対象のポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を阻害するその能力に関して試験化合物のライブラリをスクリーニングするために使用される、ハイスループットスクリーニングアッセイ、及び様々な種類の技法を表す。典型的には、ハイスループットアッセイはマルチウェル形式で行われ、無細胞アッセイ及び細胞基準アッセイを含む。
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方、すなわち、抗原又はハプテン、すなわちヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡポリペプチド断片又はそのペプチドを認識することができる任意の免疫グロブリンタンパク質又はその一部分を表す。好ましい一実施形態では、抗体はＰＡポリペプチド断片又はその変異体内における酵素（ヌクレオチド鎖切断）活性中心に結合することができる。抗体の抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法により、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断により作製され得る。幾つかの実施形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体等のキメラ抗体、ダイアボディ（diabodies）、及びポリペプチドとの特異的抗原結合をもたらすのに十分な抗体を少なくとも一部分含有するポリペプチドを含む。
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明の方法により同定可能な化合物、又は本発明の化合物の塩を表す。好適な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明の化合物の溶液を、薬学的に許容可能な酸（例えば塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸）の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩を含む。さらに、化合物が酸性分子部分を保有する場合には、その好適な薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩）；及び好適な有機リガンド（例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、アルキルスルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対陰イオンを使用して形成した、アンモニウム陽イオン、四級アンモニウム陽イオン及びアミン陽イオン）で形成される塩を含み得る。薬学的に許容可能な塩の例示的な例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カンファー酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩（camphorsulfonate）、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イソチオン酸塩（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むがこれらに限定されない（例えば、S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.66:1-19（1977）を参照されたい）。
本明細書中で使用される場合の「添加物」という用語は、例えば担体、結合剤、滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝液、香料又は着色料等の、活性成分ではない、薬学的配合物中の全ての物質を示すことが意図される。
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター等を含む。
詳細な説明
本発明は、インフルエンザウイルスポリメラーゼのＰＡサブユニットに関して特有の役割を初めて確立し、エンドヌクレアーゼ活性部位がＰＢ１サブユニット内に位置するという定説に反論するものである。この活性は三量体複合体においてのみ検出可能であると考えられていたが、本発明者らは驚くべきことに、ＰＡサブユニットのＮ末端由来の独立的に折り畳まれた小ドメインが三量体複合体に関して報告されたエンドヌクレアーゼの機能的特性を示すことを見出した。さらに本発明者らは、このＰＡポリペプチド断片は組換え手段により容易に作製することができ、したがってヌクレオチド鎖切断活性及び（and and）その変調に関するｉｎ ｖｉｔｒｏの研究に、並びに特に活性部位における構造情報を得るための結晶化に好適であることを見出した。
エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、上記ＰＡサブユニットがオルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のものである、ポリペプチド断片を提供することは、本発明の一態様である。好ましくは、ポリペプチド断片は水溶液中に可溶性である。本発明のポリペプチド断片の最小の長さは、ポリヌクレオチド鎖、例えばパンハンドルＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを切断するその能力により確定される、すなわち該ポリペプチドの最小の長さは、そのヌクレオチド鎖切断活性により確定される。好ましくはエンドヌクレアーゼ活性はポリヌクレオチドの種類に依存せず、したがってＤＮＡ及びＲＮＡに対して、好ましくは一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡに対して発揮され得る。好ましくは、エンドヌクレアーゼ活性は、基質となるポリヌクレオチド内の特定の認識部位に依存しない。
好ましい一実施形態では、ポリペプチド断片は結晶化に好適である、すなわち好ましくはポリペプチド断片は結晶化可能である。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片から取得可能な結晶は、Ｘ線結晶学を使用するポリペプチド断片の構造決定に好適である。好ましくは上記結晶は、２５ミクロンの立方体よりも大きく、好ましくは単色Ｘ線に対する曝露により収集される好ましくは３．５Åの又はより良好な分解能における８５％超の回折データ完全性（completeness）が得られるほどに放射線に対して十分に安定である。
一実施形態では、ポリペプチド断片は、（ｉ）１０ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜２Ｍ、より好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度のｐＨ３〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９の緩衝剤系、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌにおいて５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、例えば５ｍｇ／ｍｌ、５．５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、８．５ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、９．５ｍｇ／ｍｌ又は１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するタンパク質水溶液、すなわち結晶化溶液、及び（ｉｉ）１つ又は複数の化合物、例えばギ酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン又はエチレングリコールを含む沈殿剤／リザーバ溶液を使用して結晶化可能である。任意に、タンパク質溶液は、１つ又は複数の塩、例えば一価の塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ若しくはＬｉＣｌ、好ましくはＮａＣｌを１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度で、及び／又は二価の塩、例えばＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２若しくはＣｏＣｌ２、好ましくはＭｎＣｌ２を０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の濃度で、含有していてもよい。好ましくは、沈殿剤／リザーバ溶液は、Ｌｉ２ＳＯ４を０．５Ｍ〜２Ｍ、好ましくは１Ｍ〜１．５Ｍの範囲の濃度で、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜７の緩衝剤系、例えばＭＥＳを２０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の濃度で、酢酸マグネシウム及び／若しくは酢酸マンガンを１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の濃度で、並びに／又はエチレングリコールを１％〜２０％、好ましくは２％〜８％、より好ましくは２％〜４％の範囲の濃度で、含む。ＰＡポリペプチド断片又はその変異体の純度は、結晶化溶液中において、好ましくは８５％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらにより好ましくは９５％〜１００％である。結晶を作製するために、結晶化に好適なタンパク質溶液を、等体積の沈殿剤溶液と混合することができる。好ましい一実施形態では、結晶化媒体は、１．０Ｍ〜１．４Ｍ Ｌｉ２ＳＯ４、８０ｍＭ〜１２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５）、５ｍＭ〜１５ｍＭ 酢酸マグネシウム及び／又は酢酸マンガン、並びに２％〜４％ エチレングリコールを含む同様の体積、好ましくは等体積の沈殿剤溶液と混合した、０．０５μｌ〜２μｌ、好ましくは０．８μｌ〜１．２μｌの結晶化に好適なタンパク質溶液を含む。別の実施形態では、沈殿剤溶液は、１．２Ｍ Ｌｉ２ＳＯ４、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム及び／又は１０ｍＭ 酢酸マンガン、好ましくは１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、及び３％ エチレングリコールを含み、好ましくはこれらから本質的になり、又はこれらからなり、結晶化／タンパク質溶液は、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２を含む、好ましくはこれらから本質的になる、又はこれらからなる。
結晶を、ハンギング−シッティングドロップ（hanging and sitting drop）法、サンドイッチドロップ法、透析法、及びマイクロバッチ又はマイクロチューブバッチデバイスを含むがこれらに限定されない当業者に既知の任意の方法により成長させることができる。単独での又は化合物との複合体としての本発明のＰＡポリペプチド断片又はその変異体の結晶を作製する他の結晶化条件を特定するために、上で開示された結晶化条件を変更することは、当業者には容易に分かることだろう。このような変更は、ｐＨ、タンパク質濃度及び／若しくは結晶化温度を調整すること、使用する塩及び／若しくは沈殿剤の特性若しくは濃度を変化させること、結晶化のための種々の方法を使用すること、又は結晶化を助ける添加剤、例えば洗浄剤（例えばＴＷＥＥＮ２０（モノラウレート）、ＬＤＯＡ、Ｂｒｉｊ３０（４ラウリルエーテル））、糖（例えばグルコース、マルトース）、有機化合物（例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド）、ランタニドイオン若しくは多価イオン性（poly-ionic）化合物を導入することを含むがこれらに限定されない。ハイスループット結晶化アッセイを使用して結晶化条件の発見又は最適化を支援することもできる。
マイクロシーディング（Microseeding）を使用して、結晶のサイズ及び質を増大させることができる。簡潔に述べると、微結晶を粉砕して、ストック用種溶液を得る。ストック用種溶液を段階希釈する。ニードル、ガラスロッド又は一本の髪の毛（strand of hair）を使用して、各希釈溶液からの小量の試料を、種の非存在下で結晶を作り出すのに必要とされる濃度以下のタンパク質濃度を含有する一組の平衡化した液滴に添加する。目的は、液滴中において結晶成長の核となる働きをする単一の種結晶を最終的に得ることである。
本明細書で記載したような、表２に示すような構造座標を取得する方法、座標の解釈、及びタンパク質構造を理解する際のその有用性は、当業者により、標準的なテキスト、例えばJ. Drenth, "Principles of protein X-ray crystallography",2nd Ed., Springer Advanced Texts in Chemistry, New York (1999)、及びG. E. Schulz and R. H. Schirmer, "Principles of ProteinStructure", Springer Verlag, New York（1985）を参照して、一般的に理解されている。例えば、１００Ｋまで凍結して凍結保護した（例えば、２０％〜３０％グリセロールを用いて）結晶を多くの場合使用して、例えばＸ線源としてシンクロトロン施設におけるビームライン又は回転陽極を使用して、Ｘ線回折データを初めに取得する。その後位相問題を一般的に既知の方法、例えば多波長異常回折（ＭＡＤ）、重原子同形置換（multiple isomorphous replacement）（ＭＩＲ）、単一波長異常回折（ＳＡＤ）又は分子置換（ＭＲ）により解決する。部分構造（sub-structure）を、ＳＨＥＬＸＤ（Schneider andSheldrick, 2002, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. (Pt 10 Pt 2), 1772-1779）を使用して解明し、ＳＨＡＲＰ（Vonrhein et al., 2006, Methods Mol. Biol. 364:215-30）で位相を算出し、溶媒平滑化（solvent flattening）及び非結晶学的対称平均化により、例えばＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger, 2000, Acta Cryst. D. Biol. Crystallogr. 56:965-972）により改良することができる。モデル自動構築を例えばＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:458-63）により、精密化を例えばＲＥＦＭＡＣ（Murshudov, 1997, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 53: 240-255）により、行うことができる。当業者は、所定の静電的ポテンシャルを有するＰＡの表面領域（好ましくは活性部位における）と相互作用する可能性がある試験化合物の側基の確定の際に役に立つ静電的表面ポテンシャル（図１３を参照されたい）の確定を含む二次的な解析のために入力される構造座標（表２）を使用することができる。ＰＡポリペプチド断片に関して生成した構造座標を使用するために、構造座標を三次元形状に変換することが必要である。これは、一組の構造座標から分子又はその一部分の三次元グラフ表示を生成することができる市販のソフトウェアの使用により達成される。このようなコンピュータプログラムの例は、ＭＯＤＥＬＥＲ（Sali and Blundell, 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩホモロジーソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（９７．０）、Molecular Simulations Incorporated（SanDiego, CA））中で実行される）である。このような三次元グラフ表示を、（ｉ）Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２、ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ（Frisch, Gaussian, Incorporated（Pittsburgh,PA））、（ｉｉ）ＡＭＢＥＲ、４．０版（Kollman, カリフォルニア大学（San Francisco, CA））、（ｉｉｉ）ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（MolecularSimulations Incorporated（San Diego, CA））、（ｉｖ）ＯＰＬＳ−ＡＡ（Jorgensen, 1998, Encyclopedia of Computational Chemistry, Schleyer,Ed., Wiley, New York, Vol. 3, pp. 1986-1989）、及び（ｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Biosysm Technologies Incorporated（San Diego,CA））を含む好適なプログラムにより使用して、グラフ表示（例えば静電的ポテンシャルの）を生成することができる。同様に、構造情報を、様々なアミノ酸の位置における図１１に示すような残基の保存に関する情報と組み合わせて（図１２を参照されたい）、異なるウイルス分離株間で特に保存されることによりこれらのウイルスの突然変異株又は他の分離株にも存在する可能性がある、ＰＡの表面における及び／又は活性部位におけるこれらの残基を強調することができる。当業者に好適なこの情報は、残基に関連する情報を導くことができる。さらに、本発明により提供されるインフルエンザＡウイルスのＰＡ断片であるＰＡ−Ｎｔｅｒの構造座標（表２）は、分子置換法を使用する、オルトミクソウイルス科由来の他のウイルスのＰＡポリペプチド、又はアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するＰＡポリペプチド変異体の構造決定に有用である。
