JP2015533491A - 染色体組換え操作に基づく多機能性経口ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
[0001]本明細書中に引用される出願及び特許の各々、並びにその出願及び特許の各々で引用される各文書又は参考文献(各登録特許の審査中の「出願引用文書」を含む)、並びにこれらの出願及び特許のいずれかに対応する並びに/又はこれらの出願及び特許の優先権を主張するPCT及び外国出願又は特許の各々、並びに出願引用文書の各々で引用又は参照される文書の各々は、参照により本明細書に明確に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より一般的には、文書又は参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献リスト又は本明細書自体のいずれかにおいて本明細書に引用され、これらの文書又は参考文献(「本明細書中で引用される参考文献」)の各々、及び本明細書中で引用される参考文献(任意の製造者の仕様書、指示書などを含む)の各々で引用される各文書又は参考文献は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
政府の利益の陳述
[0002]本出願は政府の支援により実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表資料
[0003]2013年9月12日に作成され、144キロバイトのサイズの、ファイル名が「6137FDA9PCT_SEQ_Listing_20130912_ST25.txt」である、本明細書に添付された配列表テキストファイルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[0027]別の態様では、本発明は、本明細書で開示されるSalmonella typhi Ty21aを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含むワクチンを提供する。
[0030]本発明のプラスミド構築物の別の実施形態では、DNA配列は部分的に又は完全に化学合成される。
[0032]本発明の追加的な実施形態では、細菌性LPS、カプセル多糖(CPS)又はオリゴ多糖(オリゴPS)の生合成に関与する遺伝子クラスターを、in vivoでバイオコンジュゲーション反応を行う酵素に加えて目的のタンパク質担体と一緒に、E.coliに形質転換する。誘導によって一旦生成されれば、簡単な精製ステップを行い、ワクチンとして使用するための生物学的生成物を製剤化する(Dro(2012)Gen.Eng.Biotech.News、32巻、www.genengnews.com/gen−articles/developing−next−gen−conjugate−vaccines/4042;Gambillara(2012)BioPharm Int.、25:28〜32;Kowarikら(2006)Science、314:1148〜1150;Wackerら(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、103:7088〜7093;Kowarikら(2006)EMBO J.、25:1957〜1966;Feldmanら(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、102:3016〜3021;Nita−Lazarら(2005)Glycobiology、15:361〜367;Wackerら(2002)Science、298:1790〜1793;Wacker(2002)N−linked Protein Glycosylation:From Eukaryotes to Bacteria、Swiss Federal Institute of Technology、Zurichに提出されたPh.D学位論文)。
[0034]Salmonella血清型Typhi及びParatyphiは汚染された食物及び水の摂取を通して獲得され、識別不可能な腸炎熱を引き起こす。発生のピークは幼い学童において生じるが、腸炎熱は、すべての年齢が見舞われる。多抗生物質耐性は治療を複雑化し、適切な食品衛生を欠く地域において、ワクチン接種を所望の優先順位にする。2つの腸チフスワクチンが使用可能であるが、それらを発展途上国に大規模に導入する取り組みはほとんどなかった。腸炎熱と細菌性赤痢を同時に防ぐであろう多価ワクチンは、旅行者及び軍隊だけでなく、結果として生じる高い疾患死亡率を被る発展途上国に対しても、これらの疾患に対する免疫化の促進において大きな実用上の利点を有すると思われる。
[0038]以下の詳細な説明は例として挙げたものであり、記載される特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではなく、添付の図面と併せて理解することができる。
[0054]用語「O−Ps(O多糖)生合成」及び「O抗原生合成」遺伝子は、本明細書で互換的に使用される。O抗原は、コア連結リポ多糖(LPS)として、又はO抗原が細胞表面で発現しているが、脂質A−コアオリゴ糖以外の脂質と連結しているグループ4カプセルとして発現し得る多糖である。
[0072]本発明の追加的な実施形態
一実施形態では、本発明は原核微生物を含む。別の実施形態では、原核微生物は細菌種である。好ましくは、原核微生物はSalmonellaの弱毒化された株である。しかし、他の原核微生物、例えばEscherichia coli、Shigella、Yersinia、Lactobacillus、Mycobacteria、Listeria又はVibrioの弱毒化された株も本発明にとって同様に意図される。適切な微生物株の例としては、これらに限定されないが、Salmonella typhimurium、Salmonella typhi、Salmonella dublin、Salmonella enteritidis、Escherichia coli、Shigella flexneri、Shigella Sonnei、Vibrio cholerae(Yamamotoら(2009)Gene 438:57〜64)、Pseudomonas aeroginosa(Lesicら(2008)BMC Mol Biol 9:20)、Yersinia pestis(Sunら(2008)Applied and Env Microbiol 74:4241〜4245)及びMycobacterium bovis(BCG)が挙げられる。注目すべきことに、λredはMycobacteriaで機能しないが、別のファージ(例えばChe9c gp61)がMycobacteriaでの組換え操作に使用されている(van Kesselら(2008)Methods mol biol 435:203〜215)。
[0077]さらなる態様では、本発明は、原核微生物の染色体に挿入されたO抗原生合成遺伝子領域を含む原核微生物の弱毒化された株の使用を提供し、ここでは、1つ又は幾つかの異なるタイプの細菌性感染(例えば腸チフス及び赤痢)の予防的又は治療的処置のための医薬の調製において、O抗原は微生物中で生成される。
[0081]本発明による医薬組成物及び本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、医薬的に又は生理学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は無毒でなければならず、且つ、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体又は他の材料の的確な性質は、投与経路に依存する。
