JP2015523058A - 間葉系幹細胞の骨形成分化 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞外小胞を使用して骨形成分化を誘発するおよび／または促進するための方法ならびにその使用に関する。

Description

本発明は、細胞の分化を誘発するまたは促進するための方法、前記分化を誘発するまたは促進するのに使用するための細胞外小胞、前記小胞の使用、および前記小胞を使用する治療の方法に関する。

序論
インプラント表面または傷害の部位での初期の骨形成のメカニズムならびに骨−インプラントの接触、安定性、および機能の維持に影響を及ぼす因子は、完全には理解されていない。炎症細胞および幹細胞および前駆細胞がインプラントの表面で連絡する経路についての知識の増加は、臨床上の使用のための次世代のインプラントをどのように最適化するべきかを理解するのに重要である。より優れた知識により、将来、発明者らは、うまく行けば、骨結合の改善のための新しくてよりよいインプラントまたは骨治癒のためのよりよい薬剤を産生することができるであろう。

単球／マクロファージ系は、バイオマテリアル表面で、宿主防御、創傷治癒、および免疫調節における中心的な役割を果たす。単球および間葉系幹細胞は、移植された物質表面に速やかに移動し、細胞外マトリックスの沈着および骨形成の前に、互いにすぐ近くに局在化する。たとえば炎症促進性サイトカインを含有する、ヒト単球由来の条件培地が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化を促進することが示された。単球およびＭＳＣが直接的な細胞間接触の非存在下において連絡することが示唆されているが、単球がＭＳＣとどのように連絡するかは完全には決定されていない。

エキソソームを含む細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間の連絡において重要な役割を果たす。細胞間の連絡について示唆される一般的なメカニズムは、おそらく微小環境においてであるが、可能性として少し離れてでも起こるであろう、エキソソームを通しての移動によるＲＮＡの送達に関係する。エキソソームは、多胞体の形質膜との融合に際して細胞外環境へ放出される、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞（４０〜１００ｎｍ）である。エキソソームは、細胞間の連絡の手段を提供し、ここで、一方の細胞は、微小環境におけるまたはある距離を置いた他方の細胞に影響を及ぼすことができるエキソソームを放出することができる。

エキソソームは、多くの細胞から放出され、それらの機能は、それらに細胞の特徴的な組成物を与える産生細胞についての細胞起源および状態に依存する。たとえば、酸化ストレスに曝露された細胞に起源を持つエキソソームは、ストレスに対する保護的なメッセージをレシピエント細胞に伝えることが示された。

しかしながら、ＥＶがレシピエント細胞の分化に影響を及ぼすかどうか、また、どのように影響を及ぼすのかは、ほとんど知られていない。

本発明の目的は、細胞、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくはヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化を誘発するおよび／または促進するための方法を提供することである。本発明はまた、骨再生を増加させ、かつインプラントの骨結合を支持するための、細胞外小胞の使用に関する。

第１の態様において、本発明は、標的幹細胞の骨形成分化を誘発するおよび／または促進するための方法において、
ａ．非標的細胞の細胞培養由来の条件培地または非標的細胞から単離された細胞外小胞を提供するステップと、
ｂ．培地または細胞外小胞を標的幹細胞に追加するステップと、を含む方法に関する。

第２の態様において、本発明は、標的幹細胞の骨形成分化において使用するための単離細胞外小胞に関する。

第３の態様において、本発明は、標的幹細胞の骨形成分化において使用するための、非標的細胞によって得られた細胞外小胞を含む培地に関する。

第４の態様において、本発明は、細胞外小胞に曝露されたコーティングを含むインプラント表面に関する。

第５の態様において、本発明は、エキソソームを産生することができる、固定され刺激された単球、マクロファージ、または間葉系幹細胞のコーティングを含むインプラント表面に関する。

