JP2015532294A - インフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための方法および薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、それを必要とする被験者におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのインターロイキン２２（ＩＬ−２２）ポリペプチドに関する。

Description

発明の分野：
本発明は、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための方法および薬学的組成物に関する。

発明の背景：
インフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）感染は、呼吸器疾病の最も重要な原因の１つであり、かつ広範な罹患率および死亡率に関与している。感染後の最初の数日間の間、宿主は、獲得免疫応答が発達するまでの間、ＩＡＶの複製を封じ込めることを可能とする複雑かつ効果的な自然免疫応答を発達させる。しかしながら、その後の時点で、細菌重複感染への易罹患性が高まることにより、ＩＡＶの流行および大流行の間に死亡し得る。例えば、細菌性肺炎が、１９１８年の大流行（スペイン風邪）において死亡の大半を占めた（世界中で約５０００万人が死亡）。ＩＡＶ後の細菌重複感染を引き起こす主な細菌種には、肺炎連鎖球菌（肺炎球菌）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）および黄色ブドウ球菌がある。従って、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置が必要とされる。

個々の種類の細菌には特定の特徴の証拠が存在するが、続発的な細菌感染への易罹患性の増強に至る機序は幅広く、かつ、力学的および免疫学的防御の変化を含むようである。実際に、細菌の接着および侵入に対する物理的バリアの変化（粘膜の変化を含む）並びに細菌が新たに付着するための部位の解説が、記載されている。平行して、宿主自然応答（獲得応答ではなくむしろ）の障害が、インフルエンザによる攻撃後の細菌に関連した肺炎の基本的な特徴である。

ＩＬ−１０サイトカインファミリーの一員であるインターロイキン−２２は、自己免疫疾病および炎症疾病において二重の役割を果たす。（総説については（１、２））。それはヘルパーＴリンパ球および細胞障害性リンパ球（Ｔｈ１７／Ｔｃ１７、ヒトにおいてはＴｈ２２／Ｔｃ２２）によって、および自然免疫系の細胞によって産生される。後者の群の中で、レチノイン酸レセプター関連オーファン受容体−γｔ（ＲＯＲγｔ）陽性γδＴリンパ球および自然リンパ球（ＩＬＣ）の特定のサブセットが、ＩＬ−２２の初期発生源を代表する（１、３〜１０）。より近年には、ＩＬ−２２は、脂質反応性の「自然様」Ｔ細胞集団の部分集合である、ＲＯＲγｔ陽性インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）リンパ球によって産生されることが示された。

ＩＬ−２２は、肝細胞および上皮細胞を含む非造血細胞に単独で作用して、脈絡および発現される組織に依存して、炎症誘発特性および組織防御特性の両方を発揮する（１、１４〜１７）。実験的な非感染系においては、ＩＬ−２２は、肝細胞および特に腸のバリア表面における上皮細胞に対して強力な防御作用を発揮する（１８〜２１）。肺においては、ＩＬ−２２は、枯草菌（Bacillus subtilis）への慢性的な曝露によって誘発される実験的肺線維症から（２２）および人工呼吸器誘発肺損傷から（２３）防御する。ＩＬ−２２はまた、喘息の際にＴｈ２により媒介される気道炎症および組織傷害を制限するようである（２４〜２６）。他方で、ＩＬ−２２は、一部には炎症因子と協奏して組織炎症を増強することによって、皮膚炎症および表皮肥厚、ブレオマイシンにより誘発される気道の炎症、コラーゲンにより誘発される関節炎、およびＬＰＳショックを支援する（２７〜３０）。

感染の間、自然免疫細胞または慣用的なエフェクターＴ細胞によるＩＬ−２２産生は、病原体および組織に依存して二重の役割を果たす。自然免疫細胞によるＩＬ−２２の初期の産生は、肺における肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）および腸におけるシトロバクター・ローデンチウム（Citrobacter rodentium）を含む、細胞外細菌に対する宿主防御免疫にとって重要である（３１、３２）。この状況において、ＩＬ−２２の防御作用は、一部には、上皮細胞からの抗微生物ペプチドの発現に対するその効果に起因する。ＩＬ−２２はまた、肺における黄色ブドウ球菌の排除において役割を果たす（３３）。他方で、ＩＬ−２２は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、カンジタ・アルビカンズ（Candida albicans）またはマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）に対する宿主防御において実質的な役割を全く果たさない（３４〜３６）。ＩＬ−２２は、獲得免疫系が損なわれている場合には防御的自然免疫を与える。この冗長機能は、カンジタ・アルビカンズ（Candida albicans）、シトロバクター・ローデンチウム（C. rodentium）およびエイメリア・ファルシフォーミス（Eimeria falciformis）の感染においても記載されている（３７〜３９）。最後に、腸炎症に対するＩＬ−２２の有害な役割が、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）の経口感染後に報告された（３６、４０）。

ヒト系におけるウイルス感染中のＩＬ−２２の可能性ある役割について、近年、取り組まれた。重要なことには、ＩＬ−２２（おそらく、ＣＤ４^＋Ｔリンパ球に由来）は、ウイルスに何回も曝されているにも関わらず抗体陽転しない被験者におけるヒト免疫不全ウイルス感染に対する抵抗性に関与している可能性がある（４１〜４３）。他方で、肝におけるＩＬ−２２の発現はウイルス肝炎においてアップレギュレーションされているが、近年の証拠は、ＩＬ−２２が、Ｂ型およびＣ型肝炎に対する直接的な抗ウイルス活性を欠失していることを示した（４４、４５）。これは、ＩＬ−２２（４７、４８）と構造的類似性を共有するインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（４６）とは対照的である。マウス系においては、抗ウイルス宿主防御またはウイルス関連炎症におけるＩＬ−２２の可能性ある役割を調査するために非常に僅かな研究しか充てられておらず、大半の研究はインフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）に焦点が当てられている。Levillayerおよび同僚は初めて、ＩＬ−２２がタイラーウイルスにより誘発された急性脳脊髄炎中における死亡率の抑制のための候補遺伝子であると報告した（４９）。実験的ＩＡＶ感染中におけるＩＬ−２２の可能性ある役割が、中和性抗ＩＬ−２２抗体を使用して調べられた。Guo et al.（５０）は、ＩＬ−２２が、ＩＡＶに関連した罹患率および死亡率によって評価されるように、急性Ｈ１Ｎ１ ＩＡＶ感染中に全くまたは殆ど役割を果たしていないことを示した。平行して、Monticelliおよび同僚は、近年、軽度のＨ１Ｎ１ ＡＩＶ感染中に、ＩＬ−２２は、過増殖上皮応答によって評価されたように、罹患率、低下した肺機能、および呼吸器組織リモデリングに対して全く影響を及ぼさなかったことを報告した（５１）。ＩＬ−２２は、近年、Ｈ１Ｎ１ ＡＩＶ感染の後期（寛解期）における気道上皮再生に関与すると報告された（８３）。

発明の要約：
本発明は、それを必要とする被験者におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのインターロイキン２２（ＩＬ−２２）ポリペプチドに関する。