本発明によるポリペプチド断片の好ましい一実施形態では、ＰＡサブユニットは、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス若しくはインフルエンザＣウイルス由来のものである、又はその変異体である、好ましくはインフルエンザＡウイルス由来のものである、又はその変異体である。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片内に含まれるアミノ末端ＰＡ断片は、インフルエンザＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体の少なくともアミノ酸１〜１９６、好ましくはアミノ酸１〜２０９、好ましくはアミノ酸１〜２１３、すなわち配列番号２に示すようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９６、１〜２０９又は１〜２１３に対応する、好ましくはこれらから本質的になる、又はこれらからなる。
好ましい一実施形態では、本発明によるポリペプチド断片は、結晶化に好適な程度まで精製されており、好ましくはその純度は８５％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、最も好ましくは９５％〜１００％である。
別の実施形態では、本発明によるポリペプチド断片は、二価の陽イオンと結合することができる。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片は、１つ又は複数の二価の陽イオンと結合し、好ましくは２つの二価の陽イオンと結合する。この関連で、二価の陽イオンは好ましくは、マンガン、コバルト、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛からなる群から（form）選択され、より好ましくはマンガン又はコバルト、最も好ましくはマンガンである。したがって、好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、２つのマンガン陽イオンとの複合体として存在する。好ましい一実施形態では、二価の陽イオンは、配列番号２に示すような、アミノ酸Ｇｌｕ８０及びＡｓｐ１０８に対応するアミノ酸（第１の陽イオン）、並びにアミノ酸Ｈｉｓ４１、Ａｓｐ１０８及びＧｌｕ１１９に対応するアミノ酸（第２の陽イオン）に配位する。
本発明によるポリペプチド断片の好ましい一実施形態では、（ｉ）Ｎ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下の、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１８６位〜２２０位、例えば１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位若しくは２２０位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し；好ましくは、Ｎ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下の、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１９６位〜２２０位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し；より好ましくは、Ｎ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下の、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１９６位〜２０９位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、（ｉｉ）Ｎ末端が配列番号４によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下のアミノ酸、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号４によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１８５位〜２１７位、例えば１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位若しくは２１７位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し；好ましくは、Ｎ末端が配列番号４によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下のアミノ酸、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号４によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１９５位〜２１７位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し；より好ましくは、Ｎ末端が配列番号４によるアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下のアミノ酸、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号４によるアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１９５位〜２０６位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、又は（ｉｉｉ）Ｎ末端が配列番号６によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下のアミノ酸、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号６によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１６８位〜２００位から選択される位置のアミノ酸、例えば１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位若しくは２００位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し；好ましくは、Ｎ末端が配列番号６によるアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下のアミノ酸、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号６によるアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１７８位〜２００位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し；より好ましくは、Ｎ末端が配列番号６によるアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１５位以下のアミノ酸、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号６によるアミノ酸配列、及びエンドヌクレアーゼ活性を保持するその変異体の１７８位〜１８９位から選択される位置のアミノ酸と同一である若しくはこれに対応する。
別の実施形態では、上記ポリペプチド断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列、及びヌクレオチド鎖切断活性を保持するその変異体のアミノ酸５〜１９６、１０〜１９６、１５〜１９６、２０〜１９６、５〜２０９、１０〜２０９、１５〜２０９、２０〜２０９からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有する又はこれに対応する。別の実施形態では、上記ＰＡポリペプチド断片は、配列番号４に示すアミノ酸配列、及びヌクレオチド鎖切断活性を保持するその変異体のアミノ酸５〜１９５、１０〜１９５、１５〜１９５、２０〜１９５、５〜２０６、１０〜２０６、１５〜２０６、２０〜２０６からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸を有する又はこれに対応する。別の実施形態では、上記ＰＡポリペプチド断片は、配列番号６に示すアミノ酸配列、及びヌクレオチド鎖切断活性を保持するその変異体のアミノ酸５〜１７８、１０〜１７８、１５〜１７８、２０〜１７８、５〜１８９、１０〜１８９、１５〜１８９、２０〜１８９からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸を有する又はこれに対応する。好ましい実施形態では、上記ポリペプチド断片は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失、好ましくは上で示すような自然発生的な突然変異を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチド断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０９からなり、表２に示すような構造座標により規定される構造を有する。
別の実施形態では、本発明によるポリペプチド断片は、好ましくは空間群Ｐ４３２１２を有し、好ましくはａ＝ｂ＝６．７１±０．２ｎｍ、ｃ＝３０．２９ｎｍ±０．４ｎｍの単位格子寸法を有する、結晶形態を有する。別の実施形態では、本発明による結晶は、好ましくはａ＝ｂ＝６．７９ｎｍ、ｃ＝４９．４ｎｍ、α＝β＝９０°、及びγ＝１２０°の単位格子寸法を有し、好ましくは三方晶系又は六方晶系の空間群を有する、六方晶系のプレートである。好ましくは、ポリペプチド断片の結晶は、２．８Å以上、好ましくは２．６Å以上、より好ましくは２．５Å以上、さらにより好ましくは２．４Å以上、最も好ましくは２．１Å以上の分解能まで、Ｘ線を回折する。
上で言及したＰＡポリペプチド断片及びその変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供することは、本発明の別の態様である。このような単離ヌクレオチド断片を取得するために適用される分子生物学的方法は、概して当業者に既知である（標準的な分子生物学的方法に関しては、Sambrook et al., Eds., "Molecular Cloning: A LaboratoryManual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（1989）（これは参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。例えば、ＲＮＡを、インフルエンザウイルスに感染した細胞から単離することができ、ランダムプライマー（例えば、ランダムな六量体若しくは（of）十量体）、又は対象の断片の生成に特異的なプライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を適用して、ｃＤＮＡを生成することができる。その後対象の断片を、断片特異的プライマーを使用する標準的なＰＣＲにより増幅することができる。
好ましい一実施形態では、好ましい実施形態のＰＡポリペプチド断片をコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号１（インフルエンザＡ）、配列番号３（インフルエンザＢ）又は配列番号６（インフルエンザＣ）由来である。この文脈では、「由来（derived）」は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３が全長ＰＡポリペプチドをコードし、したがって、好ましいＰＡポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが、それぞれコードされるＰＡポリペプチド断片による要求に応じて、ポリヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に欠失を含み得ることを表す。
一実施形態では、本発明は、上記単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。当業者には、対象のポリヌクレオチド配列のベクター中への取り込みに使用される技法は、十分に明らかである（Sambrook et al., 1989（上記）も参照されたい）。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む、当業者に既知の任意のベクターを含む。上記ベクターは、原核生物発現又は真核生物発現に好適な発現ベクターであり得る。上記プラスミドは、複製開始点（ｏｒｉ）、多重クローニング部位、及びプロモーター（構成的な又は誘導性の）等の調節配列、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、ポリアデニル化シグナル、及び突然変異又は欠失の相補性に基づく抗生物質耐性マーカー又は栄養要求性マーカー等の選択マーカーを含み得る。一実施形態では、対象のポリヌクレオチド配列は、調節配列と操作可能に連結している。
