JP2015535176A - 肝細胞癌における全生存期間および無再発生存期間の新規な予測方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、肝細胞癌(HCC)管理の技術分野、より詳しくは、HCC悪性度の予測および関連の治療決定に関する。本発明は、遺伝子TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANを含んでなる発現プロファイルのin vitro判定および分析に基づくHCC悪性度の新規な予測方法を提供する。本発明はまた、HCC悪性度の予測のためのキット、および対象HCC悪性度の事前予測に基づく被験体におけるHCCの治療方法を提供する。
Description
本発明は、肝細胞癌(HCC)管理の技術分野、より詳しくは、HCC悪性度の予測および関連の治療決定に関する。本発明は、遺伝子TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANを含んでなる発現プロファイルのin vitro判定および分析に基づくHCC悪性度の新規な予測方法を提供する。本発明はまた、HCC悪性度の予測のためのキット、および対象HCC悪性度の事前予測に基づく被験体におけるHCCの治療方法を提供する。
肝細胞腫瘍は、悪性(肝細胞癌またはHCC)および良性(肝細胞腺腫またはHCA、限局性結節性過形成またはFNH、および再生性大結節性)腫瘍を含む不均質な腫瘍群から構成される。
HCCは、アジアおよびアフリカにおいて大きな健康問題となっており、主として慢性B型肝炎感染の割合が高いことで説明されるが、西洋諸国でもその罹患率は絶えず上昇しており、90%を超えるHCCが肝硬変へと進行する。西洋諸国では、基礎にある肝疾患の主因は、慢性B型およびC型肝炎ならびにアルコール摂取である。代謝症候群の結果としての非アルコール性脂肪性肝炎もまた、増えてきている慢性肝疾患およびHCCの原因である。稀ではあるが(症例の10%前後)、HCCは非硬変性肝へと進行する。
外科的切除は、HCCの重要な治癒的治療に相当するが、高い再発率(5年で50%〜70%)および腫瘍関連死(5年で30%〜50%)により問題がある(Ishizawa T Gastroenterology 2008)。
従って、HCC患者の全生存期間および早期腫瘍再発を推定または予測することを可能とする簡単なツールの必要がある。
実際に、患者のHCCの悪性度によって、前記患者の臨床管理は異なる。
・低悪性度(すなわち、全生存期間および早期再発の良好な予測)の場合には、経過観察だけが推奨され得る;
・対照的に、高悪性度(すなわち、全生存期間および早期再発の不良な予測)の場合には、細胞傷害性化学療法(ドキソルビシンまたはゲムシタビンおよびオキサリプラチンの併用)または標的療法(ソラフェニブ)を用いた補助療法が推奨され得る。
・低悪性度(すなわち、全生存期間および早期再発の良好な予測)の場合には、経過観察だけが推奨され得る;
・対照的に、高悪性度(すなわち、全生存期間および早期再発の不良な予測)の場合には、細胞傷害性化学療法(ドキソルビシンまたはゲムシタビンおよびオキサリプラチンの併用)または標的療法(ソラフェニブ)を用いた補助療法が推奨され得る。
このような状況にあっては、被験体の肝臓サンプルの分子プロファイリングに基づく簡単な予後ツールが極めて有用となる。
EPCAM(Yamashita T, et al. 2008; Lee JS, et al. 2006)およびKRT19(Lee JS, et al. 2006; Durnez A, et al, 2006)などのいくつかの遺伝子がHCC予後に関連付けられている。
術後2年以内の腫瘍再発と定義される早期再発は、主として腫瘍の生物学に関連する(Imamura H J hepatol 2003)。本発明者らはこれまでにHCCの6つのサブグループ(G1〜G6)への分子的分類を記載しており、G3サブグループのHCCは予後が不良であることを示した(Boyault S Hepatology 2007; Villanueva A Gastroenterology 2011; WO2007/063118A1)。HCC再発および関連死の他の分子シグネチャーも公開されているが、それらの中で外的に妥当性が評価されたものはほとんどない(Villanueva A, clinical cancer res 2010)。妥当性が評価された予後分類の1つが、パラフィン包埋組織において従前に妥当性が認められたG3シグネチャーであった(Boyault S Hepatology 2007, Villanueva A, gastroenterology 2011)。さらに、無再発生存期間の予測のための数種のシグネチャー(良好な予後は術後最初の4年間に再発が無いことに関連付けられ、不良な予後は術後最初の2年間の再発に関連付けられる)も、WO2007/063118A1に記載されている。
これに対して、術後3年以降の腫瘍再発と定義される後期再発は、主として周囲の非腫瘍組織の特徴に関連する(「発癌性の場の効果(carcinogenic field effect)」)。非腫瘍性肝臓サンプルに由来する196の遺伝子の分子シグネチャーが後期再発および全生存期間に関連付けられ、基礎にある肝硬変の重篤度および発癌能のサロゲートマーカーと考えることができる(Hoshida Y, NEJM, 2008)。さらに、5年全生存期間(再発有りまたは無し)の予測のいくつかのシグネチャーもWO2007/063118A1に記載されている。
上記従来技術のツールはHCC悪性度の予測に有用ではあるが、切除されたHCCの全生存期間および早期再発を推定するために、妥当性が認められたより有力な腫瘍分子シグネチャーの必要がなおある。
特に、予後によって選択される治療管理が異なることを鑑みれば、この種の治療決定を考慮するために使用される予後方法は高感度かつ特異的であって、高い陽性反応的中度(PPV)、陰性反応的中度(NPV)および精度(ROC曲線下面積またはAUCにより評価される)を示すことが重要である。
さらに、全生存期間と早期再発の両方を推定することができたならば、臨床医に極めて有用となろう。この点について、本発明者らは、従来技術に記載されている予後ツールはどれも全生存期間の予測と早期再発の予測に関して異なることを注記しておく。特に、WO2007/063118A1に開示されている全生存期間(global survival)(すなわち、全生存(overall survival))の最良の予測因子と無再発生存期間の最良の予測因子(早期再発も推定する)は異なり、臨床医にとって実用的ではない。
さらに、HCC予後の分子シグネチャーの同定を試みる多くの研究が特定の病因を有する(例えば、HBV関連またはHCV関連HCC、Nault JC, semliver dis 2011, Woo HG gastroenterology 2011, Hsu HC Am J pathol 2000参照)患者のコホートに基づいており、このようなコホートで同定された分子シグネチャーの一般適用性には問題のある可能性があり、いずれにせよ、他のHCC病因を有する患者でのさらなるバリデーションが必要である。
よって、全生存期間と早期再発の両方の推定を可能とし、高い感度、特異性、PPV、NPVおよび精度を示す、簡単かつ信頼性の高い予後ツールの必要がなお存在する。
種々のHCCサンプルから得られたマイクロアレイデータの分析の新規な戦略に基づき、本発明者らは、上記の基準を満たす簡単かつ信頼性のある分子予後ツールを構築した:
・本ツールは、全生存期間と早期再発の同時推定を可能とするので極めて簡単である。さらに、予後に必要とされるのは5つの遺伝子の発現レベルの分析だけであり、これも本検査の簡便性に寄与する;また
・腫瘍関連死を推定するための時間依存性曲線下面積(AUC)は119名の患者のバリデーションコホートで0.80に達したことから、本ツールは信頼性が高い。含む患者数が多いことならびにそれらのHCC癌の病因が多様であることが、本検査の信頼性および一般適用性をさらに担保する。特に、本予後は、硬変による根拠、腫瘍サイズおよび病理学的特徴に依存しない。
・本ツールは、全生存期間と早期再発の同時推定を可能とするので極めて簡単である。さらに、予後に必要とされるのは5つの遺伝子の発現レベルの分析だけであり、これも本検査の簡便性に寄与する;また
・腫瘍関連死を推定するための時間依存性曲線下面積(AUC)は119名の患者のバリデーションコホートで0.80に達したことから、本ツールは信頼性が高い。含む患者数が多いことならびにそれらのHCC癌の病因が多様であることが、本検査の信頼性および一般適用性をさらに担保する。特に、本予後は、硬変による根拠、腫瘍サイズおよび病理学的特徴に依存しない。
発明の説明
よって、本発明は、
HCCに罹患している被験体において前記被験体の肝臓サンプルからの全生存期間および/または無再発生存期間のin vitro予後の方法であって、
a)前記肝臓サンプルからin vitroにおいて下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルを決定すること;および
b)少なくとも1つの参照HCC肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、前記発現プロファイルに基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測すること
を含んでなる方法に関する。
よって、本発明は、
HCCに罹患している被験体において前記被験体の肝臓サンプルからの全生存期間および/または無再発生存期間のin vitro予後の方法であって、
a)前記肝臓サンプルからin vitroにおいて下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルを決定すること;および
b)少なくとも1つの参照HCC肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、前記発現プロファイルに基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測すること
を含んでなる方法に関する。
「被験体」とは、性別または年齢を問わず、任意のヒト被験体を意味する。被験体はHCCに罹患しており、好ましくは、外科的肝腫瘍切除を受けている。
本発明によれば、HCC進行の「予測」は、特定のHCC腫瘍の、この特定のHCC腫瘍に罹患している患者に相対的な将来の進行の推定を意味する。本発明による方法は、全生存期間予測と無再発生存期間予測の両方を同時に可能とする。
「全生存期間予測」とは、再発有りまたは無しの生存期間の予測を意味する。前述のように、HCCに対する主要な現行治療は、腫瘍の外科的切除である。結果として、「不良な全生存期間予測」は、肝臓切除後3年以内の死亡の発生と定義され、「良好な全生存期間予測」は、術後5年間死亡が無いことと定義される。
「無再発生存期間予測」とは、再発(relapse)または再発(recurrence)の無い生存期間の予測を意味する。「不良な無再発生存期間予測」は、肝臓切除後2年以内の腫瘍再発の存在と定義され、「良好な無再発生存期間予測」は、術後4年間の再発が無いことと定義される。「再発(relapse)」または「再発(recurrence)」とは、一般には腫瘍の外科的切除による初期治療の後に、同じ被験体でHCCが再び増殖することを意味する。
本発明による上記方法では、参照サンプルは、アルゴリズムを較正するために使用され、そのアルゴリズムはその後、全生存期間および/または無再発生存期間を予測するために使用可能である。本発明の方法の有利な実施態様では、全生存期間および無再発生存期間を予測するために使用される1または複数のアルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルは、下記のもの:
a)全生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも5年生存した患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプルおよび腫瘍切除後3年以内に死亡した患者由来の少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプル;
b)無再発生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも4年間再発しなかった患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプルおよび腫瘍切除後2年以内に再発した患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプル
である。
a)全生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも5年生存した患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプルおよび腫瘍切除後3年以内に死亡した患者由来の少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプル;
b)無再発生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも4年間再発しなかった患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプルおよび腫瘍切除後2年以内に再発した患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプル
である。
本発明による方法では、肝臓サンプルが分析される。「肝臓サンプル」とは、被験体の肝臓の一部を採取することによって得られる任意のサンプルを意味する。「HCC肝臓サンプル」とは、HCCに罹患している被験体由来の肝臓サンプルを意味する。このような肝臓サンプルは、特に、肝臓生検または部分的もしくは全肝臓腫瘍外科的切除であり得る。アルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルもまた肝臓サンプルであり、好ましくは、分析されるものと同タイプのものである。
本発明による上記方法は、5つの特異的遺伝子を含んでなるまたはからなる特定の発現プロファイルのin vitro判定に基づく。これら5つの遺伝子に関する情報を下表1に示す。
本発明による上記方法では、全生存期間および/または無再発生存期間の予測は、5つの特異的遺伝子、および任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに基づいてなされる。「発現プロファイル」とは、発現プロファイルに含まれる遺伝子群の発現レベルを意味する。「含んでなる」とは、発現プロファイルが他の遺伝子をさらに含んでなり得ることを意味するものとする。これに対して、「からなる」とは、分析される発現プロファイルにさらなる遺伝子が存在しないことを意味するものとする。「その等価発現プロファイル」または「EEP」とは、それらの遺伝子のうちいくつか(好ましくは、多くて1つまたは2つの遺伝子)の付加、欠失または置換がその診断の信頼性を有意に変化させないオリジナルの発現プロファイル(それと前記EEPが等価である)を意味するものとする。
好ましい実施態様では、等価発現プロファイルは、選択された遺伝子組合せの遺伝子のうち1つが等価な遺伝子で置き換えられた発現プロファイルを含む。本明細書において、第1の遺伝子(「遺伝子A」)は、発現プロファイル中の「遺伝子A」を「遺伝子B」で置き換えてもその検査の性能に有意な影響を及ぼさない場合に、別の第2の遺伝子(「遺伝子B」)と等価と見なすことができる。これは一般に「遺伝子A」が「遺伝子B」と相関している場合であり、ピアソンの相関係数などの尺度で判定した場合に、「遺伝子A」の発現が「遺伝子B」の発現レベルと統計学的に相関していることを意味する。相関は正(患者において「遺伝子A」がアップレギュレートされている場合に、同じ患者で「遺伝子B」もアップレギュレートされていることを意味する)であってもよいし、または負(患者において「遺伝子A」がアップレギュレートされている場合に、同じ患者で「遺伝子B」はダウンレギュレートされていることを意味する)であってもよい。本発明者らによって定量的PCRを用いて分析された103の遺伝子のうち、予後に必要な5つの遺伝子のそれぞれと最も良く相関し、平均ピアソン相関係数が≧0.3または≦−0.3である最大10の遺伝子を上記の表1に記載する。
「発現プロファイルを決定する」とは、選択された遺伝子の群の発現レベルの測定を意味する。各遺伝子の発現レベルは、当技術分野で公知の任意の技術を用い、in vitroにおいて、タンパク質レベルまたは核酸レベルのいずれかで決定することができる。
例えば、タンパク質レベルでの、特定のタンパク質の発現レベルのin vitro測定は、限定されるものではないが、ELISAまたは質量分析などの、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。これらの技術はいずれの肝臓サンプルにも容易に適合される。実際に、肝臓サンプルのタンパク質は、溶液法でELISAまたは質量分析に関して当業者に周知の種々の技術を用いて抽出することができる。あるいは、肝臓サンプル中のタンパク質の発現レベルは、直接、組織切片での質量分析を用いて分析してもよい。
本発明による方法の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、in vitroにおいて核酸レベルで決定される。核酸レベルにおいて、ある遺伝子の発現レベルのin vitro測定は、直接的にメッセンジャーRNA(mRNA)に対して、または逆転写した相補的DNA(cDNA)に対して行うことができる。限定されるものではないが、マイクロアレイ分析、定量的PCR、サザン分析を含め、発現レベルを測定するためのいずれの方法も使用可能である。
本発明による方法の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、in vitroにおいて核酸マイクロアレイ、特に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて決定される。本発明による方法の別の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、in vitroにおいて定量的PCRを用いて決定される。いずれにせよ、いずれの遺伝子の発現レベルも正規化されることが好ましい。得られた発現データを正規化するためには、発現の測定に使用される技術によって多くの方法が存在する。このような方法は当業者に周知である。いくつかの実施態様では、正規化は、内部対照遺伝子、一般には、限定されるものではないが、リボソームRNA(例えば、18SリボソームRNAなど)またはHPRT1(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1)、UBC(ユビキチンC)、YWHAZ(チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド)、B2M(β−2−ミクログロブリン)、GAPDH(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ)、FPGS(ホリルポリグルタミン酸シンターゼ)、DECR1(2,4−ジエノイルCoAレダクターゼ1、ミトコンドリア)、PPIB(ペプチジルプロリルイソメラーゼB(シクロフィリンB))、ACTB(アクチンβ)、PSMB2(プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット,βタイプ,2)、GPS1(Gタンパク質経路サプレッサー1)、CANX(カルネキシン)、NACA(新生ポリペプチド関連複合体αサブユニット)、TAX1BP1(Tax1(ヒトT細胞白血病ウイルスタイプI)結合タンパク質1)、およびPSMD2(プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット,非ATPアーゼ,2)などの遺伝子を含む、ハウスホールド遺伝子の発現レベルと比較して行うことができる。
本発明に関して、予後に使用される遺伝子の「発現値」(「発現レベル」とも呼ばれる)は、下記の両方を含む:
・正規化されてない生の発現値、および
・正規化に使用される方法に関わらず、さらに正規化されていてもよい生の発現値の導関数。
・正規化されてない生の発現値、および
・正規化に使用される方法に関わらず、さらに正規化されていてもよい生の発現値の導関数。
特に、予後に使用される遺伝子のin vitro発現値を測定するために定量的PCRが使用される場合、ΔCt、−ΔCt、ΔΔCt、または−ΔΔCt値から選択される生の発現値の導関数が使用できる。
予後に使用される遺伝子のin vitro発現値を測定するためにマイクロアレイが使用される場合、生の発現値(さらに正規化されていてもされていなくてもよい)の対数導関数(特に、log2導関数)が通常使用される。
これらの技術もまた、いずれの肝臓サンプルにも容易に適合される。実際に、いくつかの周知の技術が、組織サンプルからmRNAを抽出し、mRNAをcDNAに逆転写するために当業者に利用可能である。
in vitroで決定された発現プロファイルに基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測するために、多くのアルゴリズムが使用可能である。特に、アルゴリズムは、PLS(部分最小二乗)回帰アルゴリズム、サポートベクターマシン(SVM)アルゴリズム、線形回帰またはその派生アルゴリズム(GLMと略される一般化線形モデル、ロジスティック回帰を含む)、線形判別分析(LDA、対角線形判別分析(DLDA)を含む)アルゴリズム、対角二次判別分析(DQDA)アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、k−NN(近傍)アルゴリズム、およびPAM(マイクロアレイ予測分析)アルゴリズムから選択することができる。コックスモデルも使用可能である。また、種々のタイプの距離を用いるセントロイドモデルも使用可能である。
参照サンプル群(一般に、トレーニングデータとも呼ばれる)は、良好な予後を不良な予後から最良に分離する最適な統計アルゴリズム(決定則など)を選択するために使用される。最良の分離は通常、分類を誤るサンプルができる限り少なく、異なるデータセットに対しても十分同等に遂行できる可能性が最も高いものである。
良好/不良な予後などの二元転帰では、ロジスティック回帰を含む線形回帰または一般化線形モデル(GLMと略される)が使用可能である。
線形回帰関数の他の表示も使用可能である(下記参照)。
上記の線形またはロジスティック回帰関数では、x1〜xNは、シグネチャーのN個の遺伝子の発現値(または定量的PCRの場合にはΔCt、−ΔCt、ΔΔCt、もしくは−ΔΔCt、もしくはマイクロアレイの場合には対数値などのその導関数)であり、β0は切片であり、かつ、β1〜βNは回帰係数である。
切片および回帰係数の値は、参照サンプルの群(「トレーニングデータ」)に基づいて決定される。次に、線形またはロジスティック回帰関数の値は、検定発現プロファイルが良好または不良な予後を有する確率を定義する(トレーニングデータに基づいて線形またはロジスティック回帰関数を定義する場合、ユーザーが、その確率が良好な予後の確率か不良な予後の確率かを決定する)。その後、検定発現プロファイルは、それが良好な予後または不良な予後を有する確率が特定の閾値(これもまたトレーニングデータに基づいて決定される)より低いか高いかによって、良好な予後または不良な予後を有するとして分類される。場合によっては、未確定領域を画定する2つの閾値が使用される。ロジスティック回帰以外のタイプの一般化線形モデルも使用可能である。
新規なサンプルには、そのサンプルが良好な予後の群に近いか不良な予後の群に近いかに基づく近傍法(k−NNと略される)などの別法も慣用される。「より近い」という概念は、予後に有用なN個の遺伝子(従って、正規化目的で使用される潜在的ハウスキーピング遺伝子を除く)からなるシグネチャーにより画定されるn次元空間における距離(限定されるものではないが、ユークリッド距離などのメトリック)の選択に基づく。検定発現プロファイルと総ての参照良好または不良予後発現プロファイルの間の距離が計算され、そのサンプルがk最近接参照サンプルの解析により分類され(kは、少なくとも1、多くても一般に3または5の正の整数である)、分類の規則は、k最近接参照発現プロファイル中の良好または不良予後参照発現プロファイルの数によって予め設定される。例えば、kが1であるとき、検定発現プロファイルは、最近接参照発現プロファイルが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、最近接参照発現プロファイルが不良予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。kが2であるとき、検定発現プロファイルは、その2つの最近接参照発現プロファイルが良好予後発現プロファイルであれば応答として、その2つの最近接参照発現プロファイルが不良予後発現プロファイルであれば不応答として分類され、その2つの最近接参照発現プロファイルが良好予後および不良予後参照発現プロファイルを含むかどうかは判定されない。kが3であるとき、検定発現プロファイルは、その3つの最近接参照発現プロファイルのうち少なくとも2つが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、その3つの最近接参照発現プロファイルのうち少なくとも2つが不良な予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。より一般には、kがpであるとき、検定発現プロファイルは、そのp個の最近接参照発現プロファイルのうち半数を超えるものが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、そのp個の最近接参照発現プロファイルのうち半数を超えるものが不良予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。良好予後参照発現プロファイルと不良予後参照発現プロファイルの数が等しい場合には、その検定発現プロファイルは未確定として分類される。
統計学、数学または工学分野由来の他の方法論も存在し、例えば、限定されるものではないが、決定木、サポートベクターマシン(SVM)、ニューラルネットワークおよび線形判別分析(LDA)がある。コックスモデルも使用可能である。種々のタイプの距離を用いるセントロイドモデルも使用可能である。これらのアプローチは当業者に周知である。