第６の態様において、本発明は、患者を治療するための方法において、血液または組織サンプルを患者から収集するステップと、非標的細胞を単離するステップと、非標的細胞を培養し、かつ刺激するステップと、非標的細胞によって産生されたエキソソームを単離するステップと、エキソソームを患者に投与するステップと、を含む方法に関する。

第７の態様において、本発明は、骨損傷、骨粗しょう症、骨形成の治療のためのまたは骨修復における単離細胞外小胞の使用に関する。

第８の態様において、本発明は、骨損傷、骨空隙、骨粗しょう症、または骨形成の治療のための単離細胞外小胞を含む組成物に関する。

第９の態様において、本発明は、単離細胞外小胞を含む骨空隙充填剤に関する。

図１は、ヒト単球細胞系ＨＭＣ−１の条件培地から単離され、かつＣＤ６３に対して免疫金標識されたエキソソームの透過型電子顕微鏡観察写真を示す図である。 図２は、抗ＣＤ６３ラテックスビーズにコンジュゲートした単球由来エキソソームのフローサイトメトリー分析を示す図である。エキソソームは、テトラスパニンＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１（右のパネル）ならびにアイソタイプ一致コントロール（左のパネル）に対して免疫染色した。 図３は、単球エキソソームおよびそれらのドナー細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。 図４は、単球由来のエキソソームおよび細胞の全ＲＮＡおよび小型ＲＮＡの検出を示す図である。（ａ）単球エキソソームおよび細胞（ｂ）における全ＲＮＡならびにエキソソーム（ｃ）および細胞（ｄ）における小型ＲＮＡのヌクレオチドにおけるサイズ分布（ｎｔ）ならびに蛍光強度（ＦＵ）を明らかにする電気泳動図。 図５は、フローサイトメトリー分析（単球エキソソームと同様）を、間葉系幹細胞由来のエキソソームの検出に適用したことを示す図である。データは、間葉系幹細胞が、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１についてポジティブなエキソソームを放出することを示す。 図６は、ＭＳＣエキソソームのナノ粒子トラッキング分析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す図である。 図７は、ＣＤ６３に対して免疫金標識されたＭＳＣエキソソームの透過型電子顕微鏡観察写真を示す図である（バー２０ｎｍ）。 図８は、ＭＳＣ培養物から単離されたＭＳＣおよびエキソソームにおける全ＲＮＡのヌクレオチドにおけるサイズ分布（ｎｔ）および蛍光強度（ＦＵ）を明らかにする電気泳動図を示す図である。 図９は、ＭＳＣエキソソームの単球への移動を示す図である。ＭＳＣエキソソームを単離し、緑色蛍光色素（ＰＫＨ６７、ＳＩＧＭＡ）により標識し、培養物中の単球に追加した。標識小胞の取込みは、（ａ）フローサイトメーターおよび（ｂ）蛍光顕微鏡によって２４時間後に分析した。コントロール；ＰＫＨ６７染色ＰＢＳ。ＤＡＰＩは核染色に使用した。緑色の細胞は、緑色のエキソソームについてポジティブな単球であり、それらがエキソソームを取込んだまたはエキソソームがそれらの表面に付着したことを示す。 図１０は、図９と同様のＭＳＣエキソソームのＭＳＣへの移動を示す図である。ＭＳＣエキソソームを単離し、緑色蛍光色素（ＰＫＨ６７、ＳＩＧＭＡ）により標識し、ＭＳＣ培養物に追加した。取込みは、（ａ）フローサイトメーターおよび（ｂ）蛍光顕微鏡によって２４時間後に分析した。コントロール；ＰＫＨ６７染色ＰＢＳ。ＤＡＰＩは核染色に使用した。緑色の細胞は、緑色のエキソソームについてポジティブなＭＳＣであり、それらがエキソソームを取込んだまたはエキソソームがそれらの表面に付着したことを示す。 図１１は、ＬＰＳにより刺激した単球／マクロファージから放出されたエキソソームを単離し、緑色の蛍光色素（ＰＫＨ６７、ＳＩＧＭＡ）により標識し、培養中のＭＳＣに追加したことを示す図である。ＭＳＣを約７２時間、緑色のエキソソームの存在下において培養し、その後、細胞をフローサイトメーター（ａ）によって、蛍光顕微鏡（ｂ）において分析した。ＤＡＰＩは核染色に使用した。緑色の細胞は、緑色のエキソソームについてポジティブなＭＳＣであり、それらがエキソソームを取込んだまたはエキソソームがそれらの表面に付着したことを示す。単球／マクロファージ由来のエキソソームは、間葉系幹細胞に取込まれる／付着する。 図１２は、無条件コントロール培地（ｃｔｒｌ）において、単球条件培地（ＣＭ）において、またはエキソソームを補足した培地（ｅｘｏ）において、７２時間、培養したｈＭＳＣにおけるＲｕｎｘ２およびＢＭＰ−２の遺伝子発現を示す図である。

