JP2015529323A - 血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置 - Google Patents
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Abstract
本発明は、医学および生物学に関し、特に血液およびその成分の凝固特性を決定するための診断および研究の目的に、そしてバイオテクノロジーおよび基礎生物学的研究において、使用可能である。本発明の課題は、試験サンプル中およびサーモスタットで制御された流体中の気泡が試験プロセス自体(たとえば、血液の凝固)や記録されたデータの処理に影響しないようにすることであり、このことは、得られる結果の精度や試験の完全性に、そして凝固プロセスおよびその特定のパラメーターに関する新たな情報の取得に影響を及ぼす。この課題は、流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも1つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、記録手段は、サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、圧力調節手段は、サーモスタット制御式チャンバーまたはキュベットに接続されている装置を作製することによって、解決される。
Description
本技術判定は、医学および生物学に関し、特に血液およびその成分の凝固特性を決定するための診断および研究の目的に、そしてバイオテクノロジーおよび基礎生物学的研究において、使用可能である。
血液およびその成分の凝固についての研究は、特定の疾患の診断を可能にするだけでなく、血液凝固パラメーターに影響する調製物の活性評価もできるようにするため、実用上、重要である。全血および血漿における凝固速度を決定するためのさまざまな装置が、背景技術から知られている。しかしながら、現在まで、これらの研究は恒久的に混合されている均一系において設計されてきた。試験の最初から終わりまで血漿全体が恒久的に混合されるため、凝固血漿形成過程の間に形成されるすべての凝固因子が試験液中で均一に分散され、同時に試験サンプル全体で凝塊の形成が進行している。生理学的観点から、この過程はin vivoでの凝塊形成条件とは基本的に異なる。
背景技術から、本発明者らは、国際出願第PCT/CH2007/000543号(国際公開WO2009/055940号、分類G01N 33/49、2009年5月7日公開)に開示された、フィブリン凝塊の空間的な形成をモニタリングするための装置を知っている。この装置は、凝固活性化因子が底端に固定化されたインサートと、キュベットと、からなるキュベットアセンブリーを含む。キュベットアセンブリーは、キュベットを熱的に安定させるためのサーモスタットとキュベットをサーモスタットの内部に固定するための装置とを含むホルダー内に配置される。サーモスタットには、少なくとも部分的に透明な流体が充填されている。前記装置は、フィブリン凝塊の空間的な成長の過程を調節する他の凝固因子の形成過程と空間的な分布を登録する可能性を与えることなく、フィブリン凝塊の形成過程の登録を凝固系の作用の最終生成物とすることを可能にする。このように開示された解決手段に対する最も近い類似物としては、血液およびその成分の凝固特性を調査するための装置(特許RU 2395812、分類G01N33/49、2010年7月27日公開)があり、この装置は、流体が充填され、かつ、試験サンプルを有するキュベットと凝固活性化因子が固定化されたインサートとを収容しているサーモスタット制御式チャンバーと、キュベットの内容物およびインサートの下端付近で形成される凝塊に光を照射するための照明手段と、デジタルカメラと、を含み、得られたデータを処理するようコンピューターに接続される。
前記装置の欠点の一つは、サーモスタット制御式チャンバーでの試験サンプルの加熱時における登録領域内での試験サンプルおよび流体中の気泡の形成である。これらの気泡は、フィブリン凝塊からの光散乱信号を歪めてしまう。さらに、この装置は、たとえば赤色光など一波長のみの照明手段しか有しておらず、このことが、たとえば蛍光的な方法でのタンパク質分解酵素の時空間分布の研究をフィブリン凝塊形成についての研究と同時に行うことを妨げている。
特許請求の範囲に記載の解決手段を実現することで得られる技術的な結果は、多数の血液疾患を診断するのに必要な、血液およびその成分の空間的な凝固のパラメーターの定義に関して、方法の精度と信頼性が改善されるのみならず、過去には研究されていなかった多数の別のパラメーターを決定できるようになることである。
開示された解決手段によって解決される課題は、試験サンプル中やサーモスタットで制御された流体中の気泡が試験プロセス自体(たとえば、血液の凝固)や記録されたデータの処理に影響しないようにすることであり、このことは、得られる結果の精度や試験の完全性に、そして凝固プロセスおよびその特定のパラメーターに関する新たな情報の取得に影響を及ぼす。
この課題は、流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも1つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、記録手段は、サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、圧力調節手段は、サーモスタット制御式チャンバーまたはキュベットに接続されている装置を作製することによって、解決される。
さらに、事実によれば、装置は、少なくとも1つの別の照明手段を含む。