発明の詳細な説明：
背景および組織に応じて、インターロイキン（ＩＬ）−２２は、自己免疫疾病、炎症疾病および感染症の間に、冗長性の防御的機能または病的機能を有する。インフルエンザＡ型（ＡＩＶ）感染を含むウイルス感染中における宿主防御および病態におけるＩＬ−２２の細胞源および役割は現在殆ど知られていない。この問題に取り組むために、呼吸器Ｈ３Ｎ２インフルエンザ感染のマウスモデルを使用した。本発明者らは、ＩＬ−２２並びにＩＬ−２２産生に関連した因子が、ＩＡＶ感染の初期において肺組織に発現されることを示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＲＯＲγｔ陽性細胞が、ＩＡＶ感染の初期における主なＩＬ−２２産生体であり、ＲＯＲγｔ陽性細胞のいくつかの部分集合が、増強されたＩｌ２２転写物を発現することを示す。ＩＡＶ感染の軽度および重度のモデルを使用して、本発明者らは、内因性ＩＬ−２２が、ＩＡＶ複製の制御およびＩＡＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の発達に役割を全く果たさないことを示す。急性かつ致死的感染のモデルにおいて、ＩＬ−２２の欠失は、ＩＡＶ関連肺炎および動物死を加速または遅延させなかった。全く対照的に、軽度なＩＡＶ感染中に、Ｉｌ２２^−/−マウスは、増強された肺損傷およびより低い気道上皮完全性を示した。重要なことには、肺傷害における内因性ＩＬ−２２の防御作用は、インフルエンザ後の続発性の細菌感染を制限する上で役立つようであった。実際に、肺炎連鎖球菌による２回目の攻撃後、ＩＡＶを経験したＩｌ２２^−/−動物は、生存率および細菌増殖の点で野生型対照よりも易罹患性であった。要するに、ＩＬ−２２は、インフルエンザ感染中に冗長な（重度）および有益な（軽度）役割を果たし、この所見は、インフルエンザ後の細菌重複感染をより良好に制御するために治療レベルで活用され得る。

従って、本発明は、それを必要とする被験者におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのインターロイキン２２（ＩＬ−２２）ポリペプチドに関する。

被験者は、インフルエンザ感染に易罹患性のヒトまたは任意の他の動物（例えば鳥類および哺乳動物）であり得る（例えば、飼育動物、例えばネコおよびイヌ；家畜（livestock）および家畜（farm animal）、例えばウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）。典型的には、前記被験者は、非霊長類（例えばラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えばサル、チンパンジーおよびヒト）を含む哺乳動物である。特定の態様において、被験者は非ヒト動物である。いくつかの態様において、被験者は家畜またはペットである。別の態様において、被験者はヒトである。

本発明によると、被験者はインフルエンザに感染している。本明細書において使用される「インフルエンザ感染」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、インフルエンザウイルスによる感染によって引き起こされた疾病を指す。本発明のいくつかの態様において、インフルエンザ感染は、インフルエンザウイルスＡ型またはＢ型に関連する。本発明のいくつかの態様において、インフルエンザ感染は、インフルエンザウイルスＡ型に関連している。本発明のいくつかの特定の態様において、インフルエンザ感染は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１であるインフルエンザウイルスＡ型によって引き起こされる。

本明細書において使用される「予防」または「予防的使用」および「予防的処置」という用語は、その目的が疾病を予防することである任意の医学的または公衆衛生的手順を指す。本明細書において使用される「予防する」、「予防」および「予防すること」という用語は、所与の容態を獲得または発症するリスクの低減、あるいは病気ではないが、疾病を有する被験者の近くにいたかもしくは近くにいた可能性のある被験者における前記容態の再発の低減または阻止を指す。

本発明の予防法は、下気道感染（例えば肺炎）、中耳感染（例えば中耳炎）および細菌性副鼻腔炎などであるがそれらに限定されるわけではない、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防に特に適している。細菌重複感染は、数多くの細菌性病原体によって引き起こされ得る。例えば、それらは、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、マイコプラズマ種（Myoplasma species）、およびカタル球菌（Moraxella catarrhalis）からなる群より選択された少なくとも１つの生物によって媒介され得る。

本発明の予防法は、少なくとも５０歳である被験者、長期療養施設に滞在する被験者、肺または心血管系の慢性疾患を有する被験者、慢性代謝疾病（糖尿病を含む）、腎機能不全、ヘモグロビン異常症または免疫抑制（薬物療法によってまたはヒト免疫不全［ＨＩＶ］ウイルスによって引き起こされた免疫抑制を含む）のためにその前の年に定期的な医学的フォローアップまたは入院を必要とした被験者、１４歳未満の小児、長期アスピリン療法を受けている６カ月から１８歳までの患者、およびインフルエンザの季節に妊娠の第２または第３三半期にいるであろう女性を含む、インフルエンザ後の細菌重複感染を発症するリスクが高いと同定された被験者に特に適している。より具体的には、本発明の予防法は、１歳以上１４歳未満の被験者（すなわち小児）、５０歳から６５歳の被験者、および６５歳を超える成人における、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防に適していると考えられる。

いくつかの態様において、被験者はＩＬ−２２欠損症を有する（すなわち、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２レセプター産生の調節不全）。前記欠損症は、乾癬、クローン病およびアレルギー症からなる群より選択された疾病によって引き起こされ得る。

「ＩＬ−２２ポリペプチド」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然のＩＬ−２２およびその機能保存的変異体および改変形を含む。ＩＬ−２２は任意の入手源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）ＩＬ−２２、より特定するとヒトＩＬ−２２である。ＩＬ−２２は、１７９アミノ酸からなる。Dumoutier et al.は、初めて、マウスおよびヒトＩＬ−２２の遺伝子のクローニングを報告した（Dumoutier, et al., JI, 164:1814-1819, 2000；米国特許第６，３５９，１１７号および第６，２７４，７１０号）。

「機能保存的変異体」は、ポリペプチド中の所与のアミノ酸残基を、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を改変させることなく変化（アミノ酸を、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸で置換することを含むがそれらに限定されるわけではない）させた変異体である。タンパク質中で保存されたと指摘されたもの以外のアミノ酸は異なり得、よって、機能の類似した任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似率は変化し得、例えば、クラスター法（類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）などによるアラインメントスキームに従って決定したところ例えば７０％から９９％であり得る。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定したところ少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％を有し、比較される天然または親タンパク質と同じまたは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドを含む。

特定の態様において、本発明の治療法に使用されるＩＬ−２２ポリペプチドは、その治療効力を向上させるために修飾され得ると考えられる。治療化合物のこのような修飾は、毒性を低下させるか、循環時間を延長させるか、または体内分布を改変させ得る。例えば、重要である可能性のある治療化合物の毒性を、体内分布を改変させる様々な薬物担体ビヒクルとの組合せによって有意に低減させ得る。

薬物の実行可能性を改善させる戦略は、水溶性ポリマーの使用である。様々な水溶性ポリマーが、体内分布を改変させ、細胞への取り込み形態を改善させ、生理学的バリアを通した透過性を変化させ、かつ体内からのクリアランス速度を改変することが示された。標的化作用または持続放出作用のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、またはポリマー鎖の吊り下がった基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成された。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はその高い生体適合度および改変のし易さから薬物担体として幅広く使用されている。様々な薬物、タンパク質およびリポソームへ付着させることが、滞留時間を改善し、毒性を低減させることが示された。ＰＥＧを、鎖の末端におけるヒドロキシル基を通して、および他の化学的方法を介して活性物質に結合させることができるが、しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子あたり最大で２つの活性物質に制限されている。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧおよびアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子あたり多くの付着点を有するという利点が加わり（より大きな薬物がローディングされる）、様々な適用に適合するように合成的に設計され得る、新規生体材料として探究された。