本発明において、用語「標的幹細胞」は、非標的細胞由来の条件培地または細胞外小胞によって骨形成分化が誘発される細胞を意味する。

用語「条件培地」は、培養細胞を除去した後に、細胞培養に使用される培地を意味する。

細胞へのシグナル伝達は、一般に、可溶性の形態でおよび／または細胞の形質膜であるもしくはマトリックス結合性である表面上に示される分子の効果と見なされる。本発明は、たとえばタンパク質、ｍＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを含有する、細胞由来の約２０〜４００ｎｍまたは５０〜２００ｎｍの細胞外小胞によって媒介される細胞間連絡に関する。小胞は、標的細胞に付着し、融合し、または標的細胞によって内部移行され、標的細胞において調節作用を及ぼす。この連絡は、幹細胞、とりわけヒト間葉系幹細胞などのような細胞の骨形成分化を誘発し得るおよび／または促進し得る。

本発明者らは、標的細胞の骨形成分化を誘発するおよび／または促進するための方法を開発した。方法は、非標的細胞の細胞培養物由来の条件培地または非標的細胞から放出された単離細胞外小胞を提供するステップを含む。一実施形態において、細胞外小胞が、エキソソームである。細胞外小胞は、前記小胞を放出させるために、任意選択での非標的細胞の刺激の間に、非標的細胞を培養することおよび条件培地または小胞の単離によって、提供される。非標的細胞は、様々な時間、たとえば１時間以上または１日以上または２日以上または３日以上、培養されてもよい。培地または小胞は、幹細胞であってもよい標的細胞に追加されてもよいまたはそれと接触させてもよい。次いで、小胞は、標的細胞によって取込まれまたはそれに付着し、骨形成分化を誘発するおよび／または促進する。

標的細胞は、任意の適した細胞型であってもよいが、細胞型はまた、前駆細胞もしくは幹細胞であってもよい。細胞は、たとえば、骨芽細胞、破骨細胞、肥満細胞、筋細胞、脂肪細胞、またはヒトＭＳＣなどのような間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であってもよい。

本発明者らの知る限りでは、骨形成分化を誘発するおよび／または促進するための、細胞外エキソソームまたは同様の特性を有する他の細胞外小胞を介しての、炎症細胞および間葉系幹細胞などのような標的細胞などのような細胞の間のクロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）について記載している刊行物はない。発明者らは、炎症細胞などのような細胞が、間葉系幹細胞などのような他の細胞にメッセージを送り、レシピエント細胞、たとえば幹細胞における骨分化遺伝子の発現の増加をもたらすことを発見した。これらのメッセージは、エキソソームおよび／または他の細胞外小胞である。

