JP2015520375A - 薬物誘発毒性マーカーを同定するための照合による細胞に基づくアッセイ - Google Patents

薬物誘発毒性マーカーを同定するための照合による細胞に基づくアッセイ Download PDF

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Abstract

本明細書には、モデル組み立てにより薬物誘発毒性条件、例えば心臓毒性を解析するための発見プラットフォーム技術が記載されている。【選択図】図７

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年5月22日出願の米国特許仮出願第61/650462号の優先権を主張するものであり、この全内容が本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は、薬物誘発毒性マーカーを同定するための、照合による細胞に基づくアッセイに関する。
製薬産業は現在、臨床開発を開始している潜在的な化合物の90％の欠落に直面しており、そのうち30％は臨床安全性が低いことに起因している（Kola et al.(2004) Nat Rev Drug Discovery:3 711-715）。U.S.では、致命的な有害薬物反応（ADRs）が死亡の4番目から6番目の主要因となっている。ADRsに直接起因するコストは、U.S.において1年当たりの直接的な病院コストにおいてさらなる15.6億から40億ドルを生じうる（Lazarou J et al.(1998) JAMA; 279(15):1200-1225）。薬物発見及び開発のコストは、部分的には臨床開発の後期における化合物及びNMEの欠落の増大のために、約10億ドルにまで増加している（Adams CP, Brantner VV (2010) “Spending on New Drug Development” Health Econ. 19: 130-141）。薬物開発の早期における毒性の予測を補助することができる信頼性のあるツールの欠如に、部分的には、コストの増大と投資に対する低いリターンの原因がある。さらに、薬物の安全性の問題は、製薬産業における訴訟及び和解の増加の主な要因である。2009年1月から2011年5月の間に、産業は、薬物の安全性の問題に関連する訴訟事例に対して80億USドル以上を費やしている。
初期臨床試験及び薬物開発において化合物の「初期ポリシーの停止（kill early policy）」を高めるため、FDAは現在、製薬産業及び団体に非常に革新的な戦略を採用するように奨励している。FDAの白書「Innovation or Stagnation: Challenges and Opportunity on the Critical Path to New Medical Projects」では、「強力な新規化学的・技術的方法を含む新しい製品開発ツールキット、例えば動物又はコンピュータ支援予測モデル、安全性及び有効性のためのバイオマーカー、並びに新規な臨床評価技法が、実験室コンセプトから市販製品までのクリティカルパスに沿って予測性及び効率性を改善するために緊急に必要とされている。」と記載されている（FDA, 2005）。FDAの宣誓は、薬物開発における効率的な意思決定を補助することができる革新的な技術の欠如を明らかに強調している。
心臓毒性とは、治療用分子によって誘発される心臓機能に対する広範な有害作用を意味する。心臓毒性は、前臨床研究の初期に出現することもあるし、又は臨床状況の後期に明らかになることもある。これは投薬中止の主な原因となっており、1994年までの全投薬中止の45％以上を占め、これが薬物開発の顕著な財政負担となっている。心血管系毒性には、限定されるものではないが、QT時間延長、不整脈、心筋虚血、高血圧及び血栓塞栓性合併症、並びに心筋機能障害が含まれる。
FDAにより現在使用されている心臓安全性バイオマーカーは、QTc延長−電気生理学的不整脈、循環トロポニンc、心拍、血圧、脂質、トロポニン、C反応性タンパク質（CRP）、脳性又はB型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、ex vivo血小板凝集、及びイメージングバイオマーカー（心臓磁気共鳴映像法）である。QTc延長は、非常に強力であるが複雑なマーカーである。しかしながら、初期開発において薬物をやめるか又は維持するかどうかをQTcのみに基づいて決定することは難しい。さらに、QTcは、主観的であり、頻脈性不整脈に至る可能性がある基礎病理に依存している。
以上を考慮すると、当技術分野では、新規な心臓安全性バイオマーカー、例えば分子心臓安全性バイオマーカーが必要とされていることが明らかである。
本明細書に記載するプラットフォーム技術は、薬物誘発毒性と関連するマーカーの同定に有用である。このプラットフォーム技術は、初代ヒト細胞に基づくモデルから開始してヒト臨床サンプルまでの階層内の及びそれを横断した分子相互作用を統合する。このアプローチにより、潜在的な薬物であるNME（フェーズI臨床試験を開始する準備を行っている薬物候補物質など）又は化合物により引き起こされる基礎的な毒性を反映するバイオマーカーの同定に至る。薬物誘発毒性としては、心臓毒性、腎臓毒性、肝毒性及び他の組織毒性が含まれる。本出願は、薬物誘発毒性に関連するいくつかの新規バイオマーカーを提供し、これは、分子又は薬物候補物質の潜在的な毒性を予測する方法において、及び薬物誘発毒性を処置、予防又は対抗するための潜在的な治療標的として、有用である。
本明細書に記載されている本発明は、少なくとも一部には、ネットワーク生物学、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクス及びバイオインフォマティクスのツール並びに方法論の新規協調的利用に基づいており、これらを組み合わせ、薬物誘発毒性と関連する又はその原因となる分子機構への見解を得ることなど、いずれかの対象の生物学的システムの研究に用いることができる。プラットフォーム技術は、国際PCT出願PCT/US2012/027615（その全内容を明示的に本明細書に組み入れる）にさらに記載されている。プラットフォーム技術のさらなる実施形態、例えば酵素（例としてキナーゼ）活性データの組み込みを含むプラットフォーム技術方法を実施する方法の説明は、2012年9日7日出願のU.S.出願第13/607,587号に記載されている（参照によりその全内容を明示的に本明細書に組み入れる）。第1のステップにおいて、薬物誘発毒性、例えば心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性を探索するために、細胞モデル系を開発する。薬物誘発毒性をモデリングする細胞系は、種々の関連する環境刺激（例えば、高血糖、低酸素、免疫ストレス（immuno-stress）及び脂質過酸化、又は試験分子若しくは薬物候補物質への暴露）に供した毒性関連細胞を含みうる。一部の実施形態において、細胞モデリング系は、特定の薬物誘発毒性に関連する様々な相互作用する細胞型（心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞又は筋芽細胞など）間の細胞クロストーク機序を含む。細胞モデル系からのハイスループット生物学的読み出し情報は、例えば、最先端の質量分析（LC/MSMS）、フローサイトメトリー、細胞に基づくアッセイ及び機能アッセイを包含する技法の組み合わせを用いることにより得られる。続いて、ハイスループット生物学的読み出し情報をバイオインフォマティクス解析に供して、in vitro、in vivo及びin silicoモデリングにより一致したデータ傾向を試験する。得られたマトリクスは、相互関連（cross-related）データマイニングを可能にし、そこで、線形及び非線形回帰解析が開発されて、最終的な圧点（pressure point）（又は「ハブ」）に到達する。本明細書に提示されるこのような「ハブ」は、薬物発見のための候補である。特に、このようなハブは、薬物誘発毒性の軽減若しくは緩和のための潜在的な薬物標的、及び/又は薬物誘発毒性マーカーを表す。
差次の分子サインは、薬物誘発毒性をもたらす組織微小環境における変更を指示する機序に関する洞察を可能にする。総合すると、上記技術プラットフォームと戦略的細胞モデリングとの組み合わせにより、薬物誘発毒性作用を生じるリスクのある薬物候補、並びに薬物誘発毒性を軽減又は緩和しうる薬物標的の早期同定を可能にするバイオマーカーライブラリーを構築する一方で、薬物誘発毒性、例えば心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性に寄与する発症機序及び分子ドライバーの理解のさらなる確立に用いることのできる強固な知能が可能となる。
本発明のプラットフォームの顕著な特色は、AIに基づくシステムが、薬物誘発毒性に関して公知の生物学的関係性等、当該技術分野におけるいかなる既存の知識にも頼る又は考慮することなく（すなわち、いかなるデータ点も人為的ではない）、薬物誘発毒性細胞モデル系から得られるデータセットに基づくことである。従って、プラットフォームから作成された、得られた統計モデルは先入観のないものである（公正である）。本発明のプラットフォーム及びその構成要素、例えば、細胞モデル系及びそれから得られるデータセットの別の顕著な特色は、薬物誘発毒性の細胞モデルから作成された初期の「第1世代」コンセンサス因果関係ネットワークが、細胞モデルそれ自体の進化に沿って複数世代の因果関係ネットワーク（及びそれから得られるデルタ又はデルタ-デルタネットワーク）へと進化することができるような、薬物誘発毒性細胞モデルにおける経時的な連続的組み立て（例えば、新たな細胞及び/又は条件の導入による）を可能にすることである。このようにして、薬物誘発毒性細胞モデル、薬物誘発毒性細胞モデルから得られたデータセット及びプラットフォーム技術（Platform Technology）方法を用いて薬物誘発毒性細胞モデルから作成された因果関係ネットワークは共に、絶えず進化し、プラットフォーム技術から得られた以前の知識の上に組み立てることができる。
本発明は、薬物誘発心臓毒性に関連する新規のバイオマーカーの同定に、少なくとも部分的に基づく。本発明は更に、コエンザイムQ10が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防することが可能であるという発見にも、少なくとも部分的に基づく。
したがって、本発明は、心臓毒性を引き起こすか又はこれを引き起こす危険性がある薬剤（作用物質）を同定する方法を提供する。一実施形態において、薬剤は、薬物又は薬物候補物質である。一実施形態において、毒性は、薬物誘発毒性、例えば心臓毒性である。一実施形態において、薬剤は、糖尿病、肥満、心血管系疾患、癌、神経障害、又は炎症性障害を処置するための薬物又は薬物候補物質である。これらの方法では、1対のサンプル（薬物処置に供されていない第1のサンプル、及び薬物処置に供された第2のサンプル）中の1種以上のバイオマーカー/タンパク質の量を評価する。第1のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較して、第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーのレベル、発現レベル又は活性のモジュレーションは、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又は引き起こす危険性があることの指標である。一実施形態において、1種以上のバイオマーカーは、表2に列挙したマーカーから選択される。本発明の方法を、当業者により用いられる他の任意の方法と一緒に実施して、薬物誘発心臓毒性を引き起こす危険性のある薬物を同定することができる。
一実施形態において、本発明の方法において使用することができる薬物としては、限定されるものではないが、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、及びTNFアンタゴニストが挙げられる。
したがって、一態様において、本発明は、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性がある薬物を同定する方法であって、（i）薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現レベルを、（ii）薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーが、表2に列挙したマーカーから選択され、第1のサンプルと比較した、第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルのモジュレーションは、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である方法を提供する。
一実施形態において、細胞は、心血管系の細胞、例えば、心筋細胞である。一実施形態において、細胞は、糖尿病性心筋細胞である。一実施形態において、薬物は、糖尿病、肥満、心血管系疾患、癌、神経障害、又は炎症性障害を処置するための薬物又は薬物候補物質である。一実施形態において、薬物は、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、及びTNFアンタゴニストのいずれか1つである。
一実施形態において、第2のサンプル中の表2に列挙したマーカーから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上のバイオマーカの発現レベルの、第1のサンプルと比較したモジュレーション（例えば、上昇又は低下）は、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である。
一実施形態において、第2のサンプル中のTIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルの発現レベルの、第1のサンプルと比較したモジュレーション（例えば、上昇又は低下）は、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である。
本発明ではまた、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうるレスキュー薬を同定する方法も提供される。これらの方法では、3つのサンプル（薬物処置に付されていない第1のサンプル、薬物処置に付された第2のサンプル、並びに薬物処置及び薬剤処置のいずれにもかけられた第3のサンプル）中の1種以上のバイオマーカーの量を評価する。薬物により処置された第2のサンプル中の発現の変化を示す、第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルの、第1のサンプル中の発現レベルと比較して正常化されたレベルから、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標となる。一実施形態において、1種以上のバイオマーカーは、表2に列挙したマーカーから選択される。
本明細書に記載された方法を用いて、種々の分子、特に細胞膜を横切ることができるのに十分に小さい分子を含む細胞を、例えば本発明のマーカーの発現及び/又は活性をモジュレートする（例えば上昇又は下降させる）分子を同定するために、スクリーニングすることができる。このようにして同定された化合物は、対象に提供され、対象における薬物誘発毒性を軽減、緩和又は予防することができる。
したがって、別の態様では、本発明は、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうるレスキュー薬を同定する方法であって、（i）心臓毒性誘発薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現の正常レベルを決定するステップと；（ii）心臓毒性誘発薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現の処置レベルを決定して、処置細胞サンプルにおける発現の変化を有する1種以上のバイオマーカーを同定するステップ；（iii）心臓毒性誘発薬物及びレスキュー薬による処置の後で得られる第3の細胞サンプル中に存在する、心臓毒性誘発薬物で処置したサンプルにおいて発現レベルが変化した1種以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップ；並びに（iv）第3のサンプル中で決定した1種以上のバイオマーカーの発現レベルを、第1のサンプル中に存在する1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーは、表2に列挙したマーカーから選択され、第1のサンプルと比較して第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの正常化された発現レベルは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標となる方法を提供する。
一実施形態において、細胞は、心血管系の細胞、例えば、心筋細胞である。一実施形態において、細胞は、糖尿病性心筋細胞である。一実施形態において、薬物は、糖尿病、肥満、心血管系疾患、癌、神経障害、又は炎症性障害を処置するための薬物又は薬物候補物質である。一実施形態において、薬物は、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、及びTNFアンタゴニストのいずれか1種である。一実施形態において、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中の表2に列挙したマーカーから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上のバイオマーカーの発現のほぼ同じレベルは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標である。
一実施形態において、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中のTIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルの正常化された発現レベルは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標である。
本発明はさらに、その必要がある対象において薬物誘発心臓毒性を緩和、軽減又は予防する方法であって、対象（例えば、哺乳動物、ヒト、又は非ヒト動物）に、本明細書で提供されるスクリーニング方法により同定される薬剤（作用物質）を投与することを含み、それにより対象において薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防する方法を提供する。一実施形態において、薬剤は、心臓毒性誘発薬物で既に処置された対象に投与される。一実施形態において、薬剤は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置と同時に対象に投与される。一実施形態において、薬剤は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置の前に対象に投与される。
本発明はさらに、その必要がある対象において薬物誘発心臓毒性を緩和、軽減又は予防する方法であって、対象（例えば、哺乳動物、ヒト、又は非ヒト動物）にコエンザイムQ10を投与することを含み、それにより対象において薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防する方法を提供する。一実施形態において、コエンザイムQ10は、心臓毒性誘発薬物で既に処置された対象に投与される。一実施形態において、コエンザイムQ10は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置と同時に対象に投与される。一実施形態において、コエンザイムQ10は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置の前に対象に投与される。一実施形態において、薬物誘発心臓毒性は、表2に列挙されたマーカーから選択される、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上のバイオマーカーの発現のモジュレーションと関連している。前出のリスト中に提示した全ての値はまた、前出の遺伝子（又はタンパク質）のうちの、本発明の一部であることを意図する範囲、例えば、1〜5、1〜10、2〜5、2〜10、又は5〜10の間の範囲の上限又は下限でもありうる。
一実施形態において、薬物誘発心臓毒性は、心筋症、心不全、心房細動、心筋症及び心不全、心不全及びLV（左心室）機能不全、心房粗動及び細動、又は心臓弁障害及び心不全である。
本発明はさらに、薬物誘発心臓毒性に関する予測マーカーとして有用なバイオマーカー（例えば遺伝子及び/又はタンパク質）を提供する。これらのバイオマーカーとしては、表2に列挙されたマーカーが含まれる。
一実施形態において、薬物誘発心臓毒性は、TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルのモジュレーションと関連している。
一実施形態において、薬物誘発心臓毒性の予測マーカーは、TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルである。
しかし、当業者は、本明細書で記載される方法を使用することにより、例えば、実施例3で記載する方法を実施することによってであるが、心臓毒性を誘導することが公知である異なる薬物を使用することにより、薬物誘発心臓毒性を予測するさらなるバイオマーカーを同定することが可能であろう。下記では、本発明の例示的な薬物誘発心臓毒性のバイオマーカーについて更に記載する。
一態様において、本発明は、薬物誘発毒性のモジュレーターを同定する方法であって、（1）薬物誘発毒性の特徴的な側面を表すために、薬物誘発毒性に関連する細胞を用いて薬物誘発毒性のモデルを確立するステップ、（2）上記薬物誘発毒性のモデルから第1のデータセットを取得するステップであって、第1のデータセットが、薬物誘発毒性に関連する細胞に特徴的なゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス（metabolomic）、トランスクリプトミクス（transcriptomic）、及び一塩基多型（SNP）データのうち1種以上を表す、上記ステップ、（3）上記薬物誘発毒性のモデルから第2のデータセットを取得するステップであって、第2のデータセットが、薬物誘発毒性に関連する細胞の機能活性又は細胞応答を表す、上記ステップ、（4）第1のデータセット及び第2のデータセットのみに基づき、プログラムされた計算装置を用いて、ゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、及び一塩基多型（SNP）データのうち1種以上の発現レベル、並びに機能活性又は細胞応答の間でコンセンサス因果関係ネットワークを作成するステップであって、コンセンサス因果関係ネットワークの作成が、第1のデータセット及び第2のデータセット以外のいかなる公知の生物学的関係性にも基づくものではない、上記ステップ、（5）上記コンセンサス因果関係ネットワークから、薬物誘発毒性に特有の因果関係を同定するステップであって、特有の因果関係に関連する遺伝子、脂質、タンパク質、代謝物、転写物又はSNPが、薬物誘発毒性のモジュレーターとして同定される、上記ステップを含む方法を提供する。
特定の実施形態において、モジュレーターは、薬物誘発毒性を刺激又は促進する。
特定の実施形態において、モジュレーターは、薬物誘発毒性を阻害（抑制）する。
特定の実施形態において、薬物誘発毒性のモデルは、薬物誘発毒性に関連する細胞のin vitro培養物を含み、場合により対照細胞の適合するin vitro培養物を更に含む。
特定の実施形態において、細胞のin vitro培養物は、環境変動に付され、適合する対照細胞のin vitro培養物は、環境変動に付されない同一細胞である。
特定の実施形態において、環境変動は、薬剤（作用物）との接触、培養条件の変化、遺伝的改変/突然変異の導入、及び遺伝的改変/突然変異を引き起こす媒体（例えばベクター）のうち1種以上を含む。
特定の実施形態において、第1のデータセットは、複数の遺伝子のタンパク質及び／又はmRNA発現レベルを含む。
特定の実施形態において、第1のデータセットは、ゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス（metabolomic）、トランスクリプトミクス（transcriptomic）、及び一塩基多型（SNP）データのうち2種以上を更に含む。特定の実施形態において、第1のデータセットは、ゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、及び一塩基多型（SNP）データのうち3種以上を更に含む。
特定の実施形態において、細胞の機能活性又は細胞応答を表す第2のデータセットは、生体エネルギー（bioenergetics）、細胞増殖、アポトーシス、オルガネラ機能、並びにATP、ROS、OXPHOS及びSeahorseアッセイから選択される機能モデルによって実現化される遺伝子型-表現型関連、網羅的酵素活性、並びに薬物誘発毒性に関連する細胞の酵素代謝基質に対する網羅的酵素活性の影響、のうち1種以上を含む。一実施形態において、網羅的酵素活性は、網羅的キナーゼ活性である。一実施形態において、酵素代謝基質に対する網羅的酵素活性の影響は、細胞のリン酸化プロテオーム（phospho proteome）である。
特定の実施形態において、ステップ（4）は、人工知能（AI）に基づくインフォマティクスプラットフォームにより行われる。
特定の実施形態において、AIに基づくインフォマティクスプラットフォームは、REFS(商標)を含む。
特定の実施形態において、AIに基づくインフォマティクスプラットフォームは、統計的カットオフポイントを適用せずに、第1のデータセット及び第2のデータセットからのあらゆるデータ入力を受け取る。
特定の実施形態において、ステップ（4）において確立されたコンセンサス因果関係ネットワークは、入力データに基づくin silicoシミュレーションにより、ステップ（5）の前にシミュレーション因果関係ネットワークへと更に精緻化されて、コンセンサス因果関係ネットワーク内の1種以上の因果関係のための予測の信頼レベルをもたらす。