当業者は、薬物の効果的な修飾のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧと三機能モノマー（例えばリジン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーは、VectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を通してリジンのａ−およびｅ−アミノ基に連結されている。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密に制御されかつ予め決定された間隔で反応性の吊り下がった基（リジンのカルボン酸基）を与えつつ、ＰＥＧの所望の特性を保持する。反応性の吊り下がった基は、他の分子を用いての誘導体化、架橋、またはコンジュゲーションに使用され得る。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、および薬物とポリマーの間の切断可能な結合を変化させることによって、安定で長時間循環するプロドラッグを産生するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体のスペーシング、およびコンジュゲートの分子量あたりの薬物の量に影響を及ぼす（より小さなＰＥＧセグメントはより大きな薬物がローディングされる）。一般的に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量を増加させると、コンジュゲートの循環半減期は増加する。それにも関わらず、コンジュゲートは、容易に分解可能でなければならないか、または糸球体ろ過限界閾値未満の分子量（例えば４５ｋＤａ未満）を有さなければならない。

循環半減期および体内分布の維持に重要であるポリマー骨格に加えて、リンカーを使用することにより、特異的なトリガー、典型的には標的組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまでプロドラッグ形で治療剤を維持し得る。例えば、このタイプの組織活性化薬物送達は、特定の体内分布の部位への送達が必要とされ、治療剤が病態の部位にまたは病態部位の近くに放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達に使用される連結基ライブラリーは当業者には公知であり、かつ酵素動態学、活性化酵素の遍在、および選択された疾病特異的酵素の開裂特異性に基づき得る（例えば、VectraMed, Plainsboro, N.J.によって確立された技術を参照）。このようなリンカーは、治療送達のために本明細書に記載されたＩＬ−２２由来タンパク質を改変するのに使用され得る。

別の特定の態様において、ＩＬ−２２ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合している。適切な免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。ＩｇＧおよびＩｇＡが好ましく、ＩｇＧが最も好ましく、例えばＩｇＧ１である。前記Ｆｃドメインは、完全Ｆｃドメインまたはその機能保存的変異体である。本発明のＩＬ−２２ポリペプチドは、リンカーによってＦｃドメインに連結され得る。リンカーは、約１から１００、好ましくは１から１０アミノ酸残基からなり得る。

本発明によると、ＩＬ−２２ポリペプチドは、慣用的な自動ペプチド合成法または組換え発現によって産生され得る。タンパク質を設計および製造する一般的な原則は当業者には周知である。

本発明のＩＬ−２２ポリペプチドは、溶液中でまたは固相支持体上で、慣用的な技術に従って合成され得る。様々な自動合成機が市販されており、StewartおよびYoung; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986およびBaranyおよびMerrifield, GrossおよびMeienhofer, 1979に記載のような公知のプロトコールに従って使用され得る。本発明のＩＬ−２２ポリペプチドはまた、Applied Biosystems Inc.製のモデル４３３Ａなどの例示的なペプチド合成機を使用して固相技術によって合成され得る。自動ペプチド合成を通してまたは組換え法を通して生成された任意の所与のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定され得る。各ペプチドの化学的確実性は、当業者には周知の任意の方法によって確立され得る。

自動ペプチド合成の代替として、組換えＤＮＡ技術が使用され得、選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションし、本明細書において以下に記載されているような発現に適した条件下で培養する。組換え法は、より長いポリペプチドを産生するのに特に好ましい。

ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含みかつ発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系が使用され得る。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌；酵母発現ベクター（Giga-Hama et al., 1999）を用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス、Ghosh et al., 2002参照）を用いて感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクションさせたまたは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド；例えば、Babe et al., 2000参照）を用いて形質転換させた植物細胞系；あるいは動物細胞系が含まれるがそれらに限定されるわけではない。当業者は、タンパク質の哺乳動物における発現を最適化するための様々な技術を知っている（例えば、Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000を参照されたい）。組換えタンパク質産生において有用な哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。細菌、酵母および他の脊椎動物におけるペプチド基質または融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的プロトコールは当業者に公知であり、本明細書において以下に簡潔に記載されている。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系もまた当業者には周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングする特定の能力のために、またはタンパク質の活性を与えるのに有用である特定の翻訳後修飾を生じる特定の能力のために選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後プロセシングもまた正しい挿入、フォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８などの種々の宿主細胞は、このような翻訳後活性のための特異的な細胞機械および特徴的な機序を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするように選択され得る。

本発明のＩＬ−２２由来タンパク質の組換え産生において、ＩＬ−２２由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを使用することが必要である。このようなベクターを調製する方法並びにこのようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞を産生する方法は、当業者には周知である。このような努力に使用されるポリヌクレオチド分子を、宿主において増殖させるために、選択マーカーおよび複製起点を一般的には含むベクターに接続し得る。発現構築物のこれらの配列は当業者には周知である。一般的に、発現ベクターは、適切な転写または翻訳調節配列に作動可能に連結された所与のタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するＤＮＡを含む。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳を制御する適切な配列が挙げられる。

「発現ベクター」、「発現構築物」または「発現カセット」という用語は、本明細書全体を通して互換的に使用され、核酸コード配列の一部または全部が転写され得る遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を含むことを意味する。

本発明のペプチドまたはポリペプチドの発現のための適切な発現ベクターの選択は、勿論、使用される具体的な宿主細胞に依存し、これは当業者の技能範囲内である。

発現は、宿主細胞における対象の核酸の発現を駆動するために使用され得るウイルス源および哺乳動物源の両方からのエンハンサー／プロモーターなどの適切なシグナルがベクターに提供されることを必要とする。通常、発現される核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機械または導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列を指す。ヌクレオチド配列は、調節配列が対象のタンパク質（すなわちＩＬ−２２、変異体など）をコードするＤＮＡに機能的に関連している場合に作動可能に連結されている。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を指令するならば、所与のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。

本発明の別の局面は、それを必要とする被験者におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのＩＬ−２２ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。

典型的には、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、これは、任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたは上記のようなウイルスベクターに含められ得る。よって、本発明のさらなる目的は、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのＩＬ−２２ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。

本発明は、患者に治療有効量のＩＬ−２２ポリペプチド（またはＩＬ−２２ポリペプチドをコードする核酸）を投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防法に関する。

「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でインフルエンザ後の細菌重複感染を予防するのに十分な量のＩＬ−２２ポリペプチド（またはＩＬ−２２ポリペプチドをコードする核酸）を意味する。

本発明の化合物および組成物の全１日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効投与量レベルは、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路および排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野において周知である同様な因子を含む、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投薬を始め、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは当技術の技能範囲内であることは周知である。しかしながら、製品の１日量は、成人１人あたり１日あたり、０．０１〜１，０００mgの幅広い範囲におよび変化し得る。好ましくは、前記組成物は、処置される患者への投与量の症候による調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgを含む。医薬品は、典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、１日あたり０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）の投与量レベルで供給される。

本発明のＩＬ−２２ポリペプチド（またはそれをコードする核酸）は、薬学的に許容される賦形剤および場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、薬学的組成物を形成し得る。

「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与される場合に、有害反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤化助剤を指す。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を単独でまたは別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、および経口用懸濁剤もしくは液剤、舌下および頬側投与剤形、エアゾール剤、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内および鼻腔内投与剤形および直腸投与剤形を含む。

好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）、または場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水の添加時に注射溶液の構成を可能とする、乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。