本発明による標的幹細胞の骨形成分化の誘発および／または促進は、本明細書において非標的細胞と呼ばれる、標的細胞以外の細胞を刺激することによって実行されてもよい。これらの刺激非標的細胞は、任意の適した細胞であってもよく、たとえば単球、マクロファージ、赤血球、破骨細胞、肥満細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、または任意の他の炎症細胞もしくは非炎症細胞および幹細胞、たとえば間葉系幹細胞とすることができる。好ましくは、非標的細胞は、単球、マクロファージ、または幹細胞であり、好ましい実施形態において、これらは、ヒト単球、マクロファージ、または幹細胞、たとえばｈＭＳＣである。方法は、インビボにおいてまたインビトロにおいて実行することができる。

理論によって拘束されないが、標的または非標的細胞の表現型は、骨形成分化の誘発および／または促進の成功において役割を果たし得る。異なる表現型を有する非標的細胞由来のＥＶがまた、異なる表現型および機能をも有することが知られている。さらに、標的細胞の表現型は、ＥＶが標的細胞に結合し、それらのメッセージを送達することができるかどうかおよびさらに、標的細胞を特異的な方向に向けることができるかどうかに影響を及ぼし得る。本発明の一実施形態において、非標的細胞が、自己由来または非自己由来のものである。他の実施形態において、標的細胞が、自己由来または非自己由来のものである。自己由来のものを使用することの有益性は、免疫応答が限られているということとなり得るが、健康な人または治療される疾患に罹患していない人由来の非自己由来の細胞は、再生または治癒プロセスに関しては、有益となり得る。

細胞は、様々な方法において、たとえば、リポ多糖（ＬＰＳ）、サイトカイン、ケモカイン、もしくは任意の他の刺激薬またはその組み合わせなどのような刺激剤の使用によって刺激することができる。刺激剤の量は、１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲、たとえば１ｎｇ／ｍｌ以上または５ｎｇ／ｍｌ以上または１０ｎｇ／ｍｌ以上または２０ｎｇ／ｍｌ以上または１００ｎｇ／ｍｌ以下または７０ｎｇ／ｍｌ以下または５０ｎｇ／ｍｌ以下または３０ｎｇ／ｍｌ以下であってもよい。一実施形態において、刺激剤の濃度範囲が、１〜２０ｎｇ／ｍｌであり、他の実施形態において、濃度が、５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、他の実施形態において、濃度が、５〜１５ｎｇ／ｍｌである。

理論によって拘束されないが、非標的細胞、とりわけ刺激非標的細胞は、細胞から放出された細胞膜の小さな嚢である分化刺激細胞外小胞、たとえばエキソソームを産生し、これは、標的幹細胞と接触した場合にまたはそれによって取込まれた場合に、骨形成分化を誘発すると考えられる。これらの小胞、骨形成分化を促進するおよび／または誘発する小胞は、非標的細胞、たとえば単球、マクロファージ、赤血球、破骨細胞、肥満細胞、脂肪細胞、および幹細胞、たとえば間葉系幹細胞のいずれか由来の条件培地から単離することができる。小胞は、増殖因子などのような他の生体分子と混合することができる。細胞外小胞のサイズは、２０〜４００ｎｍの範囲、たとえば２０ｎｍ以上または５０ｎｍ以上または８０ｎｍ以上または１００ｎｍ以上または４００ｎｍ以下または３００ｎｍ以下または２５０ｎｍ以下または２００ｎｍ以下または１５０ｎｍ以下であってもよい。図１は、条件培地から単離されたエキソソームを明らかにする。

一実施形態において、単離ＥＶが、２つ以上の異なる細胞型から放出されたＥＶの組み合わせである。他の実施形態において、単離ＥＶが、２つ以上の異なるタイプの刺激剤を使用して刺激された細胞から放出されたＥＶの組み合わせである。他の実施形態において、単離ＥＶが、２つ以上の異なる細胞型から放出されたＥＶの組み合わせであり、それぞれの細胞型が、少なくとも１つの異なるタイプの刺激剤を使用して刺激される。