別の実施形態では、上記ベクターは、対象のポリペプチド断片の精製を容易にするエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグをコードするヌクレオチド配列を含む。このようなエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグは、ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ポリＨｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）、マルトース結合タンパク質タグ（ＭＢＰタグ）、ＮｕｓＡタグ及びチオレドキシンタグ、又は（高感度）緑色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＧＦＰ）、（高感度）黄色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（イソギンチャクモドキ（Discosoma）の種由来の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、若しくは単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ））、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等の蛍光タンパク質タグ等を含むがこれらに限定されない。好ましい一実施形態では、エピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグを、例えばトロンビン、第Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶプロテアーゼ等のようなプロテアーゼを使用して、対象のポリペプチド断片から切断することができる。好ましくは、該タグは、ＴＥＶプロテアーゼを使用して切断する（cleaved of）ことができる。このようなプロテアーゼに関する認識部位は、当業者に既知である。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位のアミノ酸数７のコンセンサス配列は、Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ここで、Ｘはどのようなアミノ酸でもよい）であり、本発明との関連では、好ましくはＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号２１）である。別の実施形態では、ベクターは、組換え宿主細胞の培養培地中への、又は細菌の細胞膜周辺腔中への、対象のポリペプチド断片の分泌をもたらす機能的配列を含む。シグナル配列断片は、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中に（グラム陽性細菌）、又は細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔中に（グラム陰性細菌）分泌される。好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され、シグナルペプチド断片と外来遺伝子との間にコードされ得るプロセシング部位が存在する。
別の態様では、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド又は上記組換えベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞は、古細菌細胞及び細菌細胞等の原核生物細胞、又は酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物細胞であり得る。好ましい一実施形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞である。当業者には、上記単離ポリヌクレオチド又は上記組換えベクターを上記宿主細胞中に導入する方法は、十分に明らかである。例えば、細菌細胞は、例えば化学的形質転換（例えば塩化カルシウム法）又はエレクトロポレーションを使用して、容易に形質転換することができる。酵母細胞は、例えば、酢酸リチウム形質転換法又はエレクトロポレーションを使用して、形質転換することができる。他の真核生物細胞は、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitrogen）等の市販のリポソーム系トランスフェクションキット、Ｆｕｇｅｎｅ（RocheDiagnostics）等の市販の脂質系トランスフェクションキット、ポリエチレングリコール系トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（微粒子銃）、エレクトロポレーション又はウイルス感染を使用して、トランスフェクトすることができる。本発明の好ましい一実施形態では、組換え宿主細胞は、対象のポリヌクレオチド断片を発現する。さらにより好ましい一実施形態では、上記発現は、本発明の可溶性ポリペプチド断片をもたらす。これらのポリペプチド断片は、上で言及したエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグを任意に利用して、当業者に既知のタンパク質精製法を使用して、精製することができる。
別の態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）表２に示される本発明によるポリペプチド断片の構造座標により規定される活性部位のコンピュータモデルを構築する工程、
（ｂ）活性を変調させる有望な化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させて上記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）上記化合物の新規リガンド設計
からなる群から選択される方法により、活性を変調させる有望な化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を利用する工程であって、該活性部位における上記化合物のエネルギーを最小化した立体配置を提供するために、上記化合物と上記活性部位とのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、利用する工程、並びに
（ｄ）上記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、上記化合物と該活性部位モデルとの間の会合を定量化し、それにより上記活性部位と会合する上記化合物の能力を評価する、評価する工程
を含む、方法に関する。
好ましくは、変調させる化合物は、ＰＡサブユニット又はその変異体内におけるヌクレオチド鎖切断活性部位と結合する。変調させる化合物は、上記ヌクレオチド鎖切断活性を増大又は減少させることができ、好ましくは減少させることができる。
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、ＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物は上記活性を減少させ、より好ましくは上記化合物は上記活性を阻害する。好ましくは、該化合物は、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を、上記化合物の非存在下における、しかしそれ以外は同じ反応条件、すなわち緩衝剤条件、反応時間及び反応温度によるＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性と比較して５０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは１００％減少させる。該化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を特異的に減少させる又は阻害するが、他のエンドヌクレアーゼ、特に哺乳動物のエンドヌクレアーゼのヌクレオチド鎖切断活性を同じ程度までは減少させず又は阻害せず、好ましくは全く減少させない又は阻害しないことが特に好ましい。
初めて、本発明は、表２によるヌクレオチド鎖切断活性部位の構造座標に基づき、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させる可能性のある化合物を同定、選択又は設計する分子設計技法の使用を可能とする。このような予測モデルは、ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる可能性を有する多数の多様な化合物の調製及び試験に関連する費用が高いという観点から貴重である。ＰＡポリペプチド断片に関して生成した構造座標を使用するために、構造座標を三次元形状に変換することが必要である。これは、一組の構造座標から分子又はその一部分の三次元グラフ表示を生成することができる市販のソフトウェアの使用により達成される。このようなコンピュータプログラムの例は、ＭＯＤＥＬＥＲ（Sali and Blundell, 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩホモロジーソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（９７．０）、Molecular Simulations Incorporated（SanDiego, CA））中で実行される）である。
当業者は、ＰＡサブユニット又はＰＡポリペプチド変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させるその能力に関して、化学的物質又は断片をスクリーニングする複数の方法を使用することができる。このプロセスは、例えば、表２による構造座標に基づくＰＡのヌクレオチド鎖切断活性部位の三次元コンピュータモデルの目視検査により、開始し得る。選択した断片又は化学的化合物は、その後様々な方向で位置づけることができ、又は活性部位内にドッキングすることができる。Ｃｅｒｉｕｓ、Ｑｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌ（Tripos Associates（St. Louis, MO））等のソフトウェアを使用してドッキングを達成することができ、その後ＯＰＬＳ−ＡＡ、ＣＨＡＲＭＭ及びＡＭＢＥＲ等の標準的な分子動力学力場を用いてエネルギー最小化及び分子動力学的検討を行う。好適な化合物又は断片を選択するプロセスにおいて当業者を支援することができるさらなる特定のコンピュータプログラムは、例えば、（ｉ）ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Goodsell et al., 1990, Proteins: Struct., Funct., Genet. 8: 195-202；ＡＵＴＯＤＯＣＫはThe Scripps Research Institute（La Jolla, CA）から入手可能である）、及び（ｉｉ）ＤＯＣＫ（Kuntz et al., 1982, J. Mol. Biol., 161: 269-288；ＤＯＣＫは、カリフォルニア大学（San Francisco, CA）から入手可能である）を含む。
好適な化合物又は断片が選択されると、それらを設計するか、又は集合化させ単一の化合物又は複合体とすることができる。この手動のモデル構築は、Ｑｕａｎｔａ又はＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを使用して行われる。個々の化合物又は断片を連結する際に当業者を支援する有用なプログラムは、例えば、（ｉ）ＣＡＶＥＡＴ（Bartlett et al., 1989, in Molecular Recognition in Chemical and BiologicalProblems, Special Publication, Royal Chem. Soc., 78:182-196、Lauri and Bartlett, 1994; J. Comp. Aid. Mol. Des. 8:51-66；ＣＡＶＥＡＴはカリフォルニア大学（Berkley, CA）から入手可能である）、（ｉｉ）ＩＳＩＳ（MDLInformation Systems（San Leandro, CA）；Martin, 1992, J. Med. Chem. 35: 2145-2154中で概説されている）等の３Ｄデータベースシステム、及び（ｉｉｉ）ＨＯＯＫ（Eisen et al., 1994, Proteins: Struct., Funct., Genet. 19:199-221；ＨＯＯＫはMolecular Simulations Incorporated（SanDiego, CA）から入手可能である）を含む。
本発明により可能となる別のアプローチは、ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位、又はＰＡポリペプチド変異体の活性部位と全体的に又は部分的に結合することができる化合物に関する小分子データベースの演算によるスクリーニングである。このスクリーニングでは、このような化合物の活性部位への適合（fit）の質は、形状相補性により、又は推定相互作用エネルギーにより、判断することができる（Meng et al., 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524）。
代替的に、ＰＡサブユニット又はそのポリペプチド変異体のヌクレオチド鎖切断活性の有望な変調剤（modulator）、好ましくはヌクレオチド鎖切断活性の阻害剤は、表２によるＰＡポリペプチド断片の３Ｄ構造に基づいて新規に設計され得る。当業者が利用可能な、様々な新規のリガンド設計方法が存在する。このような方法は、（ｉ）ＬＵＤＩ（Bohm, 1992, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78；ＬＵＤＩはMolecular Simulations Incorporated（SanDiego, CA）から入手可能である）、（ｉｉ）ＬＥＧＥＮＤ（Nishibata and Itai,Tetrahedron 47:8985-8990；ＬＥＧＥＮＤはMolecular SimulationsIncorporated（San Diego, CA）から入手可能である）、（ｉｉｉ）ＬｅａｐＦｒｏｇ（Tripos Associates（St. Louis, MO）から入手可能）、（ｉｖ）ＳＰＲＯＵＴ（Gillet et al., 1993, J. Comp. Aid. Mol. Des. 7:127-153；ＳＰＲＯＵＴはリーズ大学（UK）から入手可能である）、（ｖ）ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（Rotstein and Murcko,1993, J. Med. Chem. 36:1700-1710）、及び（ｖｉ）ＧＲＯＷ（Moon and Howe,1991, Proteins 11:314-328）を含む。
加えて、ヌクレオチド鎖切断活性部位の有望な変調剤及び／又は阻害剤、好ましくはヌクレオチド鎖切断活性部位の結合パートナーの新規の設計及びモデリングの際に当業者を支援することができる複数の分子モデリング技法（参照により本明細書に援用される）が記載されており、例えば、Cohen et al., 1990, J. Med. Chem. 33:883-894、Navia and Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210、Balbes et al., 1994, Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5,Lipkowitz and Boyd, Eds., VCH, New York, pp. 37-380、Guida,1994, Curr. Opin. Struct. Biol. 4:777-781を含む。
ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合するものとして設計又は選択された分子は、その結合状態において好ましくは標的領域との反発的な静電的相互作用を欠くように、さらに演算的に最適化することができる。このような非相補的な（例えば静電的な）相互作用は、反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用及び電荷−双極子相互作用を含む。具体的には、結合状態における結合化合物と結合ポケットとの間の全静電的相互作用の合計は、好ましくは結合のエンタルピーに対する中立的な（neutral）又は好ましい寄与をもたらす。化合物変形エネルギー及び静電的相互作用を評価することができる特定のコンピュータプログラムが、当該技術分野で利用可能である。好適なプログラムの例は、（ｉ）Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２、ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ（Frisch, Gaussian, Incorporated（Pittsburgh,PA））、（ｉｉ）ＡＭＢＥＲ、４．０版（Kollman, カリフォルニア大学（San Francisco, CA））、（ｉｉｉ）ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（MolecularSimulations Incorporated（San Diego, CA））、（ｉｖ）ＯＰＬＳ−ＡＡ（Jorgensen, 1998, Encyclopedia of Computational Chemistry, Schleyer,Ed., Wiley, New York, Vol. 3, pp. 1986-1989）、及び（ｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Biosysm Technologies Incorporated（San Diego,CA））を含む。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション、ＩＲＩＳ ４Ｄ／３５又はＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を使用して、実行することができる。他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケージが、当業者に既知である。
上で説明したように、対象の分子が選択又は設計されると、その後、その結合特性を改善又は修正するために、その原子又は側基の幾つかにおいて置換が為され得る。概して、初期置換は保存的であり、すなわち、置換基は元の基とおよそ同じサイズ、形状、疎水性及び電荷を有する。勿論、立体構造を変化させることが当該技術分野において知られている成分は避けるべきであると理解すべきである。このような置換した化学的化合物は、その後、上で詳細に説明した同様の演算（computer）方法により、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位への適合の効率に関して分析することができる。
上で記載した本発明の方法の一実施形態では、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＬｙｓ１３４に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＨｉｓ４１に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＧｌｕ８０に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＧｌｕ１１９に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０及びＧｌｕ１１９に対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＴｙｒ２４に対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＡｒｇ８４に対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＬｅｕ１０６に対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＴｙｒ１３０に対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＧｌｕ１３３に対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＬｙｓ１３７に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４及びＬｅｕ１０６に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７に対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記活性部位は、配列番号２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７に対応するアミノ酸を含む。
上で説明される本発明の方法のさらなる一態様において、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位は、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＬｙｓ１３４の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＨｉｓ４１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＧｌｕ８０の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＧｌｕ１１９の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０及びＧｌｕ１１９の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＴｙｒ２４の構造座標により規定される。さらに別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＡｒｇ８４の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＬｅｕ１０６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＴｙｒ１３０の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＧｌｕ１３３の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＬｙｓ１３７の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４及びＬｅｕ１０６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記活性部位が、表２によるＰＡ（配列番号２）のアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７の構造座標により規定される。
一態様では、本発明は、表２によるＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位に対する変異体であるヌクレオチド鎖切断活性部位を変調させることができる及び／又はこれと会合することができる化合物に関する、上記で説明される方法による演算によるスクリーニング方法を提供する。一実施形態では、上記活性部位の上記変異体は、表２によるアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＬｙｓ１３４の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＨｉｓ４１の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＧｌｕ８０の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４及びＧｌｕ１１９の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０及びＧｌｕ１１９の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＴｙｒ２４の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＡｒｇ８４の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＬｅｕ１０６の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＴｙｒ１３０の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＧｌｕ１３３の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９及びＬｙｓ１３７の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４及びＬｅｕ１０６の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７の；アミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７の骨格原子からの３Å以下の二乗平均平方根偏差を有する。別の実施形態では、上記二乗平均平方根偏差が２．５Å以下である。別の実施形態では、上記二乗平均平方根偏差が２Å以下である。別の実施形態では、上記二乗平均平方根偏差が１．５Å以下である。別の実施形態では、上記二乗平均平方根偏差が１Å以下である。別の実施形態では、上記二乗平均平方根偏差が０．５Å以下である。
本明細書において上で記載した本方法によるコンピュータモデリングによりＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位に対する化合物の結合が示される場合、上記化合物を合成することができ、任意に、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体と共に上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を配合することができる。したがって、上で記載した方法は、（ｅ）上記化合物を合成すると共に、任意に、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体と共に上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を配合するさらなる工程を含み得る。任意に、ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させる、好ましくは減少させる、好ましくは阻害する上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩又はその配合物の能力を、（ｆ）上記化合物を本発明のＰＡポリペプチド断片若しくはその変異体又は組換え宿主細胞と接触させるさらなる工程であって、ＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体の（ｉ）活性部位と結合する、及び／又は（ｉｉ）ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる、減少させる若しくは阻害する上記化合物の能力を確定する、接触させるさらなる工程を含めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。活性部位に対するこのような化合物の適合の質を、形状相補性により、又は推定相互作用エネルギーにより判断することができる（Meng et al., 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524）。上記化合物を合成する方法は当業者に既知であり、又はこのような化合物は市販されていることがある。
上で記載した方法により同定可能な化合物であって、上記化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができる、化合物を提供することは、本発明の別の態様である。別の態様では、本発明は、上で記載した方法により同定可能な化合物であって、上記化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体、例えば本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を減少させることができ、好ましくは阻害することができる、化合物を表す。本発明の化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、有機小分子若しくは無機小分子、化学的化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン、並びにその組合せ及び誘導体を含むがこれらに限定されない任意の作用物質であり得る。「小分子」という用語は、５０ダルトン〜約２５００ダルトン、好ましくは２００ダルトン〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を表す。加えて、本発明による試験化合物は、検出可能な標識を任意に含み得る。このような標識は、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物を含むがこれらに限定されない。本発明による化合物の好ましい一実施形態では、化合物は、４−置換２−ジオキソブタン酸、４−置換４−ジオキソブタン酸、４−置換２，４−ジオキソブタン酸、ピラジン−２，６−ジオン若しくは置換ピラジン−２，６−ジオン、例えばフルチミド、Ｎ−ヒドロキサム酸、又はＮ−ヒドロキシミド（hydroxymide）ではない。特に、本発明による化合物は、式Ｉ：
R2=アシル、カルバモイル、スルホニル
による化合物ではない。
さらなる一態様では、本発明は、ＰＡサブユニット又はそのポリペプチド変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合し、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、より好ましくは減少させ、最も好ましくは阻害する化合物を同定する方法であって、（ｉ）本発明によるＰＡポリペプチド断片又は本発明による組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程、及び（ｉｉ）上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合する、エンドヌクレアーゼ活性を変調させる、減少させる、又は阻害する上記試験化合物の能力を分析する工程を含む、方法を提供する。
一実施形態において、ＰＡポリペプチド断片又はその変異体と試験化合物との間の相互作用を、プルダウンアッセイの形態で分析することができる。例えば、ＰＡポリペプチド断片を精製することができ、ビーズ上で固定化することができる。一実施形態では、ビーズ上で固定化されたＰＡポリペプチド断片は、例えば（ｉ）別の精製タンパク質、ポリペプチド断片若しくはペプチド、（ｉｉ）タンパク質、ポリペプチド断片若しくはペプチドの混合物、又は（ｉｉｉ）細胞若しくは組織の抽出物と接触させることができ、タンパク質、ポリペプチド断片又はペプチドの結合を、クーマシー染色又はウェスタンブロッティングと組み合わせて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検証することができる。未知の結合パートナーを、質量分光分析により同定することができる。
別の実施形態において、ＰＡポリペプチド断片又はその変異体と試験化合物との間の相互作用を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく実験形態で分析することができる。一実施形態では、本発明によるＰＡポリペプチド断片又はその変異体を、ＥＬＩＳＡプレート表面上に固定化することができ、試験化合物と接触させることができる。例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びエピトープタグ付き化合物に対する試験化合物の結合を、試験化合物又はエピトープタグに特異的な抗体により検証することができる。これらの抗体を酵素と直接的に結合することができるか、又は好適な基質と組み合わせて、化学発光反応（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）若しくは比色反応（例えばアルカリホスファターゼ）を実施する上記酵素と結合した二次抗体によって検出することができる。別の実施形態では、抗体では検出することができない化合物の結合を、試験化合物と直接的に結合した標識により検証することができる。かかる標識には、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物が含まれ得る。別の実施形態では、試験化合物をＥＬＩＳＡプレート上に固定化することができ、本発明による可溶性のＰＡポリペプチド断片又はその変異体と接触させることができる。上記ポリペプチドの結合を、ＰＡポリペプチド断片特異的抗体と、上で説明されるような化学発光反応又は比色反応とにより検証することができる。