注射用途に適した剤形は、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および、無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、それは細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防御されていなければならない。

遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物中でおよび油中で調製されてもよい。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。

ＩＬ−２２ポリペプチド（またはそれをコードする核酸）は、天然形または塩形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられ、これは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から導かれ得る。

担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長吸収は、組成物に、吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらされ得る。

無菌注射溶液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体および上記に列挙された中の必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

製剤時に、溶液は、投与製剤に適合性の様式で、治療有効量で投与される。製剤は、様々な剤形で、例えば、上記したようなタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用され得る。

水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体はまず十分な食塩水またはグルコースを用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知である。例えば、１用量を、１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００mlの皮下点滴液に加え得るかまたは提案された注入部位に注射するかのいずれかを行ない得る。投与量のいくぶんの変動は、処置される被験者の容態に依存して、必然的に生じるだろう。投与責任者が、任意の事象において、個々の被験者に対する適切な投与量を決定するだろう。

薬学的組成物はまた、気道に投与され得る。気道は、上気道（中咽頭および咽頭を含む）、続いて下気道（これはその後、気管支および細気管支へと分岐される気管を含む）を含む。肺送達用組成物は、患者による分散液の吸入によって送達され得、よって、分散液中の活性成分は肺に到達し得、そこでそれは例えば、肺胞領域を通して直接血液循環中へと容易に吸収され得る。肺送達は、噴霧製剤、エアゾール化製剤、ミセル製剤および乾燥粉末に基づいた製剤の使用を含む種々のアプローチによって行なわれ得；吸入による投与は、経口および／または鼻腔であり得る。送達は、液体噴霧器、エアゾールをベースとした吸入器、および乾燥粉末分散装置を用いて行なわれ得る。定量装置が好ましい。噴霧器または吸入器を使用する利点の１つは、装置が内蔵型であるため汚染の可能性が最小限になることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末として、単独で、または適切な粉末担体と組み合わせて安定に保存され得る。吸入用の本発明の薬学的組成物の送達は、装置に取り込まれると、エアゾール医薬品投与中における投与量の追跡、コンプライアンスのモニタリング、および／または患者への投与のトリガーを可能とする、タイマー、用量計測器、時間測定装置、または時間表示器を含み得る投与タイミング要素（dosing timing element）によって媒介され得る。エアゾール送達用の薬学的装置の例としては、定量吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）およびエアジェット噴霧器が挙げられる。

ＩＬ−２２ポリペプチド（またはそれをコードする核酸）は、１用量あたり約０．０００１〜１．０mgまたは約０．００１〜０．１mg、または約０．１から１．０、またはさらには約１０mgなどを含むように治療混合物内で製剤化され得る。複数の投与量を投与してもよい。

いくつかの態様において、本発明によるＩＬ−２２ポリペプチドは、抗生物質などの抗菌剤と組み合わせて患者に投与される。ＩＬ−２２ポリペプチドと組み合わせて共投与され得る適切な抗生物質としては、セフトリアキソン、セフォタキシム、バンコマイシン、メロペネム、セフェピム、セフタジジム、セフロキシム、ナフシリン、オキサシリン、アンピシリン、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸（チメンチン）、アンピシリン／スルバクタム（ユナシン）、アジスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シナシッド、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸（オーグメンチン）、セフロキシム、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アジスロマイシン、クリンダマイシン、ジクロキサシリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、セフィキシム、セフポドキシム、ロラカルベフ、セファドロキシル、セファブチン（cefabutin）、セフジニル、およびセフラジンからなる群より選択された少なくとも１つの抗生物質が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。

本発明のさらなる局面は、
（ｉ）ＩＬ−２２および／またはその関連プロモーターをコードする遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／または
（ｉｉ）ＩＬ−２２をコードする遺伝子の発現を分析するために、
前記患者からの生物学的試料を分析する工程を含む、インフルエンザ感染患者が、インフルエンザ後に細菌重複感染にかかるリスクがあるかどうかを試験する方法に関する。

本明細書において使用される「生物学的試料」という用語は、血液または血清などの患者からの任意の試料を指す。

ＩＬ−２２をコードする遺伝子の突然変異を検出するための典型的な技術としては、制限断片長多型、ハイブリダイゼーション技術、ＤＮＡシークエンス、エキソヌクレアーゼに対する抵抗性、ミクロシークエンシング、ｄｄＮＴＰを使用した固相伸張、ｄｄＮＴＰを使用した溶液中における伸張、オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基多型を検出するための方法、例えば動的な対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーション連鎖反応、ミニシークエンス、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲまたは分子ビーコンと混合した単一または二重標識プローブを用いての対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションなどが挙げられ得る。

ＩＬ−２２をコードする遺伝子の発現の分析は、転写された核酸または翻訳されたタンパク質の発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかによって評価され得る。

好ましい態様において、ＩＬ−２２をコードする遺伝子の発現は、ｍＲＮＡ転写物またはｍＲＮＡ前駆体、例えば前記遺伝子の新生ＲＮＡの発現を分析することによって評価される。前記分析は、患者からの生物学的試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを基準ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって評価され得る。調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、サザンまたはノザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、例えば定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）、およびプローブアレイ、例えばＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＤＮＡアレイ（AFF YMETRIX）を含むがそれらに限定されるわけではないハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイに使用され得る。

有利には、ＩＬ−２２をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルの分析は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号に示された実験態様）、リガーゼ連鎖反応（BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991）、自己維持配列複製（GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990）、転写増幅系（KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法などによる核酸増幅プロセス、続いて、増幅された分子を、当業者には周知の技術を使用して検出することを含む。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数存在する場合には核酸分子の検出に特に有用である。本明細書において使用される増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）にアニーリングすることができ、かつその間の短い領域を含む、一対の核酸分子として定義される。一般的に、増幅プライマーは約１０から３０ヌクレオチド長であり、約５０から２００ヌクレオチド長の領域にフランキングする。適切な条件下および適切な試薬を用いて、このようなプライマーは、プライマーによってフランキングされるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。

別の好ましい態様において、ＩＬ−２２をコードする遺伝子の発現は、前記遺伝子から翻訳されたタンパク質の発現を分析することによって評価される。前記分析は、ＩＬ−２２をコードする遺伝子から翻訳されたタンパク質に特異的に結合する、抗体（例えば放射標識された、発色団標識された、フルオロフォア標識されたまたは酵素標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質との、またはタンパク質／リガンド対（例えばビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質もしくはタンパク質のリガンドとの抗体結合物）、または抗体フラグメント（例えば一本鎖抗体、単離抗体超可変ドメインなど）を使用して評価され得る。前記分析は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＲＩＡ）を含むがそれらに限定されるわけではない当業者には周知の多種多様な技術によって評価され得る。

本発明の方法は、患者からの生物学的試料中のＩＬ−２２をコードする遺伝子の発現レベルを、対照における前記遺伝子の正常な発現レベルと比較することを含み得る。正常な発現レベルと比較した、患者の生物学的試料中の前記遺伝子の有意により弱い発現レベルは、患者にインフルエンザ後の細菌重複感染のリスクがあることの徴候である。ＩＬ−２２をコードする遺伝子の「正常な」発現レベルは、インフルエンザ後に細菌重複感染を発症しない患者（または患者群）の生物学的試料中の前記遺伝子の発現レベルである。好ましくは、前記の正常な発現レベルは、対照試料において評価され、好ましくは前記遺伝子の平均発現レベルはいくつかの対照試料中において評価される。