分化を担うサイトカイン、増殖因子、もしくは他のシグナル物質または物質の組み合わせは、まだ完全には決定されていない。サイトカイン、増殖因子、および他のシグナル物質はまた、たとえば特異的な表現型および／または機能を有する細胞外小胞を放出するように、非標的性細胞を刺激するために使用されてもよい。他のシグナル物質は、たとえばホルモンとすることができる。可能性のあるサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、Ｉｌ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、もしくはＩＦＮ型またはその組み合わせである。可能性のある増殖因子は、ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、もしくはＦＧＦまたはその組み合わせである。ケモカインの例は、ＣＣＬ ２、ＣＣＬ ３、ＣＣＬ ５、ＣＣＬ ７、ＣＣＬ ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ １３、ＣＣＬ １７、ＣＣＬ ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、またはその組み合わせなどのような、型ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣのいずれか１つとなるであろう。他のシグナル物質は、たとえばホルモンとすることができる。

小胞は、他のタンパク質、増殖因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、もしくはＦＧＦまたはその組み合わせ）、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは他の小さな調節性ＲＮＡなどのような他の物質を含む。

一実施形態において、非標的性細胞が、リポ多糖（ＬＰＳ）、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、もしくはＦＧＦまたはその組み合わせ）、または任意の他の刺激薬またはその組み合わせを使用して、タンパク質、増殖因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、もしくはＦＧＦまたはその組み合わせ）、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは他の小さな調節性ＲＮＡまたはその組み合わせを含有する細胞外小胞を放出するように、刺激される。

他の実施形態において、非標的性細胞が、リポ多糖（ＬＰＳ）、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、もしくはＦＧＦまたはその組み合わせ）、または任意の他の刺激薬またはその組み合わせを使用して、タンパク質、増殖因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、もしくはＦＧＦまたはその組み合わせ）、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは他の小さな調節性ＲＮＡまたはその組み合わせを含有する細胞外小胞を放出するように、刺激される。次いで、これらの小胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、もしくは任意の他の刺激薬またはその組み合わせと組み合わせて、標的細胞に追加されるまたはそれと接触させられる。

本発明者らは、ＭＳＣおよび単球の両方が、ＲＮＡを含有する細胞外小胞を放出することを示し、図１〜８、また、本発明者らはまた、標的ＭＳＣが、放出された細胞外小胞を取込むことをも示した、図９〜１０。本発明者らはまた、ＲＵＮＸ２およびＢＭＰ−２の遺伝子発現の増加によって例証されるように、ｈＭＳＣを本発明に従って処理した場合に、骨形成分化が促進されたことをも示した（図１２）。

細胞外小胞は、ＰＢＳバッファーまたは任意の他の食塩水バッファーまたは任意の他の培地などのような細胞培養培地（または調整培地）と混合することができる。培地は、２つ以上のタイプの非標的細胞、たとえば２つ、３つ、または４つの細胞型由来の小胞を含有してもよい。たとえば、培地は、単球およびｈＭＳＣまたは単球、ｈＭＳＣ、およびマクロファージ由来の小胞の混合物を含有してもよい。細胞外小胞は、インビトロおよびインビボの両方において、標的細胞に提供されてもよい。

非標的の細胞培養由来の条件培地または単離細胞外小胞は、骨再生が必要とされる部位に追加することができる。条件培地または小胞はまた、標的細胞と一緒に送達することもできる。標的細胞が位置する部位に培地または小胞を送達することによって、骨形成分化が誘発されるであろう。送達は、送達ビヒクルの注射によってまたは移植を通して行うことができる。エキソソームなどのような細胞外小胞は、たとえば合成のリポソームと比較して、中程度の免疫応答しか引き起こさないまたは免疫応答を全く引き起こさないという有益性を有する。