さらなる一実施形態において、精製されたＰＡポリペプチド断片を、ペプチドアレイと共にインキュベートすることができ、ＰＡポリペプチド断片と、特異的なペプチド配列に対応する特異的なペプチドスポットとの結合を、例えばＰＡポリペプチド特異的抗体、ＰＡポリペプチド断片と融合したエピトープタグを対象とする抗体により、又はＰＡポリペプチド断片と結合した蛍光タグから放出された蛍光シグナルにより分析することができる。
別の実施形態において、本発明による組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる。これは、試験タンパク質又はポリペプチドの共発現と、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は免疫共沈降による相互作用の検証とにより達成することができる。別の実施形態では、直接的に標識された試験化合物を、組換え宿主細胞の培地に添加することができる。試験化合物が膜に浸透し、ＰＡポリペプチド断片と結合する可能性は、例えば上記ポリペプチドの免疫沈降と標識の存在の検証とにより検証することができる。
別の実施形態では、ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させる、好ましくは減少させる、より好ましくは阻害する試験化合物の能力を評価する。例えば、精製したＰＡサブユニットポリペプチド断片と、その基質、例えばパンハンドルＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡとを、変動量の試験化合物の存在下又は非存在下で接触させ、或る特定の期間、例えば５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、６０分間又は９０分間インキュベートする。試験化合物の非存在下でＰＡサブユニットポリペプチドがヌクレオチド鎖切断活性を有するように反応条件を選択する。その後基質を、分解／ヌクレオチド鎖切断に関して、例えばゲル電気泳動により分析する。代替的には、このような試験は、基質分子がエンドヌクレアーゼにより切断された場合にはシグナルをもたらすが基質分子が無傷である場合にはシグナルをもたらさない標識した基質分子を含み得る。例えば、基質ポリヌクレオチド鎖を、基質ポリヌクレオチド鎖が無傷である場合には蛍光レポーターが消光されるように、蛍光レポーター分子及び蛍光クエンチャーにより標識することができる。基質ポリヌクレオチド鎖が切断された場合には蛍光レポーター及びクエンチャーは分離し、したがって蛍光レポーターは、例えばＥＬＩＳＡリーダーにより、検出することができるシグナルを放射する。この実験設定をマルチウェルプレート形式において適用することができ、この設定は、ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる、減少させる、又は阻害するその能力に関する化合物のハイスループットスクリーニングに好適である。
好ましい一実施形態では、ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合する、ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる、減少させる、又は阻害する化合物を同定する上で記載した方法を、ハイスループット設定において行う。好ましい一実施形態では、上記方法を、本発明によるＰＡポリペプチド断片又はその変異体及び標識した試験化合物を使用して、上で記載したようなマルチウェルマイクロタイタープレートにおいて実施する。
好ましい一実施形態では試験化合物は、合成化合物又は天然化合物のライブラリに由来する。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall,UK）、ChemBridge Corporation（SanDiego, CA）又はAldrich（Milwaukee,WI）から市販されている。天然化合物ライブラリは例えば、TimTec LLC（Newark, DE）より入手可能である。代替的に、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリを使用することができる。さらに、試験化合物を、個々の化合物として又は混合物のいずれかとして、コンビナトリアルケミストリを使用して合成的に作製することができる。
別の実施形態において、インフルエンザウイルスのライフサイクルに対する同定した化合物の阻害効果をｉｎ ｖｉｖｏ設定で試験してもよい。２９３Ｔヒト胚腎臓細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞又はトリ胚線維芽細胞等のインフルエンザウイルスに感染しやすい細胞株を、同定した化合物の存在下又は非存在下でインフルエンザウイルスに感染させることができる。好ましい一実施形態では、同定した化合物を、様々な濃度で細胞の培養培地に添加することができる。ウイルスプラーク形成を、インフルエンザウイルスの感染能に関する読出し情報（read out）として使用することができ、同定した化合物で処理した細胞と処理していない細胞との間で比較することができる。
本発明のさらなる一実施形態において、上で説明される方法のいずれかで適用される試験化合物は小分子である。好ましい一実施形態では、上記小分子は、ライブラリ、例えば小分子阻害剤ライブラリに由来する。別の実施形態では、上記試験化合物はペプチド又はタンパク質である。好ましい一実施形態では、上記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質ライブラリに由来する。
上で説明される、本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合し、ヌクレオチド鎖切断活性を変調させ、減少させ、又は阻害する化合物を演算及びｉｎ ｖｉｔｒｏで同定する方法の別の実施形態において、上記方法は、同定可能な化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体と共に配合する工程をさらに含む。別の態様では、本発明は、上述の方法により製造可能な薬学的組成物を提供する。本発明による化合物を単独で投与することができるが、ヒト療法では概して、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択される好適な薬学的な添加物、希釈剤又は担体と混合して投与する（以下を参照されたい）。
本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位に関する結合パートナー、ヌクレオチド鎖切断活性の変調剤及び／又は阻害剤の演算によるモデリング又はスクリーニングの態様において、調合薬として投与される分子に有益であり得る化学的分子部分を対象の分子に導入することが可能であり得る。例えば、分子と標的領域との結合には直接影響し得ないが、例えば薬学的に許容可能な担体における分子の溶解度全体、分子のバイオアベイラビリティ、及び／又は分子の毒性に寄与する化学的分子部分を対象の分子に導入する、又は化学的分子部分を対象の分子から除外することが可能であり得る。対象の分子の薬理を最適化するための検討事項及び方法は、例えば"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics",8th Edition, Goodman, Gilman, Rall, Nies, & Taylor, Eds.,Pergamon Press（1985）、Jorgensen& Duffy, 2000, Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1155-1158に見出すことができる。さらに、対象の有機分子の物理的に重要となる記載及び薬学的に関連する特性に関する迅速な予測を提供するのに、コンピュータプログラム「Ｑｉｋ Ｐｒｏｐ」を使用することができる。新たに合成された化合物の経口吸収を推測するのに、「５の法則（Rule of Five）」見込み法を使用することができる（Lipinski etal., 1997, Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3-25）。ファーマコフォアの選択及び設計に好適なプログラムとしては、（ｉ）ＤＩＳＣＯ（Abbot Laboratories（Abbot Park, IL））、（ｉｉ）Ｃａｔａｌｙｓｔ（Bio-CAD Corp.（Mountain View, CA））及び（ｉｉｉ）Ｃｈｅｍ ＤＢＳ−３Ｄ（Chemical Design Ltd.（Oxford, UK））が挙げられる。
本発明で考慮される薬学的組成物を、当業者にとって既知の様々な方法で構築することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、錠剤、ピル、カプセル（軟ゲルカプセルを含む）、カシェ剤、ロゼンジ、腔坐剤、粉末、顆粒若しくは坐剤の形態のような固体形態、又はエリキシル、溶液、エマルション若しくは懸濁液の形態のような液体形態であり得る。
固体投与形態は、微小結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシン及びデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカのデンプン）等の添加物、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び或る特定のケイ酸錯体等の崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシア等の造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルク等の平滑剤が含まれ得る。類似の種類の固体組成物をゼラチンカプセルにおける充填剤として利用してもよい。これに関する好ましい添加物としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。
経口投与に適した水性の懸濁液、溶液、エリキシル及びエマルションに関して、化合物を、様々な甘味料又は香料、着色物質又は色素、乳化剤及び／又は懸濁化剤、及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン等の希釈剤、並びにそれらの組合せと組み合わせることができる。
本発明の薬学的組成物は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、硬化ヒマシ油、カルナバワックス、パラフィンワックス、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、及びそれらの混合物を含む放出速度調整剤を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、即時分散性又は溶解性の剤形配合物（fast dispersing or dissolving dosage formulations）（ＦＤＤＦ）の形態であってもよく、以下の成分を含有し得る：アスパルテーム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミント香料、ポリエチレングリコール、ヒュームドシリカ、二酸化ケイ素、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール。
坐剤を調製するために、初めに脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物等の低融点ワックスを融解させ、撹拌等により、活性成分をこの中に均一に分散させる。それから融解した均一混合物を手頃な大きさの鋳型に入れ、冷却することにより、固体化させる。
非経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液の形態で使用することが最良とされ、これには他の物質、例えばこの溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースが含有されていてもよい。必要に応じて、水溶液を好適に緩衝させる（好ましくは３〜９のｐＨに）必要がある。
鼻腔内投与及び吸入による投与に好適な薬学的組成物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ．ＴＭ．）若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ．ＴＭ．）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は別の好適なガス等の好適な推進剤を使用して、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザから、乾燥粉末吸入剤又はエアロゾル噴霧剤の形態で送達されることが最良とされる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザは、例えば溶媒としてエタノールと推進剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液又は懸濁液を含有していてもよく、平滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有していてもよい。
上で記載した方法により同定可能な化合物であって、該化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができる、化合物を提供することは、本発明の別の態様である。別の態様では、本発明は、上で記載した方法により同定可能な化合物であって、該化合物が、ＰＡサブユニット又はその変異体、例えば本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を減少させることができる、好ましくは阻害することができる、化合物を表す。本発明の化合物は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのスクリーニング方法のための、上で記載したような任意の作用物質であり得る。本発明による化合物の好ましい一実施形態では、化合物は、４−置換２−ジオキソブタン酸、４−置換４−ジオキソブタン酸、４−置換２，４−ジオキソブタン酸、ピラジン−２，６−ジオン若しくは置換ピラジン−２，６−ジオン、例えばフルチミド、Ｎ−ヒドロキサム酸、又はＮ−ヒドロキシミドではない。特に、本発明による化合物は、式Ｉによる化合物ではない。