要約すると、線形回帰またはその派生法、例えば、一般化線形モデル(GLM、ロジスティック回帰を含む)、近傍法(k−NN)、決定木、サポートベクターマシン(SVM)、ニューラルネットワーク、線形判別分析(LDA)、ランダムフォレスト、またはマイクロアレイの推定分析(PAM)から選択され得るアルゴリズムは参照サンプルの群(好ましくは、複数の良好予後参照発現プロファイルと複数の不良予後参照発現プロファイルを含む)に基づいて較正された後、検定サンプルに適応される。簡単に言えば、患者は、シグネチャー内の総ての遺伝子が、良好な予後の群(トレーニングデータ)から構築された参照プロファイル由来の総ての遺伝子にいかに匹敵するかに基づいて良好な予後(または不良な予後)として分類される。
発現プロファイルの個々の遺伝子が不良予後サンプルに対して良好予後サンプルで増加しているか減少しているかという概念は科学的に着目される。各個の遺伝子について、良好予後群の遺伝子発現レベルは、スチューデントのt検定または同等の方法の使用によって不良予後群と比較することができる。しかしながら、このような二元比較は、シグネチャーが数種の異なる遺伝子を含んでなる場合の予後には、一般に使用されない。
有利な実施態様では、全生存期間および/または無再発生存期間を予測するために使用されるアルゴリズムは、下式:
[式中、
・Nは、発現プロファイルの遺伝子の数を表し、
・xi、1≦i≦N、発現プロファイルに含まれるN個の遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し(これらの値は特に、場合により正規化後の、定量的RT−PCR実験ではΔCt、−ΔCt、ΔΔCt、または−ΔΔCt値に相当し、マイクロアレイ実験では対数値、特に、log2の値に相当する)、
・miおよびwi、1≦i≦Nは、少なくとも1つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
・サンプルXは、スコア(サンプルX)が閾値Tより低い場合には良好な全生存期間および/または無再発生存期間予測を有し、スコア(サンプルX)が閾値T以上である場合には不良な全生存期間および/または無再発生存期間予測を有すると見なされ、ここで、Tは、少なくとも1つの参照サンプルで較正されたものである]
を用いた線形回帰である。
・Nは、発現プロファイルの遺伝子の数を表し、
・xi、1≦i≦N、発現プロファイルに含まれるN個の遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し(これらの値は特に、場合により正規化後の、定量的RT−PCR実験ではΔCt、−ΔCt、ΔΔCt、または−ΔΔCt値に相当し、マイクロアレイ実験では対数値、特に、log2の値に相当する)、
・miおよびwi、1≦i≦Nは、少なくとも1つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
・サンプルXは、スコア(サンプルX)が閾値Tより低い場合には良好な全生存期間および/または無再発生存期間予測を有し、スコア(サンプルX)が閾値T以上である場合には不良な全生存期間および/または無再発生存期間予測を有すると見なされ、ここで、Tは、少なくとも1つの参照サンプルで較正されたものである]
を用いた線形回帰である。
特に好ましい実施態様では、発現プロファイルは定量的PCRを用いて決定され、発現値はΔΔCt値であり、Nは5であり、閾値Tは0であり、かつ、miおよびwi、1≦i≦5は下表2に示される値を有する。
本明細書に記載される本発明による予後の方法は、
a)予後に関連する少なくとも1つの他の変数を決定すること、および
b)少なくとも1つの参照HCC肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、発現プロファイルと前記1または複数の他の変数に基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測すること
をさらに含んでなり得る。
a)予後に関連する少なくとも1つの他の変数を決定すること、および
b)少なくとも1つの参照HCC肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、発現プロファイルと前記1または複数の他の変数に基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測すること
をさらに含んでなり得る。
実際に、予後に独立に関連するさらなる変数を含めると、予後の信頼性をさらに改善することができる。前記他の変数は特に、G1−G6分類(WO2007/063118A1に開示、下記参照)、BCLC(Barcelona Clinic Liver Cancer、Llovet, 1999, sem liv dis)、CLIP(Cancer of the Liver Italian Program、CLIP investigators Hepatology, 1998)、JIS(Japan Integrated Staging、Kudo m, J Gasterol 2003)、TNM(Tumour-Node-Metastasis、AJCC cancer staging Handbook, 7th ed Springer)臨床病期分類、ミラン(Mazzaferro v, New England J Medicine 1996)およびメトロチケットカリキュレーター(Mazzaferro v, lancet Oncol 2009)判定基準、硬変の存在(Hoshida y, NEJM, 2008)、術前AFP(αフェトタンパク質)血漿レベル(Chevret S J hepatol 1999)、エドモンソングレード(Edmondson Cancer, 1954)、および肝臓サンプルの微小血管侵入(Mazzaferro v, lancet Oncol 2009) から選択され得る。
G1−G6分類は後述する。
BCLC、CLIP、JIS、およびTNM臨床病期分類、ミランおよびメトロチケットカリキュレーター判定基準、およびエドモンソングレードは、上述の刊行物に記載のように、通常の一般知識に基づき任意の肝臓サンプルに対するHCC診断、予後および管理の熟練者に周知であり、容易に決定される。
他の変数が決定される場合、それらの値は、任意の適当なアルゴリズムを用い、総ての変数(発現プロファイルおよびさらなる変数)に基づく全体的予後を行うために発現プロファイルと併合する。
好ましい実施態様では、他の変数が決定される場合、前記他の変数はBCLC臨床病期分類および肝臓サンプルの微小血管侵入である。
好ましい実施態様では、総合スコアは、他の変数(特に、BCLC臨床病期分類および微小血管侵入)の値および本明細書に記載のように計算される発現プロファイルスコアに基づいて決定される。
予後に使用可能な総合スコアの例を図5に示す。
本発明はまた、多くて65の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイル(前記発現プロファイルは下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる)、またはその等価発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットに関する。
好ましい実施態様では、本発明によるキットは、上述の発現プロファイルの1つの決定(the determination or one of the above mentioned expression profile)に特化されてもよく、よって、対象とする最大数の遺伝子を含む発現プロファイルが5つの遺伝子と任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなることが分かっているので、多くて10の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。別の好ましい実施態様では、本発明によるキットは、HCC診断および/またはサブグループへのHCC分類に結びつけることができる、対象とする他の発現プロファイルのための試薬をさらに含んでなってもよい。この場合、キットは、対象とする付加的発現プロファイルの発現レベルをin vitroで決定することを可能とするための、多くて65の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。特に、HCCサンプルの、下表3に示される臨床的および遺伝的主要特徴により定義される6つのサブグループG1からG6への分類はWO2007/063118A1に記載されており、このような分類に関するその内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
この分類は、有利には下記の16の遺伝子:RAB1A、REG3A、NRAS、RAMP3、MERTK、PIR、EPHA1、LAMA3、G0S2、HN1、PAK2、AFP、CYP2C9、CDH2、HAMP、およびSAE1を含んでなるまたはからなる発現プロファイルのin vitro決定に基づき、この方法は、特に、
a)上述の16の遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルを決定すること;
b)前記発現プロファイルから6つのサブグループ距離を計算すること;および
c)前記HCC腫瘍を、サブグループ距離が最低であるサブグループに分類すること
を含んでなり得る。
a)上述の16の遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルを決定すること;
b)前記発現プロファイルから6つのサブグループ距離を計算すること;および
c)前記HCC腫瘍を、サブグループ距離が最低であるサブグループに分類すること
を含んでなり得る。
好ましくは、発現プロファイルは定量的PCRを用いて決定され、サンプルiから各サブグループkの距離は下式:
(式中、各遺伝子tおよびサブグループkに関して、μ(サブグループk、遺伝子t)およびσ(遺伝子t)値は下表4に示されるものである)
を用いて計算される。
を用いて計算される。
N個の遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬としては、前記発現プロファイルに含まれる遺伝子の発現レベルを特異的に定量することを可能とするいずれの試薬も含み得る。例えば、発現プロファイルがタンパク質レベルで決定される場合、このような試薬は、その発現プロファイルに含まれる遺伝子のそれぞれに特異的な抗体を含み得る。好ましくは、発現は、核酸レベルで測定される。この場合、本発明のキット中の試薬は、特に、その発現プロファイルに含まれる遺伝子のそれぞれに特異的なプライマー対(フォワードプライマーとリバースプライマー)および/もしくはプローブ(特に、発現プロファイルの定量的PCR決定に有効)または核酸マイクロアレイ、特に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを含み得る。後者の場合、核酸マイクロアレイは、前段落に定義されるように、最大数の遺伝子の検出のためのプローブを含んでなる専用の核酸マイクロアレイである。
背景技術の節に示したように、本発明による予後方法は、ユニークかつ簡単な検査に基づいて、HCC腫瘍の悪性度を評価すること、ひいてはその予後に対する治療を適合させることを可能とするので、臨床医にとって重要である。
よって、本発明はまた、本発明の予後方法を用いて不良な予後が示された被験体におけるHCCの治療に使用するための細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬に関する。本発明はまた、本発明による予後方法により不良な全生存期間および/または無再発生存期間予測を示した被験体におけるHCCの治療を意図した薬剤の製造のための、治療用細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬の使用に関する。前記被験体のHCCが上記で定義されたようなサブグループG1にさらに分類されている場合には、IGFR1阻害剤またはAkt/mTor阻害剤が補助療法として好ましい。あるいは、前記被験体のHCCが上記で定義されたようなサブグループG2にさらに分類されている場合には、Akt/mTor阻害剤が補助療法として好ましい。あるいは、前記被験体のHCCが上記で定義されるようなサブグループG3にさらに分類されている場合には、プロテアソーム阻害剤が補助療法として好ましい。あるいは、前記被験体のHCCが上記で定義されるようなサブグループG5またはG6にさらに分類されている場合には、WNT阻害剤が補助療法として好ましい。しかしながら、現行のWNT阻害剤は毒性の問題があり、より効果的かつ安全なWNT阻害剤の必要がなお存在する。
「細胞傷害性化学療法薬」とは、癌細胞を死滅させるのに有用ないずれの好適な化学薬剤も意味する。HCCの補助療法として現行使用され、かつ、本発明において好ましい細胞傷害性化学療法薬は、ドキソルビシン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、およびそれらの組合せである。ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用が特に好ましい。「標的療法」とは、HCC悪性化に関与するシグナル伝達経路の酵素を選択的に阻害するいずれの好適な薬剤も意味するものとする。現在、数種のチロシンタンパク質キナーゼ(VEGFRおよびPDGFR)およびRafキナーゼ(B−RafよりもC−Rafに注力されている)の小分子阻害剤であるソラフェニブがHCCの補助療法に承認されており、本発明において好ましい。ソラフェニブは、式:
のビアリール尿素である。
本発明はまた、必要とする被験体においてHCCを治療するための方法であって、
a)前記被験体の全生存期間および/または無再発生存期間を、本発明による予後方法を用いて予測すること;
b)前記被験体が不良な予後を示した場合に、前記被験体に、特に、細胞傷害性化学療法(例えば、ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用)または標的療法(例えば、ソラフェニブ)から選択される補助療法を投与すること
を含んでなる方法に関する。
a)前記被験体の全生存期間および/または無再発生存期間を、本発明による予後方法を用いて予測すること;
b)前記被験体が不良な予後を示した場合に、前記被験体に、特に、細胞傷害性化学療法(例えば、ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用)または標的療法(例えば、ソラフェニブ)から選択される補助療法を投与すること
を含んでなる方法に関する。
本発明の治療方法は、
i.前記HCCサンプルを、上記の分類方法を用いてサブグループG1からG6のうちの1つに分類すること;
ii.前記HCCサンプルがG1サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のIGFR1阻害剤および/またはAkt/mTor阻害剤を投与すること;
iii.前記HCCサンプルがG2サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のAkt/mTor阻害剤を投与すること;
iv.前記HCCサンプルがG3サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のプロテアソーム阻害剤を投与すること;
v.前記HCCサンプルがG5またはG6サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のwnt阻害剤を投与すること
をさらに含んでなり得る。
i.前記HCCサンプルを、上記の分類方法を用いてサブグループG1からG6のうちの1つに分類すること;
ii.前記HCCサンプルがG1サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のIGFR1阻害剤および/またはAkt/mTor阻害剤を投与すること;
iii.前記HCCサンプルがG2サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のAkt/mTor阻害剤を投与すること;
iv.前記HCCサンプルがG3サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のプロテアソーム阻害剤を投与すること;
v.前記HCCサンプルがG5またはG6サブグループに分類された場合には、前記被験体に有効量のwnt阻害剤を投与すること
をさらに含んでなり得る。
本発明はまた、本発明による予後方法を遂行するためのシステム(およびコンピューターシステムにそれを遂行させるためのコンピューター可読媒体)に関する。
一つの実施態様において、本発明は、被験体の肝臓サンプルからその被験体の全生存期間または無再発生存期間を予測するためのシステム1であって、
a)肝臓サンプルを受容し、下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール2;
b)前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス3;
c)前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール4、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる;および
d)任意選択の、ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント6を表示するための表示モジュール5、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなるシステムに関する。
a)肝臓サンプルを受容し、下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール2;
b)前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス3;
c)前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール4、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる;および
d)任意選択の、ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント6を表示するための表示モジュール5、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなるシステムに関する。
別の実施態様では、本発明は、発現プロファイルデータの解釈に関する本発明による予後方法のコンピューターステップへの実装のためのソフトウエアモジュールを定義するためにコンピューター可読命令が記録されたコンピューター可読媒体7に関する。好ましくは、前記ソフトウエアモジュールは、
a)下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関する発現レベル情報をユーザーより入力可能とし、さらなる比較のために保存(少なくとも一時的に)可能とするエントリーモジュール8;
b)ユーザーにより入力された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール4、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる;および
c)ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント6を表示するための表示モジュール5、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなる。
a)下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRAN、ならびに任意選択の1以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関する発現レベル情報をユーザーより入力可能とし、さらなる比較のために保存(少なくとも一時的に)可能とするエントリーモジュール8;
b)ユーザーにより入力された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール4、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる;および
c)ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント6を表示するための表示モジュール5、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなる。
システムおよびコンピューター可読媒体に関する本発明の実施態様はファンクションモジュールによって記述されており、コンピューター可読媒体に記録されているコンピューター実行可能命令により定義され、実行された際にコンピューターにメソッドステップを遂行させる。これらのモジュールは、分かりやすくするために機能によって分離されている。しかしながら、これらのモジュールは個々の(discreet)コードブロックに対応する必要はなく、記載されている機能が様々な媒体に保存され、様々な時点で実行される様々なコード部分の実行によって遂行できると理解されるべきである。さらに、これらのモジュールは他の機能を遂行してもよく、従って、これらのモジュールは任意の特定の機能または機能セットを持つことに限定されないと認識されるべきである。
コンピューター可読媒体は、コンピューターによりアクセス可能な任意の利用可能な有形媒体であり得る。コンピューター可読媒体としては、コンピューター可読命令、データストラクチャー、プログラムモジュールまたは他のデータなどの情報の保存のための任意の方法または技術に実装される揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル有形媒体が含まれる。コンピューター可読媒体としては、限定されるものではないが、RAM(ランダム・アクセス・メモリ)、ROM(リード・オンリー・メモリ)、EPROM(イレイサブル・プログラマブル・リード・オンリー・メモリ)、EEPROM(エレクトリカリー・イレイサブル・プログラマブル・リード・オンリー・メモリ)、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、CD−ROM(コンパクト・ディスク・リード・オンリー・メモリ)、DVD(デジタル・バーサタイル・ディスク)または他の光学保存媒体、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク保存または他の磁気保存媒体、他のタイプの揮発性および不揮発性メモリ、および所望の情報を保存するために使用可能であり、かつ、コンピューターによりアクセス可能である任意の他の有形媒体(上記の任意の好適な組合せを含む)が挙げられる。
1以上のコンピューター可読媒体に具現化されたコンピューター可読データは、例えば、コンピューターにより実行される結果として、コンピューターに本明細書に記載される1以上の機能(例えば、システム1、またはコンピューター可読媒体7に関する)、ならびに/または種々の実施態様、変形形態およびそれらの組合せを遂行するように命令する1以上のプログラムの一部としての命令を定義し得る。このような命令は、複数のプログラミング言語、例えば、Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、Eiffel、Basic、COBOLアセンブリ言語など、またはそれらの様々な任意の組合せのいずれで書かれていてもよい。このような命令が具現化されているコンピューター可読媒体は、本明細書に記載のシステム1またはコンピューター可読媒体6のいずれかの1以上の成分に存在してよく、このような成分の1以上にわたって記載されてもよく、その間で移行してもよい。
コンピューター可読媒体は、そこに保存されている命令が、本明細書に述べられている本発明の態様を実施するために任意のコンピューターリソースにロードされ得るように転送可能である。さらに、上記の1または複数のコンピューター可読媒体に保存されている命令は、ホストコンピューター上で実行中のアプリケーションプログラムの一部として具現化された命令に限定されないと認識されるべきである。むしろ、これらの命令は、コンピューターを本発明の態様を実施するようにプログラムするために使用可能な任意のタイプのコンピューターコード(例えば、ソフトウエアまたはマイクロコード)として具現化できる。コンピューター実行可能命令は、好適なコンピューター言語または数種の言語の組合せで書かれてよい。基礎計算生物学法は当業者に公知であり、例えば、Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997, ref 38); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998, ref 39); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000, ref 40)およびOuelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)に記載されている。
本発明の特定の実施態様の機能モジュールは、決定モジュール2、保存デバイス3、比較モジュール4および表示モジュール5を含む。機能モジュールは、1または複数のコンピューターで、または1または複数のコンピューターネットワークを使用することにより実行できる。決定モジュール2は、コンピューター可読形式で発現レベル情報を提供するためのコンピューター実行可能命令を含む。
本明細書で使用する場合、「発現レベル情報」とは、全長または部分的いずれかの、任意のヌクレオチド(RNAまたはDNA)および/またはアミノ酸配列の発現レベルに関する情報を意味する。好ましい実施態様では、発現レベル情報は、種々の技術により測定されるmRNAまたはcDNAの発現レベルを意味する。この情報は、質的(転写産物の有無)であっても量的であってもよい。好ましくは、情報は量的である。
発現レベル情報を決定するための方法、すなわち、決定モジュール2は、タンパク質およびDNA/RNA分析のためのシステム、特に、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおける発現プロファイルの決定に関して上記したものを含む。