細胞外小胞は、骨形成分化を誘発するおよび／または促進するのに十分な量で、標的細胞に追加されるまたはそれと接触させられる。

さらに、小胞は、表面上に、たとえばインプラント表面上に小胞をコーティングするもしくは固定することによってまたは薬剤送達系の一部として、幹細胞に提供されてもよい。インプラント表面は、チタンもしくは酸化チタンなどのような金属表面またはリン酸カルシウム表面などのようなセラミック表面とすることができる。薬剤送達系は、たとえば、小胞をゆっくり放出するヒドロゲルまたは生分解性物質とすることができる。ヒドロゲルは、たとえばヒアルロン酸またはキトサンまたはポリビニルアルコールまたはその組み合わせとすることができる。他の実施形態において、インプラント表面が、細胞外小胞のインビボにおける放出のために、細胞でコーティングされるまたは固定される。たとえば、表面は、インプラントの部位で骨形成分化を誘発するおよび／または促進するために、数が増加したエキソソームを放出するであろう刺激単球、マクロファージ、または間葉系幹細胞でコーティングされてもよいまたは固定されてもよい。

本発明による方法はまた、患者を治療するために使用されてもよい。方法は、
−ヒト、たとえば患者彼自身から、任意の利用可能な適した技術を使用して、血液または組織サンプルを収集するステップと、
−促進するおよび／または誘発する細胞外小胞を産生するために、非標的細胞を単離し、細胞を培養し、任意選択で、非標的細胞を刺激するステップと、
−非標的細胞によって産生された前記細胞外小胞を単離するステップと、
−細胞外小胞を患者に投与するステップと、を含む。

投与は、全身的にまたは局所的に、任意の適した技術によって、たとえば注射器によって、骨形成分化が必要とされるまたは求められる位置に対して実行されてもよい。

本発明は、骨手術、インプラント手術、骨治癒治療、または骨もしくは歯の修復治療の間の補足の治療として使用することができる。単離細胞外小胞は、歯などのような歯科用の適用のためのインプラント、股関節または膝または任意の他の骨インプラントなどのような、様々な足場およびインプラント上に固定することができる。小胞はまた、ねじまたは修復プレートなどのような骨修復インプラント上に固定することもできる。さらに、本発明は、骨空隙充填物質、骨増殖体、頭蓋骨癒合症、変形性関節症、様々な骨炎疾患、大理石骨病、骨減少症、骨粗しょう症、または骨形成などのような、様々な骨関連性の疾患および損傷を治療するために使用することができる。

実施例１
プロセスについての一般的な説明
単球の単離および培養：単球は、磁気分離を使用してヒト血液から単離し、異なるバイオマテリアル上で、刺激（たとえばＬＰＳ）ありまたはなしで培養する。間葉系幹細胞は、勾配分離によってヒト骨髄から得る。７２時間後、細胞を収集し、エキソソームを条件培地から単離する。

エキソソーム単離および検出：エキソソームは、繰り返しの遠心分離およびろ過のステップに基づく方法を使用して、細胞デブリ、アポトーシス小体などを除去し、その後、超遠心分離を使用して、エキソソームをペレットにして、単離する。代替の単離方法もまた、使用されてもよい。エキソソームは、電子顕微鏡観察ならびにフローサイトメトリーおよびウェスタンブロットを使用する、エキソソーム上でよく見つけられる多くのマーカー（たとえばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、Ｔｓｇ１０１）およびエキソソームに不在であるはずである多くのマーカー（カルネキシン）についての検出を含む方法の組み合わせを使用して検出する。

エキソソームのｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの含有量：マイクロアレイは、ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの含有量を評価するために、異なる刺激に曝露された単球およびＭＳＣ由来のエキソソームに対して実行する。

取込み実験：単離エキソソームに蛍光色素を標識し、培養中のＭＳＣに追加し、取込みを、様々な時点の後に、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーを使用して分析した。