[0085]ワクチン株の好ましい実施形態では、キャリヤー株によって防御免疫応答を誘導するために、異種の遺伝子(複数可)は、増殖に非必須とされる定められた組み込み部位で、前記株の染色体中に安定して組み込まれる。
[0093]好ましい実施形態では、前記生ワクチンは、グラム陰性腸内病原体に対する免疫化に使用される。
a)配列番号2及びその種相同体のうちのいずれか一つに示されるDNA配列、
b)配列番号2及びその種相同体のうちのいずれか一つによってコードされるShigella sonneiのO抗原生合成ポリペプチドをコードするDNA分子、及び
c)中程度ストリンジェントな条件下で(a)又は(b)のDNAとハイブリダイズする、O抗原生合成遺伝子産物をコードするDNA分子
からなる群から選択されるDNAによってコードされるO抗原生合成ポリペプチドを使用する。中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。
[0108]ある種の実施形態では、本発明は、細菌性感染を治療する(例えば、細菌性感染の1つ若しくは複数の症状若しくは特徴を緩和する、寛解させる、軽減する、細菌性感染の1つ若しくは複数の症状若しくは特徴の発症を遅延させる、細菌性感染の1つ若しくは複数の症状若しくは特徴の進行を抑制する、細菌性感染の1つ若しくは複数の症状若しくは特徴の重症度を低減する、及び/又は細菌性感染の1つ若しくは複数の症状又は特徴の発生を低減する)及び/又は細菌性感染を予防するための組成物(ワクチンを含む)及び方法を提供する。
[0112]組成物及びワクチン(本明細書で互換的に使用される用語)は、治療及び/又はワクチン接種に有効な、任意の量及び任意の投与経路で投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢及び全体的な状態、感染の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象によって異なる。組成物は、一般的には、投与の容易さ及び投薬量の均一性の理由で、投薬単位形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることを理解されたい。任意の特定の対象又は生物に対する特定の治療的有効量レベルは、治療を受ける及び/又はワクチン接種される障害及び障害の重症度;用いられる特定のワクチン組成物の活性;投与後の組成物の半減期;対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別及び食事;用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路及び排出速度;治療の継続期間;用いられる特定の化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物;医学分野で周知の同様の因子を含めた、種々の因子に依存する。
[0128]「ワクチン」は、ワクチンのレシピエント又は宿主において免疫応答を誘導する組成物である。ワクチンは、その後の細菌種(又は他の微生物)による攻撃感染時に、感染に対して防御を誘導することができる。防御は、少なくとも1つの細菌種(又は他の微生物)による宿主動物の持続感染への抵抗性(例えば部分的な抵抗性)を指す。ワクチン接種した宿主中で生成された中和抗体は、この防御を与えることができる。他の状況では、CTL応答がこの防御を与えることができる。場合によっては、中和抗体と細胞性免疫(例えばCTL)応答の両方が、この防御を与えることができる。
[0140]本発明による組成物及びワクチンは、単独で、又はこれらに限定されないが、ワクチン及び/若しくは抗体を含めた1種若しくは複数の他の治療剤と組み合わせて対象に投与することができる。「と組み合わせて」は、一緒に送達するように、薬剤が同時に投与される又は製剤化される必要があることを意味することを意図するものではない(とはいえ、これらの送達方法は本発明の範囲内である)。本発明による組成物及びワクチンは、1種又は複数の他の所望の治療法又は医学的手法と同時に、それらより前に、又はそれらの後に投与することができる。組み合わせて使用される治療的活性剤は、単一組成物において共に投与されてもよいし、異なる組成物において別々に投与されてもよい。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び/又はタイムスケジュールで投与されることが理解されよう。
[0144]本発明によるワクチン(又は他の組成物)の投薬量は、例えば、最初に、予防的及び/又は治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を特定することにより決定することができる。これは、細菌特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによって、並びに/又は血清試料、尿試料及び/若しくは粘膜分泌物中の抗体の抑制比を測定することによって達成することができる。問題になっている細菌種に対して天然の宿主でない動物を含めた動物の研究から投薬量を決定することができる。例えば、動物にワクチン候補、例えば本発明によるワクチンを投与して、誘導される免疫応答を部分的に特徴づける及び/又は任意の中和抗体が生成されたかどうかを決定することができる。さらに、慣例のヒト臨床研究を行って、ヒトに対する有効量を決定することができる。
[0148]本発明による組換え操作したSalmonella Typhi Ty21a又はワクチン若しくは組成物を含むキットは、追加的な実施形態で提供される。キットは、これらに限定されないが、使用のための指示書;他の試薬、例えば、希釈剤、投与するためにワクチン又は組成物を調製するためのデバイス又は他の材料;医薬的に許容可能な担体;及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含めた、1つ又は複数の他の要素を含むことができる。使用のための指示書は、例えば、ヒト対象における、本明細書に記載のような、推奨される投薬量及び/又は投与様式を含めた、治療適用(例えば、DNAワクチン接種及びタンパク質追加免疫)のための指示を含むことができる。
実施例1
S.sonneiの最小必須O抗原生合成遺伝子のクローニング
[0151]S.sonneiのI型O抗原生合成配列及び隣接配列をコードする大きな30kb領域は、O抗原の発現のための最小必要配列を決定するために(最初に欠失解析によって)以前に特徴づけられた。この領域のDNA配列解析と共に、これらの欠失データによって、推定上のプロモーター及び10個のorf(図1のorf4から13)を含む連続する12.3kbの領域が、S.sonneiにおけるO抗原生合成に必要とされることが示された。これらの欠失研究によって、一般的にはO抗原鎖長の調節に関与するwzz(ofr3)は、Ty21aにおける1型の発現に必須でないが、wzzの後半部分が推定上の1型O抗原生合成オペロンプロモーターを明らかに含むことも示唆された(Xuら(2002)Infect and Immun 70:4414〜4423)。