特定の実施形態において、特有の因果関係は、細胞において特有に存在し、適合する対照細胞において存在しない差次的因果関係ネットワークの一部として同定される。
一実施形態において、同定される特有の因果関係は、遺伝子の発現と脂質のレベル；遺伝子の発現と転写物のレベル；遺伝子の発現と代謝物のレベル；第1の遺伝子と第2の遺伝子の発現；遺伝子の発現とSNPの存在；遺伝子の発現と機能活性；脂質のレベルと転写物のレベル；脂質のレベルと代謝物のレベル；第1の脂質のレベルと第2の脂質のレベル；脂質のレベルとSNPの存在；脂質のレベルと機能活性；第1の転写物のレベルと第2の転写物のレベル；転写物のレベルと代謝物のレベル；転写物のレベルとSNPの存在；第1の転写物のレベルと機能活性；第1の代謝物のレベルと第2の代謝物のレベル；代謝物のレベルとSNPの存在；代謝物のレベルと機能活性；第1のSNPのレベルと第2のSNPの存在；及びSNPの存在と機能活性、からなる群より選択される少なくとも1対の間の関係性である。
一実施形態において、機能活性は、生体エネルギー（bioenergetics）、細胞増殖、アポトーシス、オルガネラ機能、キナーゼ活性、プロテアーゼ活性、並びにATP、ROS、OXPHOS及びSeahorseアッセイから選択される機能モデルによって実現化される遺伝子型-表現型関連からなる群より選択される。特定の実施形態において、本方法は、薬物誘発毒性モデルにおいて、同定された特有の因果関係を検証するステップを更に含む。
一実施形態において、薬物誘発毒性は、薬物誘発心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性（nephrotoxicity）、神経毒性、腎毒性（renaltoxicity）又は筋毒性である。
一実施形態において、薬物誘発心臓毒性は、心筋症、心不全、心房細動、心筋症及び心不全、心不全及びLV（左心室）機能不全、心房粗動及び細動、又は心臓弁障害及び心不全である。
一実施形態において、薬物誘発毒性のモデルは、心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞（kidney cell）、神経細胞、腎細胞（renal cell）、又は筋芽細胞を含む。
一実施形態において、薬物誘発毒性のモデルは、毒性誘発薬物、抗癌薬、糖尿病薬、神経薬、又は抗炎症薬を含む。一実施形態において、薬物は、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、又はTNFアンタゴニストである。
一態様において、本発明は、薬物誘発毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性がある薬物を同定する方法であって、（i）薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーのレベルを、（ii）薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーのレベルと比較するステップを含み、上記1種以上のバイオマーカーが、上述した方法により同定されたモジュレーターから選択され、第1のサンプルと比較して、第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーのレベルのモジュレーションは、上記薬物が、薬物誘発毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である方法を提供する。
一態様において、本発明は、薬物誘発毒性を軽減又は予防しうるレスキュー薬を同定する方法であって、（i）毒性誘発薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの正常レベルを決定するステップ、（ii）毒性誘発薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの処置レベルを決定して、処置細胞サンプルにおいてレベルの変化を有する1種以上のバイオマーカーを同定するステップ、（iii）毒性誘発薬物及びレスキュー薬による処置の後に得られた第3の細胞サンプル中に存在する、毒性誘発薬物処置サンプルにおいてレベルが変化した1種以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップ、並びに（iv）第3のサンプル中で決定した1種以上のバイオマーカーのレベルを、第1のサンプル中に存在する1種以上のバイオマーカーのレベルと比較するステップを含み、上記1種以上のバイオマーカーが、上述した方法により同定されたモジュレーターから選択され、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの正常化されたレベルは、レスキュー薬が、薬物誘発毒性を軽減又は予防しうることの指標である方法を提供する。
別の態様において、本発明は、上述の方法により同定されたレスキュー薬を対象に投与することにより、該対象において薬物誘発毒性を軽減又は予防することを含む、薬物誘発毒性の緩和、軽減又は予防方法に関する。
別の態様において、本発明は、プラットフォーム方法において使用するための薬物誘発毒性のモデルを提供する方法であって、薬物誘発毒性の特徴的な側面を表すために薬物誘発毒性に関連した細胞を用いて薬物誘発毒性モデルを確立するステップ（この薬物誘発毒性のモデルは、プラットフォーム方法において使用されるデータセットを作成するために有用である）を含み、それによりプラットフォーム方法において使用するための薬物誘発毒性のモデルを提供する方法に関する。
一実施形態において、薬物誘発毒性のモデルは、心筋細胞, 糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞、又は筋芽細胞を含む。
別の態様において、本発明は、プラットフォーム方法において使用するための薬物誘発毒性のモデルから第1のデータセット及び第2のデータセットを取得する方法であって、（1）プラットフォーム方法において使用するための薬物誘発毒性のモデルから第1のデータセットを取得するステップであって、該薬物誘発毒性のモデルは薬物誘発毒性に関連する細胞を含み、第1のデータセットは、薬物誘発毒性に関連する細胞における複数の遺伝子の発現レベルを表す、上記ステップ、（2）プラットフォーム方法において使用するための薬物誘発毒性のモデルから第2のデータセットを取得するステップであって、第2のデータセットは、薬物誘発毒性に関連する細胞の機能活性又は細胞応答を表す、上記ステップを含み、これによりプラットフォーム方法において使用するための薬物誘発毒性のモデルから第1のデータセット及び第2のデータセットを取得する方法に関する。
別の態様において、本発明は、薬物誘発毒性のモジュレーターを同定する方法であって、（1）薬物誘発毒性のモデルから取得した第1のデータセット及び第2のデータセットの間でコンセンサス因果関係ネットワークを作成するステップであって、該モデルは薬物誘発毒性に関連する細胞を含み、プログラミングされたコンピュータデバイス（計算装置）を用いて、第1のデータセットは、該細胞における複数の遺伝子の発現レベルを表し、第2のデータセットは、該細胞の機能活性又は細胞応答を表し、該コンセンサス因果関係ネットワークの作成は、第1のデータセット及び第2のデータセット以外のいかなる公知の生物学的関係性にも基づくものではない、上記ステップ、（2）上記コンセンサス因果関係ネットワークから、薬物誘発毒性に特有の因果関係を同定するステップであって、特有の因果関係に関連する遺伝子が、薬物誘発毒性のモジュレーターとして同定されるステップを含み、これにより薬物誘発毒性のモジュレーターを同定する方法に関する。
別の態様において、本発明は、薬物誘発毒性のモジュレーターを同定する方法であって、（1）薬物誘発毒性のモデルから作成されたコンセンサス因果関係ネットワークを準備するステップ、（2）上記コンセンサス因果関係ネットワークから、薬物誘発毒性に特有の因果関係を同定するステップであって、特有の因果関係に関連する遺伝子が、薬物誘発毒性のモジュレーターとして同定されるステップを含み、これにより薬物誘発毒性のモジュレーターを同定する方法に関する。
種々の方法の特定の実施形態において、コンセンサス因果関係ネットワークは、薬物誘発毒性のモデルから取得した第1のデータセット及び第2のデータセットの間で作成され、該モデルは薬物誘発毒性に関連する細胞を含み、プログラミングされたコンピュータデバイス（計算装置）を用いて、第1のデータセットは、該細胞における複数の遺伝子の発現レベルを表し、第2のデータセットは、該細胞の機能活性又は細胞応答を表し、該コンセンサス因果関係ネットワークの作成は、第1のデータセット及び第2のデータセット以外のいかなる公知の生物学的関係性にも基づくものではない。
特定の実施形態において、本明細書において、「外部刺激構成要素」とも称される「環境変動」は、治療剤である。特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、小分子（例えば、5kDa、4kDa、3kDa、2kDa、1kDa、500ダルトン又は250ダルトン以下の小分子）である。特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、生物製剤である。特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、化学物質である。特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、細胞に対し内因性又は外因性である。特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、MIM又はエピシフター（epishifter）である。特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、低酸素、高血糖、高脂血症、高インスリン血症及び/又は乳酸富化条件等、細胞系にとってのストレス因子である。
特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、化学療法剤、タンパク質に基づく生物学的製剤、抗体、融合タンパク質、小分子薬、脂質、多糖、核酸等を包含する、薬物誘発毒性を処置するための治療剤又は候補治療剤を包含し得る。
特定の実施形態において、外部刺激構成要素は、低酸素、高血糖条件、酸性環境（乳酸処理によって模倣され得る）等を包含する、様々な薬物誘発毒性下でin vivoにおいて典型的に遭遇される因子等、1種以上のストレス因子とすることができる。
他の実施形態において、外部刺激構成要素は、本明細書において後に定義する1種以上のMIM及び/又はエピシフターを包含し得る。例示的なMIMとして、コエンザイムQ10（本明細書において、CoQ10とも称される）及びビタミンBファミリー内の化合物、又はビタミンBファミリー内の化合物を含むヌクレオシド、モノヌクレオチド若しくはジヌクレオチドが挙げられる。
細胞出力測定値（タンパク質発現等）の作成において、絶対量（例えば、発現量）を用いても相対レベル（例えば、相対発現レベル）を用いてもよい。一実施形態において、絶対量（例えば、発現量）が用いられる。一実施形態において、相対レベル又は量（例えば、相対発現レベル）が用いられる。例えば、細胞系の相対タンパク質発現レベルを決定するため、細胞系に対する外部刺激あり又はなしの細胞系におけるいずれか所定のタンパク質の量は、適した対照細胞株又は細胞株の混合物（同じ実験において用いられるあらゆる細胞等）と比較して、倍数増加又は倍数減少値を得ることができる。当業者であれば、遺伝子及び/又はRNA転写レベル、脂質のレベル、代謝物のレベル又はいずれかの機能出力、例えば、アポトーシスのレベル、毒性のレベル、酵素（例えばキナーゼ）活性のレベル又は本明細書に記載されているECAR若しくはOCR等、いずれかの細胞出力測定値において絶対量又は相対量を用いることができることを認識している。倍数増加（例えば、少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75若しくは100以上の倍数増加）又は倍数減少（例えば、少なくとも、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1又は0.05倍への減少、90％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％若しくは5％以下への減少）の予め定められた閾値レベルを用いて、有意な差次を選択することができ、次に、有意な差次についての細胞出力データを、本発明のプラットフォーム技術方法において利用されるデータセット（例えば、第1及び第2のデータセット）に包含させることができる。前述のリストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限、例えば、1.5〜5倍、5〜10倍、2〜5倍の間又は0.9〜0.7、0.9〜0.5若しくは0.7〜0.3倍の間ともなり得る。
本出願を通して、リストに提示されているあらゆる値、例えば、上述の値等は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限ともなり得る。
本発明の方法の一実施形態において、因果関係ネットワークにおける観察される因果関係の全てが、生物学的意義を有するとは限らない。対象の照合による生物学的評価が適用されるいずれか所定の薬物誘発毒性に関して、因果関係（及びこれに関連する遺伝子）の一部（又は恐らく全て）は、問題になっている特異的な生物学的課題に関して「決定的」となり得る、例えば、薬物誘発毒性を引き起こす原因である（治療介入の潜在的な標的）、あるいは薬物誘発毒性のバイオマーカーである（潜在的な診断又は予後因子）。一実施形態において、観察される薬物誘発毒性に特有の因果関係は、問題になっている特異的な生物学的課題に関して決定的である。一実施形態において、薬物誘発毒性に特有の観察される因果関係の全てが、問題になっている特異的な課題に関して決定的とは限らない。
かかる決定的な因果関係は、対象方法のエンドユーザーによって選択され得る、あるいはREFS、DAVID対応比較経路解析プログラム又はKEGG経路解析プログラム等、バイオインフォマティクスソフトウェアプログラムによって選択され得る。特定の実施形態において、2種以上のバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムが用いられ、2種以上のバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムに起因するコンセンサスが好ましい。
本明細書において、細胞出力の「差次」は、細胞出力の1種以上のパラメータの差（例えば、レベルの増加又は減少）を包含する。特定の実施形態において、差次は、それぞれ独立的に、mRNA転写、タンパク質発現、脂質発現、タンパク質活性、キナーゼ活性、代謝物/中間体レベル、及び/又はリガンド-標的相互作用の差次からなる群より選択される。例えば、タンパク質発現レベルの観点から、外部刺激構成要素による処理前後の細胞系に関連する出力等、2種の細胞出力の間の差次は、質量分析に基づくアッセイ（例えば、iTRAQ、2D-LC-MSMS等）などの当該技術分野において認識されている技術を用いることにより測定及び定量化することができる。
一態様において、薬物誘発毒性の細胞モデルは、細胞クロストークシステムを含み、該システムにおいて、外部刺激構成要素により第1の細胞環境を有する第1の細胞系が、第1の修飾された細胞環境を生じ、第2の細胞環境を有する第2の細胞系を第1の修飾された細胞環境に曝露することにより、クロストーク細胞系が確立される。
一実施形態において、クロストーク細胞系から少なくとも1種の有意な細胞クロストーク差次が作成され、少なくとも1種の決定的な細胞クロストーク差次は、照合による生物学的評価が起こるように同定される。特定の実施形態において、少なくとも1種の有意な細胞クロストーク差次は、複数の差次である。
特定の実施形態において、少なくとも1種の決定的細胞クロストーク差次は、エンドユーザーによって選択される。あるいは、別の実施形態において、少なくとも1種の決定的な細胞クロストーク差次は、定量的プロテオミクスデータに基づき、バイオインフォマティクスソフトウェアプログラム（例えば、REFS、KEGG経路解析又はDAVID対応比較経路解析等）によって選択される。
特定の実施形態において、本方法は、第1の細胞系の有意な細胞出力差次を作成するステップを更に含む。
特定の実施形態において、差次は、それぞれ独立的に、mRNA転写、タンパク質発現、脂質発現、タンパク質活性、代謝物/中間体レベル、及び/又はリガンド-標的相互作用の差次からなる群より選択される。
特定の実施形態において、第1の細胞系及び第2の細胞系は、独立的に、初代細胞の均一集団、薬物誘発毒性関連細胞株又は正常細胞株から選択される。
特定の実施形態において、第1の修飾された細胞環境は、第1の細胞系と外部刺激構成要素との接触の結果、第1の細胞系によって第1の細胞環境へと分泌される因子を含む。因子は、分泌タンパク質又は他のシグナル伝達分子を含むことができる。特定の実施形態において、第1の修飾された細胞環境は、元々の外部刺激構成要素を実質的に含まない。
特定の実施形態において、クロストーク細胞系は、膜により分離された挿入区画及びウェル区画を有するトランスウェル（transwell）を含む。例えば、第1の細胞系は、挿入区画（又はウェル区画）において育成することができ、第2の細胞系は、ウェル区画（又は挿入区画）において育成することができる。
特定の実施形態において、クロストーク細胞系は、第1の細胞系を育成するための第1の培養物と、第2の細胞系を育成するための第2の培養物とを含む。この場合、第1の修飾された細胞環境は、第1の細胞系由来の馴化培地となり得る。
特定の実施形態において、第1の細胞環境及び第2の細胞環境は同一であってよい。特定の実施形態において、第1の細胞環境及び第2の細胞環境は異なっていてよい。
特定の実施形態において、クロストーク細胞系は、第1の細胞系及び第2の細胞系の共培養物を含む。
本発明の方法は、任意の数の「照合による生物学的評価」に使用することができる、あるいはこれに適用することができる。照合による生物学的評価への本発明の方法の適用は、薬物誘発毒性の1種以上のモジュレーター又は薬物誘発毒性の決定的な細胞プロセス「ドライバー」の同定を可能にする。
一施形態において、照合による生物学的評価は、細胞、組織、器官又は生物に対する作用物、例えば、薬物の毒物学的プロファイリングの評価であり、薬物誘発毒性の同定されたモジュレーター、例えば、決定的な細胞プロセスドライバー（例えば、薬物誘発毒性に特有の細胞クロストーク差次又は因果関係）は、毒性、例えば、細胞毒性、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性の指標となることができ、ひいては、作用物の毒物学的プロファイリングの予測又は同定に用いることができる。一実施形態において、薬物誘発毒性の同定されたモジュレーター、例えば、決定的な細胞プロセスドライバー（例えば、薬物誘発毒性に特有の細胞クロストーク差次又は因果関係）は、薬物又は薬物候補物質の心臓毒性の指標であり、ひいては、薬物又は薬物候補物質の心臓毒物学的プロファイリングの予測又は同定に用いることができる。
別の態様において、本発明は、本発明の方法から作成された因果関係ネットワークの対象である分析物の存在を検出するため及び/又はその量を定量化するための1種以上の試薬を含む、発見プラットフォーム技術を用いて照合による生物学的評価を行うためのキットを提供する。一実施形態において、前記分析物は、薬物誘発毒性における特有の因果関係の対象、例えば、薬物誘発毒性における特有の因果関係に関連する遺伝子である。特定の実施形態において、分析物は、タンパク質であり、試薬は、タンパク質に対する抗体、タンパク質の標識及び/又はハイスループット解析（例えば、質量分析に基づく配列決定）用にタンパク質を調製するための1種以上の薬剤を含む。
実施例のみに記載されている実施形態を包含する本明細書に記載されているあらゆる実施形態は、本発明の概要の一部であり、明確に放棄される又は適用できない場合を除き、本発明のその他の実施形態と組み合わせてよいことを理解されたい。
図面を参照しつつ、本開示の様々な実施形態について本明細書において後述する。
治療を同定するためのアプローチの図解を示す。 癌のシステム生物学及び統合された複数の生理学的相互作用的出力調節の結果の図解を示す。 MIMSを用いた生物学的関連性の系統的照合の図解を示す。 照合による生物学的クエリーを可能にするための癌ネットワークモデリングの図解を示す。 照合による生物学プラットフォーム技術の図解を示す。 プラットフォーム技術において用いられる技術の図解を示す。 データ収集、データ統合及びデータマイニングを包含するプラットフォームの構成要素の略図である。 MIMSを用いた系統的照合及び「オミクス（omics）」カスケードからの応答データの収集の略図である。 正常及び糖尿病状態を表すin vitroモデルの組み立てに用いた構成要素の素描を示す。 疾患病態生理学に関係するためタンパク質の因果ネットワークの作成に用いた、インフォマティクスプラットフォームREFS(商標)の略図である。 糖尿病状態対正常状態における差次的ネットワーク及びMIMS処理により正常状態に回復された糖尿病ノード（node）の作成に向けたアプローチの略図である。 糖尿病状態対正常状態における代表的な差次的ネットワークを示す。 対象のノード及び関連するエッジ（edge）（中心にノード1）の略図である。各エッジに関連する細胞機能性を表す。 一部の実施形態に従った、例示的な方法の高レベルフローチャートである。 A〜Dは、例示的な実施形態により用いることのできるAIに基づくインフォマティクスシステムの構成要素及びプロセスの高レベル模式図である。 一部の例示的な実施形態により用いることのできるAIに基づくインフォマティクスシステムにおけるプロセスのフローチャートである。 本明細書において教示されている例示的な実施形態の実施に適した、例示的なコンピュータ処理環境を模式的に描写する。 デルタ-デルタネットワークの作成に向けた数学的アプローチの図解を示す。 糖尿病性心筋細胞における薬物誘発毒性の試験に用いた実験設計及びモデリングパラメータを表す模式図である。 薬物処理（T）による糖尿病性心筋細胞における転写ネットワークの調節不全及びヒトミトコンドリアのエネルギー代謝遺伝子の発現を示す図である。レスキュー分子（R）は、遺伝子発現を正常化する。 A.薬物処理（T）が、高血糖において条件付けされた心筋細胞由来のミトコンドリアにおいてGPAT1及びTAZの発現を誘導したことを示す図である。レスキュー分子と組み合わせて（T＋R）、GPAT1及びTAZのレベルが正常化された。B.G3PからのTAGの合成を示す図である。 A.薬物処理（T）が、高血糖において条件付けされた心筋細胞におけるミトコンドリアOCR（酸素消費速度）を減少させることを示す図である。レスキュー分子（T＋R）は、OCRを正常化する。B.薬物処理（T）が、高血糖において条件付けされた心筋細胞におけるミトコンドリアATP合成を抑圧することを示す図である。 薬物処理により下方調節されたタンパク質のGOアノテーションを示す。ミトコンドリアのエネルギー代謝に関与するタンパク質は、薬物処理により下方調節された。 デルタネットワークの作成に向けた数学的アプローチの図解を示す。両者共に糖尿病性環境におけるモデルである、T対UT由来の特有のエッジを比較する。 薬物誘発毒性の病態生理を駆動する潜在的なタンパク質ハブ及びネットワークを表す模式図である。 照合による生物学プラットフォームの概略図である。 細胞機能モデル、データ統合、及び数学的モデル組立の説明である。 薬物誘発毒性の病態生理を駆動する因果分子相互作用ネットワークである。 薬物誘発毒性の病態生理を駆動する中心ハブとしてのPTX3の因果分子相互作用サブネットワークである。 正常グルコース条件及び高グルコース条件における心筋細胞のミトコンドリアATP合成能力を示す。 ATPドライバーの因果分子相互作用ネットワークである。 ATPドライバーの因果分子相互作用ネットワークである。 中心ハブとしてのP4HBを有するATPドライバーの因果分子相互作用サブネットワークである。 中心ハブとしてのP4HBを有するATPドライバーの因果分子相互作用サブネットワークの特有のエッジである。 機能的トキシノミクス（toxicomics）：複数のオミクス統合の説明である。
本明細書に、付属書類Aとして、本明細書において参照した全てのバイオマーカーの配列を添付する。付属書類Aにおいて及び本出願によって列挙したGene Bankアクセッション番号に関連する情報は全て、本出願の出願日に入手可能なバージョンで、参照により本明細書に組み入れる。
発明の詳細な説明
I. 概説
本発明の例示的な実施形態は、多種多様な薬物誘発毒性（例えば心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性等）と、薬物誘発毒性を可能にする因子を包含するかかる薬物誘発毒性の根底にある主要分子ドライバーとを理解するためのツールである、照合による（interrogative）生物学プラットフォーム（「プラットフォーム」）を用いて行うことのできる方法を取り込む。一部の例示的な実施形態は、プラットフォームの少なくとも部分又は全てを取り込むことのできるシステムを包含する。一部の例示的な方法は、プラットフォームの少なくとも一部又は全てを用いることができる。説明目的のため、プラットフォームに関係する一部の例示的な実施形態の目的及び目標について以下に一般概要を述べる。
i）関連する細胞、組織及び／又は器官の病態生理全体に関係するものとして、薬物誘発毒性の重大な構成要素のドライバーとして特異的分子サインを創出すること、
ii）2種の生物学的状態間の変化の（例えば、正常から薬物誘発毒性状態への）機序を調停するため、ある生物学的状態（例えば、薬物誘発毒性状態） 対 異なる生物学的ステージ（例えば、正常状態）を識別する差次的分子サインの同定に役立つ、薬物誘発毒性に属する分子サイン又は差次的マップを作成し、サイン又は分子実体の理解を発展させること、並びに
iii）薬物誘発毒性の外部制御のための潜在的な介入標的としての（例えば、潜在的な治療標的としてハブを使用すること）、又は対象の薬物誘発毒性（例えば、予後及び/又はセラノスティクス用途における、薬物誘発毒性特異的バイオマーカー）の潜在的なバイオマーカーとしての、分子活性の「ハブ」の役割を調査すること。