決定モジュールにおいて決定される発現レベル情報は、保存デバイス3により読み取り可能である。本発明で使用する場合、「保存デバイス」3は、データまたは情報を保存するために構成または適合された、任意の好適な計算もしくは処理装置またはその他のデバイスを含むことを意図する。本発明とともに使用するために好適な電子装置の例としては、スタンドアローン計算装置、データテレコミュニケーションネットワーク(ローカルエリアネットワーク(LAN)、ワイドエリアネットワーク(WAN)、インターネット、イントラネット、およびエクトラネットを含む)、ならびにローカルおよび分散コンピュータープロセシングシステムが挙げられる。保存デバイス3はまた、限定されるものではないが、磁気保存媒体(例えば、フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、磁気テープ)、光学保存媒体(例えば、CD−ROM、DVD)、電子保存媒体(例えば、RAM、ROM、EPROM、EEPROM)など、一般ハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気/光学保存媒体を含む。保存デバイス3は、発現レベル情報が記録されるように適合または構成される。このような情報は、例えば、インターネット、ディスケット、USB(ユニバーサル・シリアル・バス)またはデバイス間の無線通信を含む任意の他の好適な通信様式を介して伝送および電子読み取り可能なデジタル形式で提供できる。
本発明で使用する場合、「保存」とは、保存デバイス3の情報をコード化するプロセスを意味する。当業者ならば、発現レベル情報を含んでなる製品を作製するために、既知の媒体に情報を記録するために現在知られている方法のいずれかを容易に採用することができる。
発現レベル情報を保存デバイスに保存するためには、様々なソフトウエアプログラムおよびフォーマットを使用することができる。発現レベル情報が記録されている媒体を取得または作出するために、いずれの数のデータプロセッサーストラクチャリングフォーマット(例えば、テキストファイル、スプレッドシートまたはデータベース)を使用してもよい。
発現レベル情報をコンピューター可読形式で提供することにより、比較モジュール4において、発現レベル情報を可読形式で用いて、特異的な発現プロファイルを保存デバイス3内の参照データと比較することができる。比較は特に、上記の種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。コンピューター可読形式で行われた比較はコンピューター可読比較結果を提供し、これは種々の手段によって処理することができる。比較結果に基づく内容は比較モジュール4から検索でき、表示モジュール5により表示させて良好または不良な予後を示すことができる。
好ましくは、参照データは、本発明による分類方法によって見られる可能性のあるあらゆるタイプの肝臓サンプルの指標となる発現レベルプロファイルである。
「比較モジュール」4は、すでに上記したものなどの統計アルゴリズムを提供する任意のソフトウエアを直接的または間接的に用い、決定モジュール2で決定された発現レベル情報を参照データと比較するように働く、比較のための様々な利用可能なソフトウエアプログラムおよびフォーマットを使用することができる。
比較モジュール4、または本発明の任意の他のモジュールは、リレーショナルデータベース管理システム、World Wide Webアプリケーション、およびWorld Wide Webサーバーを動かすオペレーティングシステム(例えば、Windows、Linux、Mac OSまたはUNIX)を含み得る。World Wide Webアプリケーションは、データベース言語ステートメント(例えば、構造化問合せ言語(Structured Query Language)(SQL)ステートメント)の生成に必要な実行可能コードを含む。一般に、実行可能には、埋め込みSQLステートメントを含む。さらに、World Wide Webアプリケーションは、サーバーならびにユーザーリクエストに応えるためにアクセスされなければならない種々の外部および内部データベースを含んでなる種々のソフトウエア実体に対するポインターおよびアドレスを含む設定ファイルを含み得る。必要に応じて、サーバーが2以上の分離したコンピューターに分散されていれば、設定ファイルはまた、サーバーリソースに対するリクエストを適当なハードウエアに割り当てる。一つの実施態様では、World Wide Webサーバーは、TCP/IPプロトコールをサポートする。このようなローカルネットワークは「イントラネット」と呼ばれる場合がある。このようなイントラネットの利点は、それらがWorld Wide Web上に存在するパブリックドメインデータベース(例えば、GenBankまたはSwiss Pro World Wide Webサイト)との容易な通信を可能とするということである。従って、本発明の特定の好ましい実施態様では、ユーザーは、ウェブブラウザおよびウェブサーバーによって提供されるHTMLインターフェースを用い、インターネットデータベース上に存在するデータに直接アクセスすることができる(例えば、ハイパーテキストリンクを介する)。
比較モジュール4は、既定義の判定基準、またはユーザーにより定義される判定基準によりコンピューター可読形式で処理可能なコンピューター可読比較結果を提供し、ユーザーにより要求される場合には、表示モジュール5を用いて保存および出力が可能な比較結果に部分的に基づくコンテント6を提供する。表示モジュール5は、ユーザー向けに、比較結果に部分的に基づくコンテント6の表示を可能とし、このコンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である。このような信号は、例えば、コンピューターモニター上への良好または不良な予後の指標となるコンテントの表示、プリンターからの良好または不良な予後を示すコンテントの出力ページもしくは出力レポート、または良好または不良な予後の指標となる光もしくは音であり得る。
比較結果に基づくコンテント6は、比較のために使用されるアルゴリズムによって異なる。
例えば、線形回帰またはその派生法が使用される場合、コンテント6は、良好もしくは不良な予後を持つスコアもしくは確率、または良好もしくは不良な予後を持つ確率と1以上の閾値の両方、または単に良好もしくは不良な予後の指標となる信号を含み得る。近傍法(k−NN)が使用される場合には、コンテント6は、k最近接プロファイル間の良好予後発現プロファイルと不良予後発現プロファイルの数もしくは割合、または単に良好もしくは不良な予後の指標となる信号を含み得る。さらに、コンテント6は、簡単に、数値、テキストまたはグラフィック的に(例えば、赤、橙または緑などのカラーコードを用いて)レポートされる連続的またはカテゴリースコアであってもよい。
表示モジュール5は、コンピューターからコンピューター可読情報を受容し、ユーザーに対して表示するように構成されたいずれの好適なデバイスであってもよい。限定されない例としては、例えば、Intel PENTIUMタイププロセッサー、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett−Packard PA−RISCプロセッサー、カリフォルニア州サニーベールのAdvanced Micro Devices(AMD)から、もしくはARM Holdingsから入手可能な様々なプロセッサーのいずれか、または任意の他のタイプのプロセッサー、フラットパネルディスプレー、カソードレイチューブなどのビジュアルディスプレーデバイス、ならびに種々のタイプのコンピュータープリンターまたは集積デバイス、例えば、ラップトップまたはタブレット、特に、iPadに基づくものなどの汎用コンピューターが挙げられる。
一つの実施態様では、比較結果に基づくコンテント6の表示のためのユーザーインターフェースを提供するためにWorld Wide Webブラウザが使用される。本発明の他のモジュールはウェブブラウザインターフェースを備えるように適合させることができると理解されるべきである。このウェブブラウザを介して、ユーザーは比較モジュールからのデータを検索するためのリクエストを構築することができる。そして、ユーザーは一般に、グラフィックユーザーインターフェースにおいて従来使用されている、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバーなどのユーザーインターフェースエレメントにポインターを置き、クリックする。このようにユーザーのウェブブラウザで作成されたリクエストはWebアプリケーションに伝送され、ウェブアプリケーションは、適切な情報を抽出するために使用可能なクエリを作成するためにそれらを初期化する。
一つの実施態様では、表示モジュール5は比較結果、およびその比較結果が良好な予後を示すか不良な予後を示すかを表示する。
一つの実施態様では、表示される比較結果に基づくコンテント6は、良好または不良な予後の指標となる信号(例えば、陽性または陰性の信号)であり、従って、陽性または陰性の指標のみが表示され得る。
従って、本発明は、HCC被験体において、前記HCC被験体の肝臓サンプルからの発現プロファイル情報に基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測する方法を実施するためのシステム1(およびコンピューターシステムにそれを実施させるためのコンピューター可読媒体7)を提供する。
システム1、およびコンピューター可読媒体7は、単に、HCC被験体において、発現プロファイルに基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測する方法を遂行するための本発明の例示的実施態様であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。システム1、およびコンピューター可読媒体7の変形形態も可能であり、本発明の範囲内に入るものとする。
システム1の、またはコンピューター可読媒体で使用されるモジュールは、多くの構成を想定し得る。例えば、機能は単独機に提供されてもよいし、または複数機に分散されてもよい。
実施例1.HCC患者において全生存期間および無再発生存期間の予測を可能とする分子シグネチャーの同定
患者および方法
患者および組織サンプル
肝臓サンプルは、ボルドー(1998〜2007)およびクレテイユ(2003〜2007)の2つのフランス大学病院で、腫瘍に関する肝臓切除の後に系統的に冷凍した。合計550サンプルを本研究に含め、本研究は施設内IRB委員会(CCPRB Paris Saint Louis, 1997および2004)により承認され、フランス法に従って総ての患者からインフォームド・コンセントを得た。(1)壊死>80%の腫瘍、(2)不良な質または不十分な量のRNAを有する腫瘍、(3)非治癒切除のHCC:R1またはR2切除または手術時に過度な肝転移、(4)肝移植により処置されたHCCが除外された。
患者および方法
患者および組織サンプル
肝臓サンプルは、ボルドー(1998〜2007)およびクレテイユ(2003〜2007)の2つのフランス大学病院で、腫瘍に関する肝臓切除の後に系統的に冷凍した。合計550サンプルを本研究に含め、本研究は施設内IRB委員会(CCPRB Paris Saint Louis, 1997および2004)により承認され、フランス法に従って総ての患者からインフォームド・コンセントを得た。(1)壊死>80%の腫瘍、(2)不良な質または不十分な量のRNAを有する腫瘍、(3)非治癒切除のHCC:R1またはR2切除または手術時に過度な肝転移、(4)肝移植により処置されたHCCが除外された。
一部のHCC患者(n=10)は手術合併症および/または非代償性硬変のために手術の翌月のうちに死亡し、予後分析から除外した(図1の予後の具体的フローチャートを参照)。
よって、以下のサンプル、すなわち、324のHCC(そのうち314が予後分析に適格)、40の非肝細胞性腫瘍、156の良性肝細胞性腫瘍(限局性結節性過形成(FNH、n=25)、肝細胞腺腫(HCA、n=111)、再生性大結節性(異形性を伴うものn=15、または伴わないものn=5)および30の非腫瘍サンプルが含まれた。
予後分析に含んだHCCの臨床データ、組織学的データおよび分子データ (n=314)を下記の表5および6にまとめる。
腫瘍および非腫瘍性肝臓サンプルは手術直後に冷凍し、−80℃で保存した。また、冷凍対応物からの組織サンプルを10%ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオジンおよびマッソンの三重染色で染色した。HCA、HCC、FNH、粗大再生結節および総ての非肝細胞性腫瘍の診断は、確立された組織学的判定基準に基づいた(International working party Hepatology 1995, international consensus group Hepatology 2009)。腫瘍は総て患者の転帰および初期診断を知らない2名の専門病理学者(JCおよびPBS)によって独立に評価された。肝細胞性腫瘍のサブタイプ診断に関して、または予後分析に含まれるHCCの病理学的特徴に関して不一致がある場合には、切片を再調査し、一致を見てから試験に用いた。複数の腫瘍の場合は、利用可能な最大結節を本発明者らの予後試験で分析した。
定量的PCRによるさらなる分析のための遺伝子の選択