[0152]標準的な分子生物学技法を使用して、クローニングを行った。制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼは、New England Biolabs(NEB)又はFERMENTAS(登録商標)から購入し、PHUSION(登録商標)ポリメラーゼ(Fisher)をすべてのPCRに使用した。FRT部位に隣接するKanrカセットを、NheI及びNsiI制限酵素部位を含むプライマーを使用して、pKD4からPCR増幅し、プラスミドpGB−2もNheI及びNsiI制限酵素部位を含むプライマーを使用してPCR増幅し、Spc耐性を与えるオープンリーディングフレーム(orf)を除去するように操作した。2つのPCR産物をNheI及びNsiIで消化し、ライゲーションして、Kanr、SpcSプラスミドpMD35−36を構築した。vexA遺伝子(約1000bp)及びtviD遺伝子の一部(約500bp)をTy21aゲノムDNAからPCR増幅した。図1に示すように、増幅したtviD配列をFRT部位に隣接するKanrカセットの上流にクローニングし、vexA増幅産物をマルチクローニング部位の下流(MCS)にクローニングした。必要に応じ、PHUSION(登録商標)部位特異的変異誘発キット(NEB)に記載されている方法によって、制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに加えるか又は除去して、pMD−TVを構築した。pMD−TVを構築するのに使用したプライマー配列を以下の表Cに提供する。
pMD−TVへのS.sonneiのO抗原遺伝子のクローニング
[0154]S.sonneiのO抗原遺伝子をpXK65(Xuら(2002)Infect.Immun.、70:4414〜4423)からPCR増幅した。プライマーprMD43.ss.F.HindIII、gatcaaagcttgatcaaatagctcatat tcagcg(配列番号19)及びprMD44.ss.BamHI.R、gatcaggatcctgctcagtccggttggtg(配列番号20)を使用して、wzz遺伝子(orf3)の一部からwzy(orf7)までを増幅し、これを図1で断片Aとして示す。得られたPCR産物及びpMD−TVをHindIII及びBamHIで消化し、PCR精製(QIAGEN(登録商標))し、T4リガーゼを使用してライゲーションした。プライマーprMD41.ss.F.BamHI、gtagcggatccaagcgcagctatttaggatgag(配列番号21)及びprMD42.ss.R.XhoI、gatcgctcgagttaatttacggggtgattaccagac(配列番号22)を使用して、遺伝子wbgV(orf9)からapqZまで(orf14)を増幅し、これを図1で断片Bとして示す。得られたPCR産物及び遺伝子wzzからwzy(orf3からorf7)を含むプラスミドpMD−TVをBamHI及びXhoIで消化し、PCR精製し、先の場合と同様にライゲーションして、pMD−TV−Ss−1を構築した。このように、orf9から14(図1において断片Bと明示される)をPCR増幅し、非必須のIS630エレメント(orf8)を除去し、pMD−TVにおいてこの増幅産物をクローニングした断片Aに付着させて、pMD−TV−Ss−1を生成した。
直鎖Shigella DNAのTy21a染色体への組み込み
[0156]Datsenko及びWanner(Datsenkoら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97:6640〜6645)は、突然変異の標的される遺伝子に相同である36から50bpの延長部分を含むプライマーを使用するPCRによって生成される小さな選択可能な抗生物質耐性遺伝子を用いる、E.coli染色体配列の組換え性の置き換えを介して特異的な標的遺伝子突然変異を作り出すことを可能にする、高効率のλファージred組換えシステムに基づく方法を以前に記載した。λredシステムは、β、γ及びexo遺伝子を含み、それらの産物は、それぞれBeta、Gam及びExoと呼ばれる(Murphy(1998)J.Bacteriol.、180:2063〜2071)。Gamは、宿主のRecB、C、Dエキソヌクレアーゼ及びSbcC、Dヌクレアーゼの活性を抑制し、その結果、外から加えた直鎖DNAが分解されない。Exoタンパク質は、各鎖の末端に結合する一方で他の鎖を5’から3’方向に分解する、二本鎖DNA依存的エキソヌクレアーゼである。Betaは、得られたssDNAオーバーハングに結合し、最終的に、それを相補的な染色体DNA標的と対形成させる(Sawitzkeら(2007)Methods Enzymol.、421:171〜199)。低コピープラスミドpKD20は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターの制御下でこれらの3つのλredタンパク質をコードし、β、γ及びexo遺伝子の効率的な翻訳のために最適化されたリボゾーム結合部位を有し、その容易な除去を可能にするための温度感受性レプリコンを有する(Datsenkoら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97:6640〜6645)。λredシステムは、E.coli、Salmonella及びShigella種における特異的な遺伝子不活性化のために、並びにこれらの染色体に、小さな生物学的なタグを導入する(Uzzauら(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、98:15264〜15269)又は単一遺伝子を導入するために(Yuら(2011)Appl.Microbiol.Biotechnol.、91:177〜188)広く使用されている。
[0159]
本明細書で使用される細菌株及びプラスミドを以下の表Dに記載する。E.coli株を、DIFCO(登録商標)のLuria−Bertani(LB)ブロス中で又はLBアガー上で、37℃で増殖させた。Shigella株を、DIFCO(登録商標)のトリプチックソイブロス(TSB)又はトリプチックソイアガー(TSA)で増殖させた。Salmonella株Ty21aを、0.01%ガラクトース及び0.01%グルコースを補充したTSB又はTSAで増殖させた。プラスミドを含む株を、アンピシリン(Amp;100μg/ml)、スペクチノマイシン(Spc;100μg/ml)、クロラムフェニコール(Cm;35μg/ml)又はカナマイシン(Kan;30μg/ml)を含む増殖培地中で選択した。すべての構築したプラスミドを配列決定し、VECTOR NTI(登録商標)スイート9.0ソフトウェア(Invitrogen)を使用して、その配列をアセンブルし、解析した。
[0160]組換え効率を増強するために500〜1000bpのTy21a染色体相同性領域同士の間に操作して入れた上記のS.sonneiのO抗原生合成遺伝子を、λred組換えを使用してTy21a染色体中に組み込んだ(Datsenkoら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97:6640〜6645)。Ty21aをpKD46で形質転換し、0.01%ガラクトース及び0.01%グルコースを補充したTBS−Amp中で、30℃で増殖させ、OD600=約0.7までL−アラビノースで誘導した。得られた細胞を、10mM Hepes及び10%グリセロールで洗浄し、遠心分離により500倍に濃縮することによって、エレクトロコンピテント化した。図1に示すように、PCR増幅用のtviDフォワードプライマー及びvexAリバースプライマーを用いる鋳型として、pMD−TV−Ss−を使用した。このPCR増幅した領域は、tviD遺伝子の一部、FTR部位に隣接するKanr遺伝子、遺伝子的に最小化された必須のS.sonneiのO抗原生合成遺伝子セット、及びvexA遺伝子を含む。
ワクチンベクター株Salmonella typhi Ty21a染色体中への組換え性の挿入を介してShigella sonneiの約12kbのO抗原遺伝子領域の安定発現を成し遂げるための、2年間の研究
低コピープラスミドベクターにおける発現
[0166]S.sonneiのO抗原遺伝子を低コピープラスミドpGB−2にクローニングし、この異種のO抗原をワクチンベクターTy21aにおいて安定して発現させ、わずか2%のみが60世代後に消失した。このプラスミドは、遺伝的選択目的でスペクチノマイシン耐性遺伝子カセットを含む。これに対して、このクローニングしたShigella領域を含む高コピープラスミドベクターは、遺伝的に安定でなかった(3)。pGB−2は適切に安定であると思われたが、スペクチノマイシン耐性遺伝子を除去する必要があった。