薬物誘発毒性プラットフォームに関係する一部の例示的な方法は、次の特色のうち1種以上を包含することができる。
1）薬物誘発毒性に関連する細胞を用いた、1種以上のモデル、好ましくはin vitroモデルにおける、薬物誘発毒性（例えば心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性若しくは筋毒性）及び/又は薬物誘発毒性の構成要素（例えば、薬物誘発毒性に関連する生理学及び病態生理学）のモデリング。例えば、細胞は、正常には、対象の薬物誘発毒性に関わる、ヒト由来の細胞（例えば、心臓毒性に関与する心筋（heat muscle）細胞）となり得る。モデルは、薬物誘発毒性に特異的な様々な細胞合図/条件/変動を包含し得る。理想的には、モデルは、薬物誘発毒性条件の静的評価の代わりに、様々な薬物誘発毒性状態及び流動構成要素を表す。
2）当該技術分野において認識されているいずれかの手段を用いた、mRNA及び/又はタンパク質サインのプロファイリング。例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）、及び質量分析（MS）等のプロテオミクス解析ツール。かかるmRNA及びタンパク質データセットは、環境/変動に対する生物学的反応を表す。適用でき、可能であれば、リピドミクス、メタボロミクス及びトランスクリプトミクスデータを、対象の薬物誘発毒性の補足的又は代替的尺度として統合することもできる。SNP解析は、プロセスにおいて時折用いることのできる別の構成要素である。これは、例えば、SNP又は特異的突然変異が、薬物誘発毒性にいかなる影響を有するかの調査に役立つことができる。これらの変数は、静的「スナップショット（snapshot）」又は動的プロセスの表現のいずれかとして、薬物誘発毒性の説明に用いることができる。
3）生体エネルギー、細胞増殖、アポトーシス及びオルガネラ機能を包含するがこれらに限定されない、合図及び変動に対する1種以上の機能活性又は細胞応答のアッセイ。真の遺伝子型-表現型関連は、機能モデル、例えばATP、ROS、OXPHOS、Seahorseアッセイ等を用いることによって実現化される。かかる機能活性は、網羅的酵素活性、例えばキナーゼ活性、並びに／あるいは細胞における網羅的酵素活性又は酵素代謝物若しくは基質の影響、例えば細胞のホスホルプロテオーム（phosphor proteome）を含むことができる。かかる細胞応答は、mRNA/タンパク質発現の対応する薬物誘発毒性状態（複数可）及び上述の2）におけるその他の関連する状態に応答した、薬物誘発毒性（又はそのモデル）における細胞の反応を表す。
4）人工知能に基づく（AIに基づく）インフォマティクスシステム又はプラットフォームを用いることによる、3）においてこのようにして得られた機能アッセイデータと、2）において得られたプロテオミクス及び他のデータとの統合、並びに因果関係により駆動されるタンパク質、遺伝子、脂質、酵素活性及び他の機能活性の関連の決定。かかるAIに基づくシステムは、毒物誘発毒性プロセスに関する既存の知識に頼ることなく、2）及び/又は3）において得られるデータセットに基づき、好ましくは、これのみに基づく。好ましくは、データ点は、統計的に又は人為的にカットオフとならない。代わりに、得られた全データを、タンパク質、遺伝子、脂質、酵素活性及び他の機能活性の関連を決定するためのAIシステムに読み込ませる。統合過程の目的又は出力の一つは、異なる生物学的状態（例えば、薬物誘発毒性vs.正常状態）間の1種以上の差次的ネットワーク（あるいは、本明細書において、「デルタネットワーク」、又は場合によっては「デルタ-デルタネットワーク」と称され得る）である。
5）潜在的な治療標的及び/又はバイオマーカーとしての活性の各ハブを探るための、AIに基づくインフォマティクスプラットフォームからの出力のプロファイリング。かかるプロファイリングは、いかなる実際のウェットラボ（wet-lab）実験に頼ることもなく、得られたデータセットに基づき、完全にin silicoで行うことができる。
6）分子及び細胞技法を用いることによる、活性のハブの検証。ウェットラボの細胞に基づく実験による出力のかかるポストインフォマティクス検証は、任意選択で行えばよいが、照合（interogation）を完成（full-circle）させるのに役立つ。
上に概要を述べるアプローチのうちいずれか又は全ては、少なくとも一部には特異的な用途の性質に応じて、いずれかの薬物誘発毒性に関するいずれかの具体的な用途において用いることができる。すなわち、上に概要を述べる1種以上のアプローチは、省略又は修飾することができ、1種以上の追加的なアプローチを、具体的な用途に応じて用いることができる。
プラットフォームを図解する様々な模式図が提供されている。特に、プラットフォームを用いた治療を同定するための例示的なアプローチの図解を図1において描写する。癌のシステム生物学及び統合された複数の生理学的相互作用的出力調節の結果の図解を図2において描写する。MIMSを用いた生物学的関連性の系統的照合の図解を図3において描写する。照合による生物学的クエリーを可能にするための癌ネットワークのモデリングの図解を図4において描写する。照合による生物学プラットフォーム及びプラットフォームにおいて用いられる技術の図解を図5及び図6において描写する。データ収集、データ統合及びデータマイニングを包含するプラットフォームの構成要素の略図を図7において描写する。MIMSを用いた系統的照合及び「オミクス」カスケードからの応答データの収集の略図を図8において描写する。
図14は、例示的な方法10の高レベルフローチャートであり、例示的な方法の実施に用いられる例示的なシステムの構成要素が示されている。最初に、正常には生物学的プロセスに関連する細胞を用いて、生物学的プロセス（例えば、薬物誘発毒性プロセス）及び/又は生物学的プロセスの構成要素（例えば、薬物誘発毒性生理学及び病態生理学）に対するモデル（例えば、in vitroモデル）が確立される（ステップ12）。例えば、細胞は、正常には生物学的プロセス（例えば、薬物誘発毒性）に関わるヒト由来の細胞となり得る。細胞モデルは、生物学的プロセス（例えば、薬物誘発毒性）に特異的な様々な細胞合図、条件及び/又は変動を包含し得る。理想的には、細胞モデルは、生物学的プロセスの静的評価の代わりに、生物学的プロセス（例えば、薬物誘発毒性）の様々な（薬物誘発毒性）状態及び流動構成要素を表す。比較細胞モデルは、対照細胞又は正常細胞、例えば毒性を誘発する薬物に暴露されていない細胞を包含し得る。細胞モデルの追加的な説明は、下のセクションIII.A及びIVにおいて現れる。
第1のデータセットは、例として、いずれかの公知のプロセス又はシステム（例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）、及び質量分析（MS）等のプロテオミクス解析ツール）を用いた複数の遺伝子の発現レベル（例えば、mRNA及び/又はタンパク質サイン）を表す情報を包含する、生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）の細胞モデルから得られる（ステップ16）。
第3のデータセットは、生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）の比較細胞モデルから得られる（ステップ18）。第3のデータセットは、例えば、比較細胞モデル由来の比較細胞における複数の遺伝子の発現レベルを表す情報を包含する。
本発明の方法の特定の実施形態において、これら第1及び第3のデータセットは、本明細書において、例えば、生物学的システム（例えば薬物誘発毒性モデル）に関連する細胞（比較細胞を包含するあらゆる細胞）における複数の遺伝子の発現レベルを表す「第1のデータセット」とまとめて称される。
第1のデータセット及び第3のデータセットは、1種以上のmRNA及び/又はタンパク質サイン解析システム（複数可）から得ることができる。第1及び第3のデータセットにおけるmRNA及びタンパク質データは、環境及び/又は変動に対する生物学的反応を表すことができる。適用でき、可能であれば、リピドミクス、メタボロミクス及びトランスクリプトミクスデータを、生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）の補足的又は代替的尺度として、第1のデータセットに統合することもできる。SNP解析は、このプロセスにおいて時折用いることのできる別の構成要素である。これは、例えば、一塩基多型（SNP）又は特異的突然変異が、生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）にいかなる影響を有するか調査するために役立つことができる。データ変数は、静的「スナップショット」又は動的プロセスの表現のいずれかとして生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）の説明に用いることができる。細胞における複数の遺伝子の発現レベルを表す情報を得ることに関する追加的な説明は、下のセクションIII.Bにおいて現れる。
第2のデータセットは、細胞の機能活性又は応答を表す情報を包含する、生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）の細胞モデルから得られる（ステップ20）。同様に、第4のデータセットは、比較細胞の機能活性又は応答を表す情報を包含する、生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）の比較細胞モデルから得られる（ステップ22）。
本発明の方法の特定の実施形態において、これら第2及び第4のデータセットは、本明細書において、生物学的システム（例えば薬物誘発毒性）に関連する細胞（比較細胞を包含するあらゆる細胞）の機能活性又は細胞応答を表す「第2のデータセット」とまとめて称される。
1種以上の機能アッセイシステムを、細胞又は比較細胞の機能活性又は応答に関する情報を得るために用いることができる。合図及び変動に対する機能的細胞応答に関する情報として、生体エネルギープロファイリング、細胞増殖、アポトーシス及びオルガネラ機能を挙げられることができるがこれらに限定されない。プロセス及び経路の機能モデル（例えば、アデノシン三リン酸（ATP）、反応性酸素種（ROS）、酸化的リン酸化（OXPHOS）、Seahorseアッセイ等）は、真の遺伝子型-表現型関連を得るために用いることができる。かかる機能活性は、網羅的酵素活性（例えばキナーゼ活性など）、並びに／あるいは細胞における網羅的酵素活性、又は酵素代謝物若しくは基質の影響（例えば細胞のホスホルプロテオーム）に関係しうる。機能活性又は細胞応答は、mRNA/タンパク質発現の対応する状態（複数可）及びその他の関係する適用された条件又は変動に応答した、生物学的プロセス（又はそのモデル）における細胞の反応を表す。細胞の機能活性又は応答を表す情報を得ることに関する追加的な情報は、下のセクションIII.Bにおいて提供する。
本方法は、細胞及び対照細胞における生物学的プロセス（例えば薬物誘発毒性）のコンピュータ実行モデルを作成するステップも包含する。例えば、複数の遺伝子の発現レベル及び機能活性又は細胞応答の間の因果関係の1種以上のベイズネットワーク（例えば、そのアンサンブル）は、第1のデータセット及び第2のデータセットから、細胞モデルのために作成することができる（「作成された細胞モデルネットワーク」）（ステップ24）。作成された細胞モデルネットワークは、個々に又はまとめて、関係性に関する定量的確率的指向性情報を包含する。作成された細胞モデルネットワークは、第1のデータセット及び第2のデータセット由来の情報以外の、遺伝子発現及び/又は機能活性若しくは細胞応答の間の公知の生物学的関係性に基づくものではない。1種以上の作成された細胞モデルネットワークは、コンセンサス細胞モデルネットワークとまとめて称され得る。
複数の遺伝子の発現レベル及び機能活性又は細胞応答の間の因果関係の1種以上のベイズネットワーク（例えば、そのアンサンブル）は、第1のデータセット及び第2のデータセットから、比較細胞モデルのために作成することができる（「作成された比較細胞モデルネットワーク」）（ステップ26）。作成された比較細胞モデルネットワークは、個々に又はまとめて、関係性に関する定量的確率的指向性情報を包含する。作成された細胞ネットワークは、第1のデータセット及び第2のデータセットにおける情報以外の、遺伝子発現及び/又は機能活性若しくは細胞応答の間の公知の生物学的関係性に基づくものではない。1種以上の作成された比較モデルネットワークは、コンセンサス細胞モデルネットワークとまとめて称され得る。
作成された細胞モデルネットワーク及び作成された比較細胞モデルネットワークは、人工知能に基づく（AIに基づく）インフォマティクスプラットフォームを用いて創出することができる。作成された細胞モデルネットワークの創出、作成された比較細胞モデルネットワークの創出及びAIに基づくインフォマティクスシステムに関するさらなる詳細は、下のセクションIII.C及び図2A〜3の説明に現れる。
多くの異なるAIに基づくプラットフォーム又はシステムを用いて、定量的確率的指向性情報を包含する因果関係のベイズネットワークを作成することができることに留意されたい。本明細書に記載されている特定の例は、特定の市販のシステム、すなわち、GNS（マサチューセッツ州ケンブリッジ）製のREFS(商標)（リバースエンジニアリング/フォワードシミュレーション（Reverse Engineering/Forward Simulation））を用いるが、実施形態はこれに限定されない。一部の実施形態の実行に適したAIに基づくシステム又はプラットフォームは、入力データのみに基づき、いかなる潜在的な確立された及び/又は確認された生物学的関係性に関する先行する既存の知識を考慮することもなく、入力変数（例えば、第1及び第2のデータセット）の間の因果関係を確立するために数学的アルゴリズムを用いる。
例えば、REFS(商標)AIに基づくインフォマティクスプラットフォームは、実験に由来する生の（元々の）又は加工が最小の入力生物学的データ（例えば、遺伝学、ゲノミクス、エピジェネティクス、プロテオミクス、メタボロミクス及び臨床データ）を利用し、数兆回の計算を迅速に実施し、分子が完全システムにおいて互いにどのように相互作用するか決定する。REFS(商標)AIに基づくインフォマティクスプラットフォームは、根底にある生物学的システム（例えば薬物誘発毒性）を定量的に表す、入力データに基づく、in silicoコンピュータ実行細胞モデル（例えば、作成された細胞モデルネットワーク）の創出を意図したリバースエンジニアリングプロセスを実施する。更に、仮説に関する関連する信頼レベルを伴う予測を得るために、コンピュータ実行細胞モデルに基づき、根底にある生物学的システムに関する仮説を発展させ、迅速にシミュレートすることができる。
このアプローチにより、生物学的システムは、定量的コンピュータ実行細胞モデルにより表され、該モデルにおいて、「介入」がシミュレートされて、生物学的システム（例えば薬物誘発毒性）の詳細な機序、有効介入戦略及び/又はいかなる患者が所定の処置レジメンに応答するか決定する臨床バイオマーカーを学習する。従来のバイオインフォマティクス及び統計的アプローチ、並びに公知の生物学のモデリングに基づくアプローチは、典型的には、この種の洞察をもたらすことができない。
作成された細胞モデルネットワーク及び作成された比較細胞モデルネットワークを創出した後、両者を比較する。作成された細胞モデルネットワークの少なくとも一部に存在し、作成された比較細胞モデルネットワークに存在しない又はそこに少なくとも1種の有意に異なるパラメータを有する1種以上の因果関係が同定される（ステップ28）。かかる比較は、差次的ネットワークの創出をもたらし得る。比較、同定及び/又は差次的（デルタ）ネットワーク創出は、差次的ネットワーク創出モジュールを用いて行うことができ、これについては、下のセクションIII.D及び図18の説明に関して更に詳細に説明する。
一部の実施形態において、入力データセットは、1種の細胞型及び1種の比較細胞型に由来し、これは、1種の細胞型に基づく細胞モデルネットワークのアンサンブル及び1種の比較対照細胞型に基づく比較細胞モデルネットワークの別のアンサンブルを創出する。差次は、1種の細胞型のネットワークのアンサンブル及び比較細胞型（複数可）のネットワークのアンサンブルの間で実施することができる。
他の実施形態において、入力データセットは、複数の細胞型（例えば、特定のタイプの薬物誘発毒性に正常に関連する2種以上の細胞型）及び複数の比較細胞型（例えば、2種以上の正常細胞型、例えば薬物に暴露されていない同じ細胞）に由来する。細胞モデルネットワークのアンサンブルは、各細胞型及び各比較細胞型のために個々に作成することができる、並びに/あるいは複数の細胞型及び複数の比較細胞型由来のデータは、個々の複合性データセットへと組み合わせることができる。複合性データセットは、複数の細胞型に対応するネットワークのアンサンブル（複合性データ）及び複数の比較細胞型に対応するネットワークの別のアンサンブル（比較複合性データ）を作り出す。差次は、比較複合性データのネットワークのアンサンブルと比較した複合性データのネットワークのアンサンブルにおいて実施することができる。
一部の実施形態において、差次は、2種の異なる差次的ネットワークの間で実施することができる。この出力は、デルタ-デルタネットワークと称することができ、図18に関して下に説明されている。
定量的関係性情報は、作成された細胞モデルネットワークにおける関係性毎に同定することができる（ステップ30）。同様に、作成された比較細胞モデルネットワークにおける関係性毎の定量的関係性情報を同定することができる（ステップ32）。関係性に関する定量的情報は、因果関係を示す方向性、関係性に関する統計的不確定性の尺度（例えば、曲線下面積（AUC）統計的測定値）、及び/又は関係性の強度の定量的規模の表現（例えば、倍数）を包含することができる。作成された細胞モデルネットワークにおける様々な関係性を、定量的関係性情報を用いてプロファイリングして、潜在的な治療標的及び/又はバイオマーカーとしてネットワークにおける活性の各ハブを探ることができる。かかるプロファイリングは、作成された細胞モデルネットワークの結果に基づき、いかなる実際のウェットラボ実験に頼ることもなく、完全にin silicoで行うことができる。
一部の実施形態において、ネットワークにおける活性のハブは、分子及び細胞技法を用いることにより検証することができる。ウェットラボの細胞に基づく実験により、出力のかかるポストインフォマティクス検証を実施する必要はないが、照合を完成させるのに役立つことができる。図15は、例示的なAIに基づくインフォマティクスシステム（例えば、REFS(商標)AIに基づくインフォマティクスシステム）の機能性の単純化された高レベル表現、及びAIに基づくシステムと照合による生物学プラットフォーム（「プラットフォーム」）の他の要素又は一部との間の相互作用を模式的に描写する。図15Aにおいて、薬物投与量、処置投与量、タンパク質発現、mRNA発現、脂質レベル、代謝物レベル、キナーゼ活性及び多くの他の関連する機能尺度（OCR、ECAR等）のいずれか等、生物学的プロセスのモデル（例えば、薬物誘発毒性モデル）から得られる様々なデータセットは、AIに基づくシステムに読み込まれる。図15Bに示す通り、AIシステムは、ベイズ断片列挙（図15B）と称されるプロセスにおいて、入力データセットから、生物学的プロセス（例えば、薬物誘発毒性）における分子機序を駆動する変数（例えば、タンパク質、脂質、キナーゼ及び代謝物）を包含する「ネットワーク断片」のライブラリーを創出する。
図15Cにおいて、AIに基づくシステムは、ライブラリーにおけるネットワーク断片の部分集合を選択し、該断片から初期試行ネットワークを構築する。AIに基づくシステムはまた、ライブラリーにおけるネットワーク断片の異なる部分集合を選択して、別の初期試行ネットワークを構築する。最終的に、ライブラリーにおけるネットワーク断片の異なる部分集合から、初期試行ネットワークのアンサンブルが創出される（例えば、1000種のネットワーク）。このプロセスは、並行アンサンブルサンプリングと命名することができる。アンサンブルにおける各試行ネットワークは、ライブラリー由来の追加的なネットワーク断片を加算、減算及び/又は置換することにより進化又は最適化される。追加的なデータが得られる場合、ライブラリーにおけるネットワーク断片に追加的なデータを取り込ませることができ、各試行ネットワークの進化により、試行ネットワークのアンサンブルに取り込ませることができる。最適化/進化プロセスの完了後に、試行ネットワークのアンサンブルは、作成された細胞モデルネットワークとして記載することができる。
図15Dに示す通り、作成された細胞モデルネットワークのアンサンブルを用いて、生物学的システム（例えば薬物誘発毒性）の挙動をシミュレートすることができる。シミュレーションを用いて、条件の変化に対する生物学的システム（例えば薬物誘発毒性）の挙動を予測することができ、これは、ウェットラボの細胞に基づく又は動物に基づく実験を用いて実験により確認され得る。また、作成された細胞モデルネットワークにおける関係性の定量的パラメータは、作成された細胞モデルネットワークにおける他のノードに対する影響を観察しつつ、各ノードに個々にシミュレートされた変動を適用することにより、シミュレーション機能性を用いて抽出することができる。さらなる詳細は、下のセクションIII.Cにおいて提供する。
図2A〜図2Dに描写するAIに基づくインフォマティクスシステムの自動リバースエンジニアリングプロセスは、細胞の不偏性且つ系統的なコンピュータに基づくモデルである、作成された細胞モデルネットワークのアンサンブルを創出する。
リバースエンジニアリングは、データにおける分子測定値と、対象の表現型成績（outcome）との間の確率的指向性ネットワーク接続を決定する。分子測定値における変動は、これらの実体とエンドポイントの変化との間の確率的な原因と結果の関係性の学習を可能にする。プラットフォームの機械学習性質は、絶えず進化しているデータセットに基づくクロス・トレーニング及び予測も可能にする。
一部には、接続が、コンピュータアルゴリズムにより「学習」された観察データセット間の相関に基づき得るため、データにおける分子測定値間のネットワーク接続は「確率的」である。例えば、タンパク質Xの発現レベル及びタンパク質Yの発現レベルが、データセットの統計解析に基づき、正に又は負に相関する場合、因果関係を割り当て、タンパク質XとYの間のネットワーク接続を確立することができる。かかる推定因果関係の信頼性は、p値（例えば、p<0.1、0.05、0.01等）により測定することのできる接続の尤度により更に定義することができる。
一部には、接続が刺激性であるか阻害性であるかに応じて、あるタンパク質の発現レベルの上昇が他のタンパク質の発現レベルを上昇又は下降させ得るように、リバースエンジニアリングプロセスにより決定される分子測定値間のネットワーク接続が、接続された遺伝子/タンパク質間の関係性の原因と結果を反映するため、データにおける分子測定値間のネットワーク接続は「指向性」である。
一部には、該プロセスにより決定される分子測定値間のネットワーク接続が、既存のデータセット及びこれに関連する確率的尺度に基づきin silicoでシミュレートすることができるため、データにおける分子測定値間のネットワーク接続は「定量的」である。例えば、分子測定値間の確立されたネットワーク接続において、所定のタンパク質（又はネットワークにおける「ノード」）の発現レベルを理論的に増加又は減少（例えば、1、2、3、5、10、20、30、50、100倍以上）させ、ネットワークにおける他の接続されたタンパク質に対するその影響を定量的にシミュレートすることが可能となり得る。
少なくとも一部には、データ点は統計的に又は人為的にカットオフされないため、また一部には、対象の生物学的プロセスに関する既存の知識を参照することなく、ネットワーク接続が入力データ単独に基づくため、データにおける分子測定値間のネットワーク接続は「先入観のない（不偏性の）もの（unbiased）」である。
一部には、あらゆる入力変数間のあらゆる潜在的な接続は、例えば、ペアワイズ様式で体系的に探られたものであるため、データにおける分子測定値間のネットワーク接続は「体系的」及び（不偏性）である。かかる体系的探索を実行する演算能力における確実性は、入力変数の数が増加するにつれて指数関数的に増加する。
一般に、ほぼ1,000種のネットワークのアンサンブルは通常、測定された実体全ての間の確率的な因果関係がある定量的関係性の予測に十分である。ネットワークのアンサンブルは、データにおける不確定性を捕捉し、モデル予測毎の信頼測定基準の計算を可能にする。予測は、ネットワークのアンサンブルを一体的に用いて作成され、アンサンブルにおける個々のネットワーク由来の予測の差は、予測における不確定性の度合いを表す。この特色は、モデルから作成された臨床応答の予測の信頼測定基準の割り当てを可能にする。
モデルがリバースエンジニアリングされると、さらなるシミュレーションクエリーをモデルのアンサンブルにおいて行い、薬物誘発毒性条件等、対象の生物学的プロセスの主要分子ドライバーを決定することができる。
正常及び糖尿病状態を表す例示的なin vitroモデルの組み立てに用いられる構成要素の素描を、図9に描写する。疾患病態生理学に関係するタンパク質の因果関係ネットワークの作成に用いられる例示的なインフォマティクスプラットフォームREFS(商標)の略図を図10に描写する。糖尿病状態対正常状態における差次的ネットワーク及びMIMS処置により正常状態へと回復する糖尿病ノードの作成に向けた例示的なアプローチの略図を図11に描写する。糖尿病状態対正常状態における代表的な差次的ネットワークを図12に描写する。対象のノード及び関連するエッジ（中心にノード1）並びに各エッジに関連する細胞機能性の略図を図13に描写する。
上述で本発明の概要を記載してきたが、以下のセクションでは、本明細書における方法を用いて解析することができる1種以上の具体的な生物学的システム（例えば薬物誘発毒性）と併せて、一般発明の様々な態様又は要素のより詳細な説明を示す。しかし、下の例証目的に用いられている具体的な薬物誘発毒性は、限定的ではないことに留意されたい。それとは反対に、対象プラットフォーム技術を用いて、そのいかなる代替物、修飾及び均等物を包含する他の別個の生物学的システムも同様に解析できることが企図される。
