JP2016005454A - ウリジンとn−アセチル−d−マンノサミンとを含有する培地 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)細胞を培養して糖蛋白質を発現させるために用いる培地であって,0.5〜10mMの濃度のウリジンと,1〜15mMの濃度のN−アセチル−D−マンノサミンとを含有する,培地。
(2)該ウリジンの濃度が1〜8mMであり,該N−アセチル−D−マンノサミンの濃度が4〜12mMである,上記(1)に記載の培地。
(3)該ウリジンの濃度が2〜5mMであり,該N−アセチル−D−マンノサミンの濃度が5〜10mMである,上記(1)に記載の培地。
(4)該ウリジンの濃度が約3mMであり,該N−アセチル−D−マンノサミンの濃度が約8mMである,上記(1)に記載の培地。
(5)L−アラニル−Lグルタミンを更に含有するものである,上記(1)乃至(4)のいずれかに記載の培地。
(6)該L−アラニル−Lグルタミンの濃度が0.5〜5mMである,上記(5)に記載の培地。
(7)該L−アラニル−Lグルタミンの濃度が1〜3mMである,上記(5)に記載の培地。
(8)該L−アラニル−Lグルタミンの濃度が約2mMである,上記(5)に記載の培地。
(9)血清を含まないものである,上記(1)乃至(8)のいずれかに記載の培地。
(10)該細胞が,哺乳動物細胞,植物細胞及び昆虫細胞からなる群から選択されるものである,上記(1)乃至(9)のいずれかに記載の培地。
(11)該細胞が,哺乳動物細胞である,上記(10)に記載の培地。
(12)該哺乳動物細胞がCHO細胞である,上記(11)に記載の培地。
(13)糖蛋白質をコードする外来のDNAにより形質転換された細胞,又は内因性遺伝子強発現するように改変された細胞を,上記(1)乃至(10)のいずれがに記載の培地で培養することを含んでなる,該糖蛋白質の製造方法。
(14)該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,形質転換された該細胞において該糖蛋白質が発現されるように,発現ベクターに組み込まれたものである,上記(13)に記載の製造方法。
(15)
該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,ヒト由来のDNAである上記(13)又は(14)に記載の製造方法。
(16)糖蛋白質をコードする外来のDNAにより形質転換された哺乳動物細胞,又は内因性遺伝子強発現するように改変された哺乳動物細胞を,上記(11)又は(12)に記載の培地で培養することを含んでなる,該糖蛋白質の製造方法。
(17)該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,形質転換された該哺乳動物細胞において該糖蛋白質が発現されるように,発現ベクターに組み込まれたものである,上記(16)に記載の製造方法。
(18)該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,ヒト由来のDNAである上記(16)又は(17)に記載の製造方法。
(19)該哺乳動物細胞が,36〜37℃の温度で培養された後,30〜35℃の温度で培養されるものである,上記(16)乃至(18)のいずれかに記載の製造方法。
(20)該哺乳動物細胞が,36〜37℃の温度で培養された後,31〜33℃の温度で培養されるものである,上記(16)乃至(18)のいずれかに記載の製造方法。
(21)該哺乳動物細胞が,36〜37℃の温度で培養された後,約32℃の温度で培養されるものである,上記(16)乃至(18)のいずれかに記載の製造方法。
(22)該糖蛋白質が,α−ガラクトシダーゼA,酸性スフィンゴミエリナーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ,ヘキソサミニダーゼ,α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ,α−マンノシダーゼ,イズロン酸2−スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ,ガルスルファーゼ,α−L−イズロニダーゼ,シアリダーゼ,酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA),血液凝固第VII因子,血液凝固第VIII因子,血液凝固第IX因子等の血液凝固因子,インターロイキン6等のリンホカイン,顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF),顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF),マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)等の成長因子,エリスロポエチン,インターフェロン,トロンボモジュリン,卵胞刺激ホルモン,DNasel,甲状腺刺激ホルモン(TSH),マウス抗体,ヒト化マウス抗体,ヒト・マウスキメラ抗体,ヒト抗体,PD−1,PD−1リガンド及び卵胞刺激ホルモンからなる群から選択されるものである,上記(13)乃至(21)のいずれかに記載の製造方法。