[0167]pGB−2上のS.sonneiの遺伝子は安定して発現し、抗生物質非存在下での60世代の増殖にわたって98%が安定性であった。しかしFDA規制目的のために、大規模にヒトへワクチン投与するより前に、抗生物質耐性カセットを除去する必要がある。したがって、標的制限エンドヌクレアーゼを使用して欠失させることによって、組換え法又はPCRによって生み出した欠失を使用して欠失させることによって、耐性遺伝子カセットの除去を試みた。使用した方法又は除去領域の長さにかかわらず、予想外に、抗生物質カセットの除去はプラスミドの不安定性をもたらした。60世代にわたるプラスミドの消失は、50%に達した。次いで、スペクチノマイシンカセットを、FRT部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子カセットで置き換えた。FRT部位間の組換えを介してカナマイシン耐性を除去することができれば、おそらく得られたプラスミドは遺伝的に安定であると思われる。しかしカナマイシン耐性の除去も、プラスミドの不安定性をもたらした。
[0168]抗生物質耐性カセットの非存在下で、Ty21aにおいて異種のShigella sonneiのO抗原遺伝子の安定発現を達成するために、O抗原遺伝子をTy21a染色体中に組み込んだ。この課題を促進するために、低コピープラスミドpMD35−36を、FRT部位に隣接し、マルチクローニング部位(MCS)座に近接して位置するカナマイシン耐性遺伝子カセットを含むように構築した。さらに、カナマイシン耐性カセット、FRT部位及びMCS座を、組換え挿入のためにTy21a染色体に対する相同領域を含むプライマーを使用して、このプラスミドからPCRによって合成した。Ty21a tviD及びvexA遺伝子領域は相同性のために使用した。これらは、Ty21aで非機能的なViカプセル生合成オペロンにおいて、互いに近接して位置する。
[0169]S.sonneiのO抗原オペロンの必須遺伝子(非必須のIS630エレメントを除去する)を、2ステップでプラスミドpMD35−36にクローニングした。
[0170]Datsenko及びWanner(2000)(Datsenkoら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97:6640〜6645)は、突然変異の標的される遺伝子に相同である36から50bpの延長部分を含むプライマーを使用するPCRによって生成される選択可能な抗生物質耐性遺伝子を用いる、染色体配列の組換え性の置き換えを介して、標的遺伝子内に突然変異を作り出すことを可能にする、高効率のλファージred組換えシステムに基づく方法を以前に記載した。λredタンパク質は、プラスミドpKD46から発現され、発現は、アラビノース誘導性プロモーターを通して厳重に調節される。このλredシステムは、E.coli、Salmonella及びShigella種における特異的な遺伝子不活性化のために(Kotloffら(1999)Bull.WHO、77:651〜666)、及び小さな生物学的なタグを導入するために(Kewon(2008)Curr.Opin.Infect.Dis.、21:313〜318)広く使用されている。
[0174]大きなインサートの染色体組み込みを促進するために、PCRプライマー上の染色体相同性延長部分をそれぞれ50から150塩基まで増加させた。相同性のこれらの増加領域は、高まった頻度で1.5kbのカナマイシン耐性カセットの染色体挿入を促進したが、大きな13.5kbのPCR産物は、幾つか試みた後で、染色体中に組み込むことができなかった。一般的な組換えは通常、50〜100bpの相同性で進行し、λRed媒介性組換えは通常、細菌の一般的な組換えよりも効率的であるので、この結果も予想外であった。
[0175]大きな500〜1000bpの相同性領域の使用は、染色体挿入プラスミドへのこれらの領域のクローニングを必要とした。最初に、Ty21aゲノムDNAを調製した。次に、vexA遺伝子(約1000bp)及びtviD遺伝子の一部(約500bp)をTy21aゲノムDNAからPCR増幅した。これらの2つのPCR増幅産物を、別々のステップでpMD35−36にクローニングした。さらにMCS座を、新しく且つ異なる制限酵素部位を含むようにさらに変えた。これにより、500〜1000bpの染色体相同性アームを含む新しい染色体挿入ベクター、pMD−TVが構築された。これらの長いアームは、Ty21a染色体との相同性領域を増大させ、それにより大きなDNA領域(すなわち5kbを越える)の組み込みの機会を増やすように操作された。
[0176]S.sonneiのO抗原生合成オペロンの必須遺伝子を、2ステップで、プラスミドpMD−TVにクローニングし、非必須のIS630エレメントを除去した。
[0177]S.sonneiの遺伝子を新しいpMD−TVプラスミドにクローニングした後、カナマイシン耐性カセット、S.sonneiのO抗原遺伝子及びTy21a相同性のアームを含む15.5kbのPCR産物を、λredタンパク質を発現するTy21aに形質転換した。予想外に、徹底的なプレーティング及び反復実験の後でさえ、形質転換体が得られなかった。大きな直鎖DNA断片の形質転換効率が低すぎたのかどうかという疑問に対処するために、新たなTy21aコンピテントセルを、最終的な洗浄の数を2回から3回に増やし、各形質転換反応の細胞数を増やし、さらに反応あたりの添加する直鎖DNA量を約1〜2μgに増やすことによって、さらに最適化した。これらの変更によって、異種のS.sonneiのO抗原をコードする大きな13.5kbの断片のTy21aへの順調な染色体組み込みが可能になった(Datsenkoら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97:6640〜6645;Uzzauら(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、98:15264〜15269;Xuら(2002)Infect.Immun.、70:4414〜4423)。
銀染色及び免疫ブロットによって測定したO抗原の発現。銀染色及びウェスタン免疫ブロットによるLPS解析を用いて、親株及び異種のO抗原を発現する組換え株におけるLPSの発現を調べた。
[0178]スライド凝集反応を、S.sonnei(フェーズI)又はSalmonella TyphiのO−特異的9因子(DIFCO(登録商標))に対するウサギポリクローナル抗血清を用いて行った。免疫ブロットについては、様々な組換えプラスミドの有無を問わないSalmonella、Shigella及びE.coli株を、適切な抗生物質を含む培地中でエアレーションして37℃で一晩増殖させた。LPS抽出キット(Bocca Scientific)を使用して、製造者の指示書に従って、LPSを精製した。精製したLPSをトリス−グリシンPAGEによって分離した。上記の抗体を用いて標準的なウェスタンブロッティング法を行って、特異的なLPSタイプを同定した。SILVERXPRESS(登録商標)銀染色キット(Invitrogen)を使用して、製造者の指示書に従って、銀染色解析を行った。SDS−PAGEによって分離した単離多糖の銀染色によって明らかにされたように(図2、パネルA)、ラフ型突然変異体であるE.coli DH5α(レーン1)は、S.sonneiのO抗原を、LPSラダー及びゆっくりと移行するグループ4カプセル(レーン2)の両方として発現することが観察された。Ty21a(レーン3)は、典型的な9、12LPSショートラダーパターンを生成し、これは、伸長した1型LPSラダーパターン及びゆっくりと移動する1型O抗原カプセル発現の付加(レーン4、5、6、7)の両方によって変化させられることが分かった。野生型のS.sonneiは、銀染色解析によって、1型LPSラダーパターンを発現し、大部分は最高約20のO−リピートの鎖長に達することが観察された(図2、パネルA、レーン8)。