インフルエンザ後の細菌重複感染にかかるリスクがあると考えられる患者は、その後、本発明の予防的処置（すなわち、ＩＬ−２２ポリペプチドの投与）に適格である。

本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例および図面は、いずれにしても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

インフルエンザ後の細菌重複感染に対する内因性ＩＬ−２２の役割。Ａ．Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ動物に、５０ＰＦＵのＩＡＶスコットランド／２０／７４／Ｈ３Ｎ２株を感染させた。肺を感染から３および７日後に収集した。Ｉｌ２２ｍＲＮＡコピー数を、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。データは、偽処置マウスにおける平均遺伝子発現に対する増加倍数として表現される。 インフルエンザ後の細菌重複感染に対する内因性ＩＬ−２２の役割。Ｂ．ＷＴまたはＩｌ２２^−/−マウスに、ＩＡＶ（５０ＰＦＵ）を感染させたまたは感染させなかった。７日後、ＩＡＶ感染動物またはナイーブ動物に、肺炎連鎖球菌（１×１０^４個のＣＦＵ）で攻撃し、その後、死滅するまで観察した（左パネル）。生存率が示されている（ｎ＝１５、３回の独立した実験）。カプランマイヤー生存曲線の比較のためのログランク検定は、ＷＴ動物と比較してＩｌ２２^−/−マウスの死亡率における有意差を示した。右パネル、二重感染ＷＴまたはＩｌ２２^−/−マウスを肺炎連鎖球菌による攻撃から２４時間後に屠殺し、肺内のＣＦＵ数を決定した。データは、２回の独立した実験からのプールされた結果を示す（ｎ＝９）。一元配置ＡＮＯＶＡ分析、続いてボンフェローニポスト検定を使用して有意差が示される。ＡおよびＢ、^＊ｐ＜０．０５。 インフルエンザ後の細菌重複感染に対する内因性ＩＬ−２２の役割。Ｃ．ＢＡＬ中のマクロファージおよび好中球の数は、細菌攻撃から２４時間後に決定された。ＢＡＬ液中のＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２の濃度を、細菌による攻撃から２４時間後に決定した。 インフルエンザ後の細菌重複感染に対する内因性ＩＬ−２２の役割。ＣおよびＤ．データは平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３（Ｓｐ）またはｎ＝１０（ＩＡＶ＋Ｓｐ））。 二重感染ＷＴおよびＩｌ２２^−/−マウスにおける細菌およびウイルス負荷並びにサイトカイン産生の定量。二重感染ＷＴまたはＩｌ２２^−/−マウスの肺を肺炎連鎖球菌による攻撃から１時間後に収集した。Ａ．ＩＡＶ Ｍ２ｍＲＮＡコピー数を、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。データはｇａｐｄｈの発現に対して標準化し、単一感染ＷＴマウス（ＩＡＶから７日後）における平均遺伝子発現に対する増加倍数として表現される。Ｂ．Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１７ａおよびＩｌ１７ｆｍＲＮＡコピー数を定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。データはＧａｐｄｈの発現に対して標準化し、ナイーブマウスにおける平均遺伝子発現に対する増加倍数として表現する。実施された２回の中の代表的な実験が示されている（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５）。

実施例：
材料および方法
ウイルス、細菌およびマウス
Ｈ３Ｎ２ ＩＡＶ株スコットランド／２０／７４および肺炎連鎖球菌血清型１臨床単離株Ｅ１５８６配列型ＳＴ３０４が（５８〜６１）に記載された。Ｃ５７ＢＬ／６において少なくとも１０回戻し交配したインターロイキン−２２^−／−マウス（６２）並びにＷＴの同腹仔の対照を、ルートヴィヒ研究所（Brussels, Belgium）で飼育した。ＲＯＲγｔ−ＧＦＰマウスは（６３、６４）に記載されていた（６３、６４）。マウス（８〜１０週令の雄）を、リールにあるパスツール研究所の動物資源センターのバイオセーフティレベル２の施設で維持した。全ての動物の研究は、リールにあるパスツール研究所の動物の管理と使用に関する委員会ガイドラインに従った（Comite d'Ethique en Experimentation Animale Nord Pas-De-Calaisの契約番号N°AF 16/20090）。

抗体および試薬
マウスＴＣＲβ（ＡＰＣおよびＶ４５０に結合）、ＴＣＲγδ（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５に結合）、ＣＤ４５（ｅＦｌｕｏｒ６０５ＮＣ、パシフィックブルーまたはＡＰＣ−Ｈ７に結合）、ＮＫｐ４６（ＰＥに結合）、ＣＤ１２７（ＰＥ−Ｃｙ７に結合）、ＣＤ９０．２（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００に結合）、ストレプトアビジン（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００またはＰＥに結合）およびＣＤ４（ＡＰＣ−Ｈ７に結合）に対するモノクローナル抗体はBD Biosciences (Le Pont de Claix, France)から購入した。Biotin Mouse Lineage PanelはBD Biosciences製であった。ＡＰＣ結合およびＰＥ結合ＰＢＳ−５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマーはそれぞれ、ProImmune (Oxford, UK) およびＮＩＡＩＤテトラマー施設(Emory University, Atlanta, GA)から入手した。マウスＩＬ−２２に対するモノクローナル抗体（クローン３Ｆ１１）は、W. Ouyang (Genentech, San Francisco, CA)博士からの親切なる贈与であった。

ＩＡＶ感染および定量ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の評価
マウスを麻酔し、種々の用量（１００または６００プラーク形成単位（ＰＦＵ））のウイルス（スコットランド/２０/７４、Ｈ３Ｎ２）を含む５０μlのＰＢＳを鼻腔内に投与した。偽処置マウスまたはＩＡＶ感染マウスの全肺からまたは気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）から回収された細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを古典的な手順によって合成した。定量ＲＴ−ＰＣＲを記載（１４）の通りに実施した。ｇａｐｄｈ、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１７Ａ、ｍｘ１、Ｉｆｎｂ、Ｉｌ２２およびＩＡＶ Ｍ２遺伝子に特異的なプライマーは（１４）に記載されていた。ΔＣｔ値は、内部標準物質であるｇａｐｄｈｍＲＮＡについて得られた生のサイクル閾値（Ｃｔ値）を推定することによって、調べた遺伝子について得られたＣｔ値から得られた。

ＩＡＶ感染ＲＯＲγｔ陽性細胞におけるＩＬ−２２転写物レベルの分析
ＲＯＲγｔ−ＧＦＰマウスをＩＡＶに感染させるかまたは感染させず、肺ＭＮＣを感染から６０時間後に調製した。ＲＯＲγｔ陽性αβＴリンパ球（ＣＤ４５^＋ＴＣＲβ^＋）、γδＴリンパ球（ＣＤ４５^＋ＴＣＲγδ^＋）およびＴＣＲαβ⁻ＴＣＲγδ⁻（ＣＤ４５^＋ＴＣＲβ⁻ＴＣＲγδ⁻）細胞を、ナイーブマウスおよびＩＡＶ感染マウスから選別した。ＩＬ−２２転写物の発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施された。