II. 定義
本明細書において、具体的に定義されることが企図されているが、本明細書の他のセクションにおいて未だ定義されていない特定の用語をここに定義する。
冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的目的語のうち1種又は2種以上（すなわち、少なくとも1種）を指すよう本明細書において用いられている。例として「要素（an element）」は、1種の要素又は2種以上の要素を意味する。
用語「包含する」は、語句「包含するがこれに限定されない」を意味するよう本明細書において用いられており、これと互換的に用いられている。
用語「又は」は、文脈がこれ以外を明らかに示さない限り、用語「及び/又は」を意味するよう本明細書において用いられており、これと互換的に用いられている。
用語「等」は、語句「等が挙げられるがこれに限定されない」を意味するよう本明細書において用いられており、これと互換的に用いられている。
「代謝経路」は、ある化合物を別の化合物に転換し、中間体及び細胞機能のためのエネルギーをもたらす一連の酵素媒介性反応を指す。代謝経路は、直線状又は環状又は分岐状となり得る。
「代謝状態」は、健康又は疾患の状態に関係するため、様々な化学的及び生物学的指標により測定された、所定の時点における特定の細胞、多細胞又は組織環境の分子含量を指す。
用語「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン若しくは他の種類の膜、フィルター、チップ、ガラススライド又はその他の適した固体支持体等、基板上に合成された別個のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド（例えば、抗体）又はペプチドのアレイを指す。
用語「障害」及び「疾患」は、包括的に用いられ、身体のいずれかの部分、器官又は系（又はこれらのいずれかの組み合わせ）の正常構造又は機能からの何らかの逸脱を指す。特定の疾患は、生物学的、化学的及び物理学的変化を包含する特徴的な症状及び兆候により顕在化され、多くの場合、人口統計学的、環境的、職業的（employment）、遺伝的及び病歴的因子が挙げられるがこれらに限定されない種々の他の因子に関連する。特定の特徴的な兆候、症状及び関係する因子を種々の方法により定量化して、重要な診断情報を得ることができる。
用語「薬物誘発毒性」には、限定されるものではないが、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性（hephrotoxicity）、神経毒性、腎毒性又は筋毒性が含まれる。
用語「心臓毒性」は、治療用分子によって誘発される心臓機能に対する広範な有害作用を意味する。これは、前臨床研究の初期に出現することもあるし、又は臨床状況の後期に明らかになることもある。本明細書に記載する心血管系毒性には、限定されるものではないが、QT時間延長、不整脈、心筋虚血、高血圧及び血栓塞栓性合併症、心筋機能障害、心筋症、心不全、心房細動、心筋症及び心不全、心不全及びLV（左心室）機能不全、心房粗動及び細動、並びに心臓弁障害及び心不全のいずれか1以上が含まれる。
用語「発現」は、DNA等のポリヌクレオチドからポリペプチドが産生されるプロセスを包含する。このプロセスは、遺伝子からmRNAの転写及びこのmRNAからポリペプチドへの翻訳に関与し得る。「発現」は、これが用いられる文脈に応じて、RNA、タンパク質又はその両方の産生を指すことができる。
用語「遺伝子の発現のレベル」又は「遺伝子発現レベル」は、細胞におけるmRNA並びにプレmRNA新生転写物（複数可）、転写物プロセシング中間体、成熟mRNA（複数可）及び分解産物のレベル、あるいは遺伝子にコードされるタンパク質のレベルを指す。
用語「モジュレーション」は、応答の上方調節（すなわち、活性化又は刺激）、下方調節（すなわち、阻害又は抑制）、あるいは両者の組み合わせ又はそれぞれ別個を指す。「モジュレーター」は、モジュレートする化合物又は分子であり、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、活性化因子、刺激因子、抑制因子又は阻害剤（インヒビター）となり得る。
タンパク質、脂質、転写物、代謝物、又は遺伝子発現の「正常レベル」とは、細胞を薬物と毒性の可能性がある薬物と接触する前の、タンパク質、脂質、転写物、代謝物、又は遺伝子発現のレベルを指す。「正常レベル」は、薬物の毒性を同じ条件下で試験しようとする場合には、種々の条件下、例えば高血糖、低酸素状態で増殖させた細胞において測定することができる。
「モジュレートされたレベル」とは、歴史的な正常対照サンプル、又は好ましくは同じ実験で試験した正常対照サンプルに基づく正常レベルと比較して変化した値を指す。具体的な「正常」値は、例えば、アッセイの種類（例として、ELISA、酵素活性、免疫組織化学、PCR）、試験対象のサンプル（例として、細胞の型及び培養条件）、並びに当業者に公知の他の考慮事項に応じて異なるだろう。対照サンプルは、正常と異常との間のカットオフを規定するために用いることができる。
薬物は、その薬物による細胞の処理が、「正常」又は適当な対照レベルと比較して、少なくとも1つのマーカーのレベルに統計学的に有意な変化をもたらす場合に、毒性であるとみなされる。すべての濃度の薬物が、少なくとも1つのマーカーのレベルに統計学的に有意な変化をもたらすものでなくてもよいことが理解される。好ましい実施形態において、薬物は、その薬物の治療に関連する濃度が少なくとも1つのマーカーのレベルに統計学的に有意な変化をもたらす場合に、毒性を有する可能性がある（潜在的に毒性がある）とみなされる。
「レスキュー薬」は、そのレスキュー薬が治療に関連する濃度で存在する場合、マーカーのレベルが、「正常細胞」におけるマーカーレベルに向かって統計学的に有意にモジュレートされている場合に、毒性を軽減するのに有効であるとみなされる。好ましい実施形態において、レスキュー薬は、対照細胞におけるマーカーのレベルとは統計学的に差がないレベルへとマーカーを回復する（return）。
用語「対照レベル」とは、マーカーの許容された若しくは予め決定されたレベル、又は好ましくは、試験サンプルと並行して試験された対照サンプルにおいて測定されたマーカーレベル（潜在的な毒性薬物若しくはレスキュー薬で処理していない細胞に由来するサンプルにおけるマーカーのレベルと比較するために用いられる）を指す。「対照レベル」は、同じ条件、例として、低酸素状態、高血糖、乳酸などの条件下で培養される細胞から得られる。
用語「トロラミン（Trolamine）」は、本明細書において、トロラミンNF、トリエタノールアミン、TEALAN(登録商標)、TEAlan、99％、トリエタノールアミン、99％、トリエタノールアミン、NF又はトリエタノールアミン、99％、NFを指す。これらの用語は、本明細書において互換的に用いることができる。
用語「ゲノム」は、生物学的実体（細胞、組織、器官、系、生物）の遺伝情報の全体を指す。これは、DNA又はRNA（例えば、特定のウイルスにおける）のいずれかにおいてコードされる。ゲノムは、DNAの遺伝子及び非コード配列の両方を包含する。
用語「プロテオーム」は、所定の時間においてゲノム、細胞、組織又は生物により発現されるタンパク質の全セットを指す。より具体的には、これは、所定の時間に定義された条件下で所定の種類の細胞又は生物において発現されたタンパク質の全セットを指すことができる。プロテオームは、例えば、遺伝子の選択的スプライシング及び/又は翻訳後修飾（グリコシル化又はリン酸化等）によるタンパク質バリアントを包含することができる。
用語「トランスクリプトーム」は、所定の時間において1個の細胞又は細胞集団において産生される、mRNA、rRNA、tRNA、microRNA、及び他の非コードRNAを包含する転写されたRNA分子の全セットを指す。この用語は、所定の生物における転写物の総セット、又は特定の細胞型に存在する転写物の特異的な部分集合に適用することができる。所定の細胞株に緩やかに固定された（突然変異を除く）ゲノムとは異なり、トランスクリプトームは、外部環境条件に伴って変動し得る。これは、細胞におけるあらゆるmRNA転写物を包含するため、トランスクリプトームは、転写減衰等、mRNA分解現象を例外として、所定の時間において活発に発現されている遺伝子を反映する。
発現プロファイリングとも称されるトランスクリプトミクスの研究は、多くの場合、DNAマイクロアレイ技術に基づくハイスループット技法を用いて、所定の細胞集団におけるmRNAの発現レベルを試験する。
用語「メタボローム」は、所定の時間に所定の条件下で単一の生物等、生物学的サンプル内に見出された小分子代謝物（代謝性中間体、ホルモン及び他のシグナル伝達分子並びに二次代謝物等）の完全セットを指す。メタボロームは動的であり、刻一刻と変化し得る。
用語「リピドーム（lipidome）」は、所定の時間に所定の条件下で単一の生物等、生物学的サンプル内に見出された脂質の完全セットを指す。リピドームは動的であり、刻一刻と変化し得る。
用語「インタラクトーム」は、研究対象の生物学的システム（例えば、細胞）における分子相互作用の全体のセットを指す。これは、有向グラフとして表示することができる。分子相互作用は、異なる生化学的ファミリー（タンパク質、核酸、脂質、炭水化物等）に属する分子の間で、また、所定のファミリー内で起こり得る。プロテオミクスの観点から述べると、インタラクトームは、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク（PPI）又はタンパク質相互作用ネットワーク（PIN）を指す。別の広範に研究されている種類のインタラクトームは、タンパク質-DNAインタラクトーム（転写因子（及びDNA又はクロマチン調節タンパク質）及びその標的遺伝子により形成されたネットワーク）である。
用語「細胞出力」は、1種以上の遺伝子の転写レベル（例えば、RT-PCR、qPCR、マイクロアレイ等により測定可能）、1種以上のタンパク質の発現レベル（例えば、質量分析又はウェスタンブロットにより測定可能）、1種以上の酵素又はタンパク質の絶対活性（例えば、基質変換速度として測定可能）又は相対活性（例えば、最大活性と比較した％値として測定可能）、1種以上の代謝物又は中間体のレベル、酸化的リン酸化のレベル（例えば、酸素消費速度、すなわちOCRにより測定可能）、解糖のレベル（例えば、細胞外酸性化速度、すなわちECARにより測定可能）、リガンド-標的結合又は相互作用の程度、細胞外分泌分子の活性等を包含する（これらに限定されない）、細胞状態に関係するパラメータ、好ましくは測定可能パラメータの収集を包含する。細胞出力は、標的遺伝子又はタンパク質等の予め定められた数のデータを包含し得る、あるいはあらゆる検出可能な遺伝子又はタンパク質の網羅的評価を包含し得る。例えば、質量分析を用いて、サンプル又は細胞集団においていかなる特異的タンパク質が発現され得るかに関する先行する知識を用いることなく、所定のサンプル又は細胞集団において発現されるあらゆる検出可能なタンパク質を同定及び/又は定量化することができる。
本明細書において、「細胞系」は、均一又は不均一細胞の集団を包含する。系内の細胞は、in vivoで、天然又は生理的環境下で成長することができる、あるいは例えば、制御された組織培養環境においてin vitroで成長することができる。系内の細胞は、相対的に均一（例えば、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％以上均一）となり得る、あるいは通常in vivoでごく近接して成長することが見出される細胞型又は例えばパラ分泌若しくは他の長距離細胞間情報伝達により互いにin vivoで相互作用し得る細胞型等、2種以上の細胞型を含有し得る。細胞系内の細胞は、癌細胞株、不死細胞株又は正常細胞株を包含する、樹立細胞株に由来し得る、あるいは初代細胞又は生きた組織若しくは器官から新鮮に単離された細胞となり得る。
細胞系における細胞は、典型的には、細胞挙動に影響を与える条件を定義することのできる、栄養素、気体（酸素又はCO2等）、化学物質又はタンパク質性/非タンパク質性刺激物質をもたらし得る「細胞環境」と接触する。細胞環境は、定義された化学的構成要素及び/又はあまり定義されていない組織抽出物若しくは血清構成要素を有する化学的培地となることができ、細胞が成長する特異的pH、CO2含量、圧力及び温度を包含することができる。あるいは、細胞環境は、特異的細胞系のin vivoにおいて見出される天然又は生理的環境となり得る。
特定の実施形態において、細胞環境は、生物学的システム又はプロセスの側面をシミュレートする条件、例えば、疾患状態、プロセス又は環境をシミュレートする条件を含む。かかる培養条件は、例えば、高血糖、低酸素又は乳酸富化条件を包含する。多数の他のかかる条件は、本明細書に記載されている。
特定の実施形態において、特異的細胞系の細胞環境は、細胞表面上の受容体又はリガンドの種類及びその個々の活性、炭水化物又は脂質分子の構造、膜極性又は流動性、特定の膜タンパク質のクラスター形成の状態等、細胞系の特定の細胞表面特色も包含する。これらの細胞表面特色は、異なる細胞系に属する細胞等、近隣の細胞の機能に影響を与えることができる。しかし、特定の他の実施形態において、細胞系の細胞環境は、細胞系の細胞表面特色を包含しない。
細胞環境が変更されて、「修飾された細胞環境」となり得る。変更は、細胞環境への1種以上の「外部刺激構成要素」の添加を包含する、細胞環境に見出されるいずれか1種以上の構成要素の変化（例えば、増加又は減少）を包含し得る。環境変動又は外部刺激構成要素は、細胞環境に対し内因性であっても（例えば、細胞環境は、あるレベルの刺激物質を含有し、これが更に添加されて、そのレベルを増加させる）、細胞環境に対し外因性であってもよい（例えば、刺激物質は、変更前の細胞環境には殆ど存在しない）。外部刺激構成要素は、細胞系により細胞環境へと分泌される分子を包含する細胞系の細胞出力を変化させ得るため、細胞環境は、外部刺激構成要素の添加に起因する二次変化により更に変更され得る。
本明細書において、本明細書において「環境変動」とも称される「外部刺激構成要素」は、細胞機能に影響を与え得るいずれかの外部物理学的及び/又は化学的刺激を包含する。これは、いずれかの大型又は小型の有機又は無機分子、天然又は合成化学物質、温度シフト、pH変化、放射線照射、光（UVA、UVB等）、マイクロ波、音波、電流、変調された又は変調されていない磁場等を包含し得る。
用語「多次元細胞内分子（Multidimensional Intracellular Molecule）（MIM）」は、体内で天然に産生された及び/又はヒトの少なくとも1個の細胞に存在する内因性分子の単離されたバージョン又は合成により産生されたバージョンである。MIMは、細胞に進入することができ、細胞への進入は、分子の生物学的活性部分が全体的に細胞に進入するのであれば、細胞への完全又は部分的な進入を包含する。MIMは、細胞内のシグナル伝達及び/又は遺伝子発現機序を誘導することができる。分子は、治療及びキャリア、例えば、薬物送達効果の両方を有するため、MIMは多次元的である。同様に分子は、一方では疾患状態において、異なる一方では正常状態において作用するため、MIMは多次元的である。例えば、CoQ-10の場合、VEGFの存在下におけるメラノーマ細胞へのCoQ-10の投与は、Bcl2のレベル減少をもたらし、これは次に、メラノーマ細胞の発癌潜在力減少をもたらす。対照的に、正常線維芽細胞において、CoQ-10及びVEFGの同時投与は、Bcl2のレベルに影響がない。
一実施形態において、MIMはまた、エピシフターである。別の一実施形態において、MIMは、エピシフターではない。別の一実施形態において、MIMは、前述の機能のうち1種以上により特徴付けられる。別の一実施形態において、MIMは、前述の機能のうち2種以上により特徴付けられる。更に別の一実施形態において、MIMは、前述の機能のうち3種以上により特徴付けられる。更にまた別の一実施形態において、MIMは、前述の機能のうち全種により特徴付けられる。当業者であれば、本発明のMIMが、2種以上の内因性分子の混合物を包含することも企図され、該混合物が、前述の機能のうち1種以上により特徴付けられることを理解するだろう。混合物における内因性分子は、混合物がMIMとして機能するような比率で存在する。
MIMは、脂質に基づく又は非脂質に基づく分子となり得る。MIMの例として、CoQ10、アセチルCo-A、パルミチル（palmityl）Co-A、L-カルニチン、例えば、チロシン、フェニルアラニン及びシステイン等のアミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、MIMは、小分子である。本発明の一実施形態において、MIMは、CoQ10ではない。MIMは、本明細書に詳細に記載されているアッセイのいずれかを用いて、当業者によってルーチンに同定することができる。MIMは、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を明確に使用する、米国特許出願第12/777,902号（米国特許出願公開第2011-0110914号）に更に詳細に記載されている。
本明細書において、「エピメタボリックシフター（epimetabolic shifter）」（エピシフター）は、健康（又は正常）状態から疾患状態への（逆も同様）代謝性シフトをモジュレートして、これにより、ヒトにおける細胞、組織、器官、系及び/又は宿主健康を維持又は再建する分子である。エピシフターは、組織微小環境における正常化を実現することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加される又はこれから枯渇させると、細胞の微小環境（例えば、代謝状態）に影響を与えることができるいずれかの分子を包含する。当業者であれば、本発明のエピシフターが、2種以上分子の混合物を包含することも企図されており、該混合物が、前述の機能のうち1種以上により特徴付けられることを理解するだろう。混合物における分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比率で存在する。エピシフターの例として、CoQ-10；ビタミンD3；フィブロネクチン等のECM構成要素；TNFa又はインターロイキンのいずれか、例えば、IL-5、IL-12、IL-23等の免疫モジュレーター；血管新生因子；及びアポトーシス因子が挙げられるがこれらに限定されない。
一実施形態において、エピシフターもMIMである。一実施形態において、エピシフターは、CoQ10ではない。エピシフターは、本明細書に詳細に記載されているアッセイのいずれかを用いて、当業者によってルーチンに同定することができる。エピシフターは、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を明確に援用する、米国特許出願第12/777,902号（米国特許出願公開第2011-0110914号）に更に詳細に記載されている。
本出願において明確に定義されていない他の用語は、当業者によって理解され得る意義を有する。
III. プラットフォーム技術の例示的なステップ及び構成要素
単なる例証目的のために、対象プラットフォーム技術の次のステップは、特注（custom built）の薬物誘発毒性モデルから得られるデータを統合するため及び薬物誘発毒性の病理発生を駆動する新規タンパク質/経路を同定するための例示的な有用性として本明細書において下に記載され得る。この解析によってもたらされる関連性マップは、薬物誘発毒性の処置標的と共に薬物誘発毒性に関連する診断/予後マーカーを提供する。しかし、対象プラットフォーム技術は、いかなる薬物誘発毒性に対しても一般適用性を有し、いかなる特定の薬物誘発毒性又は他の特異的薬物誘発毒性モデルにも限定されない。
加えて、下の説明は、一部において個別のステップとして提示されているが、これは例証目的及び単純性のためであり、よって、現実的には、ステップのかかる厳正な順序及び/又は区分を暗示しない。更に、本発明のステップは別々に実施することができ、本明細書に提供されている本発明は、対象プラットフォーム技術の個々のステップそれぞれ別々を、また、残りのステップと独立的に行ってよい1種以上のステップ（例えば、いずれか1、2、3、4、5、6又は全7ステップ）の組み合わせを包含することが企図されている。
本発明は、また、薬物誘発毒性プラットフォーム技術のあらゆる態様を別々の構成要素及び本発明の実施形態として包含することが企図されている。例えば、作成されたデータセットは、本発明の実施形態であることが企図されている。更に別の例として、作成された因果関係ネットワーク、作成されたコンセンサス因果関係ネットワーク及び/又は作成されたシミュレートされた因果関係ネットワークもまた、本発明の実施形態であることが企図されている。薬物誘発毒性システムに特有であると同定された因果関係は、本発明の実施形態であることが企図されている。更に、特定の薬物誘発毒性システムの特注のモデルもまた、本発明の実施形態であることが企図されている。例えば薬物の毒性（例えば、心臓毒性）の特注のモデル等、例えば、薬物誘発毒性状態又はプロセスの特注のモデルもまた、本発明の実施形態であることが企図されている。
A. カスタムモデル構築
プラットフォーム技術における最初のステップは、薬物誘発毒性システム又はプロセスのモデルの確立である。薬物誘発毒性システム又はプロセスの例は心臓毒性である。他の複雑な生物学的プロセス又はシステムと同様に、心臓毒性は、複数の特有の側面を特徴とする複雑な病的状態である。例えば、非脂肪組織（心臓及び肝臓）における取り込み、利用、オルガネラ構築及び分泌の慢性的な不均衡が、ミトコンドリアの損傷及び機能不全の中心にあり、薬物誘発心臓毒性において重要な役割を果たしていると考えられる。この目的のため、糖尿病及び正常の心筋細胞を含むカスタム心臓毒性モデルを確立して、心臓毒性の環境を、例えば心臓毒性を受ける心臓細胞の条件に非常に近似する細胞培養条件を創出することにより、シミュレートする。1以上の関連する種類の細胞、例えば、心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞又は筋芽細胞などを、このモデルにおいて使用することができる。
かかる「環境」又は成長ストレス条件の1つは、低酸素であり、これは、いくつかの疾患状態及び後期糖尿病において、又は虚血及び循環不良に起因する心血管系疾患において典型的に見られる条件である。低酸素は、当該技術分野において認識される方法を用いて細胞において誘導することができる。例えば、低酸素は、5％CO2、2％O2及び93％窒素を含有する工業用ガス混合物を充満させることができる、モジュラーインキュベーターチャンバー（Modular Incubator Chamber）（MIC-101、Billups-Rothenberg Inc.、カリフォルニア州デル・マー）内に細胞系を置くことにより誘導することができる。影響は、追加的な外部刺激構成要素あり及びなしで（例えば、0、50又は100μMのCoQ10）、低酸素処理後の予め定められた期間の後、例えば、24時間目に測定することができる。
同様に、細胞の乳酸処理は、解糖活性が高い細胞環境を模倣する。乳酸に誘導されたストレスは、追加的な外部刺激構成要素あり又はなしで（例えば、0、50又は100μMのCoQ10）、約12.5mMの最終乳酸濃度で、予め定められた時間、例えば、24時間目に調査することができる。
高血糖は、正常には、糖尿病に見出される状態である。高グルコースは、細胞代謝を変化させることが知られているため、糖尿病の治療薬は、高血糖条件下で培養した細胞において試験することができる。典型的高血糖条件への対象細胞の曝露は、培地におけるグルコースの最終濃度が約22mMになるような、適した培地への10％培養グレードのグルコースの添加を包含し得る。しかしながら、2型糖尿病を有する対象は、高頻度で過体重又は肥満であるため、他の疾患又は状態について、他の薬剤、例えば抗炎症剤による関節炎の処置、コレステロール低下剤、血圧低下剤若しくは抗凝血剤による心血管系疾患の処置など、処置されていることが多い。したがって、特注のモデルを用いて、他の疾患又は状態をも有している、第1の薬剤による第1の状態について処置すべき対象と比較して、正常対象における薬物毒性を評価することができる。例えば、高血糖条件に暴露されていない又は暴露された細胞を一緒に試験して、糖尿病を有する対象又は有しない対象における薬物の差示的な毒性を検出することができる。
高脂血症は、例えば、肥満及び心血管系疾患に見出される状態である。高脂血症はまた、心臓毒性の一側面を模倣する状態でもある。高脂血症状態は、0.15mMパルミチン酸ナトリウムを含有する培地において細胞を培養することによりもたらすことができる。
毒性の異なる側面を反映する個々の条件は、特注の毒性モデルにおいて別々に調査することができる、及び/又は一体に組み合わせることができる。一実施形態において、毒性条件の異なる側面を反映又はシミュレートする少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50種以上の条件の組み合わせが、特注の毒性モデルにおいて調査される。一実施形態において、個々の条件と、加えて、毒性条件の異なる側面を反映又はシミュレートする条件のうち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50種以上の組み合わせが、特注の毒性モデルにおいて調査される。前述のリストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限となることもでき、例えば、1〜5、1〜10、1〜20、1〜30、2〜5、2〜10、5〜10、1〜20、5〜20、10〜20、10〜25、10〜30又は10〜50種の間の異なる条件となることができる。
本明細書において、薬物誘発毒性モデルの構築のために、細胞の処理に用いることのできる条件のいくつかの例示的な組み合わせを下に列挙する。他の組み合わせは、行われている特異的な照合による生物学的評価に応じて容易に考案することができる。
1. 培地のみ
2. 50μM CTLコエンザイムQ10（CoQ10）
3. 100μM CTLコエンザイムQ10
4. 12.5mM乳酸
5. 12.5mM乳酸＋50μM CTLコエンザイムQ10
6. 12.5mM乳酸＋100μM CTLコエンザイムQ10
7. 低酸素
8. 低酸素＋50μM CTLコエンザイムQ10
9. 低酸素＋100μM CTLコエンザイムQ10
10. 低酸素＋12.5mM乳酸