別の態様では、本発明は、ＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼドメインを対象とする抗体を提供する。好ましい一実施形態では、上記抗体は、配列番号９〜配列番号１７により規定されるポリペプチド、すなわち配列番号２に示すようなアミノ酸配列のアミノ酸２０〜３０（配列番号９）、３５〜４５（配列番号１０）、７５〜８５（配列番号１１）、８０〜９０（配列番号１２）、１００〜１１０（配列番号１３）、１０７〜１１２（配列番号２０）、１１５〜１２５（配列番号１４）、１２５〜１３５（配列番号１５）、１３０〜１４０（配列番号１６）及び１３５〜１４５（配列番号１７）の群から選択されるポリペプチド断片の認識によりエンドヌクレアーゼドメインを認識する。好ましくは、上記抗体は、アミノ酸配列ＰＤＬＹＤＹＫ（配列番号２０）を認識する。特に、上記抗体は、活性部位を規定する上で示されるアミノ酸の１つ又は複数を含むエピトープと特異的に結合する。この関連で、「エピトープ」という用語は、その技術分野で認識される意味を有し、好ましくは４個〜２０個のアミノ酸、好ましくは５個〜１８個、５個〜１５個又は７個〜１４個のアミノ酸のストレッチを表す。したがって、好ましいエピトープは、４個〜２０個、５個〜１８個、好ましくは５個〜１５個又は７個〜１４個のアミノ酸の長さを有し、配列番号２のＡｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｌｙｓ１３４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及び／若しくはＬｙｓ１３７の１つ若しくは複数、又は１つ若しくは複数の対応するアミノ酸を含む。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はその一部分であり得る。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法により、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断により作製することができる。幾つかの実施形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、例えばヒト化抗体、ダイアボディ、並びにポリペプチドとの特異的な抗原結合をもたらすのに十分な抗体の一部分を少なくとも含有するポリペプチドを含む。本発明の抗体は、標準的なプロトコルに従って生成される。例えば、ポリクローナル抗体を、当業者に既知の標準的な方法に従って、任意にアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント若しくはフロイント不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）と組み合わせて、対象の抗原により動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ又はウマを免疫付与することにより生成することができる。ＰＡ又はその断片のエンドヌクレアーゼドメインを対象とするポリクローナル抗血清を、免疫付与した動物を採血（bleeding）又は屠殺することにより動物から得る。（ｉ）血清を動物から得たままの状態で使用することができ、（ｉｉ）免疫グロブリン画分を血清から得ることができ、又は（ｉｉｉ）ＰＡ若しくはその断片のエンドヌクレアーゼドメインに対して特異的な抗体を血清から精製することができる。モノクローナル抗体を、当業者に既知の方法により生成することができる。簡潔に述べると、免疫付与後に動物を屠殺し、当該技術分野で既知の任意の手段によりリンパ節及び／又は脾臓Ｂ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法は、癌遺伝子で細胞をトランスフェクトすること、細胞を腫瘍ウイルスに感染させると共に不死化した細胞に関して選択する条件下で細胞を培養すること、細胞を発癌性化合物又は突然変異性化合物に曝露すること（subjecting）、細胞を不死化した細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合させること、並びに腫瘍抑制遺伝子を不活性化させることを含むがこれらに限定されない。不死化した細胞を、ＰＡエンドヌクレアーゼドメイン又はその断片を使用してスクリーニングする。ＰＡエンドヌクレアーゼドメイン又はその断片を対象とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマを、選択し、クローニングし、堅固な成長、高い抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性に関してさらにスクリーニングする。ハイブリドーマを、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでは同系動物において、（ｉｉ）免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスで、又は（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養液で増殖させることができる。ハイブリドーマを選択する、クローニングする、及び増殖させる方法は、当業者に既知である。当業者は、抗体の生成に関する支援のために、標準的なテキスト、例えば“Antibodies: ALaboratory Manual”,Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York （1990）（参照により本明細書中に援用される）を参照することができる。
別の態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科のマイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスによるウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、ＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することができ、及び／若しくはＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させることができ、好ましくは減少させることができ、より好ましくは阻害することができる、上で記載した方法により同定可能な化合物、上で記載される薬学的組成物、又は本発明の抗体の使用に関する。好ましい一実施形態では、上記疾患状態は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イサウイルス又はトゴトウイルスによるウイルス感染により引き起こされる。さらにより好ましい一実施形態では、上記疾患状態は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、最も好ましくはインフルエンザＡウイルスからなる群から選択されるウイルス種による感染により引き起こされる。
上記疾患状態を治療、改善又は予防するために、本発明の薬物を、動物患者、好ましくは哺乳動物患者、好ましくはヒト患者に、経口的に、頬側に、舌下に、鼻腔内に、肺経路を介して、例えば吸入により、直腸経路を介して、又は非経口的に、例えば洞内に（intracavernosally）、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、心室内に、尿道内に（intraurethrally）、胸骨内に（intrasternally）、脳内に（intracranially）、筋肉内に、若しくは皮下に投与することができ、本発明の薬物を、点滴法又は無針注射法により投与することができる。
本発明の薬学的組成物を、当業者に既知の様々な方法で、また上で記載したように、構築することができる。
薬学的調製物は単位投薬形態であるのが好ましい。かかる形態では、調製物を適当な量の活性成分を含有する単位用量にさらに分割する。単位投薬形態は、パッケージングされた調製物、別々の量の調製物を含有するパッケージ、例えばバイアル又はアンプル中に入れられた錠剤、カプセル及び粉末であり得る。また、単位投薬形態自体がカプセル、錠剤、カシェ剤又はロゼンジであってもよく、又は単位投薬形態はパッケージングされた形態である適当な数のこれらのいずれかであってもよい。
本発明の使用において投与される単位投薬調製物における活性成分の量は、特定の用途及び活性成分の効力に応じて約１ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２に変更又は調整してもよい。
本発明の医学的使用に利用される化合物を、１日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの初期投薬量で投与する。約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が好ましく、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が最も好ましい。しかしながら投与量は、患者の要求、治療される状態の重症度、及び利用される化合物に応じて変わり得る。特定の状況に対する好適な投与量の決定は実践者の技能の範囲内である。概して、治療は化合物の最適用量未満のより少ない投与量から始める。その後、或る環境下で最適な効果に到達するまで、投与量を少しずつ増大させる。必要に応じて、便宜的に、１日の総投与量を分割し、１日の間で何回かに分けて（in portions）投与してもよい。
実施例は、本発明をさらに説明するために設計され、より良い理解に役立つ。実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものでは決してない。
実施例の要約
配列番号２に示すアミノ酸配列の残基１〜２０９（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５（Ｈ３Ｎ２））であるＰＡ−Ｎｔｅｒを、大腸菌において発現させ、アフィニティ及びゲル濾過クロマトグラフィにより精製した。熱安定性に対する金属イオンの影響を、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイにより試験した（Ericsson et al., 2006, Anal. Biochem. 357:289-298）。エンドヌクレアーゼ活性を、１０μＭの様々なＲＮＡ基質（Ａｌｕ−ＲＮＡ：ピロコッカス・ホリコシ（P. horikoshii）のＳＲＰ ＲＮＡのＡｌｕドメインの１１０ヌクレオチド、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）のｔＲＮＡ Ａｓｎ、ＵリッチＲＮＡ（５’−ＧＧＣＣＡＵＣＣＵＧＵ７ＣＣＣＵ１１ＣＵ１９−３’（配列番号１８）、Saito et al., 2008, Nature 454:523-527）、８１ヌクレオチドのパンハンドルＲＮＡ（ｐｈ−ＲＮＡ）（Baudin et al., 1994, EMBO J. 13:3158-3165）、単に（just）保存３’末端及び５’末端を短鎖リンカーと共に含む３６ヌクレオチドの短鎖ｐｈ−ＲＮＡ、並びに環状一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８）（Fermentas））と共に１３μＭ ＰＡ−Ｎｔｅｒを３７℃でインキュベーションすることにより試験した。２Åの分解能まで回折する結晶を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２中における５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液、並びに１．２Ｍ Ｌｉ２ＳＯ４、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム及び３％ エチレングリコールのリザーバ組成物を使用するハンギングドロップ法により２０℃で得た。回折データを、欧州シンクロトロン放射線施設（ＥＳＲＦ）でビームラインＩＤ１４−４及びＩＤ２３−１で収集した。構造を、塩化ガドリニウム浸漬結晶を使用する単一波長異常分散（ＳＡＤ）法により解明した。９つの部位をＳＨＥＬＸＤ（Schneider and Sheldrick, 2002, Acta Crastallogr. D. Biol.Crystallogr. 58:1772-1779）により見出し、ＳＨＡＲＰ（de La Fortelleet al., 1997, Methods in Enzymology 276:472-494）を用いて精密化した。ＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger, 2002, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.58:2213-2215）を用いる３倍（three-fold）ＮＣＳ平均化の後、解釈可能なマップを得て、そのモデルの多くをＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:458-463）を用いて構築することができた。さらに、未処理の（native）結晶に関してマンガンＫ端（Ｘ線波長１．８９Å）でデータを測定して、異常差異フーリエ合成により、結合したマンガンイオンの位置及び同一性を明らかにした。非対称単位にＡ、Ｂ及びＣと示す３つの分子が存在する。金属イオン構造は、分子Ａにおいて最も良く規定される。結晶学的な統計量を表１に要約し、より詳細な情報は以下の実験実施例で得られる。
表１：ＰＡ−Ｎｔｅｒに関するデータ収集及び精密化統計量
（表中英語は以下の意味）
native:未処理
Mn K-edge:Ｍｎ Ｋ端
Gd derivative:Ｇｄ誘導体
data collection:データ収集
Beamline:ビームライン
Wavelength:波長
Space group:空間群
Cell dimensions:格子寸法
Resolution:分解能
Completeness:完全性
Redundancy:冗長性
Refinement:精密化
Total No.reflections/free:総反射数／フリー
No. atoms:原子数
Protein:タンパク質
Water/sulphate/Mn ions:水／スルフェート／Ｍｎイオン
Average B-factors:平均Ｂ因子
All atoms:全原子
Chains:鎖
R.ms.deviations:二乗平均平方根偏差
Bond lengths:結合長
Bond angles:結合角
Ramachandran Plot:ラマチャンドランプロット
Favoured:好ましい
Allowed:許容される
実施例１：クローニング、発現及び精製
配列番号２に示すアミノ酸配列のＰＡの残基１〜２０９（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５（Ｈ３Ｎ２））をコードするＤＮＡを、ｐＥＴ−Ｍ１１発現ベクター（ＥＭＢＬ）のＮｃｏＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローニングした。アミノ酸配列ＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号１９）を有するポリペプチドリンカーを、ＴＥＶプロテアーゼによる１００％の切断を得るように、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位の後ろに操作した（engineered）。このベクターを使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ大腸菌株（Stratagene）を形質転換した。０．１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＴＰＧ）による誘導後、ＬＢ培地中で１５℃で終夜、タンパク質を発現した。固定化金属アフィニティカラム（ＩＭＡＣ）により、タンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼを使用する切断後に第２のＩＭＡＣ工程を行い、その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（GE Healthcare）でゲル濾過を行った。最後にタンパク質を５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
実施例２：エンドヌクレアーゼアッセイ
エンドヌクレアーゼアッセイのための全てのリボ核酸基質を、過去に記載した（Price et al., 1995, J. Mol. Biol. 249:398-408）ようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ７転写により得た。２つの構造化ＲＮＡを使用した：Ａｌｕ−ＲＮＡ；ピロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）のシグナル認識粒子（ＳＲＰ）ＲＮＡのＡｌｕ−ドメインを含む１１０ヌクレオチド（未公開の（unpublished）構築物）、及び７６ヌクレオチドから構成されるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のｔＲＮＡＡｓｎ（未公開の構築物）。本発明者らは、５１ヌクレオチドのウリジンリッチ非構造化ＲＮＡ（ＵリッチＲＮＡ；５’−ＧＧＣＣＡＵＣＣＵＧＵ７ＣＣＣＵ１１ＣＵ１９−３’；配列番号１８）（Saito et al., 2008, Nature 454:523-527）、並びにインフルエンザＡウイルスのゲノムＲＮＡセグメント５由来の２つの部分的に折り畳まれたＲＮＡ：８１ヌクレオチドのパンハンドルＲＮＡ（ｐｈ−ＲＮＡ）（Baudin et al., 1994, EMBO J. 13:3158-3165）、及び単に保存３’末端及び５’末端を短鎖リンカーと共に含む３６ヌクレオチドのより短いパンハンドルＲＮＡ（短鎖ｐｈ−ＲＮＡ）（未公開の構築物）も使用した。環状一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８）（Fermentas）も使用して、エンドヌクレアーゼ活性を試験した。