骨形成の評価：組織学的染色（フォン コッサ）および骨形成についてのマーカー（オステオカルシン、ｒｕｎｘ２、コラーゲンＩ型）をＲＴ−ＰＣＲを使用して評価する。

材料＆方法
ヒト単球は、磁気分離によってバフィーコートから得た（純度９０〜９５％、ｎ＝４）。単球をＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）により７２時間処理し、条件培地（ＣＭ）を収集した。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養し、条件培地を収集した。エキソソームを繰り返しの遠心分離およびろ過のステップによってＣＭから単離し、フローサイトメトリーを使用して検出した。フローサイトメトリー分析については、エキソソームを抗ＣＤ６３ラテックスビーズにコンジュゲートし、テトラスパニンＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１に対して免疫染色した。エキソソームはまた、透過型電子顕微鏡観察およびナノ粒子トラッキング分析を使用して視覚化した。様々なタイプの小胞およびそれらのドナー細胞由来のＲＮＡを抽出し、サイズ分布パターンをバイオアナライザーを使用して分析した。ｈＭＳＣは、単球エキソソームを補足した培地、ＣＭ、またはコントロール培地において７２時間、培養した。骨形成分化を、リアルタイムＰＣＲ分析を使用して評価した（Ｒｕｎｘ２、ＢＭＰ−２、ｎ＝４）。標的遺伝子発現の相対的な定量化について、ｄｄ−Ｃｔ法によって計算した。別々の実験において、ヒト単球またはｈＭＳＣを、ＰＫＨ６７染色小胞を補足した培地において培養し、取込みを、フローサイトメトリーおよび顕微鏡観察を使用して検査した。

結果
フローサイトメトリー分析は、ＬＰＳ刺激単球およびＭＳＣが、エキソソーム検出のためによく使用されるマーカーであるテトラスパニンＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１についてポジティブなエキソソームを放出することを明らかにした。図２および５を参照されたい。

図１１は、単球／マクロファージ由来のエキソソームが、間葉系幹細胞に取込まれる／付着することを明らかにする。緑色ＰＫＨ６７染色エキソソームの存在下において培養したＭＳＣは、ネガティブコントロールと比較して、ＦＬ−１においてポジティブであり、エキソソームがＭＳＣに付着するもしくはそれと融合するまたはＭＳＣによって内部移行されることを示す。さらに、ＰＫＨ６７標識緑色ＭＳＣエキソソームを補足した培地におけるｈＭＳＣの培養は、ＭＳＣが緑色色素についてポジティブであることを示し、ＭＳＣがエキソソームを介して他のＭＳＣと連絡することを示唆する。図１０を参照されたい。そのうえ、緑色ＭＳＣエキソソームとの単球の培養はまた、単球の一部分が緑色エキソソームを取込んだまたは内部移行したことをも明らかにした。図９を参照されたい。

単球ＣＭまたはＣＭから単離した純粋なエキソソームを補足した培地における７２時間のｈＭＳＣの培養は、Ｒｕｎｘ２（それぞれ１．７±０．３および１．４±０．２倍の変化）ならびにＢＭＰ−２（それぞれ１５．４±１．７および２．３±０．３倍の変化）の発現レベルの有意な増加をコントロール培地と比較してもたらした。図１２を参照されたい。

結果は、ＬＰＳ刺激ヒト単球が、間葉系幹細胞の骨形成分化を増強する因子を放出することおよびこの効果の少なくとも一部がエキソソームを介しての連絡によるものであることを実証する。

実施例２
ヒト初代ＬＰＳ刺激単球。エキソソームを３日間の培養の後に単離し、ＲＮＡを抽出した。細胞およびエキソソームの全ＲＮＡおよび小型ＲＮＡのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析を実行した。電気泳動図、図４は、（ａ）エキソソームおよび細胞（ｂ）における全ＲＮＡならびにエキソソーム（ｃ）および細胞（ｄ）における小型ＲＮＡのヌクレオチドにおけるサイズ分布（ｎｔ）ならびに蛍光強度（ＦＵ）を示す。

Claims (20)