ＩＬ−２２産生細胞の分析
ＩＬ−２２産生細胞の分析を、ＩＡＶ感染から２日後に評価した。可能性ある対照として、肺ＭＮＣを、１０ng/mlの組換えマウスＩＬ−１βおよびＩＬ−２３と１０μg/mlのブレフェルジンＡ（Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany）を含む完全培地中で１×１０^７個の細胞／mlで３７℃で４時間かけて培養した。活性化後、細胞を洗浄し、LIVE/DEAD（登録商標）Fixable Dead Cell Stain Kit (Life Technologies, Carlsbad, USA)を用いてＰＢＳ中で３０分かけて染色した。細胞を洗浄し、ｅＦｌｕｏｒ６０５ＮＣに結合したＣＤ４５、ＰＥに結合したＰＢＳ−５７をローディングしたＣＤ１ｄテトラマー、Ｖ４５０に結合した抗ＴＣＲβ抗体およびＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５に結合した抗ＴＣＲγδ抗体の適切な希釈液と共に３０分間、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中でインキュベーションした。細胞を洗浄し、ＩＣ固定緩衝液（eBioscience, CliniSciences, Montrouge, France）を使用して固定した。その後、固定した細胞を、製造業者の指示に従って、透過緩衝液（eBioscience）中で透過処理した。細胞を、ＩＬ−２２に対するＡＰＣの結合したｍＡｂまたは対照マウスＩｇＧ２ａｍＡｂを用いて染色し、LSR Fortessa (BD Biosciences)で分析した。ＲＯＲγｔ陽性ＴＣＲαβ⁻ＴＣＲγδ⁻細胞におけるＩＬＣの比率を分析するために、ＲＯＲγｔ陽性−ＧＦＰマウスからの肺ＭＮＣを、ＡＰＣ−Ｈ７の結合した抗ＣＤ４５抗体、Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５の結合した抗ＴＣＲγδ抗体、Ｖ４５０の結合した抗ＴＣＲβ抗体、細胞系列特異的なビオチン抗体混液（ＴＥＲ１１９、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ、ＮＫ１．１）とＰＥに結合したストレプトアビジン、ＰＥ−Ｃｙ７に結合した抗ＣＤ１２７抗体、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００に結合したＣＤ９０．２の適切な希釈液を用いて標識した。細胞をLSR Fortessaで分析した。

死亡率および病態の評価
ＩＡＶ感染（５００または５０ＰＦＵ）後、マウスを１７日間の期間におよび病気および死亡率についてモニタリングした。疾病は、肺炎症、肺内のウイルス負荷、および致死によって評価した。瀕死であることが判明したマウスは安楽死させ、その日に死亡したと判断した。マウスはまた、感染から４日後に屠殺し、全肺およびＢＡＬを回収した。組織病理学的検査のために、肺を、３．２％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液中への膨張および浸漬によって固定し、パラフィンに包埋した。気道炎症を評価するために、本発明者らは、固定された肺薄片（５μmの切片）をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色にかけた。遺伝子型を知らされていなかった評価者が、（６５）に記載の基準に従って、肺切片（０［なし］から３［極度］）をスコアリングした。

ウイルス負荷の分析およびＩＡＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の分析
肺をホモジナイズし、ウイルス力価を、メイディン・ダビーイヌ腎臓細胞上で標準的なプラークアッセイを使用して決定した。ＩｆｎｂおよびＭｘ１ｍＲＮＡ発現レベルを記載（６５）の通りに定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＩＡＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数は、報告（６５）されている通りに決定された。このために、ウイルスポリメラーゼ２タンパク質（ＰＡ_{２２４〜２２３}）に由来する免疫優性Ｄ^ｂ拘束ＣＤ８^＋Ｔエピトープに特異的な細胞（６６）を分析した。簡潔に言えば、肺ＭＮＣを、ＡＰＣに結合した抗ＣＤ１９抗体、ＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ８抗体およびＰＥに結合したＰｒｏ５（登録商標）ＭＨＣペンタマーＨ−２Ｄ^ｂSSLENFRAYVの適切な希釈液と共にインキュベーションした。ウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能を評価するために、肺細胞を、ペプチドSSLENFRAYV (１０μg/ml)で刺激し、サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって評価した。

肺炎連鎖球菌を用いての感染
７日前にＩＡＶ（５０ＰＦＵ）に感染させたまたは感染させなかったマウスに、１×１０^４個の肺炎連鎖球菌血清型１を鼻腔内に接種した。マウスを１３日間の期間におよび病気および死亡率について毎日モニタリングした。肺内の生細菌数を、肺炎連鎖球菌による攻撃から２４時間後に決定した。これは、血液寒天プレート上に肺ホモジネートを蒔くことによって測定された（６７）。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を２４時間後に数えた。形態に基づいた細胞数の鑑定を、ＢＡＬ液からのサイトスピンによる調製物に対して実施し、Diff-Quik溶液（Sigma）で染色した。

統計分析
結果は平均値±ＳＤまたは±ＳＥＭとして表現される。実験群間の統計学的有意差は、一元配置分散分析法、次いでボンフェローニポスト検定（GraphPad Prism 4 Software, San Diego, USA）によって計算された。これらのパラメトリック検定を使用する可能性は、集団がガウスであり、かつ分散が均一かどうかを確認することによって評価された（バートレット検定）。０．０５未満のｐ値を含む結果を有意と判断した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

結果：
ＩＬ−２２は、ＩＡＶ感染の初期段階に肺において産生される
初期ＩＡＶ感染中のＩＬ−２２の発現は不定であるが、近年の報告は、ＮＫ細胞が、感染から２日後の主な発生源であり得ることを示唆した（５６）。偽処置動物と比較して、より高いレベルのＩｌ２２遺伝子転写物が、感染から２および４日後にＩＡＶ感染マウスの肺組織に検出された（約１０倍の増強）。肺胞空間からの細胞もまた、より多量のＩｌ２２メッセンジャーをこれらの時点で発現した。増強されたＩＬ−２２タンパク質の濃度も、肺組織および肺胞空間において検出されたが、感染からわずか２日間であった。Ｔｈ１７由来サイトカインＩＬ−２２は、ＩＬ−１７と類似性を共有する。Ｉｌ１７ａおよびＩＬ１７ｆ遺伝子転写物もまた、感染から２および４日後にＢＡＬ細胞中にアップレギュレーションされていることが判明したが、肺細胞には判明せず、一方、ＩＬ−１７ファミリーの別のメンバーであるＩｌ２１は変調されなかった。増大したＩＬ−１７Ａタンパク質もまた、感染から２日後に検出されたが、ＢＡＬ液にのみに検出された。

インターロイキン−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αは、いくつかの状況において初期のＩＬ−２２産生に関与することが記載されている（総説については（１、８、９））。Ｉｌ２３、Ｉｌ１ｂ Ｉｌ６およびＴｎｆａ遺伝子転写物は、感染から２および４日後に、ＢＡＬ細胞および肺において強力にアップレギュレーションされた。増強されたＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αタンパク質レベルもまた、これらの時点で証明された。特に、ＲＯＲγｔおよびより低い程度でＩＬ−２２合成に重要であることが知られている転写因子であるアリールレセプター（ＡｈＲ）もまた（１、８、９）、転写レベルでアップレギュレーションされた。要するに、ＩＬ−２２並びにその発現を調節することが知られている因子は、Ｈ３Ｎ２ ＩＡＶ感染の初期段階に肺において産生される。