１３μＭ ＰＡ−Ｎｔｅｒを様々なＲＮＡ基質（全て１０μＭ）と共に最終体積５０μＬで３７℃でインキュベートすることによりＲＮＡの切断を行った。反応緩衝剤は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール及び１ｍＭ 金属塩であった。ＥＧＴＡを最終濃度２０ｍＭで添加することによりインキュベーションを停止した。反応生成物を、８Ｍ 尿素／ポリアクリルアミドゲル（８％又は１５％）上に装荷し、メチレンブルーで染色した。ＰＡ−ＮｔｅｒのＲＮＡｓｅ活性に対する二価の陽イオンの効果を、種々の金属塩（ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２（又はｐＨ７ではＮｉＣｌ２）及びＣｏＣｌ２）の存在下でｐｈ−ＲＮＡをＰＡ−Ｎｔｅｒと共にインキュベートすることにより、ｐＨ８（β−メルカプトエタノールの存在下で）及びｐＨ７（β−メルカプトエタノールの非存在下で）で試験した。ＤＮＡの切断のために、環状一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡを使用した。１０μＬの反応体積（ＲＮＡの場合と同じ緩衝剤）で、１００ｎｇ／μＬの精製プラスミドＭ１３ｍｐ１８を、ＰＡ−Ｎｔｅｒ及び１ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下で６０分間インキュベートした。反応生成物を、０．８％ アガロースゲル上に装荷し、エチジウムブロマイドで染色した。２，４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（ＤＰＢＡ）によるエンドヌクレアーゼ阻害のために、ＰＡ−Ｎｔｅｒ及びｐｈ−ＲＮＡ又は一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡを、１ｍＭ ＭｎＣｌ２及び漸増濃度のＤＰＢＡの存在下でインキュベートした。ＤＰＢＡは水に難溶性であるため、６５ｍＭ ＤＰＢＡのストック溶液を５０％ エタノール中で調製し、所用の最終濃度を得るために各反応混合物に１μＬのＤＰＢＡ溶液のみを添加すればよいようにさらに希釈した。エタノール中における阻害剤の添加によっては反応混合物のｐＨは変化せず、同じ濃度のエタノール単独の添加はヌクレアーゼ活性に対する効果を有しなかった（データは示していない）。
部分的に構造化された８１ｎｔ ｐｈ−ＲＮＡを使用して、ＰＡ−Ｎｔｅｒが、二価陽イオン依存性である固有のＲＮａｓｅ活性を有することを実証することができた（図５）。ＲＮＰにおける結果（Doan et al., 1999, Biochemistry 38:5612-5619）に矛盾せず、ｐＨ８ではマンガンで強い活性が観察され、マグネシウムイオンでより弱い活性が観察された。ｐＨ７では、ＰＡ−Ｎｔｅｒのエンドヌクレアーゼ活性がコバルトでも観察された（図６）。４０分のインキュベーションの後、高度に構造化されたＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ及びＳＲＰ Ａｌｕ−ＲＮＡは分解に対して比較的耐性を有しており、部分的に構造化されたｐｈ−ＲＮＡ及び短鎖−ｐｈ−ＲＮＡは部分的に分解され、非構造化ＵリッチＲＮＡは完全に分解され、この酵素が一本鎖に特異的であることが示唆された（図７）。酵素は環状ｓｓＤＮＡも完全に分解し、これが非特異的なエンドヌクレアーゼであることが示された（図８）。ＲＮＡ及びＤＮＡの両方に対するエンドヌクレアーゼ活性は、化合物２，４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（既知のインフルエンザエンドヌクレアーゼの阻害剤）により用量依存的に阻害された（図９）。この化合物に関するＫｉは２６μＭと評価され、無傷のインフルエンザウイルスポリメラーゼによるキャップされたＲＮＡの切断を阻害する同じ化合物に関して報告されたＩＣ５０と非常に良く一致している（非特許文献１４）。
実施例３：熱シフトアッセイ
記載される（Ericsson et al., 2006, Anal. Biochem. 357:289-298）ように、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０又はｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中における１０μＭのＰＡ−Ｎｔｅｒ、及びＳＹＰＲＯ橙色素（Invitrogen）の５×希釈液を用いて、熱シフトアッセイを行った。１分当たり１℃の増加幅で２５℃から７５℃まで温度を増大させながら、色素を４９０ｎｍで励起させ、発光を５７５ｎｍで記録した。対照アッセイをタンパク質又は色素の非存在下で実施して、蛍光シグナルが記録されないことを確認した。
熱シフトアッセイを行って、二価の陽イオンの存在下及び非存在下におけるＰＡ−Ｎｔｅｒの熱安定性を調査した。実験により、マンガンイオンの添加による熱安定性の顕著な増大（見かけの融解温度が４４℃から５７℃まで移動する）、並びにカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの添加によるより低い程度の増大が明らかとなった（図１及び図２）。マンガンと結合したＰＡ−Ｎｔｅｒに対して化合物２，４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（既知のインフルエンザエンドヌクレアーゼの阻害剤）を滴定すると、熱安定性がさらに増大する（見かけの融解温度が５９℃から（form）６５℃まで移動する）（図４）が、阻害剤は金属を含まない酵素に対して効果を有しない（データは示していない）。
実施例４：遠紫外円二色性（ＣＤ）分光法
ペルチェサーモスタットを備えたJASCOのモデルＪ−８１０ ＣＤ分光偏光計により、１ｍＭの経路長で２０℃において遠紫外ＣＤスペクトルを記録した。ＰＡ−Ｎｔｅｒ濃度は、１ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下又は非存在下において、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ中における１０μＭであった。残基数を使用して平均残基楕円率を算出した（ＰＡ−Ｎｔｅｒは、開始メチオニンの前に７個のさらなる残基を加えた２０９残基長のものである）。２００ｎｍから２６０ｎｍまでの波長スキャンを記録し、８つの連続スキャンに対して平均化した（増加幅０．５ｎｍ、応答１ｓ、バンド幅１ｎｍ、及びスキャン速度５０ｎｍ／分）。
ＣＤ分光法により調査したマンガンのＰＡ−Ｎｔｅｒとの結合の構造的効果により、１ｍＭ Ｍｎ２＋の添加によるヘリックス含有量の顕著な増大（８〜９残基と推定される）が明らかとなった（図３）。
実施例５：結晶化及び結晶学
初回のシッティングドロップ・スクリーニングを、直角座標ロボットを使用して１００ｎＬのタンパク質溶液（６ｍｇ／ｍｌ）を１００ｎＬのウェル溶液と混合して、２０℃で実施した。その後、ウェル溶液：タンパク質溶液の比率を１：１とするハンギングドロップ法により、より大きな結晶を２０℃で得た。タンパク質溶液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２中における５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであった。リザーバ組成物は、結晶化条件の改良（refinement）後、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１．２Ｍ Ｌｉ２ＳＯ４、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、３％ エチレングリコールであった。結晶は１週間〜２週間後に出現し、典型的には５０×５０×１５μｍ３の体積を有していた。
凍結保護のために、２２％ エチレングリコールの存在下において液体窒素中で結晶を凍結した。回折データを、欧州シンクロトロン放射線施設（ＥＳＲＦ）のビームラインＩＤ１４−４及びＩＤ２３−１で１００Ｋで収集し、全てのデータを、ＸＤＳ ｓｕｉｔｅ（Kabsch, 1993, J. Appl. Cryst. 26:795-800）を使用して空間群Ｐ４３２１２においてインテグレーション及びスケーリングした（integrated and scaled）。さらなる１０ｍＭ ＭｎＣｌ２で２分間浸漬した後、最良のネイティブデータを、０．９７６Åの波長で２．０５Åの分解能まで収集した。さらに、未処理の結晶に関して１．８９Å（マンガンＫ端に近い）の波長でデータを測定して、いずれかの結合したマンガンイオンの位置及び同一性を明らかにした。構造を、５ｍＭ ＧｄＣｌ３を含有する母液に６時間浸漬した結晶から１．００８Åの波長で収集した高い冗長性を有するデータセット（２．５Å分解能まで）により解明した。３つの初期Ｇｄ部位を、ＨＫＬ２ＭＡＰ（Pape and Schneider, 2004, J. Appl. Cryst. 37:843-844）において実行されるＳＨＥＬＸＤ（Schneider and Sheldrick, 2002, Acta Crystallogr. D. Biol.Crystallogr. 58:1772-1779）を使用して、その異常差異に基づいて位置づけた。ＳＨＡＲＰ（deLa Fortelle et al., 1997, Methods in Enzymology 276:472-494）における単一波長異常分散（ＳＡＤ）法を使用して、これらの初期部位を精密化し、３．５Åまでの実験的位相を算出した。何回かの反復サイクルの後、残りのマップにおいてさらなる６つの部位を同定し、２．５Åまで位相を精密化した。これらの初期位相を、ＳＨＡＲＰにおける密度修正パッケージＳＯＬＯＭＯＮを用いて改善した。最終的に、ＣＣＰ４（共同計算プロジェクト（Collaborative Computational Project）、1994,Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50:760-763）において実行されるＤＭ（Cowtan, 1994, Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on ProteinCrystallography 31:34-38）を用いて平均化するためのＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger,2002, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58:2213-2215）により９つのＧｄ部位から特定した３倍ＮＣＳ演算子（operators）を使用することにより、明らかに解釈可能なマップを得た。この平均化マップは、ＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger, 2003, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 59:45-49）で６４８個の考え得るアミノ酸（そのうち８５個はアサインされた配列であり得た）のうち３９６個を構築するのに十分な質を有するものであった。手動で修正したモデル、及びその後の２．０５Åまでの高分解能データセットを、その後ＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:458-463）に入力して、より完全なモデルを得た。このモデルを、Ｏ（Joneset al., 1991, Acta Crystallogr. A 47:110-119）における手動の再構築サイクルで繰り返されるＲｅｆｍａｃ（Murshudov, 1997, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 53:240-255）を用いて精密化した。ＴＬＳ精密化、及び構造の部分に関する緊密なＮＣＳ制約（restraints）を使用して、最終的なＲ因子（Ｒ−ｆｒｅｅ）は０．２３３（０．２９１）である。ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ（Lovell et al., 2003, Proteins 50:437-450）によれば、９７．５％、９９．８％がそれぞれラマチャンドランプロットの好ましい（favoured）領域及び許容される（allowed）領域に存在する。結晶学的な詳細を、表１に要約する。非対称単位にＡ、Ｂ及びＤと示す３つの分子が存在する。金属イオン構造は分子Ａにおいて最も良く規定される。種々の分子が、大体整列した領域６９〜７４及び１３４〜１４３を有する。Ｎ末端タグの６つの残基、及び残基２０４〜２０９は視認できない。分子Ｄは全体として整列の程度が最も低い（表１）。記載される構造において、分子の２つ（Ｂ及びＤ）の間の結晶接触により多数の立体構造が示され、これはおそらく分解（resolution）に関するネイティブデータの比較的高いＲ因子を説明するものである。ＰｙＭＯＬ（DeLano, 2002、http://www.pymol.sourceforge.netでオンライン利用可能）を用いて構造図を描いた。図１１における配列アライメントを、ＥＳＰｒｉｐｔ（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）（Gouet et al., 1999, Bioinformatics 15:305-308）を用いて描いた。静電的表面（図１３）を、ＤｅｌＰｈｉ（Rocchia et al., 2002, J. Comput. Chem. 23:128-137）を使用して算出した。ＭＳＤＦＯＬＤ（http://www.ebi.ac.uk/msdsrv/ssm/cgi-bin/ssmserver）及びＤａｌｉｌｉｔｅ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/dalilite/index.html）を用いて構造類似性検索を行った。