Ty21aにおける異種の1型O抗原の発現の安定性
[0180]S.sonneiのO抗原を発現するTy21a−Ss組換えクローンの安定性を、一晩の培養物(約24時間)であって、それを1:100に希釈したものからプレーティングし、さらに約24時間増殖させたコロニーの免疫ブロットによって試験した。コロニーをニトロセルロース膜に移して、上で明記されたLPS特異的抗体を使用して、標準的なウェスタンブロッティングによって解析した。
マウスにおいて、Ty21a−Ssによる免疫化に続いて、S.Typhi及びS.sonneiのLPSの両方に対する抗体が誘発される。
Ty21a−Ssによって与えられる、毒性S.sonneiの攻撃感染からの防御
[0183]Salmonella Typhiワクチン株による免疫刺激を実証するため、及び毒性Shigellaによる非経口的攻撃感染に対する特異的な防御を評価するために、マウスが一般的に使用される。2週間の間隔をおいてワクチンを3回投与するIP経路によって、Ty21a−Ss、Ty21a単独又は生理食塩水でBalb/Cマウスを免疫化した。マウスあたり約2〜4×107CFUのワクチン、対照Ty21a細胞のいずれかを含む0.25ml用量、又は0.25mlの滅菌生理食塩水を用いて、2週間の間隔をおいて合計で3回の投与にわたって、マウスを腹腔内に接種した。マウスは、各注射の1週間後に尾から採血した。最後の投与から2週間後に、約100×LD50の用量のS.sonnei53Gを用いて、マウスをi.p.により攻撃感染した。最終的な免疫化から2週間後に、免疫化されたマウス及び対照マウスを、滅菌生理食塩水に溶解した0.25ml(マウスあたり2×106CFU)の5%ブタ胃ムチン(Sigma)に入れた、5×106CFU/mlの新しく増殖させた中期対数期のS.sonnei株53GI(すなわち、50%致死感染用量[LD50]の約100倍)を用いて、腹腔内に攻撃感染した。生存を72時間モニターした。
[0184]S.Sonnei53Gフェーズ1を、TBS中でエアレーションして37℃で一晩増殖させ、一方、S.typhi Ty21a−Ssを、0.01%ガラクトース及び0.01%グルコースを補充したTSB中で増殖させた。LPSを、LPS抽出キット(Bocca Scientific)を使用し、製造業者の指示書に従って精製した。マイクロタイタープレートを、0.1M Na2CO3/NaHCO3、pH9.5に入れた、S.sonnei(フェーズI)又はSalmonella Typhi Ty21aの精製したLPSでコーティングした。コーティングしたマイクロタイタープレートを、TBST(0.5%tween−20を含むTBS)中に1%BSA(Sigma)を含むブロッキングバッファーで2時間ブロッキングした。血清の段階希釈物を各プレートに加え、4℃で一晩インキュベートした。TBSTで6回洗浄した後に、結合抗体を、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(SOUTHERNBIOTECH(登録商標))で検出した。エンドポイント力価は、バックグラウンドを引いた後の各試料に関する正のODを有する、カラムの最後のウェル中の抗体希釈度の逆数と定義した。バックグラウンド値は免疫前血清を用いて決定し、ここでは、免疫前血清のOD値を平均し、次いで2倍にした。この値を、すべてのマウス血清試料の用量設定(titrations)を含むすべてのウェルのODから引いた。各データ点は、すべてのマウス血清試料に対して行った2つの独立のELISAの平均エンドポイント力価を表す。個々の試料の力価及び10匹のマウスの各群に対する平均±SEMを図3に示す。
第2のLPS座の(Shigella dysenteriaeのO抗原生合成遺伝子の)クローニング及び染色体挿入
S.dysenteriaeのO抗原遺伝子のpMD−TVへのクローニング
[0190]S.dysenteriaeセロタイプ1株1617のゲノムDNAからS.dysenteriaeのO抗原遺伝子をPCR増幅した(Xuら(2007)Vaccine 25:6167〜6175)。プライマーprMD127.dy.F.HindIII gatcgaagcttggcattttttgtcatttttggatgc(配列番号27)及びprMD128.dy.R.wbbP.BamHI gatcgggatccatcgatatggctgggtaaggtcatg(配列番号28)を最初に使用して、wbbP遺伝子を増幅した。得られたPCR産物及びpMD−TVを、HindIII及びBamHIで消化し、PCR精製し、ライゲーションした。次に、プライマーprMD129.F.BamHI gatcgggatcctaatgaaaatctga ccgaatgtaacgg(配列番号29)及びprMD130.R.EcoRI gatcggaattctcacattaatgctaccaaaaagagtcgc(配列番号30)を使用して、S.dysenteriae1の大きなrfb遺伝子クラスターを増幅した。得られたPCR産物及びプラスミドpMD−TV−wbbPをBamHI及びEcoRIで消化し、PCR精製し、ライゲーションして、pMD−TV−Sd−4を構築した。
[0191]pMD−TV−Sd−4を構築するためにプラスミドpMD−TVにクローニングしたS.dysenteriaのO抗原生合成遺伝子を、tviDフォワードプライマー及びvexAリバースプライマーを用いるPCRの鋳型として使用した。PCR増幅した領域は13,574bpであり、tviD遺伝子の一部、FRT部位に隣接するKanr遺伝子カセット、S.dystenteriaeのO抗原生合成遺伝子及びvexA遺伝子を含む。記載されたように(Dharmasenaら)、PCR増幅産物を、pKD46からλredタンパク質を発現するTy21aコンピテントセルに形質転換し、Kan耐性について選択した。組み込み部位の上流及び下流のプライマー、prMD92及びprMD124を用いるPCRによって、約14.5KbのKanrインサートのバンドを得た。以前に記載されたように(Dharmasenaら)Kanrカセットを除去した後、抗生物質感受性の染色体組み込み体を、Kanrカセットの欠失についてPCRによってさらに解析し、プライマーprMD92及びprMD124から得られたPCR産物(MD149/Ty21a−Sd、約13Kbのバンド)を配列決定した。以前に配列決定したS.dystenteriaeのwpp遺伝子(GENBANK(登録商標)受託番号AY763519;配列番号4)とS.dystenteriae株1617株のものは、2塩基を除いては同一であり、株1617のwpp遺伝子の位置619〜620でCAがACに変化する。Ty21a−Sd株において染色体に挿入されたwpp中に突然変異は検出されなかった。Ty21a−Sdの染色体インサートRfb配列をS.dystenteriae1617株のRfbO抗原遺伝子クラスターに関するGENBANK(登録商標)受託番号AY585348(配列番号3)と比較した場合、単一のAからGのトランジション(N130D)のみが遺伝子rmlD中に検出され(図4)、これはスライド凝集反応及びELISA発現研究によってによって確認したときに、O抗原の発現に影響を及ぼさなかった。