1. 標的細胞の骨形成分化を誘発するおよび／または促進するための方法において、
   ａ．非標的細胞から放出された、骨形成分化を誘発するおよび／または促進する単離細胞外小胞を提供するステップと、
   ｂ．前記細胞外小胞を前記標的細胞に追加するステップと、を含むことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記非標的細胞が、刺激単球、マクロファージ、もしくは間葉系幹細胞または他の炎症細胞もしくは非炎症細胞であることを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法において、前記非標的細胞が、リポ多糖、サイトカイン、ケモカイン、または任意の他の刺激薬により刺激されることを特徴とする方法。
4. 請求項２に記載の方法において、前記非標的細胞が、間葉系幹細胞の骨形成分化を促進するおよび／または誘発する細胞外小胞を放出するように、任意の他の方法によって刺激されるまたは修飾されることを特徴とする方法。
5. 請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法において、前記細胞外小胞が、単球から放出されることを特徴とする方法。
6. 請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法において、提供される前記小胞が、２つ以上の異なるタイプの細胞から放出された小胞の組み合わせであるまたは２つ以上の異なるタイプの刺激剤を使用して刺激された細胞から放出された小胞の組み合わせであるまたは２つ以上の異なる細胞型から放出されたＥＶの組み合わせであって、それぞれの細胞型が、少なくとも１つの異なるタイプの刺激剤を使用して刺激される、ＥＶの組み合わせであることを特徴とする方法。
7. 請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法において、前記細胞外小胞が、エキソソームであることを特徴とする方法。
8. 標的細胞の骨形成分化のための、非標的細胞由来の、単離された、骨形成分化を促進するおよび／または誘発する細胞外小胞の使用。
9. 請求項８に記載の小胞において、前記非標的細胞が、刺激単球、マクロファージ、もしくは間葉系幹細胞または他の炎症細胞もしくは非炎症細胞であることを特徴とする小胞。
10. 請求項９に記載の小胞において、前記非標的細胞が、リポ多糖、サイトカイン、ケモカイン、または任意の他の刺激薬により刺激されることを特徴とする小胞。
11. 請求項８乃至１０の何れか一項に記載の小胞において、前記小胞が、エキソソームであることを特徴とする小胞。
12. 請求項８乃至１１の何れか一項に記載の小胞において、前記小胞が、培地中に懸濁されることを特徴とする小胞。
13. 骨形成分化を誘発するおよび／または促進する細胞外小胞に曝露されたコーティングを含むことを特徴とするインプラント。
14. 骨形成分化を誘発するおよび／または促進する細胞外小胞を産生することができる、固定され刺激された単球、マクロファージ、または間葉系幹細胞のコーティングを含むことを特徴とするインプラント。
15. 請求項１３または１４に記載のインプラントにおいて、前記インプラントが、歯科用の適用、股関節、膝、ねじ、または修復プレートのためのインプラントであることを特徴とするインプラント。
16. 請求項８乃至１２の何れか一項に記載の使用において、損傷、骨粗しょう症、骨形成の治療のためのまたは骨修復におけることを特徴とする使用。
17. 骨損傷、骨空隙充填物質、骨増殖体、頭蓋骨癒合症、変形性関節症、様々な骨炎疾患、骨粗しょう症、または骨形成の治療のための、単離された、骨形成分化を促進するおよび／または誘発する細胞外小胞を含むことを特徴とする組成物。
18. 単離された、骨形成分化を促進するおよび／または誘発する細胞外小胞を含むことを特徴とする骨空隙充填剤。
19. 請求項１８に記載の骨空隙充填剤において、標的性幹細胞をさらに含むことを特徴とする骨空隙充填剤。
20. 患者を治療するための方法において、血液または組織サンプルを前記患者から収集するステップと、非標的細胞を単離するステップと、前記非標的細胞を培養し、かつ刺激するステップと、前記非標的細胞によって産生された細胞外小胞を単離するステップと、前記細胞外小胞を前記患者に投与するステップと、を含むことを特徴とする方法。
    
    
    

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