11. 低酸素＋12.5mM乳酸＋50μM CTLコエンザイムQ10
12. 低酸素＋12.5mM乳酸＋100μM CTLコエンザイムQ10
13. 培地＋22mMグルコース
14. 50μM CTLコエンザイムQ10＋22mMグルコース
15. 100μM CTLコエンザイムQ10＋22mMグルコース
16. 12.5mM乳酸＋22mMグルコース
17. 12.5mM乳酸＋22mMグルコース＋50μM CTLコエンザイムQ10
18. 12.5mM乳酸＋22mMグルコース＋100μM CTLコエンザイムQ10
19. 低酸素＋22mMグルコース
20. 低酸素＋22mMグルコース＋50μM CTLコエンザイムQ10
21. 低酸素＋22mMグルコース＋100μM CTLコエンザイムQ10
22. 低酸素＋12.5mM乳酸＋22mMグルコース
23. 低酸素＋12.5mM乳酸＋22mMグルコース＋50μM CTLコエンザイムQ10
24. 低酸素＋12.5mM乳酸＋22mMグルコース＋100μM CTLコエンザイムQ10。
毒性特有のタンパク質又は経路（下を参照）を同定するため、対照として、1種以上の細胞株（例えば、心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞又は筋芽細胞）を対照条件下で培養する。対照は、上述の比較細胞モデルとなり得る。
同じ又は異なる起源の複数の細胞（例えば、心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞又は筋芽細胞）は、単一の細胞型とは対照的に、毒性モデルに包含され得る。特定の状況において、異なる細胞（心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞又は筋芽細胞）間のクロストーク又はECS実験は、いくつかの相互に関係する目的で行うことができる。
クロストークに関与する一部の実施形態において、定義された処理条件（例えば、高血糖、低酸素（虚血））下における、別の細胞系又は集団（例えば、糖尿病性心筋細胞）による、ある細胞系又は集団（例えば、心筋細胞）の細胞の状態又は機能のモジュレーションを決定するために、細胞モデルにおいて行われる実験が設計される。典型的な設定に従うと、第1の細胞系/集団は、候補分子（例えば、薬物小分子、タンパク質）又は候補条件（例えば、低酸素、高グルコース環境）等、外部刺激構成要素に接触される。それに応答して、第1の細胞系/集団は、そのトランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム及び/又はインタラクトームを変化させて、細胞内部及び外部の両方で容易に検出することができる変化を生じる。例えば、トランスクリプトームの変化は、複数の標的mRNAの転写レベルにより測定することができ、プロテオームの変化は、複数の標的タンパク質の発現レベルにより測定することができ、メタボロームの変化は、所定の代謝物に特異的に設計されたアッセイによる複数の標的代謝物のレベルにより測定することができる。あるいは、少なくとも特定の分泌された代謝物又はタンパク質に関するメタボローム及び/又はプロテオームの上述の変化は、第2の細胞系/集団のトランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム及びインタラクトームのモジュレーションを包含する、第2の細胞系/集団に対するその影響により測定することもできる。従って、実験は、異なる処理条件下における、第2の細胞系/集団に対する第1の細胞系/集団により分泌された対象の分子（複数可）の影響の同定に用いることができる。実験は、例えば、プロテオミクスの差次的スクリーニングにより、第1の細胞系（外部刺激構成要素処理に応答した）から別の細胞系へのシグナル伝達の結果モジュレートされる、いずれかのタンパク質の同定に用いることもできる。2種の細胞系の間の相反効果を評価することもできるように、同じ実験設定を逆の設定に適応させることもできる。一般に、この種の実験に関して、細胞株ペアの選択の大部分は、起源、毒性状態及び細胞機能等の因子に基づく。
2細胞系は、典型的にはこの種の実験設定に関与するが、例えば、別々の固体支持体に別個の細胞系それぞれを固定化することにより、3種以上の細胞系のために同様の実験を設計することもできる。
カスタムモデルを組み立てたら、患者間の遺伝的変動又は特定の薬物若しくはプロドラッグによる処置あり/なし等、1種以上の「変動」をシステムに適用することができる。図15Dを参照されたい。薬物誘発毒性に関係する細胞及び正常対照細胞に対する影響を包含する、システムに対するかかる変動の影響は、下のセクションIII.Bに記載されている、当該技術分野において認識されている又は専売の（proprietary）様々な手段を用いて測定することができる。
例示的な実験において、心筋細胞は、高血糖及び高脂血症条件において、加えて、環境変動、具体的には心臓毒性を誘導することが知られている糖尿病薬及び／又は可能性のあるレスキュー薬であるコエンザイムQ10による処理あり又はなしで条件付けされる。
本明細書に記載されているステップを行うことにより、特注の細胞モデルを確立して、これを本発明のプラットフォーム技術のステップを通じて用いて、最終的に薬物誘発毒性システムに特有の因果関係を同定することができる。しかし、当業者であれば、薬物誘発毒性の初期「第1世代」コンセンサス因果関係ネットワークの作成に用いられる特注の細胞モデルが、例えば、追加的な薬物誘発毒性関連細胞株及び/又は追加的な薬物誘発毒性条件の導入により、連続的に進化又は経時的に拡張させることができることを理解できよう。進化した細胞モデルから得られた追加的なデータ、すなわち、細胞モデルの新たに加えられた部分（複数可）から得たデータを収集することができる。続いて、より強固な「第2世代」コンセンサス因果関係ネットワークを作成するために、拡張又は進化した細胞モデル、すなわち、細胞モデルの新たに加えられた部分（複数可）から収集された新たなデータを、「第1世代」コンセンサス因果関係ネットワークの作成に以前に用いたデータセットに導入することができる。続いて、「第2世代」コンセンサス因果関係ネットワークから、薬物誘発毒性に特有の新たな因果関係を同定することができる。このようにして、細胞モデルの進化は、コンセンサス因果関係ネットワークの進化をもたらし、これにより、薬物誘発毒性のモジュレーターに関する新たな及び/又はより信頼のおける洞察をもたらす。
カスタムモデルはまた、併用される薬物の毒性を評価するために設計することも可能である。例えば、癌、自己免疫疾患又はHIVを含むいくつかの状態の処置のための治療薬は、典型的には併用薬物のカクテル（混合液）として投与される。さらに、多くの対象は、同時に処置すべき複数の非関連状態（例えば、糖尿病、関節炎、心血管系疾患）を有することがある。正常細胞において又は種々の培養条件に供した細胞においてモデルを構築して、同時に投与した場合に毒性を生じる可能性がある薬物の組み合わせを同定することができる。したがって、提供される方法は、薬物の組み合わせ（例として、2、3、4、5、6、7、8又はそれ以上）を一緒に試験して、その組み合わせが、単独では毒性を生じない薬物も含めて、薬物に関連した毒性を生じるかどうかを決定することを含む。
投与される又は投与が考慮される薬物の具体的な組み合わせを本明細書で提供する方法を用いて試験して、その薬物の組み合わせが許容できない毒性を有する可能性があるかどうかを決定することができる、「個別化医療（オーダーメード医療）」用途のために、モデルを構築することもできる。そのような組み合わせは、目的の対象を模倣する種々の条件下で増殖させた（例として、糖尿病を有する対象については高グルコースで、又は虚血を有する対象については低酸素状態で増殖させた）、種々の細胞型（例として、心臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、筋細胞、肝細胞；細胞系であっても、又は対象からの初代培養細胞であってもよい）において試験することができる。
特注の細胞モデルの追加的な例は、本明細書において詳細に記載されている。
B. データ収集
一般に、いずれかの特注のモデルシステムから2種類のデータを収集することができる。1種類のデータ（例えば、第1のデータセット、第3のデータセット）は通常、DNA、RNA、タンパク質、脂質等、特定の高分子のレベルに関係する。このカテゴリーにおける例示的なデータセットは、プロテオミクスデータ（例えば、サンプル由来のすべて又は実質的にすべての測定可能タンパク質の発現に関する定性的及び定量的データ）である。他の種類のデータは、一般に、第1の種類のデータの変化に起因する表現型変化を反映する機能データ（例えば、第2のデータセット、第4のデータセット）である。細胞の機能活性又は細胞応答としては、生体エネルギー、細胞増殖、アポトーシス、オルガネラ機能、ATP、ROS、OXPHOS及びSeahorseアッセイから選択される機能モデルによって実現される遺伝子型-表現型相関性、網羅的酵素活性（例として、網羅的キナーゼ活性）、並びに薬物誘発毒性と関連した細胞の酵素代謝基質に対する網羅的酵素活性の影響（例として、ホスホプロテオミクスデータ）のいずれか1以上が挙げられる。
第1の種類のデータに関して、一部の例の実施形態において、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）及びプロテオミクスが実施されて、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）及びプロテオミクスによる細胞mRNA及びタンパク質発現の変化をプロファイリングする。全RNAは、市販のRNA単離キットを用いて単離することができる。cDNA合成後に、血管新生、アポトーシス及び糖尿病等、疾患領域又は細胞プロセスに特異的な市販のqPCRアレイ（例えば、SA Biosciences製）を用いて、メーカーの説明書に従って遺伝子の予め定められたセットをプロファイリングすることができる。例えば、Biorad cfx-384増幅システムは、あらゆる転写プロファイリング実験に用いることができる。データ収集（Ct）後に、メーカーのプロトコールに概要が述べられているδCt方法を用いて、対照に対する最終倍数変化を決定することができる。プロテオミクスサンプル解析は、後続のセクションに記載されている通りに実施することができる。
対象方法は、同様の特性の数百種のサンプルの大規模ハイスループット定量的プロテオミクス解析を用いることができ、細胞出力差次の同定に必要なデータをもたらす。
この目的に適した多数の当該技術分野において認識されている技術が存在する。例示的な技法である、質量分析と組み合わせたiTRAQ解析を下に簡潔に記載する。
定量的プロテオミクスアプローチは、8-plex iTRAQ試薬による安定的同位体標識と、ペプチド同定及び定量化のための2D-LC MALDI MS/MSに基づく。この技法による定量化は相対的である。すなわちペプチド及びタンパク質は、参照サンプルに相対的な存在比を割り当てられる。複数のiTRAQ実験における共通参照サンプルは、複数のiTRAQ実験にわたるサンプルの比較を容易にする。
例えば、この解析スキームを実行するため、メーカーの示唆するところに従って、6種の一次サンプル及び2種の対照プールサンプルを8-plex iTRAQミックスに組み合わせることができる。続いて、8種のサンプルのこの混合物を二次元液体クロマトグラフィー（一次元目に強（strong）カチオン交換（SCX）、二次元目に逆相HPLC）により分画することができ、次いで質量分析による解析に付すことができる。
用いることのできる例示的な研究室手順の概略は、本明細書に提供されている。
タンパク質抽出：細胞をプロテアーゼ阻害剤（Thermo Scientific Haltプロテアーゼ阻害剤EDTAフリー）を含む8M尿素溶解バッファーにより溶解し、10分毎に5秒間ボルテックス（vertex）しつつ、氷上で30分間インキュベートすることができる。5秒間パルスの超音波処理により溶解を完了することができる。細胞ライセートを14000×gで15分間（4℃）遠心分離して、細胞デブリを除去することができる。ブラッドフォード（Bradford）アッセイを行って、タンパク質濃度の決定を実施することができる。各サンプル由来の100ugのタンパク質を還元（10mMジチオスレイトール（DTT）、55℃、1時間）し、アルキル化（25mMヨードアセトアミド、室温、30分間）し、トリプシンで消化（1:25w/w、200mM重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）、37℃、16時間）することができる。
セクレトームサンプル調製：1）一実施形態において、細胞を無血清培地において培養することができる。条件培地を凍結乾燥機により濃縮し、還元（10mMジチオスレイトール（DTT）、55℃、1時間）し、アルキル化（25mMヨードアセトアミド、室温にて30分間インキュベート）し、次いでアセトン（actone）沈殿により脱塩することができる。濃縮された条件培地由来の等量のタンパク質をトリプシンで消化（1:25 w/w、200mM重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）、37℃、16時間）することができる。
一実施形態において、細胞を血清含有培地において培養することができる。3k MWCO Vivaspinカラム（GE Healthcare Life Sciences）を用いて培地の容量を低下させ、次いで1×PBS（Invitrogen）で再構成することができる。AlbuVoidカラム（Biotech Support Group、LLC）を用いて、条件培地適用に最適化するためにバッファー交換を修正しつつメーカーの説明書に従って、全サンプルから血清アルブミンを枯渇させることができる。
iTRAQ 8 Plex標識：各実験セットにおける各トリプシン消化物由来のアリコートを一体にプールして、プールされた対照サンプルを作製することができる。メーカーのプロトコール（AB Sciex）に従ってiTRAQ 8 Plex試薬により、各サンプル及びプールされた対照サンプル由来の等量のアリコートを標識することができる。反応物を組み合わせ、減圧乾固し、0.1％ギ酸を添加することにより再懸濁し、LC-MS/MSにより解析することができる。
2D-NanoLC-MS/MS：全標識ペプチド混合物を、オンライン2D-nanoLCにより分離し、エレクトロスプレータンデム質量分析により解析することができる。実験は、ナノエレクトロスプレーイオン源（Thermo Electron、ドイツ、ブレーメン）を備えるLTQ Orbitrap Velos質量分析計に接続されたEksigent 2D NanoLC Ultraシステムにおいて行うことができる。
ペプチド混合物を、5cm SCXカラム（300μm ID、5μm、ポリスルホエチルアスパルトアミド（PolySULFOETHYL Aspartamide）カラム、PolyLC製、メリーランド州コロンビア）に流速4μL/分で注入し、10個のイオン交換溶出セグメントにおいてC18トラップカラム（2.5cm、100μm ID、5μm、300Å ProteoPep II、New Objective製、マサチューセッツ州ウォバーン）へと溶出させ、H2O/0.1％FAで5分間洗浄することができる。続いて、2〜45％のB（H2O/0.1％FA（溶媒A）及びACN/0.1％FA（溶媒B））の勾配を用いて300nL/分で120分間、15cm溶融石英カラム（75μm ID、5μm、300Å ProteoPep II、New Objective製、マサチューセッツ州ウォバーン）において分離を更に行うことができる。
Orbitrapにおいて分解能30,000により、フルスキャンMSスペクトル（m/z 300〜2000）を取得することができる。高エネルギーC-トラップ解離（HCD）を用いて断片化のために最も強いイオン（最大10種）を連続して単離し、30秒間動的に除外することができる。HCDは、単離幅1.2Daで行うことができる。orbitrapにおいて分解能7500により、得られた断片イオンをスキャンすることができる。LTQ Orbitrap Velosは、Xcalibur2.1とfoundation1.0.1により制御することができる。
ペプチド/タンパク質同定及び定量化：ペプチド及びタンパク質は、SwissProtデータベースに対するMascot検索エンジンを備えるProteome Discovererソフトウェア（Thermo Electron）を用いた自動データベース検索により同定することができる。検索パラメータは、MSトレランス（tolerance）に対し10ppm、MS2トレランスに対し0.02Da及び最大2個の切断見逃しを許す完全トリプシン消化を包含し得る。カルバミドメチル化（Carbamidomethylation）（C）は、固定された修飾として設定することができる。酸化（M）、TMT6及び脱アミド（NQ）は、動的な修飾として設定することができる。ペプチド及びタンパク質同定は、Mascot有意閾値（p<0.05）によりフィルターをかけることができる。フィルターは、タンパク質同定の99％信頼レベルを許可することができる（1％FDA）。
Proteome Discovererソフトウェアは、レポーターイオンに補正因子を適用することができ、あらゆる定量化チャネルが存在する訳でなければ、あらゆる定量化値を拒絶することができる。相対的タンパク質定量化は、平均強度における正規化により成し遂げることができる。
第2の種類のデータに関して、一部の例示的な実施形態において、癌及び正常モデルの生体エネルギープロファイリングは、Seahorse(商標)XF24分析計を用いて、解糖及び酸化的リン酸化構成要素の理解を可能にすることができる。
具体的には、Seahorse培養プレート上に最適密度で細胞を播種することができる。これらの細胞を100μlの培地又は処理溶液にプレーティングし、5％CO2を有する37℃インキュベーター内に配置することができる。2時間後、細胞を24ウェルプレートに接着させる際に、追加的な150μlの培地又は処理溶液のいずれかを添加し、プレートを培養インキュベーター内に一晩放置することができる。この二段階播種手順は、培養プレートにおける細胞の均等な分布を可能にする。酸素及びpHのセンサーを含有するSeahorseカートリッジは、37℃の非CO2インキュベーター内で較正液において一晩給水させることができる。3種のミトコンドリア薬が、典型的に、カートリッジにおける3種のポートにロードされる。オリゴマイシン；複合体III阻害剤、FCCP；脱共役剤及びロテノン；複合体I阻害剤を、カートリッジのそれぞれポートA、B及びCにロードすることができる。全ストック薬は、緩衝化されていない（unbuffered）DMEM培地において10×濃度で調製することができる。まず、カートリッジを、非CO2インキュベーター内でアッセイ前に約15分間ミトコンドリア化合物と共にインキュベートすることができる。Seahorse培養プレートは、正常増殖培地に見出される濃度のグルコースを含有する、DMEMに基づく非緩衝化培地において洗浄することができる。細胞を630ulの非緩衝化培地で積層し、前較正したカートリッジを備えるSeahorse機器に置く前に非CO2インキュベーター内で平衡化（equilibriate）することができる。機器は、ポートを通した薬物の注入が始まる前に、ベースラインを得るために混合、待機及び測定サイクルによる3〜4ループを作動することができる。次の薬物が導入される前に2ループがあってもよい。
OCR（酸素消費速度）及びECAR（細胞外（Extracullular）酸性化速度）を、7μlチャンバーにおける電極により記録し、seahorse培養プレートに押しつけるカートリッジにより創出することができる。
C. データ統合及びin silicoモデル作成
関連するデータセットが得られたら、AIに基づくインフォマティクスシステム又はプラットフォーム（例えば、REFS(商標)プラットフォーム）を用いて、データセットの統合及びコンピュータ実行統計モデルの作成を実施することができる。例えば、例示的なAIに基づくシステムは、代謝性エンドポイント（ECAR/OCR）の主要なドライバーとしてタンパク質関連のシミュレーションに基づくネットワークを作り出すことができる。図15を参照されたい。REFS(商標)システムに関するいくつかの背景詳細は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてこれらそれぞれの内容全体を明確に援用する、Xingら、「Causal Modeling Using Network Ensemble Simulations of Genetic and Gene Expression Data Predicts Genes Involved in Rheumatoid Arthritis」、PLoS Computational Biology、7巻、3号、1〜19(2011年3月)(e100105)及び米国特許第7,512,497号（Periwal）に見出すことができる。要するに、先に記載されている通り、REFS(商標)システムは、数学的アルゴリズムを用いて入力変数（例えば、タンパク質発現レベル、mRNA発現レベル、及びSeahorse培養プレートにおいて測定されるOCR/ECAR値等の対応する機能データ）間の因果関係を確立する、AIに基づくシステムである。このプロセスは、潜在的な、確立された及び/又は確認された生物学的関係性に関する先行する既存の知識を考慮することなく、入力データ単独のみに基づく。
特に、本発明のプラットフォームの顕著な利点は、AIに基づくシステムが、生物学的プロセスに関する当該技術分野におけるいかなる既存の知識に頼る又は考慮することもなく、細胞モデルから得られるデータセットに基づくことである。更に、好ましくはデータ点は、統計的に又は人為的にカットオフされず、代わりに、得られたデータは全て、タンパク質関連を決定するためにAIシステムに読み込まれる。従って、プラットフォームから作成された、その結果得られた統計モデルは、いかなる公知の生物学的関係性も考慮しないため先入観のない（不偏性）ものである。
具体的には、プロテオミクス及びECAR/OCR由来のデータは、上に記載されている通り、データ関連に基づき統計モデルを組み立てるAIに基づく情報システムに入力することができる。続いて、次の方法を用いて、タンパク質関連のシミュレーションに基づくネットワークが、処理及び条件を包含する疾患対正常シナリオ毎に導かれる。
作成された（例えば、最適化又は進化された）ネットワークを組み立てるための例示的なプロセスの詳細な説明を、図16に関して下に記す。上に記載されている通り、プロテオミクス由来のデータ及び機能的細胞データをAIに基づくシステムに入力する（ステップ210）。生データ又は最小処理データとなり得る入力データに、正規化を包含し得る前処理（pre-process）を行う（例えば、分位関数又は内部標準を用いる）（ステップ212）。前処理は、欠測データ値の帰属化（inputing）も包含し得る（例えば、K-最近傍（K-NN）アルゴリズムの使用による）（ステップ212）。
前処理されたデータを用いて、ネットワーク断片ライブラリーを構築する（ステップ214）。ネットワーク断片は、測定された変数（入力データ）のあらゆる可能な小セット（例えば、2〜3種のメンバーセット又は2〜4種のメンバーセット）の間の定量的、連続的な関係性を定義する。断片における変数間の関係性は、線形、ロジスティック、多項性、優性又は劣性ホモ結合性等となり得る。各断片における関係性に、候補関係性が入力データを与えられる可能性を反映し、また、その数学的複雑性のため関係性にペナルティーを科すベイズ確率スコアを割り当てる。入力データから推論される可能なペアワイズ及び3方向の関係性（及び一部の実施形態においては、4方向の関係性も）の全てのスコア化により、ライブラリーにおける最も可能性の高い断片を同定することができる（可能性の高い断片）。入力データに基づき関係性の定量的パラメータもコンピュータ処理し、断片毎に記憶する。断片列挙においては、線形回帰、ロジスティック回帰、（分散分析）ANOVAモデル、（共分散分析）ANCOVAモデル、非線形/多項式回帰モデル、更にはノンパラメトリック回帰等が挙げられるがこれらに限定されない、様々なモデル型を用いることができる。モデルパラメータに関する先の仮定は、モデルにおいて用いたパラメータ数に関係するガル（Gull）分布又はベイズ情報量基準（BIC）ペナルティーを仮定することができる。ネットワーク推論プロセスにおいて、断片ライブラリーにおける断片の部分集合から、初期試行ネットワークのアンサンブルにおける各ネットワークを構築する。断片ライブラリー由来の断片の異なる部分集合により、初期試行ネットワークのアンサンブルにおいて各初期試行ネットワークを構築する（ステップ216）。
Xingら、「Causal Modeling Using Network Ensemble Simulations of Genetic and Gene Expression Data Predicts Genes Involved in Rheumatoid Arthritis」、PLoS Computational Biology、7巻、3号、1〜19(2011年3月)(e100105)に基づく、ベイズネットワーク及びネットワーク断片の根底にある数学的表現の概説を下に提示する。
ランダム変数 X = X1, ..., Xn による多変量システムは、多数のパラメータΘを包含する多変量確率分布関数 P(X1, ..., Xn;Θ)により特徴付けることができる。多変量確率分布関数を因数分解し、ローカル条件付き確率分布の積により表すことができる：
Figure 2015520375
 （式中、各変数 Xiは、Yj1, ..., YjKiである、そのKi親変数を与えられたその非派生（descendent）変数とは独立的である）。因数分解後に、各ローカル確率分布は、それ自身のパラメータΘiを有する。
多変量確率分布関数は、異なる仕方で因数分解することができ、各特定の因数分解及び対応するパラメータは、別個の確率的モデルである。各特定の因数分解（モデル）は、変数 Xi毎の頂点及びローカル条件付き分布
Figure 2015520375
 における変数間の依存性を表す頂点間の有向性エッジを有する、有向非巡回グラフ（Directed Acrylic Graph）（DAC）で表すことができる。それぞれ頂点及び関連する有向性エッジを包含するDAGの部分グラフは、ネットワーク断片である。