[0192]低コピープラスミドpMD−TVは、細胞あたり約5コピーとして存在するpSC101誘導体である。したがって、Ty21a中のプラスミドpMD−TV−Sd−4は細胞あたり約5コピーのS.dystenteriaeのO抗原遺伝子を有するが、Ty21a−Sd(MD149)[すなわち、Ty21a染色体中に組み込まれたS.dystenteriaeのO抗原遺伝子を有する株]は細胞あたり1コピーのS.dystenteriaeのO抗原生合成遺伝子しか有さない。以前の研究(Dharmasenaら)から、S.sonneiのLPS:S.Typhi Ty21aのLPSの比は、ELISAによって評価した場合、Ty21a中のpGB−2プラスミド(pMD−TV−Ss)から発現する同じ遺伝子と比較して、Ty21a染色体(Ty21a−Ss)からS.sonneiのO抗原遺伝子を発現する株において約1であったことに注目されたい。しかし、S.dystenteriaeのLPS:S.Typhi Ty21aのLPSの比は、ELISAによって測定した場合、プラスミド(Ty21a中のpMD−TV−Sd−4)からと比べて、染色体(Ty21a−Sd、MD149)からS.dystenteriaeのO抗原遺伝子を発現する株において1よりかなり低かった。したがって、天然のwppプロモーターを高度に転写される恒常的に活性なプロモーターであるEscherichia coliのlppプロモーターと置き換えることによって、S.dystenteriaeのLPSの発現を増大させることを試みた。
[0194]新しく組換え操作したワクチン株Ty21a−Sd(MD149)、配列番号32、及びTy21−Sdl(MD174)、配列番号33は、抗生物質感受性であり、染色体に組み込まれたSd1のO抗原生合成遺伝子を含み、これらを、0.01%ガラクトース及び0.01%グルコースを加えた抗生物質を含まないトリプチックソイブロス(TSB)で約24時間高希釈で増殖させた。これは、約25世代の増殖に相当する。得られた細胞を0.01%ガラクトース及び0.01%グルコースを含むTSA上にプレーティングして37℃で一晩増殖させ、S.dysenteriae1に対するウサギポリクローナル抗血清(Difco)を用いて、コロニー免疫ブロットを行って、S.dysenteriaeのO抗原の発現を調べた。試験した200コロニーのすべては、S.dysenteriaeセロタイプ1のO抗原の発現を保持しており、これは染色体に組み込まれた遺伝子の100%の安定性を示すものである。
[0195]2つのワクチン候補株(Ty21a−sd及びTy21a−sdl)又は陰性対照のTy21a単独及びPBSを用いて、8週齢のメスのAJマウス(各群に10匹)を免疫化した。Ty21a−sd、Ty21a−sdl及びTy21a対照を、0.01%ガラクトース及び0.01%グルコースを補充したTSB中で一晩増殖させ、洗浄し、滅菌PBSに懸濁して1mlあたり約4〜8×107CFUの濃度にした。マウスあたり約2〜4×107CFUのワクチン、対照Ty21a細胞のいずれかを含む0.5ml用量、又は0.5mlの滅菌生理食塩水を用いて、2週間の間隔をおいて合計で3回の投与にわたって、マウスを、腹腔内に接種した。マウスは、最後の注射から1週間後に尾から採血した。両方のワクチン株(Ty21a−sd及びTy21a−sdl)による免疫化は、S.sonneiにおける400,000と比較して、S.dysenteriaeに対して約15,000という適度の抗体価をもたらした。さらに、親株のTy21aは、低レベル(約500)でS.dysenteriaeのLPSと交差反応する血清IgG抗体を誘発した(図7)。Ty21a−sdはS.TyphiのLPSに対して高い抗体価(約100,000)を誘発したが、これは親株のTy21aによって誘発されたものと本質的に同じ力価であり、Ty21a−sdlによって誘発されたS.TyphiのLPS抗体価は約4倍少なかった。これはおそらく、Ty21a−sdと比較して、Ty21a−sdlにおけるS.dysenteriaeのLPSの発現が高いことが原因である。しかし、これらの結果は、Ty21a−sd及びTy21a−sdlにおける異種のS.dysenteriaeのO抗原と同種のTy21aのLPSの両方の安定発現を確証するものである。
[0196]最終的な免疫化から2週間後に、免疫化されたマウス及び対照マウスを、滅菌生理食塩水に溶解した0.5ml(マウスあたり7.5×105CFU)の5%ブタ胃ムチン(Sigma)に入れた、1.5×106CFU/mlの新しく増殖させた中期対数期の毒性S.dysenteriae1株1617ΔstxA(すなわち、50%致死感染用量[LD50]の約10倍)を用いて、腹腔内に攻撃感染した。生存を72時間モニターした(図8)。この攻撃感染は、生理食塩水で免疫化したマウスにおいて100%の死亡率をもたらしたが、Ty21a単独で免疫化したマウスにおいては50%死亡率しかもたらさなかった。これは、ELISAによって測定されたように、いくらかの防御を与える、Ty21aによって誘発される低レベルのS.dysenteriaeのLPS交差反応抗体が原因である可能性がある。また、Ty21によって与えられる低レベルの防御は以前に観察された(Noriegaら、1999、Infection and Immunity 67:782〜788)。組換え操作したワクチン株Ty21a−Sd及びTy21a−Sdlで免疫化されたマウスは、それぞれ、S.dysenteriaeの攻撃感染から100%及び70%防御された。
Shigella flexneri2a及び3aのO抗原遺伝子の染色体組み込み
[0197]O抗原の抗原決定基に基づくと、14のS.flexneriセロタイプが存在する。セロタイプ6を除くすべてのS.flexneriセロタイプでは、すべてが、四糖N−アセチルグルコサミン−ラムノース−ラムノース−ラムノースの反復単位を含む共通の多糖骨格を有する(図9)。基本的なO抗原骨格は、セロタイプYと呼ばれる。O抗原骨格の生合成に関与する遺伝子は、gnd及びgalF遺伝子に隣接するrfbオペロン(約10kb)中に位置する。四糖中の異なる糖にグルコシル及び/又はO−アセチル基を付加することによるO抗原骨格の修飾は、異なるセロタイプを生じさせる。O抗原の修飾に関与する遺伝子は、テンペレートバクテリオファージでコードされている(Allisonら、2000、Trends in Microbiol 8:17〜23)。溶原性バクテリオファージSfIIでコードされた2つの遺伝子は、2aセロタイプ転換に必須であることが見出された。これらの遺伝子は、推定上のバクトプレノールグルコシルトランスフェラーゼをコードするbgt及び推定上のタイプII抗原決定グルコシルトランスフェラーゼをコードするgtrIIである(Mavrisら、1997、Mol Microbiol 26:939〜950)。
[0199]約10kbのrfbオペロンのクローニングは難易度が高かったので、KpnI及びXhoIを使用して、rfbオペロンの約6kbを低コピープラスミドpMD−TVにクローニングし(Dharmasenaら、2013、Intl J Med Microbiol 303:105〜113)、続いてXhoI及びBamHIを使用して、rfbオペロンの残りの4kBをクローニングした。S.flexneriの4kb及び6kbのO抗原遺伝子を、それぞれ、prMD3−2a.rfb.F−prMD16.R及びprMD18.rfb.5021.FprMD4−2a.rfb.Rプライマー対(以下の表F)を使用してS.flexneri2a2457のゲノムDNAからPCR増幅した。
[0203]それぞれE.coli及びTy21aにおける、pMD−TV−2a及びpMD−TV−3aからのS.flexneri2a及び3aのO抗原の発現を、スライド凝集反応及びウェスタンブロッティングによって確認した。E.coli又はTy21a中のpMD−TV−2aは、S.flexneriタイプII特異的抗血清と反応し(図10)、さらにS.flexneri3、4エピトープ特異的抗血清と凝集した。したがって、pMD−TV−2aは、安定なS.flexneri2aのO抗原の発現に必要とされる遺伝子のすべてを含む(Dharmasenaら、2012、Am Soc Microbiol mtg、San Francisco、CA)。