(23)該糖蛋白質が,エリスロポエチンである,上記(13)乃至(21)のいずれかに記載の製造方法。
(24)該糖蛋白質が糖鎖にシアル酸を含むものである,上記(13)乃至(23)のいずれかに記載の製造方法。
(25)培養終了後に培養物を回収し,次いで該回収された培養物から該動物細胞を除去することにより,該糖蛋白質を含有する培養上清を調製するステップを更に含むものである,上記(13)乃至(24)のいずれかに記載の製造方法。
プライマーセット,プライマーEPO−5’(配列番号1)及びプライマーEPO−3’(配列番号2),を用いて,ヒト胎児肝臓由来のcDNAライブラリー(Clontech社)からPCRでヒトエリスロポエチンのcDNAを増幅した。
CHO細胞(CHO−K1)を理化学研究所より入手した。1X107個のCHO細胞を,Lipofectamine2000(Invitrogen社)を用い,上記ヒトエリスロポエチン発現ベクター20μgにより,慣用の方法で形質転換し,次いで,10%の牛胎仔血清(FBS)とG418(SIGMA社)を0.8 mg/mL含むHam−F12培地(Invitrogen社)で選択培養して,ネオマイシンに耐性の安定した形質転換体を得た。次に,細胞を無血清培地に馴化させるために,L−グルタミンを4mM,ヒポキサンチンを10mg/L,チミジンを4mg/L,G418を120mg/L添加した市販の血清不含EX−CELL302TM培地(JRH社)中に細胞を移し,細胞の増殖が安定するまで連続的に培養した。得られた細胞を,10%のFBSと10%のDMSOを含むHam−F12培地に懸濁させ,液体窒素中に保存し,種細胞とした。
液体窒素中に保存した上記種細胞を,37℃恒温槽ですばやく解凍し,CD OptiCHOTM培地(ライフテクノロジース社)に,2mM GlutaMAX(ライフテクノロジーズ社)及び1XHTサプリメント(ライフテクノロジーズ社)を添加した培地(基礎培地)に懸濁した後,遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞を基礎培地で懸濁して細胞懸濁液とし,生細胞数を測定した。生細胞の密度が2×105個/mLとなるように細胞懸濁液を基礎培地で希釈した。細胞懸濁液を120mLずつ培養容器に分注して4群とし,5% CO2存在下,37℃で5日間培養した。このときの培養は,Bio Jr.8(100mL×8連培養装置,AbleBiott社)を用いて行い,また培養期間中は,培地のpHを6.9に維持するとともに,培養液中の溶存酸素濃度(DO)を40%に維持した。またこのとき,各群(第1群〜第4群)に,表1に示す濃度のウリジンとN−アセチル−D−マンノサミンとを,それぞれ添加した。各群とも培養は4回実施した。
上記培養の5日目に,10mLの培養液を遠心管に回収し,3000rpmで10分間遠心した後,上清を回収し,回収した培養上清を純水で1.5倍に希釈した。次いで,20mM トリス緩衝液(pH 7.5)で予め平衡化したマルチモーダル陰イオン交換樹脂CaptoTM adhereカラム(カラム体積:1mL,GEヘルスケアバイオサイエンス社)に,この希釈した培養上清を7.5mL負荷した。カラム体積5倍容の20mMトリス緩衝液(pH 7.5)でカラムを洗浄した後,200mMのNaClを含む20mM トリス緩衝液(pH 7.5)で,樹脂に吸着させた組換えヒトエリスロポエチンを溶出させて,溶出画分を得た。この溶出画分をAmicon Ultra−4遠心式フィルターユニット(分画分子量:3kDa,ミリポア社)を用いて,液量が100μLとなるまで濃縮した。
各群の濃縮液を,キャピラリー電気泳動システム(P/ACETMシステムMDQ,ベックマンコールタール社)に装着したBare Fused−Silica Capillary(50μm ID,375μmOD,全長50cm,ベックマンコールタール社)を用いて,キャピラリー電気泳動した。このとき,電気泳動バファーとして,10mM 塩化ナトリウム,500mM 酢酸ナトリウム,7M 尿素及び2.5mM プトレシンを含有する10mM トリス緩衝液(pH4.5)を用い,24μAの一定電流で50分間電気泳動をした。また,UV検出器を用いて214nmの波長をモニターし,電気泳動された組換えヒトエリスロポエチンを検出した。
上記キャピラリー電気泳動で検出された等電点の異なるイソフォームの中で,最も等電点の低いイソフォームを1型とし,等電点が低い順に,2型,3型とした。検出された全てのイソフォームに占める1型,2型及び3型の比率を算出し,各群で比較した。各群における1型,2型及び3型の比率を図3に示す。基礎培地で細胞を培養して得た第1群の組換えヒトエリスロポエチンでは,1型,2型及び3型の比率が,それぞれ約0.7%,約5%及び約15%であった(図3)。
上記の分析結果から,培地に8mMのN−アセチル−D−マンノサミンを添加して,又は培地に8mMのN−アセチル−D−マンノサミンと3mMのウリジンを添加して,組換えヒトエリスロポエチン遺伝子を導入した細胞を培養することにより,組換えヒトエリスロポエチン1分子当たり付加されるシアル酸の分子数を増加させ得ることがわかった。組換えヒトエリスロポエチン1分子当たり付加されるシアル酸の分子数は,これらの培地を用いて細胞を培養する方法と,他の方法,例えば,細胞の培養期間中に培養温度を段階的に下げる等の方法と組み合わせることにより,更に増加させることができると考えられる。