モデルは、入力データに与えられる最も可能性の高い因数分解及び最も可能性の高いパラメータを決定することにより、進化又は最適化される。これは、「ベイズネットワークの学習」として記載することができる、あるいは言い換えると、入力データのトレーニングセットを与えると、入力データに最もよく適合するネットワークを見出す。これは、入力データに関して各ネットワークを評定するスコア化関数を用いることにより達成される。
ベイズフレームワークを用いて、入力データを与えられた因数分解の尤度を決定する。ベイズ法は、データDを与えられたモデルMの事後確率P(D|M) が、モデルの事前確率P(M)を乗じたモデル仮定を与えられたデータの事後確率 P(D|M) の積の積に比例すると述べ、データの確率P（D）が、モデルにわたって一定であることを仮定する。これは、次の方程式：
Figure 2015520375
 において表現される。モデルを仮定するデータの事後確率は、パラメータの事前分布にわたるデータ尤度の積分：
Figure 2015520375
 である。あらゆるモデルに等しく可能性がある（すなわち、P(M)が定数である）と仮定すると、データDを与えられたモデルMの事後確率は、次式：
Figure 2015520375
 の通り、ローカルネットワーク断片Mi毎のパラメータにわたる積分の積に因数分解される。上の方程式において、最高次の定数項が省略されていることに留意されたい。一部の実施形態において、モデルの事後確率 P(D|M) の負の対数を取るベイズ情報量基準（BIC）を用いて、次式：
Figure 2015520375
 （式中、モデルMの総スコアStotは、ローカルネットワーク断片毎のローカルスコアSiの和である）の通り、各モデルを「スコア化」することができる。BICは、個々のネットワーク断片毎のスコアを決定するための表現を更に与える：
Figure 2015520375
 （式中、κ(Mi)は、モデルMiにおける適合パラメータの数であり、Nは、サンプル（データ点）の数である）。SMLE(Mi)は、ネットワーク断片毎に用いた機能的関係性から計算することのできる、ネットワーク断片の尤度関数の負の対数である。BICスコアに関して、スコアが低い程、モデルが入力データに一致する可能性が高くなる。
試行ネットワークのアンサンブルは網羅的に最適化され、これを最適化又は進化ネットワークとして記載することができる（ステップ218）。例えば、試行ネットワークは、メトロポリスモンテカルロ（Metropolis Monte Carlo）サンプリングアルゴリズムに従って進化及び最適化させることができる。シミュレートされたアニーリングを用いて、ローカル変換によりアンサンブルにおける各試行ネットワークを最適化又は進化させることができる。シミュレートされたアニーリングプロセスの一例において、各試行ネットワークは、ライブラリーからネットワーク断片を加えることにより、試行ネットワークからネットワーク断片を削除することにより、ネットワーク断片を置換することにより、あるいは他の仕方でネットワークトポロジーを変化させることにより変化され、次いでネットワークの新たなスコアが計算される。一般的に言えば、スコアが改善する場合、変化は続けられ、スコアが悪化する場合、変化は拒絶される。「温度」パラメータは、スコアを悪化させる一部のローカル変化を続けさせ、これは、一部のローカル最小値の回避における最適化プロセスを助ける。「温度」パラメータは、経時的に減少して、最適化/進化プロセスを収束させる。
ネットワーク推論プロセスの全て又は一部は、異なる試行ネットワークのために並行して行うことができる。各ネットワークは、別々のプロセッサ及び/又は別々の計算装置において並行して最適化することができる。一部の実施形態において、最適化プロセスは、並行して操作する数百から数千個のプロセッサを取り込むスーパーコンピュータにおいて行うことができる。情報は、並行プロセッサにおいて行われる最適化プロセスの間で共有することができる。
最適化プロセスは、スコア全体に関して閾値標準を満たさないあらゆるネットワークをアンサンブルから落すネットワークフィルターを包含し得る。落されたネットワークは、新たな初期ネットワークに置き換えることができる。更に、「スケールフリー」ではないあらゆるネットワークをアンサンブルから落すことができる。ネットワークのアンサンブルが最適化又は進化された後、その結果を作成された細胞モデルネットワークのアンサンブルと呼ぶことができ、これは、作成されたコンセンサスネットワークとまとめて称することができる。
D. 定量的関係性情報を抽出するため及び予測のためのシミュレーション
シミュレーションを用いて、作成された細胞モデルネットワークにおける各関係性に関する定量的パラメータ情報を抽出することができる（ステップ220）。例えば、定量的情報抽出のためのシミュレーションは、ネットワークにおける各ノードの10倍の変動（増加又は減少）及びモデルにおける他のノード（例えば、タンパク質）の事後分布の計算に関与し得る。1群当たり100サンプルの仮定及び0.01有意性カットオフによるt検定により、エンドポイントを比較する。t検定統計値は、100回のt検定の中央値である。このシミュレーション技法の使用により、予測の強度を表すAUC（曲線下面積）及びエンドポイントを駆動するノードのin silico規模を表す倍数変化が、ネットワークのアンサンブルにおける関係性毎に作成される。
ローカルコンピュータシステムの関係性定量化モジュールを用いて、AIに基づくシステムに、変動を実施してAUC情報及び倍数情報を抽出するよう指示することができる。抽出された定量的情報は、親ノード（note）を子ノードに接続するエッジ毎の倍数変化及びAUCを包含し得る。一部の実施形態において、特注のRプログラムを用いて、定量的情報を抽出することができる。
一部の実施形態において、作成された細胞モデルネットワークのアンサンブルをシミュレーションにより用いて、条件の変化に対する応答を予測することができ、これは後に、ウェットラボの細胞に基づく又は動物に基づく実験により確認することができる。
AIに基づくシステムの出力は、定量的関係性パラメータ及び/又は他のシミュレーション予測となり得る（222）。
E. 差次的（デルタ）ネットワークの作成
差次的ネットワーク創出モジュールを用いて、作成された細胞モデルネットワーク及び作成された比較細胞モデルネットワークの間で差次的（デルタ）ネットワークを作成することができる。上に記載されている通り、一部の実施形態において、差次的ネットワークは、作成された細胞モデルネットワーク及び作成された比較細胞モデルネットワークにおける関係性の定量的パラメータの全てを比較する。差次的ネットワークにおける関係性毎の定量的パラメータは、比較に基づく。一部の実施形態において、差次は、デルタ-デルタネットワークと呼ぶことのできる様々な差次的ネットワークの間で実施することができる。デルタ-デルタネットワークの例は、実施例セクションにおいて図18に関して下に記載されている。差次的ネットワーク創出モジュールは、PERLで書かれたプログラム又はスクリプトとなり得る。
F. ネットワークの可視化
ネットワークのアンサンブル及び差次的ネットワークの関係性の値は、ネットワーク可視化プログラム（例えば、複雑なネットワーク解析のためのサイトスケープ（Cytoscape）オープンソースプラットフォーム及びサイトスケープ（Cytoscape）コンソーシアムからの可視化）を用いて可視化することができる。ネットワークの視覚的描写において、各エッジ（例えば、タンパク質を接続する各線）の密集度は、倍数変化の強度を表す。エッジは、因果関係を示す方向性でもあり、各エッジは、関連した予測信頼レベルを有する。
G. 例示的なコンピュータシステム
図17は、AIに基づくインフォマティクスシステムと通信するための、差次的ネットワークを作成するための、ネットワークを可視化するための、データをセーブ及び記憶するための、及び/又はユーザーと相互作用するための、一部の実施形態において用いることのできる例示的なコンピュータシステム/環境を模式的に描写する。上に説明されている通り、AIに基づくインフォマティクスシステムのための計算は、例示的なコンピュータシステムと直接的に又は間接的に相互作用する数百又は数千個の並行プロセッサを備える別々のスーパーコンピュータにおいて実施することができる。環境は、関連する周辺装置を備える計算装置100を包含する。計算装置100は、本明細書において教示されている様々な方法又は方法の部分を実施するための実行可能コード150の実行をプログラム可能である。計算装置100は、ハード・ドライブ、CD-ROM又は非一過性コンピュータ可読媒体等、記憶装置116を包含する。記憶装置116は、オペレーティング・システム118及び他の関係するソフトウェアを記憶することができる。計算装置100は、メモリ106を更に包含することができる。メモリ106は、DRAM、SRAM、EDO RAM等、コンピュータシステムメモリ又はランダムアクセスメモリを含むことができる。メモリ106は、同様に他の種類のメモリ又はこれらの組み合わせを含むことができる。計算装置100は、記憶装置116及び/又はメモリ106において実行可能コード150の各部分を実行及び処理するための命令を記憶することができる。
実行可能コード150は、AIに基づくインフォマティクスシステム190と通信するための、差次的ネットワークを作成するための（例えば、差次的ネットワーク創出モジュール）、AIに基づくインフォマティクスシステム由来の定量的関係性情報を抽出するための（例えば、関係性定量化モジュール）、及びネットワークを可視化するための（例えば、サイトスケープ（Cytoscape））、コードを包含することができる。
一部の実施形態において、計算装置100は、AIに基づくインフォマティクスシステム190（例えば、REFSを実行するためのシステム）と直接的に又は間接的に通信することができる。例えば、計算装置100は、ネットワークを通じてAIに基づくインフォマティクスシステム190へとデータファイル（例えば、データフレーム）を移動させることにより、AIに基づくインフォマティクスシステム190と通信することができる。更に、計算装置100は、AIに基づくインフォマティクスシステム190にインターフェース及び命令を提供する実行可能コード150を有することができる。
一部の実施形態において、計算装置100は、入力データセットのためのデータを提供する1個以上の実験システム180と直接的に又は間接的に通信することができる。データを作成するための実験システム180は、質量分析に基づくプロテオミクス、マイクロアレイ遺伝子発現、qPCR遺伝子発現、質量分析に基づくメタボロミクス及び質量分析に基づくリピドミクス、SNPマイクロアレイ、機能アッセイのパネル並びに他のin-vitro生物学プラットフォーム及び技術のためのシステムを包含することができる。
計算装置100は、メモリ106に記憶されたソフトウェア並びに他のシステムハードウェア、周辺装置及び/又は周辺ハードウェアを制御するためのプログラムを実行するためのプロセッサ102も包含し、1個以上の追加的なプロセッサ（複数可）102'を包含することができる。プロセッサ102及びプロセッサ（複数可）102'はそれぞれ、単一のコアプロセッサ又は複数のコア（104及び104'）プロセッサとなり得る。計算装置におけるインフラストラクチャー及びリソースを動的に共有することができるように、計算装置100において仮想化を用いることができる。仮想化されたプロセッサは、記憶装置116における実行可能コード150及び他のソフトウェアと共に用いることもできる。プロセスが、複数ではなく1個のコンピュータ処理リソースのみを用いているように見えるように、仮想機械114を配置して、複数のプロセッサにおいて作動するプロセスを取り扱うことができる。複数の仮想機械を1個のプロセッサと共に用いることもできる。
ユーザーは、ユーザーインターフェース124又はその他のインターフェースを表示することのできるコンピュータのモニタ等の視覚的表示装置122を通じて計算装置100と相互作用することができる。表示装置122のユーザーインターフェース124を用いて、生データ、ネットワークの視覚的表現等を表示することができる。視覚的表示装置122は、例示的な実施形態の他の態様又は要素（例えば、記憶装置116のアイコン）を表示することもできる。計算装置100は、ユーザーからの入力を受け取るためのキーボード又はマルチポイントタッチインターフェース（例えば、タッチスクリーン）108及びポインティング装置110（例えば、マウス、トラックボール及び/又はトラックパッド）等、他のI/O装置を包含することができる。キーボード108及びポインティング装置110は、有線及び/又は無線接続を介して視覚的表示装置122及び/又は計算装置100に接続することができる。
計算装置100は、標準電話回線、LAN又はWANリンク（例えば、802.11、T1、T3、56kb、X.25）、ブロードバンド接続（例えば、ISDN、Frame Relay、ATM）、無線接続、コントローラーエリアネットワーク（CAN）又は上述のいずれか一部の組み合わせ若しくは全て等が挙げられるがこれらに限定されない種々の接続を通じて、ローカルエリアネットワーク（LAN）、広域ネットワーク（WAN）又はインターネットを介してネットワーク装置126とインターフェース接続するためのネットワークインターフェース112を包含することができる。ネットワークインターフェース112は、内蔵ネットワークアダプタ、ネットワークインターフェースカード、PCMCIAネットワークカード、カードバスネットワークアダプタ、無線ネットワークアダプタ、USBネットワークアダプタ、モデム、又は計算装置100を情報伝達可能ないずれかの種類のネットワークとインターフェース接続させ、本明細書に記載されている操作を実施させるのに適したその他の装置を含むことができる。
更に、計算装置100は、ワークステーション、デスクトップコンピュータ、サーバー、ノート型パソコン、ハンドヘルドコンピュータ、又は、情報伝達可能であり、本明細書に記載されている操作の実施に十分なプロセッサ能力及びメモリ容量を有する他の形態のコンピュータ処理若しくは遠隔通信装置等、いかなるコンピュータシステムであってもよい。
計算装置100は、MICROSOFT WINDOWS（登録商標）オペレーティング・システムのバージョンのいずれか、Unix（登録商標）及びLinux（登録商標）オペレーティング・システムの様々な版（release）、Macintoshコンピュータ用のMACOSのいずれかのバージョン、いずれかの組み込まれたオペレーティング・システム、いずれかのリアルタイムオペレーティング・システム、いずれかのオープンソースオペレーティング・システム、いずれかの専売のオペレーティング・システム、モバイル計算装置用のいずれかのオペレーティング・システム、又は計算装置において作動することができ、本明細書に記載されている操作を実施することのできるその他のオペレーティング・システム等、いずれかのオペレーティング・システム118を作動させることができる。オペレーティング・システムは、ネイティブモード又はエミュレート型モードで作動することができる。
IV. 薬物誘発毒性のモデル及びその使用
A. 薬物誘発毒性のモデルの確立
事実上あらゆる薬物誘発毒性は、異なる細胞型及び/又は器官系の間の複雑な相互作用を含む。ある細胞型又は器官における重大な機能の変動は、他の相互作用する細胞型及び器官に二次効果をもたらし、続いてかかる下流の変化は、初期変化へとフィードバックし、さらなる複雑化を引き起こし得る。従って、薬物誘発毒性のより完全な網羅的観点を得るために、所定の薬物誘発毒性を、細胞型又は器官のペア間の相互作用等、その構成要素まで詳細に解析し、このような構成要素間の相互作用を体系的に探索することが有益である。
従って、本発明は、薬物誘発毒性の細胞モデルを提供する。このため、本出願人らは、対象の発見プラットフォーム技術において用いられてきた例示的な薬物誘発毒性（例えば心臓毒性）の細胞モデルを組み立てた。本出願人らは、対象の発見プラットフォーム技術を用いて細胞モデルによる実験を行って、薬物誘発毒性に特有の因果関係を包含するコンセンサス因果関係ネットワークを作成し、これにより、特定の薬物誘発毒性に重要な「モジュレーター」又は重大な分子「ドライバー」を同定した。
プラットフォーム技術並びにその構成要素、例えば、特注の細胞モデル及び薬物誘発毒性細胞モデルから得られるデータセットの顕著な利点の一つは、薬物誘発毒性に対し作成された初期「第1世代」コンセンサス因果関係ネットワークが、例えば、追加的な細胞株/型及び/又は追加的な条件の導入により、連続的に進化又は経時的に拡張することができることである。進化した細胞モデル由来の追加的なデータ、すなわち、細胞モデルの新たに加えられた部分（複数可）から得たデータを収集することができる。続いて、より強固な「第2世代」コンセンサス因果関係ネットワークを作成するために、拡張又は進化した細胞モデル、すなわち、細胞モデルの新たに加えられた部分（複数可）から収集された新たなデータを、「第1世代」コンセンサス因果関係ネットワークの作成に以前に用いたデータセットに導入することができる。続いて、「第2世代」コンセンサス因果関係ネットワークから、薬物誘発毒性に特有の新たな因果関係を同定することができる。このようにして、薬物誘発毒性細胞モデルの進化は、コンセンサス因果関係ネットワークの進化をもたらし、これにより、薬物誘発毒性のモジュレーターに関する新たな及び/又はより信頼のおける洞察をもたらす。このようにして、薬物誘発毒性細胞モデル、細胞モデル由来のデータセット及びプラットフォーム技術方法を用いて薬物誘発毒性細胞モデルから作成された因果関係ネットワークが共に、絶えず進化し、プラットフォーム技術から得られた以前の知識の上に組み立てることができる。
従って、本発明は、プラットフォーム技術において用いられた薬物誘発毒性細胞モデルから作成されたコンセンサス因果関係ネットワークを提供する。このようなコンセンサス因果関係ネットワークは、第1世代のコンセンサス因果関係ネットワークであっても、複数世代のコンセンサス因果関係ネットワーク、例えば、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20世代以上のコンセンサス因果関係ネットワークであってもよい。更に、本発明は、プラットフォーム技術において用いられた薬物誘発毒性細胞モデルから作成された、シミュレートされたコンセンサス因果関係ネットワークを提供する。このようなシミュレートされたコンセンサス因果関係ネットワークは、第1世代のシミュレートされたコンセンサス因果関係ネットワークであっても、複数世代のシミュレートされたコンセンサス因果関係ネットワーク、例えば、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20世代以上のシミュレートされたコンセンサス因果関係ネットワークであってもよい。本発明は、本発明のコンセンサス因果関係ネットワークのいずれかから作成されたデルタネットワーク及びデルタ-デルタネットワークを更に提供する。
薬物誘発毒性の特注の細胞モデルは、薬物誘発毒性に関連する1種以上の細胞を含む。薬物誘発毒性のモデルを確立して、薬物誘発毒性の特徴的な側面を模倣する条件（例えば、細胞培養条件）を創出することにより、薬物誘発毒性の環境、例えば、in vivoにおける薬物誘発心臓毒性の環境をシミュレートすることができる。
同じ又は異なる起源の複数の細胞が、単一の細胞型とは対照的に、細胞モデルにおいて包含され得る。一実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50種以上の異なる細胞株又は細胞型が、薬物誘発毒性細胞モデルにおいて包含される。一実施形態において、細胞は全て同じ型のもの、例えば、全て心筋細胞であるが、異なる樹立細胞株、例えば、心筋細胞の異なる樹立細胞株である。前述のリストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限となることもでき、例えば、1〜5、1〜10、2〜5又は5〜15種の間の異なる細胞株又は細胞型となることができる。
本発明の細胞モデルに包含され得る細胞型の例として、ヒト細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、細菌又は真菌（fungae）が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、細胞モデルの細胞は、癌細胞又は細菌若しくはウイルス感染細胞等、罹患細胞を包含し得る。一実施形態において、細胞モデルの細胞は、糖尿病、肥満又は心血管薬物誘発毒性状態に関与する細胞、例えば、大動脈平滑筋細胞又は肝細胞等、薬物誘発毒性関連細胞を包含し得る。当業者であれば、特定の薬物誘発毒性、例えば、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性に関与又は関連する細胞を認識することができ、かかる細胞のいずれ（例えば心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞又は筋芽細胞）が本発明の細胞モデルに包含されてもよい。
本発明の細胞モデルは、1種以上の「対照細胞」を包含し得る。一実施形態において、対照細胞は、未処理又は無変動細胞となり得る。別の一実施形態において、「対照細胞」は、正常細胞、例えば、毒性を生じる薬物又は薬剤に暴露されていない細胞となり得る。一実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50種以上の異なる対照細胞が、細胞モデルに包含される。前述のリストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限となることもでき、例えば、1〜5、1〜10、2〜5又は5〜15種の間の異なる対照細胞株又は対照細胞型となることができる。一実施形態において、対照細胞は全て同じ型のものであるが、該細胞型の異なる樹立細胞株である。一実施形態において、薬物誘発毒性に特有のタンパク質又は経路を同定するために、対照として、1種以上の正常、例えば、非罹患細胞株が同様の条件下で培養される、及び/又は細胞モデルの初代細胞と同じ変動に曝露される。
本発明のカスタム細胞モデルは、薬物誘発毒性の特徴的な側面を模倣する条件を含むこともできる。例えば、糖尿病薬誘発毒性を探索するためにin vivoにおける糖尿病環境における細胞の条件又は薬物誘発心臓毒性を患う患者の大動脈平滑筋細胞の条件に近似する細胞培養条件を選択することができる。場合によっては、条件は、ストレス条件である。本発明の細胞モデルにおいて様々な条件/ストレス要因を用いることができる。一実施形態において、このようなストレス要因/条件は、細胞系の「変動」、例えば、外部刺激を構成することができる。例示的なストレス条件の一つは低酸素であり、これは、例えば進行段階の糖尿病を患う患者内に典型的に見出される条件である。低酸素は、当該技術分野において認識されている方法を用いて誘導することができる。例えば、低酸素は、5％CO2、2％O2及び93％窒素を含有する工業用ガス混合物を充満させることのできる、モジュラーインキュベーターチャンバー（MIC-101、Billups-Rothenberg Inc.、カリフォルニア州デル・マー）内に細胞系を置くことにより誘導することができる。効果（影響）は、追加的な外部刺激構成要素あり及びなしで（例えば、0、50又は100μMのCoQ10）、低酸素処理後の予め定められた期間の後、例えば、24時間目に測定することができる。同様に、乳酸処理は、解糖活性が高い細胞環境を模倣する。乳酸に誘導されたストレスは、追加的な外部刺激構成要素あり又はなしで（例えば、0、50又は100μMのCoQ10）、約12.5mMの最終乳酸濃度で、予め定められた時間、例えば、24時間目に調査することができる。高血糖は、糖尿病及び糖尿病薬誘発毒性に見出される条件である。対象細胞の処理に用いることのできる典型的な高血糖条件は、10％培養グレードのグルコースを包含し、これは適した培地に添加されて、培地におけるグルコースの最終濃度を約22mMとする。高脂血症は、例えば、肥満及び心血管系疾患に見出される条件であり、薬物誘発心臓毒性をシミュレートするために用いることができる。高脂血症条件は、0.15mMパルミチン酸ナトリウムを含有する培地において細胞を培養することによりもたらすことができる。高インスリン血症は、例えば、糖尿病並びに糖尿病薬誘発毒性に見出される条件である。高インスリン型条件は、1000nMインスリンを含有する培地において細胞を培養することにより誘導することができる。
個々の条件は、本発明の特注の細胞モデルにおいて別々に調査することができる、及び/又は一体に組み合わせることができる。一実施形態において、生物学的システムの異なる特徴的な側面を反映又はシミュレートする少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50種以上の条件の組み合わせが、特注の細胞モデルにおいて調査される。一実施形態において、個々の条件と、加えて、薬物誘発毒性の異なる特徴的な側面を反映又はシミュレートする条件のうち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50種以上の組み合わせが、特注の薬物誘発毒性細胞モデルにおいて調査される。前述のリストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限となることもでき、例えば、1〜5、1〜10、1〜20、1〜30、2〜5、2〜10、5〜10、1〜20、5〜20、10〜20、10〜25、10〜30又は10〜50種の間の異なる条件となることができる。
カスタム薬物誘発毒性細胞モデルが組み立てられると、患者間の遺伝的変動又は特定の薬物若しくはプロドラッグによる処置あり/なし等、1種以上の「変動」をシステムに適用することができる。図15Dを参照されたい。細胞モデル系に対するかかる変動の影響は、下のセクションIII.Bに記載されている通り、様々な当該技術分野において認識されている又は専売の手段を用いて測定することができる。