[0205]pMD−TV(pMD−TV−Y)にクローニングしたS.flexneriのO抗原Yセロタイプ骨格遺伝子を、tviDフォワード(prMD133.tviD.F)プライマー及びvexAリバース(prMD87.vexA.R.32bp)プライマーを用いるPCRの鋳型として使用した。tviD遺伝子の一部、FTR部位に隣接するKanカセット、S.flexneriのrfb遺伝子及びvexA遺伝子を含むPCR増幅した領域は、13,653bpであった。このPCR産物を、(Dharmasenaら、2013)に記載されているように、pKD46由来のλredタンパク質を発現するTy21aコンピテントセルに形質転換し、Kan耐性について選択した。組み込み部位の上流及び下流のプライマーprMD92及びprMD124を用いたPCRによって、約14.5Kbのバンドが生じた。(Dharmasenaら、2013)に記載されているようにKanrカセットを除去した後、抗生物質感受性の染色体組み込み体を、PCRによってKanカセットの欠失についてさらに解析し、プライマーprMD92及びprMD124から得られたPCR産物(株MD114/Ty21a−Y、約13Kbのバンド)を配列決定した。このPCRの配列を、S.flexneri2a2457(GenBank受託番号AE014073.1、完全なゲノム4,599,354bp、参考文献:Weiら、2003、Infect Immun 71(5):2775〜2786)と比較し、遺伝子rfbCの上流の遺伝子間領域において単一のAの挿入のみが検出され(図11)、これは、抗S.flexneri1〜6抗体を用いてウェスタンブロットにより確認すると、O抗原の発現に影響を及ぼさなかった。
[0208]天然のbgtプロモーターを、高度に転写される恒常的に活性なプロモーターであるlppプロモーターと置き換えることによって、S.flexneri2aのLPSの発現を増大させることを試みた。Ty21a−sdl(S.dystenteriaeのO抗原生合成遺伝子がlppプロモーターから発現する)を、tviDフォワードプライマー及び150bpのbgt相同性延長部分を有するlppプロモーターリバースプライマー(表F)を用いるPCRの鋳型として使用した。PCR増幅した領域は、tviD遺伝子の一部、FTR部位に隣接するKanカセット、200bpのlppプロモーター及びbgt遺伝子の最初の150bpを含む。PCR産物をλredタンパク質を発現するTy21a−2a(MD194)コンピテントセルに形質転換し、上記のようにKan耐性について選択し、Kanカセットを除去し、配列決定し、Ty21a−2al(MD212)を構築した。S.flexneriタイプII特異的抗血清を用いたウェスタンブロットは、Ty21a−2al(MD212)はTy21a−2a(MD194)のものよりも高いS.flexneri2aのLPSを発現することを示すが、プラスミドによる発現(Ty21a pMD−TV−2a)よりまだ少ない(図13)。
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Claims (36)
- Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella sonneiのO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に又はなしで異種のShigella sonneiの1型O抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella sonneiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Salmonella typhi Ty21a。 - Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella sonneiのO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に異種のShigella sonneiの1型O抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella sonneiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Salmonella typhi Ty21a。 - 該領域が、
a)配列番号2に示されたDNA配列、
b)配列番号2に示されたDNA配列と少なくとも約90%の配列同一性を有するDNA配列、及び
c)配列番号2に示されたDNA配列の機能的変異体であるDNA配列
からなる群から選択されるDNA配列でコードされる、請求項1に記載のTy21a。 - Shigella種(Shigella dysenteriae、Shigella flexneri及びShigella boydii)、Escherichia coliセロタイプ、Salmonella enterica血清型、Vibrio choleraeセロタイプ、Enterobacter種、Yersinia種及びPseudomonas種からなる群から選択される細菌株由来のO抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項1に記載のTy21a。
- Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella dysenteriae1のO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に又はなしで異種のShigella dysenteriaeセロタイプ1のO抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella dysenteriaeの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella Typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Salmonella typhi Ty21a。 - Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella dysenteriae1のO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に異種のShigella dysenteriaeセロタイプ1のO抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella dysenteriaeの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella Typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Salmonella typhi Ty21a。 - 該領域が、
a)配列番号33に示されたDNA配列、
b)配列番号33に示されたDNA配列と少なくとも約90%の配列同一性を有するDNA配列、及び
c)配列番号33に示されたDNA配列の機能的変異体であるDNA配列