本発明者らは、約２Åの分解能まで回折し、３つの独立した分子を非対称単位中に有する、マンガン及びマグネシウムの両方の存在下におけるＰＡ−Ｎｔｅｒの小さい正方形板状結晶を成長させた。結晶構造により、７つのαヘリックス及び混合的な５本鎖βシートを含む、視認可能な残基１〜１９６を有する単一の折り畳まれたドメインが明らかとなる（図１０）。表面図上に投影された、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス及びインフルエンザＣウイルスの間の構造に基づく配列アライメント（図１１）により、活性部位を示唆する、酸性残基が多いことにより強く負に帯電した、非常に高度に保存された窪み（depression）が明らかとなる（図１２及び図１３）。構造類似性検索は高スコアのヒットをもたらさず、全体的な（global）折り畳みが新規であることが示された。見出された最も類似のタンパク質は、ピロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）由来の古細菌ホリデイジャンクションリゾルバーゼＨｊｃである（Nishino et al., 2001, Structure 9:197-204）。ＰＡ−ＮｔｅｒのＨｊｃとの構造アライメントは、リゾルバーゼ及びＩＩ型制限酵素を含む多くのヌクレアーゼに特徴的な構造モチーフを包含するヘリックスα３及びβ鎖１〜５を重ね合わせる（図１４、左及び中央のパネル）。このモチーフは、触媒的に重要な二価の金属イオンと結合するＨｊｃの酸性残基Ａｓｐ３３及びＧｌｕ４６を含み、これにＰＡ−ＮｔｅｒのＡｓｐ１０８及びＧｌｕ１１９が正確に重ね合わせられる。ＰＡ−ＮｔｅｒのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（例えばＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＶ）との構造アライメントにより、活性部位元素の同様の重ね合わせが明らかとなる（図１４、右のパネル）。リジンは一次配列においては異なる位置に存在するが、ＥｃｏＲＶの触媒的に重要なＧｌｕ４５、Ａｓｐ７４、Ａｓｐ９０及びＬｙｓ９２が、それぞれＰＡ−ＮｔｅｒのＨｉｓ４１、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９及びＬｙｓ１３４と整列する（図１６）。保存されるリジンは、触媒作用中における攻撃する水酸化物求核試薬の安定化に関与する。したがってＰＡ−Ｎｔｅｒは、ＤＮＡ代謝の様々な態様に関与する多様な酵素を包含するＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫヌクレアーゼスーパーファミリーの新たな成員である。ＰＡ−Ｎｔｅｒにおいては、特徴的なモチーフが１０７−ＰＤＬＹＤＹＫ（配列番号２０）で生じるが、該スーパーファミリーの幾つかの他の成員と同様に、２つの酸性残基の間の距離間隔（separation）が異常に短く、推定の触媒的に重要なリジン（Ｌｙｓ１３４）が代替的な位置に「移動して（migrated）」いる。このファミリー内では、ＰＡ−Ｎｔｅｒは、ＲＮａｓｅとしての生物学的機能性を有し、活性部位にヒスチジンを有する点において独特である。
ＰＡ−Ｎｔｅｒの保存される酸性残基が金属結合残基であることを確認するために、本発明者らは、マンガンＫ吸収端で収集したデータを使用して異常差異マップを算出した。２つのマンガンイオンが、約３．８Åで分離される隣接異常ピークとして、各々の活性部位において同定された（図１５、左のパネル）。より強いピーク（Ｍｎ１）はＧｌｕ８０、Ａｓｐ１０８、及び２つの水分子に配位し、より弱い部位（Ｍｎ２）はＨｉｓ４１、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９、及びＩｌｅ１２０のカルボニル酸素に配位する。言及した残基は、（保存的に置換されるＩｌｅ１２０を除き）全てのインフルエンザウイルスＰＡ配列において絶対的に保存される（図１１）。２つの金属部位は、制限酵素、例えばＥｃｏＲＶにおいて観察される金属部位と密に対応する（図１５、右のパネル）。ヘリックスα３由来のＨｉｓ４１（ＥｃｏＲＶにおけるＧｌｕ４５と同様の位置にある）は、マンガン特異性を付与するのに重要であり得るが、これはマグネシウム及びカルシウムがヒスチジンとあまり容易に結合しないためである。Ｈｉｓ４１によるマンガンとの結合、及びその結果生じるヘリックスα３の安定化により、ＰＡ−Ｎｔｅｒをマンガンと共にインキュベートすることにより検出される付加的なヘリックス含有量（８〜９残基と推定される）を説明することができた（図３）。結晶においては、Ｍｎ１は隣接分子のループ由来のＧｌｕ５９にも配位する。ＰＡ−Ｎｔｅｒ上へのＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＶのＤＮＡ複合体の重ね合わせにより、Ｇｌｕ５９のカルボキシレート基が切断されやすいリン酸基の位置と密に対応することが示される（図１７）。したがって本発明者らの構造は、基質複合体又は生成物複合体を模倣している。
三量体ポリメラーゼに関する過去の観察結果と組み合わせた、本発明者らの構造的及び生化学的な結果により、ＰＡ−Ｎｔｅｒがキャップ・スナッチング時に宿主ｍＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼであるという説得力のある証拠がもたらされる。第１に、このドメインが、ウイルスＲＮＰに関して報告された観察結果に矛盾せず、マンガンにより選択的に活性化される固有のＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する（図６）。第２に、この活性は、インフルエンザエンドヌクレアーゼ活性を阻害することが知られている化合物により、ほぼ同一のＫｉで阻害される（図９）。第３に、このドメインは、広いファミリーのヌクレアーゼ（ＩＩ型エンドヌクレアーゼを含む）の触媒コアに特徴的な構造モチーフを含有する。活性部位は、３つの酸性残基（Ｇｌｕ８０、Ａｓｐ１０８及びＧｌｕ１１９）及び推定触媒リジン（Ｌｙｓ１３４）のクラスターを特徴付ける（図１４〜図１６）。第４に、これらの酸性残基は、Ｈｉｓ４１と共に、全てがインフルエンザウイルスにおいて絶対的に保存され、多くのヌクレアーゼに関して提唱されるような２金属依存性反応機構と立体配置的に矛盾せず、２つのマンガンイオンを配位させる（図１５、左のパネル）。
以下表２は配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０９によるＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜２０９に関する精密な原子構造座標のリストである。非対称単位にＡ、Ｂ及びＣと示す３つの分子が存在する。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラム中の最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コードが与えられ、アミノ酸配列位置が与えられる。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標により特定される位置を占有する分子の割合（fraction）を表す。値「１」は、各原子が結晶中の全ての分子において同じ立体構造、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。異方性温度因子は、「ＡＮＩＳＯＵ」と記したラインにおいて与えられる。この命名は、ＰＤＢファイル形式に対応する。
（表２）

Claims (25)

  1. エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含む可溶性ポリペプチド断片であって、
    前記ＰＡサブユニットがオルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のものであり、
    前記ＰＡサブユニットのアミノ末端断片は、
    （ｉ）配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１位〜１５位のいずれか１つの位置から開始し、１８６位〜２２０位のいずれか１つの位置で終了するアミノ酸配列を含むＰＡサブユニットのアミノ末端断片又はその断片の全長と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつエンドヌクレアーゼ活性を保持する変異体、
    （ｉｉ）配列番号４に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１位〜１５位のいずれか１つの位置から開始し、１８５位〜２１７位のいずれか１つの位置で終了するアミノ酸配列を含むＰＡサブユニットのアミノ末端断片またはその断片の全長と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつエンドヌクレアーゼ活性を保持する変異体、及び
    （ｉｉｉ）配列番号６に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１位〜１５位のいずれか１つの位置から開始し、１６８位〜２００位のいずれか１つの位置で終了するアミノ酸配列を含むＰＡサブユニットのアミノ末端断片またはその断片の全長と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつエンドヌクレアーゼ活性を保持する変異体、
    からなる群から選択されるものであり、
    前記ポリペプチド断片のうち、（ｉ）〜（ｉｉｉ）で特定されない他のアミノ酸残基に関して、ＰＡサブユニットのアミノ末端断片に（ｉ）を選択する場合は（ｉ）〜（ｉｉｉ）で特定されない他のアミノ酸残基はインフルエンザＡウイルスのＰＡタンパク質由来のものでなく、ＰＡサブユニットのアミノ末端断片に（ｉｉ）を選択する場合は（ｉ）〜（ｉｉｉ）で特定されない他のアミノ酸残基はインフルエンザＢウイルスのＰＡタンパク質由来のものでなく、ＰＡサブユニットのアミノ末端断片に（ｉｉｉ）を選択する場合は（ｉ）〜（ｉｉｉ）で特定されない他のアミノ酸残基はインフルエンザＣウイルスのＰＡタンパク質由来のものでない、
    ＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含む可溶性ポリペプチド断片。
  2. 結晶化可能である、請求項１に記載のポリペプチド断片。
  3. ２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ及び２．５ｍＭＭｎＣｌ２中における５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液、並びに１．２ＭＬｉ２ＳＯ４、１００ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び３％エチレングリコールからなるリザーバ溶液を使用して結晶化可能である、請求項２に記載のポリペプチド断片。
  4. ＰＡサブユニットが、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス若しくはインフルエンザＣウイルス由来のものである、又はその変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
  5. ２つの二価の陽イオンが結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
  6. 二価の陽イオンはマンガンである、請求項５に記載のポリペプチド断片。
  7. 配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０９からなり、明細書の表２に示される構造座標により規定される構造を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
  8. アミノ酸配列ＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号１９）を含むアミノ末端リンカーを含む、請求項７に記載のポリペプチド断片。
  9. ポリペプチド断片が、空間群Ｐ４３２１２、及びａ＝ｂ＝６．７１±０．２ｎｍ、ｃ＝３０．２９ｎｍ±０．４ｎｍの単位格子寸法を有する結晶形態を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
  10. 結晶が、２．５Å以上、又は２．１Å以上の分解能までＸ線を回折する、請求項９に記載のポリペプチド断片。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  13. 請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項１２に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
  14. オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
    （ａ）明細書の表２に示される請求項７に記載のポリペプチド断片の構造座標により規定される活性部位のコンピュータモデルを構築する工程、
    （ｂ）活性調節可能性のある化合物を選択する工程であって、
    （ｉ）分子断片を集合化させて前記化合物とすること、
    （ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
    （ｉｉｉ）前記化合物の新規リガンド設計
    からなる群から選択される方法により活性調節可能性のある化合物を選択する工程、
    （ｃ）演算手段を利用する工程であって、該活性部位における前記化合物のエネルギーを最小化した立体配置を提供するために、前記化合物と前記活性部位とのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、利用する工程、並びに
    （ｄ）前記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、前記化合物と該活性部位モデルとの間の会合を定量化し、それにより前記活性部位と会合する前記化合物の能力を評価する、評価する工程
    を含む、方法。
  15. 活性部位が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＬｙｓ１３４に対応するアミノ酸を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 活性部位が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０及びＧｌｕ１１９に対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 活性部位が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｕ１３３及びＬｙｓ１３７に対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. （ｅ）化合物を合成するさらなる工程を含む、
    請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. （ｆ）１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体と共に化合物又はその薬学的に許容可能な塩を配合するさらなる工程を含む、
    請求項１８に記載の方法。
  20. （ｇ）ＰＡサブユニットポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を調節する化合物の能力を確定する、化合物と請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド断片又は請求項１３に記載の組換え宿主細胞とを接触させるさらなる工程を含む、
    請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. ＰＡサブユニット又はそのポリペプチド変異体のエンドヌクレアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
    （ｉ）請求項１〜１０に記載のポリペプチド断片又は請求項１３に記載の組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程、及び
    （ｉｉ）前記ＰＡサブユニットポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を調節する前記試験化合物の能力を分析する工程
    を含む、方法。
  22. ＰＡサブユニットポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を分析する、請求項２１に記載の方法。
  23. ハイスループット設定において行われる、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 試験化合物が小分子、ペプチド又はタンパク質である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. １つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体と共に化合物又はその薬学的に許容可能な塩を配合する工程をさらに含む、請求項１４〜２０及び２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
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