pEF/myc/nucベクター(インビトロジェン社)を,KpnIとNcoIで消化し,EF−1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI−neoベクター(インビトロジェン社)を,BgIII及びEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に,T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF−1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して,pE−neoベクターを構築した(図5)。
CHO細胞(CHO−K1:American Type Culture Collectionより購入)に,Lipofectamine2000(Invitrogen社)を用いて,前記発現用ベクターpE−neo(FSHα)及びpE−hygr(FSHβ)を下記の方法でトランスフェクトした。すなわち,予めトランスフェクション前日にコンフルエントに近い細胞密度となるように3.5cm培養皿にCHO−K1細胞を播種し,一晩5%炭酸ガス通気下37℃で培養した。翌日,細胞をPBS(−)で2回洗浄した後,1mLの血清を含まないD−MEM/F12培地(インビトジェン社)を培養皿に添加した。次いで,培養皿にOpti−MEM I培地(インビトロジェン社)で20倍に希釈したLipofectamine2000溶液と,13.2μg/mLのpE−neo(FSHα)と6.6μg/mLのpE−hygr(FSHβ)とを含有するプラスミドDNA溶液の等量混液を200μL添加し,37℃で5時間,トランスフェクションした。
液体窒素中に保存した上記種細胞を,37℃恒温槽ですばやく解凍し,CD OptiCHOTM培地(ライフテクノロジーズ社)に,2mM GlutaMAX(ライフテクノロジーズ社)及び1XHTサプリメント(ライフテクノロジーズ社)を添加した培地(基礎培地)に懸濁した後,遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞を基礎培地で懸濁して細胞懸濁液とし,生細胞数を測定した。生細胞の密度が2×105個/mLとなるように細胞懸濁液を基礎培地で希釈した。細胞懸濁液を120mLずつ培養容器に分注して4群とし,5%CO2存在下,37℃で5日間培養した。このときの培養は,Bio Jr.8(100mL×8連培養装置,AbleBiott社)を用いて行い,また培養期間中は,培地のpHを6.9に維持するとともに,培養液中の溶存酸素濃度(DO)を40%に維持した。またこのとき,各群(第1〜4群)に,表2に示す濃度のウリジンとN−アセチル−D−マンノサミンとを,それぞれ添加した。各群とも培養は2回実施した。
上記培養の5日目に,10mLの培養液を遠心管に回収し,3000rpmで10分間遠心した後,上清を回収した。次いで,PBS(pH 7.4)で予め平衡化したFSHアフィニティー樹脂CaptureSelectTM FSH(カラム体積,1mL;ライフテクノロジーズ)に,培養上清を20mL負荷した。カラム体積5倍容のPBS(pH7.4)でカラムを洗浄した後,2MのMgCl2を含む20mM トリス緩衝液(pH7.4)で,樹脂に吸着させた組換えヒトFSHを溶出させて,溶出画分を得た。この溶出画分をAmicon Ultra−4遠心式フィルターユニット(分画分子量:3kDa)を用いて,水で希釈/濃縮を実施した。最終的に液量が100μLとなるまで濃縮し,各群(1〜4群)の各々について精製組換えヒトFSH濃縮液を得た。精製組換えヒトFSH濃縮液の組換えヒトFSHの濃度を1mg/mLに調整した。
各群の精製組換えヒトFSH濃縮液(50μL)を,37℃で30分間,0.3M水酸化ナトリウムでアルカリ処理し,次いで,80℃で60分間,0.05M塩酸で処理をすることにより,組換えヒトFSHを構成する糖鎖を単糖にまで加水分解した。次いで,蛍光試薬(9.6mM 1,2−ジアミノ−4,5−メチレンジオキシベンゼン,24mMハイドロサルファイトナトリウム,及び1M 2−メルカプトエタノールを含む水溶液)を添加して,50℃で150分間加熱し,加水分解して得られた糖を蛍光ラベルし,この反応溶液をサンプル溶液とした。このとき,標準品としてシアル酸を同様に処理し,蛍光ラベルされたシアル酸の標準品を得た。この標準品を,逆相カラムとしてCOSMOSIL 5C18−PAQを用いてHPLC分析し,シアル酸のピークが得られる溶出時間を測定した。次いで,サンプル溶液をHPLC分析し,シアル酸に対応するピークの面積を求めた。
上記の分析結果から,培地に8mMのN−アセチル−D−マンノサミンと3mMのウリジンを添加して,所望の糖蛋白質をコードする遺伝子又は外来のDNAを導入した細胞を培養することにより,組換え糖蛋白質1分子当たり付加されるシアル酸の分子数を増加させ得ることがわかった。組換え糖蛋白質1分子当たり付加されるシアル酸の分子数は,これらの培地を用いて細胞を培養する方法と,他の方法,例えば,細胞の培養期間中に培養温度を段階的に下げる等の方法と組み合わせることにより,更に増加させることができると考えられる。
Claims (25)