カスタム薬物誘発毒性細胞モデルは、変動、例えば、「環境変動」又は「外部刺激構成要素」に曝露させることができる。「環境変動」又は「外部刺激構成要素」は、細胞環境に対し内因性であっても（例えば、細胞環境は、あるレベルの刺激物質を含有し、これが更に添加されて、そのレベルを増加させる）、あるいは細胞環境に対し外因性であってもよい（例えば、刺激物質/変動は、変更前の細胞環境には殆ど存在しない）。外部刺激構成要素は、細胞系により細胞環境へと分泌される分子等、細胞系の細胞出力を変化させ得るため、細胞環境は、環境変動又は外部刺激構成要素を加えることによる二次変化により更に変更され得る。環境変動又は外部刺激構成要素は、細胞機能に影響を与えることのできるいずれかの外部物理学的及び/又は化学的刺激を包含し得る。これは、いずれかの大型又は小型の有機又は無機分子、天然又は合成化学物質、温度シフト、pH変化、放射線照射、光（UVA、UVB等）、マイクロ波、音波、電流、変調された又は変調されない磁場等を包含し得る。環境変動又は外部刺激構成要素は、導入される遺伝的改変若しくは突然変異又は遺伝的改変/突然変異を引き起こす媒体（例えば、ベクター）も包含し得る。
（i）クロストーク細胞系
特定の状況において、2種以上の細胞系の間の相互作用の調査が望まれる場合、第1の細胞系の修飾された細胞環境を第2の細胞系と接触させて、第2の細胞系の細胞出力に影響を与えることにより、「クロストーク細胞系」を形成することができる。
本明細書において、「クロストーク細胞系」は、2種以上の細胞系を含み、該2種以上の細胞系において、少なくとも1種の細胞系の細胞環境は、第2の細胞系における少なくとも1種の細胞出力が変化又は影響されるように、第2の細胞系と接触させられる。特定の実施形態において、クロストーク細胞系内の細胞系は、互いに直接接触されている。他の実施形態において、細胞系のいずれも、互いに直接接触されていない。
例えば、特定の実施形態において、クロストーク細胞系は、第1の細胞系が挿入区画において育成され、第2の細胞系が対応するウェル区画において育成される、トランスウェルの形態となり得る。2種の細胞系を同じ又は異なる培地と接触させ、培地構成要素の一部又は全てを交換することができる。一方の細胞系に添加された外部刺激構成要素は、一方の細胞系により実質的に吸収され得る、及び/又は他方の細胞系へと拡散する機会を得る前に分解され得る。あるいは、外部刺激構成要素は、最終的に2種の細胞系内で平衡に接近又は到達する。
特定の実施形態において、クロストーク細胞系は、別々に培養された細胞系の形態を採用することができ、各細胞系は、それ自身の培地及び/又は培養条件（温度、CO2含量、pH等）、又は同様の若しくは同一の培養条件を有することができる。例えば、一方の細胞系由来の馴化培地を採取し、これを別の細胞系と接触させることにより、2種の細胞系を接触させることができる。2種の細胞系の間の直接的な細胞-細胞接触を必要であればもたらすこともできる。例えば、2種の細胞系の細胞は、必要であればいずれかの時点で共培養し、後に、例えば、少なくとも一方の細胞系における細胞が選別可能なマーカー又は標識（安定的に発現される蛍光マーカータンパク質GFP等）を有する場合は、共培養された細胞系をFACS選別により分離することができる。
同様に、特定の実施形態において、クロストーク細胞系は、単純に共培養物であってよい。まず、一方の細胞系における細胞を処理した後に、別の細胞系における細胞との共培養において処理細胞を培養することにより、一方の細胞系における細胞の選択的処理をもたらすことができる。共培養クロストーク細胞系設定は、例えば、外部刺激構成要素による第1の細胞系の刺激後に、第1の細胞系における細胞表面変化によりもたらされる第2の細胞系に対する効果（影響）を研究することが望まれる場合に役立つことができる。
本発明のクロストーク細胞系は、一方又は両方の細胞系の細胞出力に対する特定の予め定められた外部刺激構成要素の効果（影響）を探るのに特に適している。第1の細胞系（刺激と直接的に接触する）におけるかかる刺激の一次効果は、第1の細胞系と外部刺激との接触前後に、細胞出力（例えば、タンパク質発現レベル）を比較することにより決定することができ、これは本明細書において、「（有意な）細胞出力差次」と称され得る。第1の細胞系の修飾された細胞環境により媒介される、第2の細胞系におけるかかる刺激の二次効果（そのセクレトーム等）を同様に測定することもできる。そこで、例えば、第2の細胞系のプロテオームにおける比較は、第1の細胞系における外部刺激処理ありの第2の細胞系のプロテオームと、第1の細胞系における外部刺激処理なしの第2の細胞系のプロテオームとの間で行うことができる。観察される（プロテオーム又はその他の対象の細胞出力の）いずれかの有意な変化は、「有意な細胞クロストーク差次」と称され得る。
細胞出力測定値（タンパク質発現等）の作成において、絶対発現量又は相対発現レベルのいずれかを用いることができる。例えば、第2の細胞系の相対タンパク質発現レベルを決定するために、第1の細胞系への外部刺激あり又はなしにおける、第2の細胞系におけるいずれか所定のタンパク質の量を適した対照細胞株及び細胞株の混合物と比較し、倍数増加又は倍数減少値を得ることができる。かかる倍数増加（例えば、少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75又は100倍以上の倍数増加）又は倍数減少（例えば、少なくとも0.95、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1若しくは0.05倍又は90％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％若しくは5％以下の減少）の予め定められた閾値レベルを用いて、有意な細胞クロストーク差次を選択することができる。前述のリストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限となることもでき、例えば、1.5〜5倍の間、2〜10倍の間、1〜2倍の間又は0.9〜0.7倍の間となることができる。
本出願を通して、例えば、上述の値等、リストに提示されているあらゆる値は、本発明の一部であると企図される範囲の上限又は下限となることもできる。
図解のため、薬物誘発心臓毒性及び腎臓毒性モデルの側面を真似るよう確立された例示的な2細胞系の一例において、心臓平滑筋細胞株（第1の細胞系）を低酸素条件（外部刺激構成要素）で処理し、心臓平滑筋の馴化培地と腎臓細胞との接触に起因する腎臓細胞株（第2の細胞系）におけるプロテオーム変化を、従来の定量的質量分析を用いて測定することができる。このような腎臓細胞における有意な細胞クロストーク差次は、適切な対照（例えば、低酸素条件で処理されていない同様に培養された心臓平滑筋細胞由来の馴化培地と接触された、同様に培養された腎臓細胞）との比較に基づき決定することができる。
観察された有意な細胞クロストーク差次の全てに生物学的意義があるとは限らない。対象の照合による生物学的評価が適用されるいずれか所定の薬物誘発毒性に関して、有意な細胞クロストーク差次の一部（又は恐らくは全て）が、問題になっている特異的生物学的課題に関して「決定的」となり得る、例えば、薬物誘発毒性をもたらす原因である（治療介入の潜在的な標的）、あるいは薬物誘発毒性のバイオマーカーである（潜在的な診断又は予後因子）。
かかる決定的なクロストーク差次は、対象方法のエンドユーザーにより選択され得る、あるいはDAVID対応比較経路解析プログラム又はKEGG経路解析プログラム等、バイオインフォマティクスソフトウェアプログラムにより選択され得る。特定の実施形態において、2種以上のバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムが用いられ、2種以上のバイオインフォマティクスソフトウェアプログラム由来のコンセンサス結果が好ましい。
本明細書において、細胞出力の「差次」は、細胞出力のいずれか1種以上のパラメータの差（例えば、レベルの増加又は減少）を包含する。例えば、タンパク質発現レベルの観点から、外部刺激構成要素による処理前後の細胞系に関連する出力等、2種の細胞出力の間の差次は、質量分析に基づくアッセイ（例えば、iTRAQ、2D-LC-MSMS等）等、当該技術分野において認識されている技術を用いることにより測定及び定量化することができる。
B. 照合による生物学的評価のための細胞モデルの使用
本明細書に記載し、さらに国際出願PCT/US2012/027615に記載されている方法及び細胞モデルは、任意の数の「照合による生物学的評価」に用いる又は適用することができる。照合による生物学的評価のための本発明の方法の使用は、薬物誘発毒性の「モジュレーター」又は決定的な細胞プロセス「ドライバー」の同定を容易にする。
本明細書において、「照合による生物学的評価」は、生物学的システムの1種以上のモジュレーター、例えば、環境変動若しくは外部刺激構成要素に関連する決定的な細胞プロセス「ドライバー」（例えば、生物学的経路又は経路の主要なメンバー又は経路のメンバーに対する主要な調節因子の活性の増加又は減少）、あるいは生物学的システム又はプロセスに特有の、特有の因果関係の同定を包含することができる。これは、in vivo動物モデル及び/又はin vitro組織培養実験を包含する、同定された決定的な細胞プロセスドライバーが、環境変動又は外部刺激構成要素に関連する下流の事象に必要である及び/又は十分であるか検査又は確認するよう設計された追加的なステップを更に包含することができる。
好ましい実施形態において、照合による生物学的評価は、細胞、組織、器官又は生物における作用物（例えば薬物）の薬物誘発性毒物学的プロファイリングの評価であり、生物学的システムの同定されたモジュレーター、例えば、決定的な細胞プロセスドライバー（例えば、生物学的システム又はプロセスに特有の細胞クロストーク差次又は因果関係）は、薬物誘発毒性、例えば細胞毒性、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性の指標となることができ、ひいては、薬物の毒物学的プロファイリングの予測又は同定に用いることができる。一実施形態において、薬物誘発毒性の同定されたモジュレーター、例えば、決定的な細胞プロセスドライバー（例えば、薬物誘発毒性に特有の細胞クロストーク差次又は因果関係）は、薬物又は薬物候補の心臓毒性の指標であり、ひいては、薬物又は薬物候補の心臓毒物学的プロファイリングの予測又は同定に用いることができる。
V. プロテオミクスサンプル解析
特定の実施形態において、対象方法は、同様の特性の数百種のサンプルの大規模ハイスループット定量的プロテオミクス解析を用いて、細胞出力差次の同定に必要なデータをもたらす。
この目的に適した、当該技術分野において認識されている技術が多数存在する。例示的な技法である質量分析と組み合わせたiTRAQ解析について下に簡潔に記載する。
iTRAQ技法による相対的定量化のための参照サンプルを用意するため、複数のQCプールを創出する。細胞#1及び細胞#2サンプル（これらのサンプルは、それぞれ上清及びペレットに関して、QCS1及びQCS2並びにQCP1及びQCP2として示される）から、各サンプルのアリコートからなる2種の別々のQCプールを作成する。2種の細胞株にわたるタンパク質濃度比較を可能にするため、上述のQCプール由来の細胞ペレットアリコートを等容量で組み合わせて、参照サンプル（QCP）を作成する。
定量的プロテオミクスアプローチは、8-plex iTRAQ試薬による安定的同位体標識並びにペプチド同定及び定量化のための2D-LC MALDI MS/MSに基づく。この技法による定量化は相対的である。ペプチド及びタンパク質は、参照サンプルに相対的な存在比を割り当てられる。複数のiTRAQ実験における共通参照サンプルは、複数のiTRAQ実験にわたるサンプルの比較を容易にする。
この解析スキームを実行するため、6種の一次サンプル及び2種の対照プールサンプルを組み合わせて1つの8-plex iTRAQミックスとし、対照プールサンプルは、メーカーの示唆するところに従って113及び117試薬で標識されている。続いて、二次元液体クロマトグラフィーによりこの8サンプルの混合物を分画する。一次元目に強カチオン交換（SCX）、二次元目に逆相HPLCを行う。MALDIプレートにおいてHPLC溶離液を直接的に分画し、MDS SCIEX/AB 4800 MALDI TOF/TOF質量分析計においてプレートを解析する。
追加的な情報なしで、タンパク質発現における最も重要な変化は、異なる処理条件下における同じ細胞型内の変化であることが仮定される。このため、細胞#1及び細胞#2由来の一次サンプルを、別々のiTRAQミックスにおいて解析する。細胞#1対細胞#2サンプルにおけるタンパク質発現の比較を容易にするため、一次又は細胞株特異的QCサンプル（QC1及びQC2）に占有されていない利用できる「iTRAQスロット」において、普遍的QCPサンプルを解析する。
用いた研究室手順の概略を本明細書に提供する。
A. 細胞上清サンプルからのタンパク質抽出
細胞上清サンプル（CSN）に関して、培養培地由来のタンパク質が、培養細胞により分泌されたタンパク質よりも大過剰に存在する。このようなバックグラウンドを低下させる試みにおいて、突出して（upfront）豊富なタンパク質の枯渇を実行した。特異的アフィニティーカラムは、ウシ又はウマ血清タンパク質に利用できないため、抗ヒトIgY14カラムを用いた。この抗体は、ヒトタンパク質に対するものであるが、抗体のポリクローナルな性質によってもたらされる幅広い特異性は、用いた細胞培養培地に存在するウシ及びウマタンパク質の両方の枯渇を達成することが期待された。
フロースルー材料における総タンパク質濃度を決定する試験（ビシンコニン酸（BCA）アッセイ）の開始前に、CSN QC材料の200μlアリコートを10mL IgY14枯渇カラムにロードする。次に、ロード容量を選択して、およそ40μg総タンパク質を含有する画分の枯渇を成し遂げる。
B. 細胞ペレットからのタンパク質抽出
細胞#1及び細胞#2のアリコートを、BGMにおける組織サンプルの解析に用いた「標準」溶解バッファーに溶解し、BCAアッセイにより総タンパク質含量を決定する。これらの代表的な細胞ライセートのタンパク質含量を確立した後、全細胞ペレットサンプル（セクション1.1に記載されているQCサンプルを包含）を細胞ライセートに加工した。およそ40μgの総タンパク質のライセート量を、加工ワークフローにおいて先に進めた。
C. 質量分析のためのサンプル調製
サンプル調製は、標準操作手順に従い、次の項目を構成する。
・タンパク質の還元及びアルキル化
・逆相カラムにおけるタンパク質清浄化（clean-up）（細胞ペレットのみ）
・トリプシンによる消化
・iTRAQ標識
・強カチオン交換クロマトグラフィー - 6画分の収集（Agilent 1200システム）
・HPLC分画及びMALDIプレートへのスポッティング（Dionex Ultimate3000/Probotシステム）。
D. MALDI MS及びMS/MS
HPLC-MSは、一般に、オンラインESI MS/MS戦略を用いる。BG Medicineは、同一サンプルを複数回注入する必要がなく、一次サンプルにわたる観察されたタンパク質セットのより優れた一致をもたらすオフラインLC-MALDI MS/MSプラットフォームを用いる。全iTRAQミックスにわたる最初のパスデータ収集後に、ペプチド画分はMALDI標的プレート上に保持されるため、最初の取得の際に得られた知識に由来する標的化MS/MS取得パターンを用いて、サンプルを2回目に解析することができる。このようにして、同定されたタンパク質全ての最大の観察頻度が達成される（理想的には、全iTRAQミックスにおいて全タンパク質を測定するべきである）。
E. データ処理
BGMプロテオミクスワークフロー内のデータ処理プロセスを、iTRAQミックス毎に個々に完了する予備的ペプチド同定及び定量化等の手順（セクション1.5.1）と、プロジェクトのデータ取得が完了するまで完了しないペプチドからタンパク質への最終割り当て及びタンパク質の最終定量化等のプロセス（セクション1.5.2）へと分けることができる。
BGMプロテオミクスワークフロー内の主要データ処理ステップを次に示す。
・Mascot（Matrix Sciences）データベース検索エンジンを用いたペプチド同定
・Mascot IDの自動自家（in house）検証
・ペプチドの定量化及びタンパク質の予備的定量化
・最終データセットの専門家キュレーション
・自動PVTツールを用いた、タンパク質の共通セットへの各ミックス由来のペプチドの最終割り当て
・異常値除去及びタンパク質の最終定量化。
（i）個々のiTRAQミックスのデータ処理
各iTRAQミックスは、ワークフローにより処理されるため、ペプチド及びタンパク質同定のための専売のBGMソフトウェアツール並びに定量化情報の初期評価を用いてMS/MSスペクトルを解析する。この予備的解析の結果に基づき、ミックスにおける一次サンプル毎のワークフローの品質を、BGM性能測定基準のセットに対して判断する。所定のサンプル（又はミックス）が指定の最小性能測定基準をパスせず、追加的な材料が利用できる場合、該サンプルをその全体において反復し、ワークフローのこの2回目の実行由来のデータを最終データセットに取り込む。
（ii）ペプチド同定
ブタトリプシン等、共通夾雑物配列により増強されたヒト、ウシ及びウマ配列を含有するUniprotタンパク質配列データベースに対して、MS/MSスペクトルを検索した。修飾の完全リストを包含するMascot検索パラメータの詳細を表1に示す。
Figure 2015520375
Mascot検索が完了した後、自動検証手順を用いて、特異的Mascotペプチドマッチを促進（すなわち、検証）する。有効及び無効マッチ間の区別は、予想されるMascotスコアに対する獲得したMascotスコア、並びにランク1ペプチド及びランク2ペプチドMascotスコア間の差に基づく。ペプチドが、iTRAQミックスにおける単一のタンパク質にマッチした数個のうち1個である場合、あるいはペプチドが、以前に検証されたペプチドのカタログに存在する場合、検証に必要とされる判断基準は、若干緩和される。
（iii）ペプチド及びタンパク質定量化
ミックス毎の検証されたペプチドのセットを利用して、ミックス毎の予備的タンパク質定量化測定基準を計算する。検証されたペプチド毎のiTRAQ標識（すなわち、m/z114、115、116、118、119又は121）由来のピーク面積を、参照プール（QC1又はQC2）のピーク面積の最も優れた表現（best representation）で除することにより、ペプチド比を計算する。このピーク面積は、両方のサンプルがQC承認判断基準をパスする場合、113及び117ピークの平均である。該タンパク質にマッチするあらゆる「有用な」検証されたペプチドの比率の中央値を計算することにより、予備的タンパク質比を決定する。「有用な」ペプチドは、完全にiTRAQ標識され（全N末端がリシン又はPyroGluのいずれかで標識される）、完全にシステイン標識される（すなわち、全Cys残基がカルバミドメチルによりアルキル化される又はN末端Pyro-cmc）。
（iv）取得後処理
プロジェクトにおける全ミックスに対しMS/MSデータ取得の全パスが完了したら、各一次サンプル由来の結果を別の結果と単純且つ有意義に比較できることを意図した後述する3ステップを用いて、データを並べる。
（v）タンパク質へのペプチド配列の網羅的割り当て
専売のタンパク質検証ツール（PVT）により、タンパク質アクセッション番号へのペプチド配列の最終割り当てを行う。PVT手順は、最良の最小非重複タンパク質セットを決定して、プロジェクトにおいて同定されたペプチドの全収集を記載する。これは、均一な分類由来のデータを取り扱うよう最適化された自動手順である。
データベースにおける混合型分類の複雑性を扱うために、上清実験のタンパク質割り当てを手作業でキュレーションした。自動パラダイムは、ウシ及びウマ血清補充培地において育成した細胞培養物には有効ではないため、大規模な手作業のキュレーションが、いずれか所定のタンパク質のソースのあいまいさの最小化に必要である。
（vi）ペプチド比の正規化
Vandesompeleら、Genome Biology、2002、3(7)、research 0034.1-11の方法に基づき、サンプル毎のペプチド比を正規化する。この手順は、細胞ペレット測定のみに適用される。培地由来のペプチド同定への最大の貢献を考慮して、上清サンプルに関して定量的データは正規化されない。
（vii）タンパク質比の最終計算
標準統計的異常値除去手順を用いて、対数変換データセットにおいて1.96σレベルを超える、各タンパク質の比率の中央値から異常値を除去する。この除去プロセス後に、タンパク質比の最終セットを（再）計算する。
VI. 本発明のマーカー及びそれらの使用
本発明は、薬物誘発毒性、例えば心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性若しくは筋毒性など、又は治療剤などの変動に対する薬物誘発毒性の応答に関連する新規のバイオマーカーの同定に、少なくとも部分的に基づく。
特に、本発明は、実施例で記載するマーカー（本明細書の以下では、「マーカー」又は「本発明のマーカー」）に関する。本発明は、マーカーによりコードされるか又はこれらに対応する核酸及びタンパク質（本明細書の以下では、それぞれ、「マーカー核酸」及び「マーカータンパク質」）を提供する。これらのマーカーは、薬物誘発毒性状態の診断； 薬物誘発毒性状態の予後診断；多様な薬物誘発毒性状態のための薬物標的の開発；毒性、好ましくは、薬物誘発毒性、例えば、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性若しくは筋毒性の存在についてのスクリーニング； 薬物誘発毒性を引き起こすか又は薬物誘発毒性を引き起こす危険性がある作用物の同定； 薬物誘発毒性を軽減又は予防しうる作用物の同定； 薬物誘発毒性の緩和、軽減、又は予防；及び薬物誘発毒性を予測するマーカーの同定に特に有用である。
「マーカー」とは、組織内又は細胞内のその発現のレベルの、正常又は健常な組織内又は細胞内のその発現レベルからの変化が、薬物誘発毒性、例えば、心臓毒性などの毒性状態に関連する遺伝子である。「マーカー核酸」とは、本発明のマーカーによりコードされるか又はこれらに対応する核酸（例えば、mRNA、cDNA）である。このようなマーカー核酸は、本発明のマーカーである遺伝子のうちのいずれかの全配列若しくは部分配列、又はこのような配列の相補体を含むDNA（例えば、cDNA）を含む。当業者には、このような配列が知られており、例えば、NIH政府のPubmedウェブサイト上で見出すことができる。マーカー核酸はまた、本発明の遺伝子マーカーのうちのいずれかの全配列若しくは部分配列、又はこのような配列の相補体を含むRNAであって、全てのチミジン残基がウリジン残基で置きかえられたRNAも含む。「マーカータンパク質」とは、本発明のマーカーによりコードされるか又はこれらに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、本発明のマーカータンパク質のいずれかの全配列又は部分配列を含む。当業者には、このような配列が知られており、例えば、NIHのPubmedウェブサイト上で見出すことができる。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。
「毒性状態に関連する」体液とは、患者の体内で、肉腫細胞と接触するか若しくは肉腫細胞内を通過する体液、又は肉腫細胞から剥落した細胞若しくはタンパク質が通過することが可能な体液である。疾患状態又は毒性状態に関連する例示的な体液は、血液（例えば、全血、血清、そこから血小板を除去された血液）を含み、下記でより詳細に記載される。疾患状態又は毒性状態に関連する体液は、全血液、そこから血小板を除去された血液、リンパ、前立腺液、尿、及び精液に限定されない。
マーカーの「正常な」発現レベルとは、毒性状態に罹患していないヒト対象又はヒト患者の細胞内のマーカーの発現レベルである。
マーカーの「過剰発現」又は「高い発現レベル」とは、発現を評価するために使用されるアッセイの標準誤差を超える、被験サンプル中の発現レベルを指し、対照サンプル（例えば、薬物誘発毒性状態、例えば、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性に関連するマーカーを有さない健常な対象由来のサンプル）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、複数の対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルの、好ましくは、少なくとも2倍であり、より好ましくは、3、4、5、6、7、8、9、又は10倍である。
マーカーの「低い発現レベル」とは、対照サンプル（例えば、薬物誘発毒性状態、例えば、心臓毒性、心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性又は筋毒性に関連するマーカーを有さない健常な対象由来のサンプル）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、複数の対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルの、多くとも2分の1である被験サンプル中の発現レベルを指し、より好ましくは、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1、又は10分の1である被験サンプル中の発現レベルを指す。
「転写されたポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド転写物」とは、本発明のマーカーの転写、並びに、存在する場合は、RNA転写物の正常な転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、及びRNA転写物の逆転写により作製される成熟mRNAの全部又は一部と相補的であるか又は相同なポリヌクレオチド（例えば、mRNA、hnRNA、cDNA、又はこのようなRNA若しくはcDNAの類似体）である。
「相補的」とは、2つの核酸鎖の領域の間又は同じ核酸鎖の2つの領域の間の配列相補性についての広範な概念を指す。第1の核酸領域のアデニン残基は、その残基がチミン又はウラシルである場合は、第1の領域とアンチパラレルな第2の核酸領域の残基と、特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成することが可能なことが公知である。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基は、その残基がグアニンである場合は、第1の鎖とアンチパラレルな第2の核酸鎖の残基と、塩基対合することが可能なことも公知である。2つの領域がアンチパラレルな形で配置される場合、第1の領域の少なくとも1種のヌクレオチド残基が、第2の領域の残基と塩基対合することが可能であれば、核酸の第1の領域は、同じ核酸又は異なる核酸の第2の領域と相補的である。好ましくは、第1の領域は、第1の部分を含み、第2の領域は、第2の部分を含み、ここで、第1の部分及び第2の部分がアンチパラレルな形で配置されると、第1の部分のヌクレオチド残基のうちの少なくとも約50％、好ましくは、少なくとも約75％、少なくとも約90％、又は少なくとも約95％は、第2の部分内のヌクレオチド残基と塩基対合することが可能である。より好ましくは、第1の部分の全てのヌクレオチド残基は、第2の部分内のヌクレオチド残基と塩基対合することが可能である。