からなる群から選択されるDNA配列でコードされる、請求項5に記載のTy21a。 - Shigella種(Shigella sonnei、Shigella flexneri及びShigella boydii)、Escherichia coliセロタイプ、Salmonella enterica血清型、Vibrio choleraeセロタイプ、Enterobacter種、Yersinia種及びPseudomonas種からなる群から選択される細菌株由来のO抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項5に記載のTy21a。
- i)配列番号1に示されたDNA配列、又はii)配列番号1に示されたDNA配列と少なくとも約90%の配列同一性を有するDNA配列を有する、プラスミド構築物。
- Shigella sonneiのO抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項9に記載のプラスミド構築物。
- Shigella dysenteriae1のO抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項9に記載のプラスミド構築物。
- 大きな抗原性遺伝子領域を細菌の染色体中に組換え操作する方法であって、
i)以下:
ia)5’及び3’がそれぞれFRT部位に隣接する遺伝的選択マーカー、
ib)3’FRT部位の下流のマルチクローニング部位、及び
ic)2つのうちの1つが5’FRT部位の上流に位置し、2つのうちの1つがマルチクローニング部位の下流に位置する、2つの染色体相同性部位
を含むベクターに該領域をクローニングするステップ、
ii)λred組換えを使用して、該領域を細菌の染色体に組み込むステップ、
iii)遺伝的選択マーカーについて選択するステップ、並びに
iv)選択マーカーを除去するステップ
を含み、
このようにして該領域を染色体中に組換え操作する、前記方法。 - 抗原性遺伝子領域が約5から約20kbの長さである、請求項12に記載の方法。
- ベクターが、プラスミド、ファージ、ファスミド及びコスミド構築物からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- プラスミド構築物が請求項9に記載の構築物である、請求項14に記載の方法。
- 細菌の染色体がSalmonella typhi Ty21aである、請求項12に記載の方法。
- 遺伝的選択マーカーが抗生物質耐性マーカーである、請求項12に記載の方法。
- 抗生物質耐性マーカーがカナマイシンである、請求項17に記載の方法。
- 抗原性領域がShigella sonneiのO抗原生合成遺伝子領域である、請求項12に記載の方法。
- 抗原性領域がShigella dysenteriae1のO抗原生合成遺伝子領域である、請求項12に記載の方法。
- 抗原性領域がShigella flexneri2aのO抗原生合成遺伝子領域である、請求項12に記載の方法。
- 抗原性領域がShigella flexneri3aのO抗原生合成遺伝子領域である、請求項12に記載の方法。
- 該領域が、ステップiiの前に、約500から約1000bpの細菌の染色体相同性領域同士の間に操作して入れられる、請求項12に記載の方法。
- カナマイシン耐性遺伝子がpCP20での形質転換の後に誘導される組換えを介して除去される、請求項18に記載の方法。
- Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella flexneri2aのO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に又はなしで異種のShigella flexneri2aのO抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella flexneri2aの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Salmonella typhi Ty21a。 - Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella flexneri2aのO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に異種のShigella flexneri2aのO抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella flexneri2aの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Salmonella typhi Ty21a。 - Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella flexneri3aのO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に又はなしで異種のShigella flexneri3aのO抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella flexneri3aの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
Salmonella typhi Ty21a。 - Salmonella typhi Ty21a染色体に挿入されたShigella flexneri3aのO抗原生合成遺伝子領域を含むSalmonella typhi Ty21aであって、
a)同種のSalmonella typhiのO抗原と共に異種のShigella flexneri3aのO抗原が安定して発現され、
b)毒性Shigella flexneri3aの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
c)毒性Salmonella typhiの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
Salmonella typhi Ty21a。 - 請求項1〜8及び25〜28のいずれか一項に記載のSalmonella typhi Ty21aを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含む、組成物。
- 請求項1〜8及び25〜28のいずれか一項に記載のSalmonella typhi Ty21aを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含むワクチン。
- 少なくとも1つの細菌性感染を予防又は治療する方法であって、予防的又は治療的有効量の請求項1〜8及び25〜28のいずれか一項に記載のSalmonella typhi Ty21aを対象に投与して、少なくとも1つの細菌性感染を予防又は治療するステップを含む、前記方法。
- 遺伝子領域が部分的に又は完全に化学合成される、請求項1〜8及び25〜28のいずれか一項に記載のSalmonella typhi Ty21a。
- DNA配列が部分的に又は完全に化学合成される、請求項9に記載のプラスミド構築物。
- タンパク質−LPSコンジュゲート生成物を化学的に製造するために設計されている細菌株での、O抗原生合成遺伝子領域の使用。
- 全細胞細菌ワクチンにおいて使用するための、請求項12〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化された生きたSalmonella株、Shigella株、Listeria株、Yersinia株、Escherichia coli株、Enterobacteriaceae株、原生動物株、又は別のベクター化生ワクチンにおいて使用するための、請求項12〜24のいずれか一項に記載の方法。
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