103遺伝子を定量的RT−PCR分析に関して選択した。同じプラットフォームで行ったAffymetrix HG133A遺伝子チップTMマイクロアレイハイブリダイゼーションを用い、57のHCC(E−TABM−36)、5つのHNF1A不活性化腺腫(GSE7473)、7つの炎症性腺腫(GSE11819)、4つの限局性結節性過形成(GSE9536)、9つの非腫瘍性肝臓サンプル(硬変および正常肝臓(E−TABM−36およびGSE7473を含む)を含む82の肝臓サンプルのmRNA発現を分析した。分類目的で、腫瘍の特定のサブグループで差次的に発現される遺伝子を3つの包含基準に従って選択した:
(1)38の遺伝子が本発明者らによって得られ、Boyault S, et al.2007; Rebouissou S, et al.2007; Rebouissou S, et al.2009 and Rebouissou S, et al.2008に記載されたこれまでのマイクロアレイデータから選択された:RAB1A、REG3A、NRAS、RAMP3、MERTK、PIR、EPHA1、LAMA3、G0S2、HN1、PAK2、AFP、CYP2C9、CDH2、HAMP、SAE1、NTS、HAL、SDS、cmkOR1/CXCR7、ID2、GADD45B、CDT6、UGT2B7、LFABP、GLUL、LGR5/GPR49、TBX3、RHBG、SLPI、AMACR、SAA2、CRP、MME、DHRS2、SLC16A1、GLS2、およびGNMT;
(2)9つの遺伝子がこれまで文献に記載されている(Odom DT, et al. 2004; Paradis V, et al. 2003; Rebouissou S, et al. 2008; Llovet J, et al. 2006; Capurro M, et al. 2003; Chuma M, et al. 2003; Tsunedomi 2005; Kondoh N 1999):HNF1A、HNF4A、SERPIN、ANGPT1、ANGPT2、XLKD1−LYVE1、GPC3、HSP70/HSPA1A、およびCYP3A7;ならびに
(3)13の遺伝子が本発明者らのこれまでのマイクロアレイデータの新たな分析から選択された:STEAP3、RRM2、GSN、CYP2C19、C8A、AKR1B10、ESR1、GMNN、CAP2、DPP8、LCAT、NEK7、LAPTM4B。
103遺伝子を定量的RT−PCR分析に関して選択した。同じプラットフォームで行ったAffymetrix HG133A遺伝子チップTMマイクロアレイハイブリダイゼーションを用い、57のHCC(E−TABM−36)、5つのHNF1A不活性化腺腫(GSE7473)、7つの炎症性腺腫(GSE11819)、4つの限局性結節性過形成(GSE9536)、9つの非腫瘍性肝臓サンプル(硬変および正常肝臓(E−TABM−36およびGSE7473を含む)を含む82の肝臓サンプルのmRNA発現を分析した。分類目的で、腫瘍の特定のサブグループで差次的に発現される遺伝子を3つの包含基準に従って選択した:
(1)38の遺伝子が本発明者らによって得られ、Boyault S, et al.2007; Rebouissou S, et al.2007; Rebouissou S, et al.2009 and Rebouissou S, et al.2008に記載されたこれまでのマイクロアレイデータから選択された:RAB1A、REG3A、NRAS、RAMP3、MERTK、PIR、EPHA1、LAMA3、G0S2、HN1、PAK2、AFP、CYP2C9、CDH2、HAMP、SAE1、NTS、HAL、SDS、cmkOR1/CXCR7、ID2、GADD45B、CDT6、UGT2B7、LFABP、GLUL、LGR5/GPR49、TBX3、RHBG、SLPI、AMACR、SAA2、CRP、MME、DHRS2、SLC16A1、GLS2、およびGNMT;
(2)9つの遺伝子がこれまで文献に記載されている(Odom DT, et al. 2004; Paradis V, et al. 2003; Rebouissou S, et al. 2008; Llovet J, et al. 2006; Capurro M, et al. 2003; Chuma M, et al. 2003; Tsunedomi 2005; Kondoh N 1999):HNF1A、HNF4A、SERPIN、ANGPT1、ANGPT2、XLKD1−LYVE1、GPC3、HSP70/HSPA1A、およびCYP3A7;ならびに
(3)13の遺伝子が本発明者らのこれまでのマイクロアレイデータの新たな分析から選択された:STEAP3、RRM2、GSN、CYP2C19、C8A、AKR1B10、ESR1、GMNN、CAP2、DPP8、LCAT、NEK7、LAPTM4B。
合計60の遺伝子を定量的PCRによりその後の分析のために選択した。
本発明者らはまた、HCCの簡単かつ信頼性のある予後のための新規なツールを提供したいと考え、従って、HCC予後に関連することが判明した、または既に記載されているさらなる遺伝子もさらなる定量的PCR分析に含めた:
(1)根本的に異なる予後によって特徴付けられたHCC患者間で最も差次的に発現される(有意性および倍率)41遺伝子のパネルを、治癒的切除により処置された44のHCCの発現パターンのAffymetrixマイクロアレイE−TABM−36分析を用いて得られた新たなマイクロアレイデータにより同定した:TAF9、NRCAM、PSMD1、ARFGEF2、SPP1、CDC20、NRAS、ENO1、RRAGD、CHKA、RAN、TRIP13、IMP−3/IGF2BP3、KLRB1、C14orf156、NPEPPS、PDCD2、PHB、 KIAA0090、KPNA2、KIAA0268/UNQ6077/LOC440751、G6PD、STK6、TFRC、GLA、AKR1C1/AKR1C2、GIMAP5、ADM、CCNB1、TKT、AGPS、NUDT9、HLA−DQA1、NEU1、RARRES2、BIRC5、FLJ20273、HMGB3、MPPE1、CCL5、およびDLG7;ならびに
(2)HCC 予後に関連するとして文献に記載されている2つの遺伝子(KRT19およびEPCAM)(Lee JS, et al. 2006, Yamashita T, et al.2008)。
(1)根本的に異なる予後によって特徴付けられたHCC患者間で最も差次的に発現される(有意性および倍率)41遺伝子のパネルを、治癒的切除により処置された44のHCCの発現パターンのAffymetrixマイクロアレイE−TABM−36分析を用いて得られた新たなマイクロアレイデータにより同定した:TAF9、NRCAM、PSMD1、ARFGEF2、SPP1、CDC20、NRAS、ENO1、RRAGD、CHKA、RAN、TRIP13、IMP−3/IGF2BP3、KLRB1、C14orf156、NPEPPS、PDCD2、PHB、 KIAA0090、KPNA2、KIAA0268/UNQ6077/LOC440751、G6PD、STK6、TFRC、GLA、AKR1C1/AKR1C2、GIMAP5、ADM、CCNB1、TKT、AGPS、NUDT9、HLA−DQA1、NEU1、RARRES2、BIRC5、FLJ20273、HMGB3、MPPE1、CCL5、およびDLG7;ならびに
(2)HCC 予後に関連するとして文献に記載されている2つの遺伝子(KRT19およびEPCAM)(Lee JS, et al. 2006, Yamashita T, et al.2008)。
合計43の遺伝子をHCC予後との関連に関して選択した。
定量的RT−PCR
RNA抽出および定量的RT−PCRは、従前に記載されているように行った。103の選択遺伝子の発現を、TaqMan Microfluidic card TLDA(Applied Biosystems)遺伝子発現アッセイを用い、550の全サンプルにおいて二反復で分析した。遺伝子発現を、RNAリボゾーム18Sを用いて正規化し、腫瘍サンプルの発現レベルを正常肝臓組織での対応する遺伝子発現の平均レベルと比較し、n倍率として表した。RNAの相対量を、2ΔΔCT法を用いて算出した。
RNA抽出および定量的RT−PCRは、従前に記載されているように行った。103の選択遺伝子の発現を、TaqMan Microfluidic card TLDA(Applied Biosystems)遺伝子発現アッセイを用い、550の全サンプルにおいて二反復で分析した。遺伝子発現を、RNAリボゾーム18Sを用いて正規化し、腫瘍サンプルの発現レベルを正常肝臓組織での対応する遺伝子発現の平均レベルと比較し、n倍率として表した。RNAの相対量を、2ΔΔCT法を用いて算出した。
突然変異スクリーニング
DNAを抽出し、質を評価した。総てのHCAサンプルは、CTNNB1(エキソン2〜4)、HNF1A(エキソン1〜10)、IL6ST(エキソン6および10)、GNAS(エキソン8)およびSTAT3(エキソン2、5および20)に関して配列決定が行われていた。総てのHCCサンプルは、CTNNB1(エキソン2〜4)およびTP53(エキソン2〜11)に関して配列決定が行われていた。総ての突然変異を、両鎖において、二次的な独立増幅産物を配列決定することにより確認し、生殖細胞系突然変異を検出するために、適合する非腫瘍サンプルにおける突然変異のスクリーニングを行った。
DNAを抽出し、質を評価した。総てのHCAサンプルは、CTNNB1(エキソン2〜4)、HNF1A(エキソン1〜10)、IL6ST(エキソン6および10)、GNAS(エキソン8)およびSTAT3(エキソン2、5および20)に関して配列決定が行われていた。総てのHCCサンプルは、CTNNB1(エキソン2〜4)およびTP53(エキソン2〜11)に関して配列決定が行われていた。総ての突然変異を、両鎖において、二次的な独立増幅産物を配列決定することにより確認し、生殖細胞系突然変異を検出するために、適合する非腫瘍サンプルにおける突然変異のスクリーニングを行った。
予後に関するエンドポイント
試験計画は、予後試験REMARKにおけるマーカーに関する報告(McShane LM, et al.2005)およびEASL/EORTCガイドライン(EASL J, et al.2012)の一般的推奨に従った。手術後、患者を経過観察し、HCC再発を血清AFPの投与およびCTスキャン(または肝臓MRI)によってスクリーニングした。本試験の主要エンドポイントは、腫瘍関連死を分析することによる疾病特異的な全生存期間であり、本発明者らは別の病因から死亡した患者は打ち切りとした。腫瘍関連死は、肝臓の50%超を含むHCC、広範な腫瘍門脈血栓症または肝外転移伴うHCCを有する患者で死亡が見られた場合と定義した。二次的な独立したHCCの出現によるバックグラウンドノイズを制限するために、本発明者らは、生存期間を最初の切除術の後5年で打ち切りとした。最終の経過観察記録受診は2011年2月であった。本発明者らはまた、再発する患者の生存期間、すなわち、腫瘍再発から死亡の間と定義される「再発後生存期間」も評価した。
試験計画は、予後試験REMARKにおけるマーカーに関する報告(McShane LM, et al.2005)およびEASL/EORTCガイドライン(EASL J, et al.2012)の一般的推奨に従った。手術後、患者を経過観察し、HCC再発を血清AFPの投与およびCTスキャン(または肝臓MRI)によってスクリーニングした。本試験の主要エンドポイントは、腫瘍関連死を分析することによる疾病特異的な全生存期間であり、本発明者らは別の病因から死亡した患者は打ち切りとした。腫瘍関連死は、肝臓の50%超を含むHCC、広範な腫瘍門脈血栓症または肝外転移伴うHCCを有する患者で死亡が見られた場合と定義した。二次的な独立したHCCの出現によるバックグラウンドノイズを制限するために、本発明者らは、生存期間を最初の切除術の後5年で打ち切りとした。最終の経過観察記録受診は2011年2月であった。本発明者らはまた、再発する患者の生存期間、すなわち、腫瘍再発から死亡の間と定義される「再発後生存期間」も評価した。
予後スコアの構築
314のHCCは、トレーニングセットS1(ボルドーで処置を受けた189名の患者)およびバリデーションセットS2(クレテイユで処置を受けた125名の患者)に分けられた。S1を基に、評価した103の遺伝子それぞれに関して単変量コックスモデルを計算し(生存Rパッケージ、coxph関数、ブレスロウ法)、ログランク検定p値が0.05未満の遺伝子を選択したところ31遺伝子が得られた。これらの31遺伝子を、選択基準としてログランク検定p値を用いるステップワイズ法において使用し、S1に対する多変量コックスモデルを構築した。本発明者らは、改変型ステップワイズフォワード法を用い、k>2での実施の場合(すなわち、(k−1)個の変数で事前に得られたモデルに基づいてk個の変数でのモデルを構築する)、本発明者らは一変数を加え、その後、一変数を除き、再び一変数を加える。加えるまたは除くべき変数は、判定基準を最適化するものの中から選択される。複数の変数が判定基準を最適化している場合には、最初に直面するものが選択される。本発明者らは、1から10遺伝子の範囲の10個のモデルを構築する。本発明者らは、次に、最小のモデル、すなわち、判定基準を最適化する変数ができる限り少ないものを選択した。このモデル(k=5遺伝子)の妥当性を評価するために、それを用いてバリデーションセットS2からのサンプルを推定した。