ＲＯＲγｔ発現細胞は、ＩＡＶ感染後の初期に増強されたＩＬ−２２転写物を産生する
本発明者らは、ＩＡＶ感染中のＩＬ−２２の初期発生源（群）を分析するためにＲＯＲγｔ−ＧＦＰマウスを活用した。ＩＡＶ感染マウスから精製されたＲＯＲγｔ陽性細胞は、非感染動物から単離されたＲＯＲγｔ陽性細胞と比較して、劇的に増強されたレベルのＩｌ２２遺伝子転写物を発現する。これに対し、インフルエンザ感染は、ＲＯＲγｔ陰性細胞においてＩｌ２２メッセンジャー発現をトリガーしなかった。特に、ＮＫｐ４６^＋細胞は、肺組織においてＲＯＲγｔを発現せず、ＩＡＶに応答してＩｌ２２メッセンジャーを産生できなかった。

種々の肺ＲＯＲγｔ発現細胞集団を、次に、偽処置動物およびＩＡＶ感染動物から選別し、Ｉｌ２２遺伝子転写物発現について分析した。（６４、６８）と一致して、αβＴリンパ球およびγδＴリンパ球は、ＲＯＲγｔを発現している２つの主要な集団を代表した。インバリアントＮＫＴ細胞をαβＴリンパ球プールから廃棄し、別々に分析した。ＲＯＲγｔ^＋細胞の別のマイナーな集団も同定された。この集団は、約７０％のＬｉｎ⁻ＣＤ１２７^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ４⁻細胞を含み、従って、ＩＬＣの強化された集団と呼ばれた。αβＴリンパ球、γδＴリンパ球、ｉＮＫＴ細胞、およびより低い程度でＩＬＣの強化された集団は、ＩＡＶ感染の脈絡においてより高いレベルのＩｌ２２ｍＲＮＡを産生した。

次に、ＲＯＲγｔ発現細胞によるＩＬ−２２タンパク質の発現の分析は、陽性対照としてここで使用されたＩＬ−１βおよびＩＬ−２３の混液への応答で評価された。αβＴリンパ球（主にＣＤ４⁻）、γδＴリンパ球、ｉＮＫＴ細胞およびより低い程度でＩＬＣの強化された集団内の細胞は、ＩＬ−２２タンパク質を産生した。特に、肺ＮＫｐ４６^＋細胞は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２３に応答してＩＬ−２２を発現できなかった。他方で、ＩＡＶ感染の脈絡においては、ＩＬ−２２タンパク質の発現は、いかなる細胞集団を分析しようと、細胞内ＦＡＣＳ染色によって証明されなかった。

ＩＬ−２２欠損症は、マウス生存率、ウイルス排除およびＩＡＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答に対して全く影響を及ぼさない
重度の肺免疫病態は、インフルエンザに関連した罹患率および死亡率の強力な原因となる（６９）。ＩＬ−２２は、免疫病態の万能な制御因子であることが知られているが（１、８、９）、ＩＡＶ感染中におけるその役割については殆ど知られていない。この点に取り組むために、ＷＴマウスおよびＩｌ２２^−/−マウスを生存試験に使用した。遺伝子バックグラウンドに因るあり得る偏りを排除するために、ＷＴおよびＩｌ２２^−/−同腹仔を使用した。致死量（６００ＰＦＵ）のＩＡＶにより、ＷＴ動物は重度の病気を示し、１３日目に死亡した。有意ではないが、Ｉｌ２２^−/−マウスの１０〜１５％が、感染から１８日後に感染から脱して生き延びた。逆に、致死量以下の用量を使用して（５０ＰＦＵ）、Ｉｌ２２^−/−マウスは、ＷＴ動物と比較して、有意ではないが僅かに低下した抵抗性を示した。

内因性ＩＬ−２２がウイルス排除において役割を果たしているかどうかを決定するために、ウイルス負荷を、プラークアッセイによって感染から４日後および７日後にモニタリングした。使用されるＩＡＶ用量がどのようなものであれ、Ｉｌ２２^−/−マウスは、ＷＴ動物と類似した動態で、肺におけるウイルス複製を制御した。これと一致して、ウイルス複製に関連した遺伝子（ｉｆｎｂ、ｍｘ１）の転写物レベルは、感染ＷＴマウスとＩｌ２２^−/−マウスの間で有意差はなかった。

インターロイキン−２２は、いくつかの状況においてＡｇにより誘発された肺免疫応答を減弱させることが示された（２８、３０〜３２）。従って、本発明者らは、細胞数およびサイトカイン産生に関して、ＩＡＶ感染ＷＴマウスおよびＩｌ２２^−/−マウスにおけるウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を比較した。ＩＡＶの用量がどのようなものであれ、肺ＣＤ８^＋Ｄ^ｂＰＡ_{２２４〜２３３} ^＋細胞数は、感染から４日後および７日後において、ＷＴマウスとＩｌ２２^−/−マウスとの間で差はなかった。同様に、ＰＡ_{２２４〜２３３}を用いての再刺激時に、肺細胞によって放出されるＩＦＮ−γの量は同一であった。特に、ＩＡＶ感染マウスからの肺ＭＮＣは７日目に自発的にＩＬ−２２を放出するが、ＩＬ−２２の産生は、ＩＡＶペプチドによる再刺激後に増幅せず、従って、少なくとも使用される免疫優性ペプチドに応答した、初期ＩＡＶの脈絡における、ＩＡＶ特異的ＩＬ−２２産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞は欠失していることを示す。ウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答はまた、ＷＴマウスおよびＩｌ２２^−/−マウスからの肺流入領域リンパ節において類似していた。

内因性ＩＬ−２２は、軽度であり重篤ではないＩＡＶ関連肺炎の制御において正の役割を果たす
本発明者らは次に、ＩＡＶに関連した肺病態に対する内因性ＩＬ−２２の役割を調べた。それを行なうために、致死量または致死以下の用量のＩＡＶに感染させたＷＴマウスおよびＩｌ２２^−/−マウスからの肺を、肺炎症応答および上皮傷害の急性期における組織診断のために収集した。ＩＡＶが急性の肺炎を引き起こし、最終的に動物が死滅する状態では（６００ＰＦＵ）、ＩＬ−２２の欠失は、肺炎症の強度を有意に変調しなかった。実際に、肺への細胞浸潤並びに肺胞炎および細気管支炎スコアは、感染ＷＴマウスとＩｌ２２^−/−マウスとの間で有意差はなかった。両方の感染動物群において、気管支上皮が強く傷害を受け、これは、ＢＡＬ液中の高い全タンパク質濃度によって測定されるような損なわれた上皮完全性を伴っていた。

全く対照的に、致死以下の攻撃時に（５０ＰＦＵ）、気道炎症の有意な増強が、ＷＴマウスと比べて、Ｉｌ２２^−/−マウスにおいて認められ、これは後者の群におけるより高い組織病態スコアによって反映される。Ｉｌ２２^−/−マウスにおいては、肺胞炎および細気管支炎は、ＷＴの同腹仔と比べてより顕著であり、好中球およびマクロファージの増強された流入が肺組織において観察された。さらに、Ｉｌ２２^−/−マウスに由来する気管支を囲む上皮はより多くの傷害を受けていた。細胞間接着の消失の増大および剥皮された上皮によって特徴付けられる、重度の損傷の兆候が、Ｉｌ２２^−/−動物に観察された。しかしながら、この見かけ上の上皮完全性の消失は、ＢＡＬ中のタンパク質濃度の有意な増強を伴わなかった。これに対し、肺胞の管腔側における赤血球の数は、肺胞からの漏出および病変性の浮腫を示す、Ｉｌ２２^−/−マウスにおいて劇的に増強されていた。