さらに、事実によれば、装置は、照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする光学素子を含む。
さらに、事実によれば、装置は、前記照明手段、記録手段、および圧力調節手段の作業を同期可能とするよう製造された、照明手段、記録手段、および圧力調節手段の制御ユニットを更に含む。
さらに、事実によれば、装置は、試験の結果を処理する手段との接続を更に含む。
特許請求の範囲に記載の装置は、温度調節可能に製造され、流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバー1を含む。水および空気のサーモスタット制御や、ゲルの使用を伴うサーモスタット制御を含む、異なるタイプのサーモスタット制御を提供する可能性がある。ところで、試験液は放射線用に透明に維持されなければならないことが考慮されてきた。水のサーモスタット制御が好ましい。サーモスタット制御時、恒久的な温度が維持される。キュベット2は、前記チャンバー1の内部に配置される。キュベット2は、少なくとも1本のチャネル3を設けて製造可能である。試験液サンプルは、チャネル3内に入れられる。試験液サンプルの代表例は、血液、血漿、全血、乏血小板血漿、または多血小板血漿などの哺乳動物(ヒトまたは動物)の体液であってもよい。さらに、サンプルは、止血活性を有する、精製された天然、合成、または組換えタンパク質、および/または他の調製物/試薬の混合物を含んでもよい。たとえば凝固の研究対象プロセスの開始を容易にする作用剤が底端に適用されたインサート4を、前記キュベット2の中に入れることができる。以下の作用剤を使用して、凝固プロセスの開始を容易にすることが可能である:タンパク質、異なる手段によってインサート4の前面に、あるいは、あらかじめ定められた位置でキュベット2の内面に直接、固定化されたいわゆる組織因子(トロンボプラスチン)、そして、細胞および組織の調製物などの他の有機体剤。ガラス、カオリンなどの他の血栓形成剤を活性化因子として使用してもよい。
背景技術から知られている装置の主な欠点のひとつは、加熱時に、サンプル中の気泡のみならず、サーモスタット制御式チャンバー1内の流体中の気泡の形成によって生じるモニタリングパラメーターのゆがみである。この欠点を排除するために、著者らは、試験時に安定した圧力を調節および維持する手段5を有する、特許請求の範囲に記載の装置を提供することを提案した。この目的のために、圧力調節手段5が、サーモスタット制御式チャンバー1に接続される。圧力調節手段5は、特定の製造例において、戻し弁を介してサーモスタット制御式チャンバー1の内側の(圧力がシールされた)部分と上述したチャンバー1の圧力を測定する圧力センサーとに接続された空気ポンプで代表されるものであってもよい。圧力センサーの値に基づいて、制御ユニット(図1には図示せず)は、空気ポンプを制御する(これのオン/オフを切り替える)。ポンプは、たとえば、当該空気ポンプを介したサーモスタット制御式チャンバー1からの偶発的な圧力開放を防止する戻し弁が組み込まれるパイプによって形成された圧力ラインを介して、サーモスタット制御式チャンバー1に接続される。弁は、受動的かつ機械的であってもよいし、制御ユニットによって電機機械的に調整されてもよい。制御ユニットの命令下、サーモスタット制御式チャンバー1の圧力シール時に、ポンプはオンに切り替わり、チャンバー1内での加圧を開始する。圧力センサーによって測定される標的圧力に達した後、ポンプは、オフに切り替わる。試験時、圧力が標的レベル未満まで降下したらポンプのオン/オフを切り替えることによって、標的圧力が維持される。
標的圧力を維持しつつ、サーモスタット制御式チャンバー1の圧力シールが与えられる。圧力シールは、たとえば、サーモスタット制御式チャンバー1の内側部分の加圧手段6を用いて与えることができる。加圧手段は、カバー、カップ、シャッター、または他の任意の一般的な手段に代表されるものであってもよい。同時に、加圧手段6は、オペレーターによって閉じられる機械的なものであってもよいし、制御ユニットによって指令される電気機械的なものであってもよい。
さらに、キュベット2内で圧力を直接発生させてもよい。その後、圧力調節手段5がキュベット2内に圧力を加え、圧力ライン(パイプ)が前記キュベットと接続される。
試験全体を通して大気圧に対して過剰な圧力、好ましくは0.2から0.5atmを維持すると、気泡の排除が可能であるということが立証された。
サーモスタット制御式チャンバー1には、透明なウィンドウ7が設けられ、このウィンドウを介して少なくとも1つの照明手段8が試験サンプルとその中に形成された凝塊に光を照射する。所望のスペクトル範囲のLEDまたは他の任意の放射線源(たとえば、光学フィルター付き電球)を照明手段として用いることができる。大きくなっていく凝塊の画像(凝塊からの光散乱)を、たとえばレンズ10を備えるデジタルカメラなどの登録手段9によって固定する。登録された画像の品質(信号/バックグラウンドの相関)を改善するため、ならびにサーモスタット制御式チャンバー1における凝固の追加のパラメーターをモニタするために、ライトトラップ11が提供される。前記ライトトラップ11は、バックグラウンドの放射線を低減するのに用いられる。バックグラウンドの放射線は、光を散乱できる凝塊などの研究対象の構造体によって登録手段の方向に散乱する以外のすべての放射線である。ライトトラップ11は、異なる方法で製造可能であり、とりわけサーモスタット制御式チャンバーの内面の特定の幾何学形状によって形成され、特に、扁平な錐形によって表される。また、これは、たとえばチャンバーの内面を暗色にしていくぶん粗くするなど、その内面に吸光特性を与えることによっても形成可能である。ライトトラップ11の幾何学形状および光学特性は、バックグラウンドの放射線を繰り返し再反射および吸収するように考え出された。