314のHCCは、トレーニングセットS1(ボルドーで処置を受けた189名の患者)およびバリデーションセットS2(クレテイユで処置を受けた125名の患者)に分けられた。S1を基に、評価した103の遺伝子それぞれに関して単変量コックスモデルを計算し(生存Rパッケージ、coxph関数、ブレスロウ法)、ログランク検定p値が0.05未満の遺伝子を選択したところ31遺伝子が得られた。これらの31遺伝子を、選択基準としてログランク検定p値を用いるステップワイズ法において使用し、S1に対する多変量コックスモデルを構築した。本発明者らは、改変型ステップワイズフォワード法を用い、k>2での実施の場合(すなわち、(k−1)個の変数で事前に得られたモデルに基づいてk個の変数でのモデルを構築する)、本発明者らは一変数を加え、その後、一変数を除き、再び一変数を加える。加えるまたは除くべき変数は、判定基準を最適化するものの中から選択される。複数の変数が判定基準を最適化している場合には、最初に直面するものが選択される。本発明者らは、1から10遺伝子の範囲の10個のモデルを構築する。本発明者らは、次に、最小のモデル、すなわち、判定基準を最適化する変数ができる限り少ないものを選択した。このモデル(k=5遺伝子)の妥当性を評価するために、それを用いてバリデーションセットS2からのサンプルを推定した。
予後の推定(5遺伝子二分スコア)
あるサンプルが2つの予後クラス0および1(それぞれ好適な転帰および好適でない転帰に相当する)の一方に分類され、N個の変数、およびこのサンプルの関連評価値X=(x1,…,xN)とすれば、そのサンプルは下記の法則:
予後(X)=IR+(Λ(X))、
すなわち、Λ(X)≧0ならば予後(X)=1
Λ(X)<0ならば予後(X)=0
ここで、
に基づいてクラス0または1に帰属される。パラメーター(mi,wi)は上記表2に示される。
あるサンプルが2つの予後クラス0および1(それぞれ好適な転帰および好適でない転帰に相当する)の一方に分類され、N個の変数、およびこのサンプルの関連評価値X=(x1,…,xN)とすれば、そのサンプルは下記の法則:
予後(X)=IR+(Λ(X))、
すなわち、Λ(X)≧0ならば予後(X)=1
Λ(X)<0ならば予後(X)=0
ここで、
総合予後スコアにおいて、Λ(X)の値は、BCLCクラスおよび微小血管侵入に加え、インプットとして使用される。
統計分析
ログランク検定およびカプラン・マイヤー法を用いて、生存期間を評価した。連続変数および離散変数を、それぞれマン・ホイットニーおよびカイ二乗またはフィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。単変量および多変量解析はコックスモデルを用いて行った。統計分析はR統計ソフトウエアおよびrmsパッケージを用いて行った。
ログランク検定およびカプラン・マイヤー法を用いて、生存期間を評価した。連続変数および離散変数を、それぞれマン・ホイットニーおよびカイ二乗またはフィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。単変量および多変量解析はコックスモデルを用いて行った。統計分析はR統計ソフトウエアおよびrmsパッケージを用いて行った。
特定の生存推定に関してシグネチャー精度を検定するための曲線下面積をUno, H., et al.2007に従って求めた。推定規則は、打ち切り回帰モデル(Journal of the American Statistical Association 102, 527-537)で、survAUC Rパッケージを用いてt年生存者に関して評価した。rmsパッケージを使用することにより、ノモグラムを設定した。
結果
切除HCCの予後に関連する5遺伝子スコア
切除HCCの全生存期間および早期腫瘍再発を推定するためのロバストな分子遺伝子スコアの作成と妥当性評価を行うため、103遺伝子のセットの発現を予後に適格な314のHCCで分析した(図1のフローチャートを参照)。トレーニングセット(ボルドーで処置を受けた189名の患者)において、単変量コックス分析およびリーブイン−リーブアウト戦略(leave in-leave out strategy)を用い、最も強い予後連関を示す5遺伝子のパネル(TAF9、RAMP3、HN1、KRT19およびRAN)を同定した(図2参照)。これらの5遺伝子のうち、4つが不良予後のHCCにおいてアップレギュレートされていた(図3参照)。最後に、トレーニングコホートから、多変量コックスモデルの係数および回帰式を用いて5遺伝子スコアを構成した。次に、この5遺伝子スコアの妥当性を、モンドール病院で処置を受けた125名の患者を含む独立したバリデーションコホートにおいて評価した。
切除HCCの予後に関連する5遺伝子スコア
切除HCCの全生存期間および早期腫瘍再発を推定するためのロバストな分子遺伝子スコアの作成と妥当性評価を行うため、103遺伝子のセットの発現を予後に適格な314のHCCで分析した(図1のフローチャートを参照)。トレーニングセット(ボルドーで処置を受けた189名の患者)において、単変量コックス分析およびリーブイン−リーブアウト戦略(leave in-leave out strategy)を用い、最も強い予後連関を示す5遺伝子のパネル(TAF9、RAMP3、HN1、KRT19およびRAN)を同定した(図2参照)。これらの5遺伝子のうち、4つが不良予後のHCCにおいてアップレギュレートされていた(図3参照)。最後に、トレーニングコホートから、多変量コックスモデルの係数および回帰式を用いて5遺伝子スコアを構成した。次に、この5遺伝子スコアの妥当性を、モンドール病院で処置を受けた125名の患者を含む独立したバリデーションコホートにおいて評価した。
二分化5遺伝子スコアは、トレーニング(ログランクP<0.0001、図2A)およびバリデーションコホート(ログランクP<0.0001、図2B)において全生存期間と有意に関連があった。全特異的生存を推定するための5遺伝子スコアの精度を評価するために、5遺伝子スコアのAUCを、トレーニングコホートでコックス回帰モデルを構築することにより計算し、バリデーションコホートで検定した。種々の期間についてAUCを計算し、図2Fに報告する。AUCの集約尺度を0か月から60か月までのAUCの積分によって求めたところ0.80に達した。
さらに、5遺伝子スコアはまた、トレーニングコホート(ログランクP<0.0001、図2C参照)およびバリデーションコホート(ログランクP=0.0006、図2D参照)の両方において、早期腫瘍再発とも関連があった。
次に、本発明者らは、原発腫瘍の分子的予後分類が対応する再発の臨床経過を推定できるかどうかに疑問を持った。結果的に、再発患者のサブグループにおいて、スコア(原発腫瘍に対して遂行)は再発後の死亡リスクを正確に推定した(ログランクP<0.0001、図2E参照)。この結果から、術後の患者の早期再発が原発腫瘍に由来することが確認された。結果として、本発明者らにより決定された5遺伝子スコアは、最初の腫瘍および再発の悪性度に関連している。
完全な除去によって処置された314名のHCC患者のうち、129名が5遺伝子スコアによって不良予後群に分類された。分子的不良予後を有するこの群の患者は、これまでにHCC予後と関連付けられている周知の臨床(HBV感染、腫瘍サイズ、術前AFP、BCLC病期)、病理学的(大血管および微小血管侵入、腫瘍分化)および分子的特徴(G3分類、P53突然変異)のほとんど総てと有意に関連していた(下表7参照)。これに対し、分子的予後の5遺伝子スコアは、年齢、他の病因、腫瘍数、METAVIRスコアおよびCTNNB1突然変異とは関連がない。
HCC患者の予後を評価するための多変量解析
本発明者らはまた、予後を推定するための新たな分子的5遺伝子スコアの独立値を調べることを目的とした。5遺伝子スコアは、トレーニングコホート、バリデーションコホートおよび全コホートにおいて、BCLC病期分類を含む臨床的特徴および病理学的特徴とは独立に全生存期間に関連することが、多変量解析を用いて示された(下表8参照)。
本発明者らはまた、予後を推定するための新たな分子的5遺伝子スコアの独立値を調べることを目的とした。5遺伝子スコアは、トレーニングコホート、バリデーションコホートおよび全コホートにおいて、BCLC病期分類を含む臨床的特徴および病理学的特徴とは独立に全生存期間に関連することが、多変量解析を用いて示された(下表8参照)。
興味深いことに、試験した患者において、TP53およびCTNNB1の突然変異は予後に関連が無かった。さらに、G3分類との関連とともに(下表9参照)、5遺伝子スコアは各患者コホートの予後の推定により寄与が大きかった(下表9参照)。
さらにまた、5遺伝子スコアの性能を、WO2007/063118A1に開示されたいくつかの予後スコアと比較した。この場合にも、5遺伝子スコアは各患者コホートの予後の推定により寄与が大きいことが判明した(下表10参照)。
フランスの患者が病期、病因および基礎肝疾患の点でHCCの多様性を示したことから、各条件で5遺伝子スコアの性能を分析した(図2G参照)。興味深いことに、5遺伝子スコアは、基礎肝疾患、腫瘍の大きさ、腫瘍分化のレベルまたは微小血管侵入の存在とは無関係に、HCCの各サブタイプにおいて全生存期間と有意に関連していた。さらに、最も慣用されている臨床病期分類であるBCLCにより分類された患者では、5遺伝子スコアは予後推定を精密化することができた(図2G参照)。5種類の他の臨床病期分類システム(CLIP、JIS、TNM分類、ならびにミランおよびメトロチケットカリキュレーター判定基準でも同様の結果が得られた(図3および上の表6参照)。
これらの結果は総て、HCCが切除により処置された患者の予後を推定する5遺伝子スコアのロバスト性および強い非依存的能力を強調する。
最後に、全系列のHCC患者で、最も関連の大きい臨床変数、病理変数および分子変数を集めて総合予後予測因子を開発した。BCLC分類を微小血管侵入および5遺伝子スコアの統合を行って総合スコアを取得した。図5Aのノモグラムは、5年における腫瘍関連死を推定するための各変数の寄与を示す。33および66パーセンタイルで分けた総合スコア化は、良好な予後、中間の予後および不良な予後を有する患者を正確に区別した(図5B参照)。
結論
HCC再発の分子推定および関連死は、拡張分野である。18を超える異なる分子シグネチャーが報告されているが、そのうち外的に妥当性が評価されているものはまだほとんどない(Villanueva A, et al.2010)。これらの妥当性評価済みの分子予後分類の1つが、パラフィン包埋組織で従前に妥当性が評価されたG3シグネチャーであった(Boyault S, et al.2007, Villanueva A, et al.2011)。
HCC再発の分子推定および関連死は、拡張分野である。18を超える異なる分子シグネチャーが報告されているが、そのうち外的に妥当性が評価されているものはまだほとんどない(Villanueva A, et al.2010)。これらの妥当性評価済みの分子予後分類の1つが、パラフィン包埋組織で従前に妥当性が評価されたG3シグネチャーであった(Boyault S, et al.2007, Villanueva A, et al.2011)。
この予後シグネチャーに含まれる5遺伝子は、TAF9、RAMP3、HN1、KRT19およびRANであった。それらは不良予後の腫瘍で、調節を欠いた異なるシグナル伝達経路を示した。KRT19発現に関連した幹細胞/前駆細胞の特徴は不良予後のHCCにおいてすでに記載されている(Lee JS nat med 2006)。同様に、TAF9、RAMP3、およびHN1も、WO2007/063118A1でHCC予後にすでに関連付けられている。これに対し、RANは、HCC予後における新たな役者である。腫瘍内で確認されたこれらの脱調節は癌の悪性度に関連し、これは術後の早期再発および再発後の生存に関連している。
本研究において、新たに同定された5遺伝子スコアは、HCCが切除により処置された患者の予後にG3シグネチャーよりも寄与度が高かった。特に、5遺伝子シグネチャーは、G3サブグループに分類されたほとんどの腫瘍(86%)を不良な予後を有すると識別したが、非G3分子サブグループに分類された腫瘍を有する不良予後患者も識別した。
同様に、単一の新たに同定された5遺伝子スコアはまた、全生存期間または無再発生存期間の予後に関してもWO2007/063118A1で開示された種々のシグネチャーよりも寄与度が高いことが判明した。
本研究で使用した患者の西洋コホートにおいて、2つのフランス大学病院で同様に処置を受けた種々の病因(アルコール、C型およびB型肝炎、代謝疾患)および種々の病期(初期〜浸潤性)のHCCが活用された。主としてHBV関連HCC(Nault JC, et al.2011, Woo HG, et al.2011, Hsu HC, et al.2000)に焦点を当てる他の研究とは対照的に、TP53またはCTNNB1突然変異と予後の間の有意な関連は見られなかった。5遺伝子スコア化は、腫瘍病期、病因または硬変の存在とは独立に予後に有意に関連する。
結論として、本発明者らにより同定された5遺伝子スコアは、HCC患者の予後および治療決定を簡単かつ精密にする。
実施例2.定量的PCRにより同定されたシグネチャーのマイクロアレイデータへの適用
実施例1に記載の5遺伝子予後予測因子は、RT定量的PCR ΔΔCt評価用に設計されたプロトコールに基づく。
実施例1に記載の5遺伝子予後予測因子は、RT定量的PCR ΔΔCt評価用に設計されたプロトコールに基づく。
同じ5遺伝子予後予測因子(遺伝子TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANからなる発現プロファイルに基づく)、マイクロアレイデータ専用の10のさらなるバージョンもまた、5遺伝子シグネチャーの妥当性評価を行うために開発された。
これらの10種の「マイクロアレイ」バージョンは、2つの異なるトレーニングセットに基づき、すなわち、一方は定量的RT−PCRデータに基づき、他方はマイクロアレイデータに基づき、5つの異なるアルゴリズムを用いて得られた。