- 細胞を培養して糖蛋白質を発現させるために用いる培地であって,0.5〜10mMの濃度のウリジンと,1〜15mMの濃度のN−アセチル−D−マンノサミンとを含有する,培地。
- 該ウリジンの濃度が1〜8mMであり,該N−アセチル−D−マンノサミンの濃度が4〜12mMである,請求項1に記載の培地。
- 該ウリジンの濃度が2〜5mMであり,該N−アセチル−D−マンノサミンの濃度が5〜10mMである,請求項1に記載の培地。
- 該ウリジンの濃度が約3mMであり,該N−アセチル−D−マンノサミンの濃度が約8mMである,請求項1に記載の培地。
- L−アラニル−L−グルタミンを更に含有するものである,請求項1乃至4のいずれかに記載の培地。
- 該L−アラニル−L−グルタミンの濃度が0.5〜5mMである,請求項5に記載の培地。
- 該L−アラニル−L−グルタミンの濃度が1〜3mMである,請求項5に記載の培地。
- 該L−アラニル−L−グルタミンの濃度が約2mMである,請求項5に記載の培地。
- 血清を含まないものである,請求項1乃至8のいずれかに記載の培地。
- 該細胞が,哺乳動物細胞,植物細胞,及び昆虫細胞からなる群から選択されるものである,請求項1乃至9のいずれかに記載の培地。
- 該細胞が,哺乳動物細胞である,請求項10に記載の培地。
- 該哺乳動物細胞がCHO細胞である,請求項11に記載の培地。
- 糖蛋白質をコードする外来のDNAにより形質転換された細胞,又は内因性遺伝子強発現するように改変された細胞を,請求項1乃至10のいずれかに記載の培地で培養することを含んでなる,該糖蛋白質の製造方法。
- 該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,形質転換された該細胞において該糖蛋白質が発現されるように,発現ベクターに組み込まれたものである,請求項13に記載の製造方法。
- 該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,ヒト由来のDNAである請求項13又は14に記載の製造方法。
- 糖蛋白質をコードする外来のDNAにより形質転換された哺乳動物細胞,又は内因性遺伝子強発現するように改変された哺乳動物細胞を,請求項11又は12に記載の培地で培養することを含んでなる,該糖蛋白質の製造方法。
- 該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,形質転換された該哺乳動物細胞において該糖蛋白質が発現されるように,発現ベクターに組み込まれたものである,請求項16に記載の製造方法。
- 該糖蛋白質をコードする外来のDNAが,ヒト由来のDNAである請求項16又は17に記載の製造方法。
- 該哺乳動物細胞が,36〜37℃の温度で培養された後,30〜35℃の温度で培養されるものである,請求項16乃至18のいずれかに記載の製造方法。
- 該哺乳動物細胞が,36〜37℃の温度で培養された後,31〜33℃の温度で培養されるものである,請求項16乃至18のいずれかに記載の製造方法。
- 該哺乳動物細胞が,36〜37℃の温度で培養された後,約32℃の温度で培養されるものである,請求項16乃至18のいずれかに記載の製造方法。
- 該糖蛋白質が,α−ガラクトシダーゼA,酸性スフィンゴミエリナーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ,ヘキソサミニダーゼ,α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ,α−マンノシダーゼ,イズロン酸2−スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ,ガルスルファーゼ,α−L−イズロニダーゼ,シアリダーゼ,酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA),血液凝固第VII因子,血液凝固第VIII因子,血液凝固第IX因子等の血液凝固因子,インターロイキン6等のリンホカイン,顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF),顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF),マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)等の成長因子,エリスロポエチン,インターフェロン,トロンポモジュリン,卵胞刺激ホルモン,DNasel,甲状腺刺激ホルモン(TSH),マウス抗体,ヒト化マウス抗体,ヒト・マウスキメラ抗体,ヒト抗体,PD−1,PD−1リガンド及び卵胞刺激ホルモンからなる群から選択されるものである,請求項13乃至21のいずれかに記載の製造方法。
- 該糖蛋白質が,エリスロポエチン又は卵胞刺激ホルモンである,請求項13乃至21のいずれかに記載の製造方法。
- 該糖蛋白質が糖鎖にシアル酸を含むものである,請求項13乃至23のいずれかに記載の製造方法。
- 培養終了後に培養物を回収し,次いで該回収された培養物から該動物細胞を除去することにより,該糖蛋白質を含有する培養上清を調製するステップを更に含むものである,請求項13乃至24のいずれかに記載の製造方法。
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