そして、登録手段9は、試験結果を処理する手段13、たとえばコンピューターと電気的および情報的に接続されている。照明手段および登録手段は、制御ユニット(図1に図示せず)によって調節できるよう製造される。
発色基質、続いて蛍光基質の登場によって、凝固系の機能原理についての新たな情報を取得することが可能になった。前記基質を、タンパク質分解酵素を含む試験サンプルに加えると、後者が基質から信号プローブを切断する。このプローブは、試験サンプルの光学密度を変更する(発色基質)か、あるいは照射されると蛍光を発する(蛍光基質)ことができる。反応−拡散−対流タイプの式を使用し、信号プローブの空間分布に基づいて、対応するタンパク質分解酵素の空間分布を把握可能である。
蛍光基質を用いる場合、プローブの蛍光を励起するために、特許請求の範囲に記載の装置には、定められた時点で試験液のサンプルに励起放射線を照射する少なくとも1つの照明手段12が更に設けられる。照明手段12は、好ましくはキュベット壁2に直交する方向で、光学素子を介して放射線を供給する。この光学素子は、たとえば、鏡14と共に放射フィルター15および励起フィルター16を用いて、サーモスタット制御式チャンバー1に形成されたウィンドウ7を介して、照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする。UV−スペクトルLEDのようなUV放射線源を、照明手段12として使用する。励起フィルターは、照明手段12のスペクトルからプローブの蛍光スペクトルを分離する。
この装置は、以下のように動作する。サーモスタット制御式チャンバー1の温度が固定されたレベルに設定され、維持されて、その内部に配置されたキュベット2が均一に加温される。試験の前に、たとえば血漿などのサンプルがキュベット2内に入れられる。サンプルの体積全体が同じ温度になり、その中の対流が停止したら、インサート4がキュベット内に入れることによって、前記インサート4の端に塗布した血栓形成剤をサンプルと接触させて、研究対象の凝固プロセスが開始されるようにする。サーモスタット制御式チャンバー1は、加圧手段6によって閉じられ、圧力調節手段5によってチャンバー内の過剰な圧力が生み出される。研究時、ライトトラップ11は、その幾何学形状および表面挙動がゆえに、キュベット2の面の後ろを通過する放射線を効率的に吸収し、バックグラウンドの放射線を繰り返し再反射および吸収して、反射された放射線がキュベット2の登録領域に戻ってレンズ10の入射開口に入射することがないようにする。キュベット2の内部で大きくなっている凝塊の画像は、透明なウィンドウ7およびレンズ10を介して、登録手段9に送られる。その後、結果をさらにデジタル処理するために、記憶手段13にデジタル画像が送られる。
もし、たとえば蛍光基質が試験サンプルに添加されると、定められた時点で、照明手段12によって蛍光基質が照明されてプローブの蛍光を励起し、サンプル中のプローブの蛍光の空間分布が登録手段9によって登録される。特別に開発されたソフトウェアによって、照明手段および登録手段の制御ユニットは、記録が行われている短い時間のみ照明手段8および/または12をオンにすることができる。照明手段のこのような動作方式は、基質プローブの光退色の作用を低減する。基質プローブの照明と同時に、照明手段8によって試験液サンプルが照明され、光散乱の空間分布、サンプル内での光透過の空間分布、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される試験サンプルの光学パラメーターが登録される。それによって、血液凝固パラメーターの空間分布、特に、フィブリンの空間分布が登録される。照明波長は、蛍光が研究される場合であれば、プローブの励起スペクトルに従って選択され、あるいは、光散乱が登録される場合であれば、光散乱のスペクトルおよび登録手段の感度に従って選択される点に注意されたい。
このように、特許請求の範囲に記載の装置は、時間および空間における凝固プロセスの全段階のより正確で詳細な研究を可能にし、正常な病理学的条件および様々な病理学的条件下における試験サンプルの臨床評価の精度と信頼性を高めるものである。
Claims (5)
- 流体が充填されたサーモスタット制御式チャンバーと、少なくとも1つの照明手段と、記録手段と、圧力調節手段と、を含む、血液およびその成分の空間的な凝固をモニタリングするための装置であって、前記サーモスタット制御式チャンバーの内部には、試験液のサンプルを入れるためのキュベットが設けられ、前記記録手段は、前記サーモスタット制御式チャンバーの内面の幾何学形状によって形成されたライトトラップを備え、前記圧力調節手段は、前記サーモスタット制御式チャンバーまたは前記キュベットに接続されている、装置。
- 少なくとも1つの別の照明手段を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記照明を指向させ、その焦点を絞り、スペクトル補正をする光学素子を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記照明手段、前記記録手段、および前記圧力調節手段の作業を同期可能となるよう製造された、前記照明手段、前記記録手段、および前記圧力調節手段の制御ユニットを更に含む、請求項1に記載の装置。
- 試験の結果を処理する手段との接続を更に含む、請求項1に記載の装置。
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