より詳しくは、10種類の「マイクロアレイ」バージョンは、次のようにして得られた:
・5つの遺伝子TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANは、Affymetrix HG−U133A プローブセット:TAF9/202168_at、RAMP3/205326_at、HN1/217755_at、KRT19/201650_at、RAN/200750_s_atにマッピングされた。
・5つの遺伝子TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANは、Affymetrix HG−U133A プローブセット:TAF9/202168_at、RAMP3/205326_at、HN1/217755_at、KRT19/201650_at、RAN/200750_s_atにマッピングされた。
・トレーニングセット:2つの択一的トレーニングセットを用いた:
○実施例1に記載のトレーニングセットに対応するRT−PCRデータを第1のトレーニングコホートとして用いた。発現値はΔΔCt値に相当した;または
○E−TABM−36データセット(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-36)のうち、全生存期間情報およびAffymetrix HG−U133A RMA正規化発現プロファイルが利用可能であった46のHCCを第2のトレーニングコホートとして用いた。この場合、予測因子に用いた値は、生の発現値のlog2導関数に相当した。
○実施例1に記載のトレーニングセットに対応するRT−PCRデータを第1のトレーニングコホートとして用いた。発現値はΔΔCt値に相当した;または
○E−TABM−36データセット(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-36)のうち、全生存期間情報およびAffymetrix HG−U133A RMA正規化発現プロファイルが利用可能であった46のHCCを第2のトレーニングコホートとして用いた。この場合、予測因子に用いた値は、生の発現値のlog2導関数に相当した。
・これらの2つの択一的トレーニングセットに基づき、予後予測因子の2×5マイクロアレイバージョンを、下記の5つアルゴリズムを用いて得た:
●二分閾値セットから0までの場合の全生存期間情報を用いたコックスモデル:
式中、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
○miおよびwi、1≦i≦5は、下記の固定パラメーターであり、
●二分閾値セットから0までの場合の全生存期間情報を用いたコックスモデル:
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
○miおよびwi、1≦i≦5は、下記の固定パラメーターであり、
かつ、患者は、その予後スコアが0より低い場合には良好な予後を示し、その予後スコアが0以上の場合には不良な予後を示す。
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離として(1−ピアソン相関係数)を、行をセンタリングすることなく使用:
予後スコア(サンプルX)=Argmin(距離(good);距離(bad))
ここで、
式中、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
予後スコア(サンプルX)=Argmin(距離(good);距離(bad))
ここで、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離として(1−ピアソン相関係数)を、中央値行をセンタリングすることなく使用:
予後スコア(サンプルX)=Argmin(距離(good);距離(bad))
ここで、
式中、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
予後スコア(サンプルX)=Argmin(距離(good);距離(bad))
ここで、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離としてDQDAを、行をセンタリングすることなく使用:
式中、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、かつ、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、かつ、
また
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離としてDQDAを、中央値行をセンタリングすることなく使用:
式中、
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、かつ、
・セントロイドに基づき、推定する変数として非打ち切り全生存期間、および距離としてDQDAを、中央値行をセンタリングすることなく使用:
○xi、1≦i≦5は、発現プロファイルに含まれる5つの遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、かつ、
上記の結果は、同じ遺伝子に基づくが、別のトレーニングセットおよび/または別の発現レベル測定技術および/または別のアルゴリズムに基づいて異なる較正が行われた予測因子が同等の結果をもたらすことを示す。
これらの結果はまた、バリデーション群の発現レベルの測定に使用される技術がトレーニング群に使用される技術と同じである必要はないことを示す。
Claims (19)
- HCCに罹患している被験体において前記被験体の肝臓サンプルからの全生存期間および/または無再発生存期間のin vitro予後の方法であって、
a)前記肝臓サンプルからin vitroにおいて下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANを含んでなるまたはからなる発現プロファイルを決定すること;および
b)少なくとも1つの参照HCC肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、前記発現プロファイルに基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測すること
を含んでなる、方法。 - 前記発現プロファイルが1以上の内部対照遺伝子をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 全生存期間および無再発生存期間を予測するために使用される1または複数のアルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルが、下記のもの:
i)全生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも5年生存した患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプルおよび腫瘍切除後3年以内に死亡した患者由来の少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプル;
ii)無再発生存期間予測目的では、腫瘍切除後少なくとも4年間再発しなかった患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプルおよび腫瘍切除後2年以内に再発した患者に由来する少なくとも1つの(好ましくは、複数の)HCCサンプル
である、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 前記肝臓サンプルが肝臓生検または部分的もしくは全肝臓腫瘍外科的切除物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現プロファイルが核酸レベルで決定される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現プロファイルが定量的PCRを用いて決定される、請求項5に記載の方法。
- 全生存期間および/または無再発生存期間を予測するために使用されるアルゴリズムが、PLS(部分最小二乗)回帰アルゴリズム、サポートベクターマシン(SVM)アルゴリズム、線形回帰またはその派生アルゴリズム(GLMと略される一般化線形モデル、ロジスティック回帰を含む)、線形判別分析(LDA、対角線形判別分析(DLDA)を含む)アルゴリズム、対角二次判別分析(DQDA)アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、k−NN(近傍)アルゴリズム、およびPAM(マイクロアレイ予測分析)アルゴリズムから選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 全生存期間および/または無再発生存期間を予測するために使用されるアルゴリズムが、下式:
・Nは、発現プロファイルの遺伝子の数を表し、
・xi、1≦i≦N、発現プロファイルに含まれるN個の遺伝子のin vitroで測定された発現値を表し、
・miおよびwi、1≦i≦Nは、少なくとも1つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
・サンプルXは、スコア(サンプルX)が閾値Tより低い場合には良好な全生存期間および/または無再発生存期間予測を有し、スコア(サンプルX)が閾値Tより高い場合には不良な全生存期間および/または無再発生存期間予測を有すると見なされ、ここで、Tは、少なくとも1つの参照サンプルで較正されたものである]
を用いた線形回帰である、請求項7に記載の方法。 - a)予後に関連する少なくとも1つの他の変数を決定すること、および
b)少なくとも1つの参照HCC肝臓サンプルで較正されたアルゴリズムを用い、発現プロファイルと前記1または複数の他の変数に基づいて全生存期間および/または無再発生存期間を予測することをさらに含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記他の変数が、G1−G6分類、BCLC(Barcelona Clinic Liver Cancer)、CLIP(Cancer of the Liver Italian Program)、JIS(Japan Integrated Staging)、TNM(Tumour-Node-Metastasis)臨床病期分類、ミランおよびメトロチケットカリキュレーター判定基準、硬変の存在、術前AFP(αフェトタンパク質)血漿レベル、エドモンソングレード、および微小血管侵入から選択され、好ましくは、前記他の変数がBCLC臨床病期分類および肝臓サンプルの微小血管侵入である、請求項10に記載の方法。
- 多くて65の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットであって、前記発現プロファイルが下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANを含んでなるまたはからなる、キット。
- 前記発現プロファイルが1以上の内部対照遺伝子をさらに含んでなる、請求項12に記載のキット。
- a)特異的な増幅プライマーおよび/もしくはプローブ、または
b)核酸マイクロアレイ
を含んでなる、請求項12または請求項13に記載のキット。 - 請求項1〜11のいずれか一項に記載の予後方法を用いて不良な予後を示した被験体におけるHCCの治療に使用するための、治療用細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の予後方法によって不良な全生存期間および/または無再発生存期間予測を示した被験体におけるHCCの治療を意図した薬剤の調製のための、治療用細胞傷害性化学療法薬または標的治療薬の使用。
- 被験体の肝臓サンプルからその被験体の全生存期間または無再発生存期間を予測するためのシステム1であって、
a)肝臓サンプルを受容し、下記の5つの遺伝子:TAF9、RAMP3、HN1、KRT19、およびRANを含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール2;
b)前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス3;
c)前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール4、ここで、前記比較結果は良好または不良な予後の指標となる;および
d)任意選択の、ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント6を表示するための表示モジュール5、ここで、前記コンテントは良好または不良な予後の指標となる信号である、
を含んでなる、システム。 - 前記発現プロファイルが1以上の内部対照遺伝子をさらに含んでなる、請求項17に記載のシステム。
- 発現プロファイルデータの解釈に関する請求項1〜11のいずれか一項に記載の予後方法のコンピューターステップへの実装のためのソフトウエアモジュールを定義するためのコンピューター可読命令が記録されたコンピューター可読媒体7。
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