ＩＬ−２２欠損症により、インフルエンザ後の続発性細菌感染への易罹患性は増強される
インフルエンザ後の上皮傷害は、肺炎連鎖球菌などの続発性細菌感染において役割を果たすと提唱されている（７０〜７６）。従って、本発明者らは、インフルエンザ後の細菌重複感染における内因性ＩＬ−２２の役割を研究した。この目的を達成するために、ＷＴマウスおよびＩｌ２２^−/−マウスを、致死量以下の用量のＩＡＶに感染させ、７日後、マウスを肺炎連鎖球菌により攻撃した。本発明者らがこの時点を選んだのは、それがインフルエンザ後の細菌への易罹患性のピークに相当するからである（示されていない）。特に、使用されるＩＡＶの用量（５０ＰＦＵ）では、Ｉｌ２２ｍＲＮＡは、感染から３日後および７日後に肺組織において検出された。（図１Ａ）。予想された通り、事前のＩＡＶ感染は、肺炎連鎖球菌による攻撃後に動物死を誘発したが（ＡＩＶ＋Ｓｐ）、ナイーブマウスでは、使用された用量では、肺炎連鎖球菌による攻撃は生存率に影響を及ぼさなかった（Ｓｐ）（図１Ｂ、左パネル）。特に、ＩＡＶを経験したＷＴマウスの５０％が、肺炎連鎖球菌感染後に屈したが、ほぼ全ての共感染Ｉｌ２２^−/−マウスが細菌感染により死滅した。この作用は、肺組織における生細菌数の増加に関連していた（図１Ｂ、右パネル）。重要なことには、観察された作用は、おそらく、内因性ＩＬ−２２それ自体の直接的な抗細菌作用に起因していなかった。実際に、ＩＡＶを経験していないＷＴおよびＩｌ２２^−/−マウスの両方が、致死量以下の肺炎連鎖球菌による攻撃後に、生き延びかつ肺内の細菌を等しく排除した（図１Ｂ）。

従って、ＩＬ−２２の欠失は、続発性の肺炎連鎖球菌による肺炎の予後を悪化させる。この作用は、肺における有意により高いＩＡＶの負荷にも（図２Ａ）、肺炎連鎖球菌の排除に重要であることが知られている細胞である、二重感染マウスのＢＡＬ中へのマクロファージおよび好中球の動員の差異にも関連していなかった（７７、８９）（図１Ｃ）。さらに、抗肺炎球菌効果を発揮することが知られている因子（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７並びに好中球遊走因子ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２を含む）の産生は、ＷＴマウスとＩｌ２２^−/−二重感染マウスとの間で差異はなかった（図１Ｄおよび図２Ｂ）。要するに、内因性ＩＬ−２２が、インフルエンザ後の細菌重複感染を制限し、これは増強された宿主防御機序とはおそらく独立した現象である。

結論：
現在の研究において、本発明者らは、ＩＡＶ感染したＩｌ２２^−/−マウスは、同じように感染させたＷＴ動物と比較して、低下した生存率、および肺からの続発性の肺炎連鎖球菌感染の低下した排除を示すことを報告する。本発明者らは、ＩＡＶ後の細菌重複感染におけるＩＬ−２２における防御的役割は、ＩＡＶ感染に起因する肺（上皮を含む）損傷に対するその正の初期の効果に起因するのではなく、むしろ、抗細菌作用機序それ自体に起因するという仮説を支持する。実際に、肺炎連鎖球菌に対する初期の自然防御機序に関連した分子性（ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１／２）および細胞性（マクロファージ、好中球）エフェクターは、ＩＬ−２２の非存在下で有意に減少しなかった。さらに、以前にＩＡＶに感染していなかったＩｌ２２^−/−マウスは、少なくとも致命的ではない攻撃後には肺炎連鎖球菌を抑制した。ＩＬ−２２がＩＡＶ後の続発性細菌感染から防御する機序は、将来研究する価値がある。平行して、ヒトにおけるＩＬ−２２またはＩＬ−２２レセプター産生の調節不全が、特定の病態（乾癬、クローン病およびアレルギー症を含む）において報告されているので、患者における細菌重複感染への易罹患性と、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２レセプター産生との間のあり得る相関（もしあれば）を決定することは興味深いことであり得る。近年の所見は、抗生物質および抗ウイルス療法と組み合わせて、肺上皮を保護するおよび／または肺修復応答を刺激する処置は、インフルエンザと細菌の共感染中の患者における生存率を改善する上で有益であり得ることを示唆する（５７、７６）。結論すると、ＩＬ−２２の補充は、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための良い選択肢を示す。

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (12)

1. 被験者に治療有効量のインターロイキン２２（ＩＬ−２２）ポリペプチドを投与することを含む、それを必要とする被験者におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための方法。
2. インフルエンザ感染がインフルエンザウイルスＡ型またはＢ型に関連している、請求項１の方法。
3. インフルエンザ感染が、ＨＩＮ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１であるインフルエンザウイルスＡ型によって引き起こされる、請求項２の方法。
4. 細菌重複感染が、下気道感染、中耳感染および細菌性副鼻腔炎からなる群より選択される、請求項１の方法。
5. 細菌重複感染が、肺炎連鎖球菌；黄色ブドウ球菌；インフルエンザ菌；マイコプラズマ種およびカタル球菌からなる群より選択される少なくとも１つの生物によって媒介され得る、請求項１の方法。
6. 被験者が、少なくとも５０歳である被験者、長期療養施設に滞在する被験者、肺または心血管系の慢性疾患を有する被験者、慢性代謝疾病、腎機能不全、ヘモグロビン異常症または免疫抑制のためにその前の年に定期的な医学的フォローアップまたは入院を必要とした被験者、１４歳未満の小児、長期アスピリン療法を受けている６カ月から１８歳までの患者、およびインフルエンザの季節に妊娠の第２または第３三半期にいるであろう女性からなる群より選択される、請求項１の方法。
7. １歳を超えかつ１４歳未満の被験者、５０歳から６５歳の被験者、および６５歳を超える成人におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防に適した、請求項１の方法。
8. 被験者がＩＬ−２２欠損症を有する、請求項１の方法。
9. ＩＬ−２２ポリペプチドが、抗生物質などの抗菌剤と組み合わせて患者に投与される、請求項１の方法。
10. 抗生物質が、セフトリアキソン、セフォタキシム、バンコマイシン、メロペネム、セフェピム、セフタジジム、セフロキシム、ナフシリン、オキサシリン、アンピシリン、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸（チメンチン）、アンピシリン／スルバクタム（ユナシン）、アジスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シナシッド、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸（オーグメンチン）、セフロキシム、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アジスロマイシン、クリンダマイシン、ジクロキサシリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、セフィキシム、セフポドキシム、ロラカルベフ、セファドロキシル、セファブチン（cefabutin）、セフジニル、およびセフラジンからなる群より選択される、請求項９の方法。
11. （ｉ）ＩＬ−２２および／またはその関連プロモーターをコードする遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／または（ｉｉ）ＩＬ−２２をコードする遺伝子の発現を分析するために、前記患者からの生物学的試料を分析する工程を含む、インフルエンザ感染患者が、インフルエンザ後に細菌重複感染にかかるリスクがあるかどうかを試験する方法。
12. 患者が、細菌重複感染にかかるリスクがあると考えられる場合に、請求項１の予防処置に適格である、請求項１１の方法。

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