本明細書で用いられる「相同」とは、同じ核酸鎖の2つの領域の間、又は2つの異なる核酸鎖の領域の間のヌクレオチド配列の類似性を指す。いずれの領域内のヌクレオチド残基の位置も、同じヌクレオチド残基により占有されている場合、領域はその位置において相同である。各領域の少なくとも1種のヌクレオチド残基の位置が、同じ残基により占有されている場合、第1の領域は、第2の領域と相同である。2つの領域の間の相同性は、同じヌクレオチド残基により占有されている2つの領域のヌクレオチド残基の位置の比率との関係性で表される。例を目的として述べると、ヌクレオチド配列5'-ATTGCC-3'を有する領域と、ヌクレオチド配列5'-TATGGC-3'を有する領域とは、50％の相同性を共有する。好ましくは、第1の領域は、第1の部分を含み、第2の領域は、第2の部分を含み、ここで、部分の各々のヌクレオチド残基の位置のうちの少なくとも約50％、好ましくは、少なくとも約75％、少なくとも約90％、又は少なくとも約95％は、同じヌクレオチド残基により占有されている。より好ましくは、各々の部分の全てのヌクレオチド残基の位置は、同じヌクレオチド残基により占有されている。
「本発明のタンパク質」は、マーカータンパク質及びそれらの断片；変異体のマーカータンパク質及びそれらの断片；マーカータンパク質又は変異体のマーカータンパク質の少なくとも15アミノ酸のセグメントを含むペプチド及びポリペプチド；並びにマーカータンパク質若しくは変異体のマーカータンパク質を含む融合タンパク質、又はマーカータンパク質若しくは変異体のマーカータンパク質の少なくとも15アミノ酸のセグメントを含む融合タンパク質を包含する。
本発明は、とりわけ、本発明のマーカータンパク質及びマーカータンパク質の断片と結合する抗体、抗体の誘導体、及び抗体のフラグメントも更に提供する。本明細書内で別段に指定されない限り、「抗体」及び「抗体」という用語は、抗体（例えば、IgG、IgA、IgM、IgE）の自然発生形態、並びに一本鎖抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体、並びに多特異性抗体などの組換え抗体、並びに前出の全てのフラグメント及び誘導体であって、少なくとも1種の抗原結合性部位を有するフラグメント及び誘導体を広範に包含する。抗体の誘導体は、抗体へとコンジュゲートされたタンパク質又は化学部分を含みうる。
一実施形態において、本発明のマーカーは、薬物誘発毒性に関連するか又はこれに関与する遺伝子又はタンパク質である。薬物誘発毒性に関与するこのような遺伝子又はタンパク質は、例えば表2に列挙したマーカーを含む。一部の実施形態において、本発明のマーカーは、前出の遺伝子（又はタンパク質）のうちの、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上の組合せである。前出のリスト中に提示した全ての値はまた、前出の遺伝子（又はタンパク質）のうちの、本発明の一部であることを意図する範囲、例えば、1〜5、1〜10、1〜20、1〜30、2〜5、2〜10、5〜10、1〜20、5〜20、10〜20、10〜25、10〜30の間の範囲の上限又は下限でもありうる。
A. 心臓毒性関連マーカー
本発明は、薬物誘発心臓毒性に関連する新規のバイオマーカーの同定に、少なくとも部分的に基づく。本発明は更に、コエンザイムQ10は、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防することが可能であるという発見にも、少なくとも部分的に基づく。
したがって、本発明は、薬物誘発毒性を引き起こすか又はこれを引き起こす危険性がある薬剤を同定する方法を提供する。一実施形態において、薬剤は、薬物又は薬物候補物質である。これらの方法では、一対のサンプル（薬物処置に付されていない第1のサンプル、及び薬物処置に付された第2のサンプル）中の1種以上のバイオマーカー/タンパク質の量を評価する。第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルの、第1のサンプルと比較したモジュレーションは、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である。一実施形態において、1種以上のバイオマーカーが、表2に列挙したマーカーから選択される。本発明の方法を、当業者が使用する他の任意の方法と共に実施して、薬物誘発心臓毒性を引き起こす危険性がある薬物を同定することができる。
したがって、一態様では、本発明は、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性がある薬物を同定する方法であって、（i）薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現レベルを、（ii）薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーが、表2に列挙したマーカーから選択され；第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルの、第1のサンプルと比較したモジュレーションは、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である、方法を提供する。
一実施形態において、細胞は、心血管系の細胞、例えば、心筋細胞である。一実施形態において、細胞は、糖尿病性心筋細胞である。一実施形態において、薬物は、糖尿病、肥満、又は心血管系疾患を処置するための薬物又は薬物候補物質である。
一実施形態において、第2のサンプル中の表2に列挙したマーカーから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上のバイオマーカーの発現レベルの、第1のサンプルと比較したモジュレーション（例えば、上昇又は低下）は、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である。
一実施形態において、第2のサンプル中のTIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルの発現レベルの、第1のサンプルと比較したモジュレーション（例えば、上昇又は低下）は、薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である。
本発明ではまた、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうるレスキュー薬を同定する方法も提供される。一実施形態において、薬物は、糖尿病、肥満、又は心血管系障害を処置するための薬物又は薬物候補物質である。これらの方法では、3つのサンプル（薬物処置に付されていない第1のサンプル、薬物処置に付された第2のサンプル、並びに薬物処置及び該薬の処置のいずれにも付された第3のサンプル）中の1種以上のバイオマーカーの量を評価する。第2のサンプル中の発現レベルの変化と共に、第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルが、第1のサンプル中の発現レベルと比較してほぼ正常化されていることは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることを示している。一実施形態において、1種以上のバイオマーカーが、表2に列挙したマーカーから選択される。
本発明のマーカーの発現及び/又は活性をモジュレートする、例えば、増大又は減少させる分子を同定するために、本明細書で記載される方法を使用して、特に、細胞膜を越えることが可能な程度に十分に小さい分子を含む様々な分子をスクリーニングすることができる。対象における薬物誘発心臓毒性を軽減するか、緩和するか、又は予防するために、このようにして同定された化合物を、対象へと施すことができる。
したがって、別の態様では、本発明は、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうる薬剤を同定する方法であって、（i）毒性誘発薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現の正常レベルを決定するステップと；（ii）毒性誘発薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現の処置レベルを決定して、処置細胞サンプルにおける発現の変化を有する1種以上のバイオマーカーを同定するステップと；（iii）毒性誘発薬物及びレスキュー薬による処置の後で得られる第3の細胞サンプル中に存在する、毒性誘発薬物で処置したサンプルにおいて発現レベルが変化した1種以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと；（iv）第3のサンプル中で決定した1種以上のバイオマーカーの発現レベルを、第1のサンプル中で決定した1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、第1のサンプル中の発現レベルと比較して第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの正常化された発現レベルは、該薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標である、方法を提供する。一実施形態において、1種以上のバイオマーカーは、表2に列挙したマーカーから選択される。
一実施形態において、細胞は、心血管系の細胞、例えば、心筋細胞である。一実施形態において、細胞は、糖尿病性心筋細胞である。一実施形態において、薬物は、糖尿病、肥満、又は心血管系疾患を処置するための薬物又は薬物候補物質である。一実施形態において、薬物は、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、又はTNFアンタゴニストである。一実施形態において、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中の表2に列挙したマーカーから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上のバイオマーカーの正常化された発現レベルは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標である。
一実施形態において、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中のTIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択されるマーカーの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルの正常化された発現レベルは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標である。
一実施形態において、サンプルは、対象から得られる液体を含む。一実施形態において、液体は、血液、嘔吐物、唾液、リンパ液、嚢胞液、尿、気管支洗浄により回収される液、腹腔洗浄により回収される液、及び婦人科液からなる群より選択される。一実施形態において、サンプルは、血液サンプル又はその成分である。
別の実施形態において、サンプルは、対象から得られた組織又はその成分を含む。一実施形態において、組織は、骨、結合組織、軟骨、肺、肝臓、腎臓、筋組織、心臓、すい臓及び皮膚からなる群より選択される。
一実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、生物学的サンプル中の1種以上のマーカーの発現レベルは、サンプル中の転写されたポリヌクレオチド又はその一部をアッセイすることにより決定する。一実施形態において、転写されたポリヌクレオチドのアッセイは、転写されたポリヌクレオチドの増幅を含む。
一実施形態において、対象のサンプル中のマーカーの発現レベルは、サンプル中のタンパク質又はその一部をアッセイすることにより決定する。一実施形態において、タンパク質は、該タンパク質に特異的に結合する試薬を用いてアッセイする。
一実施形態において、サンプル中の1種以上のマーカーの発現レベルは、上記サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅反応、逆転写酵素PCR分析、一本鎖コンフォメーション多型解析（SSCP）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析（heteroduplex analysis）、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウエスタンブロット分析、in situハイブリダイゼーション、アレイ解析、デオキシリボ核酸配列決定、制限断片長多型解析、及びこれらの組み合わせ又はサブコンビネーションからなる群より選択される技法を用いて決定する。
一実施形態において、サンプル中のマーカーの発現レベルは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ELISA及び質量分析からなる群より選択される技法を用いて決定する。
一実施形態では、複数のマーカーの発現レベルを決定する。
本発明はさらに、その必要がある対象において薬物誘発心臓毒性を緩和、軽減又は予防する方法であって、対象（例えば、哺乳動物、ヒト、又は非ヒト動物）に、本明細書で提供されるスクリーニング方法により同定される薬剤（作用物質）を投与することを含み、それにより対象において薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防する方法を提供する。一実施形態において、薬剤は、心臓毒性誘発薬物で既に処置された対象に投与される。一実施形態において、薬剤は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置と同時に対象に投与される。一実施形態において、薬剤は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置の前に対象に投与される。
本発明はさらに、その必要がある対象において薬物誘発心臓毒性を緩和、軽減又は予防する方法であって、対象（例えば、哺乳動物、ヒト、又は非ヒト動物）にコエンザイムQ10を投与することを含み、それにより対象において薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防する方法を提供する。一実施形態において、コエンザイムQ10は、心臓毒性誘発薬物で既に処置された対象に投与される。一実施形態において、コエンザイムQ10は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置と同時に対象に投与される。一実施形態において、コエンザイムQ10は、心臓毒性誘発薬物による対象の処置の前に対象に投与される。一実施形態において、薬物誘発心臓毒性は、表2に列挙されたマーカーから選択される、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上のバイオマーカーの発現のモジュレーションと関係している。前出のリスト中に提示した全ての値はまた、前出の遺伝子（又はタンパク質）のうちの、本発明の一部であることを意図する範囲、例えば、1〜5、1〜10、2〜5、2〜10、又は5〜10の間の範囲の上限又は下限でもありうる。
一実施形態において、薬物誘発心臓毒性は、TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルのモジュレーションと関連している。
本発明は、薬物誘発心臓毒性について予測的なマーカーとして有用なバイオマーカー（例えば、遺伝子及び/又はタンパク質）も更に提供する。これらのバイオマーカーとしては、表2に列挙されたマーカーが挙げられる。一実施形態において、薬物誘発心臓毒性の予測的なマーカーは、TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種のマーカーのパネルである。しかし、当業者は、本明細書で記載される方法を使用することにより、例えば、実施例3で記載する方法を実施することによってであるが、心臓毒性を誘導することが公知である異なる薬物を使用することにより、薬物誘発心臓毒性を予測するさらなるバイオマーカーを同定することが可能であろう。下記では、本発明の例示的な薬物誘発心臓毒性のバイオマーカーについて更に記載する。
GRP78及びGRP75はまた、グルコース応答タンパク質とも称する。これらのタンパク質は、心筋細胞の小胞体/筋小胞体ストレス（ERストレス）に関連する。SERCA又は筋小胞体のカルシウムATPaseは、心筋細胞内のCa2+ホメオスタシスを調節する。これらのATPaseのいかなる破壊も、心機能不全及び心不全をもたらしうる。本明細書で提示されるデータに基づくと、GRP75及びGRP78並びにそれらの周囲のエッジは、薬物誘発心臓毒性の新規の予測因子である。
TIMPメタロプロテアーゼインヒビター1ともまた称するTIMP1は、MMPに関連する細胞外マトリクスのリモデリングに関連する。TIMP1の発現は、心臓線維症と相関し、血管内皮細胞の低酸素状態もまた、TIMP1の発現を誘導する。本明細書で提示されるデータに基づくと、TIMP1は、薬物誘発心筋毒性の新規の予測因子である。
ペントラキシン3（Pentraxin 3）ともまた称するPTX3は、C反応性タンパク質（CRP）のファミリーに属し、心臓の炎症状態の優れたマーカーである。しかし、血漿PTX3はまた、敗血症又は他の医学的状態に起因する全身性の炎症応答も表しうるであろう。本明細書で提示されるデータに基づくと、PTX3は、心機能又は心臓毒性の新規のマーカーでありうる。更に、ネットワーク内のPTX 3に関連するエッジは、バイオマーカーの新規のパネルを形成しうるであろう。
HSPA6ともまた称するHSP76は、内皮細胞内及びBリンパ球内で発現することが公知であるにすぎない。このタンパク質については、心機能における役割が知られていない。本明細書で提示されるデータに基づくと、HSP76は、薬物誘発心臓毒性の新規の予測因子でありうる。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーAタンパク質ともまた称するPDIA4、PDIA1は、GRPと同様に、ERストレス応答に関連する。これらのタンパク質については、心機能における役割が知られていない。本明細書で提示されるデータに基づくと、これらのタンパク質は、薬物誘発心臓毒性の新規の予測因子でありうる。
CA2D1はまた、電位依存性カルシウムチャネルアルファ2/デルタサブユニットとも称する。電位依存性カルシウムチャネルのアルファ-2/デルタサブユニットは、カルシウム電流の密度、及びカルシウムチャネルの活性化/不活化反応速度を調節する。CA2D1は、心臓における励起収縮連関において重要な役割を演じる。このタンパク質については、心機能における役割が知られていない。本明細書で提示されるデータに基づくと、CA2D1は、薬物誘発心臓毒性の新規の予測因子である。
GPAT1は、4つの既知のグリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼアイソフォームのうちの1つであり、ミトコンドリア外膜上に位置し、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-1との相互調節を可能とする。GPAT1は、インスリン及びSREBP-1cにより転写的に上方調節され、AMP活性化タンパク質キナーゼにより急速に下方調節され、トリアシルグリセロール合成における役割と一致する。本明細書で提示されるデータに基づくと、GPAT1は、薬物誘発心臓毒性の新規の予測因子である。
タファジンともまた称するTAZは、心筋内及び骨格筋内で高度に発現する。TAZは、カルジオリピンの代謝に関与し、リン脂質-リゾリン脂質トランスアシラーゼとして機能する。タファジンは、ミトコンドリア内膜の特徴的な（signature）脂質のリン脂質であるカルジオリピン（CL）のリモデリングの一因となる。本明細書で提示されるデータに基づくと、TAZは、薬物誘発心臓毒性の新規の予測因子である。
本発明の多様な態様については、後続の小節で更に詳細に記載する。
B. 単離された核酸分子
本発明の一態様は、マーカータンパク質又はその一部をコードする核酸を含む単離核酸分子に関する。本発明の単離された核酸はまた、マーカー核酸分子及びマーカー核酸分子の断片、例えば、マーカー核酸分子を増幅するか又は突然変異させるためのPCRプライマーとしての使用に適する断片を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子も含む。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、DNA分子（例えば、cDNA又はゲノムDNA）及びRNA分子（例えば、mRNA）並びにヌクレオチド類似体を使用して作り出されたDNA又はRNAの類似体を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあるが、二本鎖DNAであることが好ましい。
「単離」された核酸分子とは、核酸分子の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。一実施形態において、「単離」された核酸分子は、天然では、核酸が由来する生物のゲノムDNA内で、核酸に隣接する配列（すなわち、核酸の5'端及び3'端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。例えば、多様な実施形態において、単離された核酸分子は、天然では、核酸が由来する細胞のゲノムDNA内で、核酸分子に隣接するヌクレオチド配列のうちの約5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB、又は0.1kB未満を含有しうる。別の実施形態において、cDNA分子などの「単離」された核酸分子は、組換え法により作製される場合は、他の細胞物質又は培養培地を実質的に含まないことも可能であり、化学合成される場合は、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことも可能である。細胞物質を実質的に含まない核酸分子は、約30％、20％、10％、又は5％未満の異種核酸（本明細書ではまた「夾雑核酸」とも称する）を有する調製物を含む。
本発明の核酸分子は、標準的な分子的生物学法及び本明細書で記載されるデータベース記録内の配列情報を使用して単離することができる。このような核酸配列の全部又は一部を使用する、標準的なハイブリダイゼーション法及びクローニング法（例えば、Sambrookら編、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989において記載されている）を使用して、本発明の核酸分子を単離することができる。
本発明の核酸分子は、標準的なPCR増幅法に従い、鋳型としてのcDNA、mRNA、又はゲノムDNA、及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することができる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクターへとクローニングし、DNA配列解析により特性決定することができる。更に、本発明の核酸分子の全部又は一部に対応するヌクレオチドは、標準的な合成法により、例えば、自動式DNA合成器を使用して調製することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、マーカー核酸のヌクレオチド配列又はマーカータンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。所与のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子とは、所与のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、これにより、安定的な二本鎖を形成しうる程度に十分に、所与のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子である。
更に、本発明の核酸分子は、全長の核酸配列が、マーカー核酸を含むか、又はマーカータンパク質をコードする核酸配列の一部だけを含む場合もある。このような核酸を、例えば、プローブ又はプライマーとして使用することができる。プローブ/プライマーは、1種以上の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして使用することが典型的である。オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸の少なくとも約7、好ましくは約15、より好ましくは約25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、又は400以上の連続するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むことが典型的である。
本発明の核酸分子の配列に基づくプローブを使用して、本発明の1種以上のマーカーに対応する転写物配列又はゲノム配列を検出することができる。プローブは、それへと結合された標識基、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素の共因子を含む。このようなプローブは、対象からの細胞サンプル中のタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定すること、例えば、mRNAレベルを検出すること、又はタンパク質をコードする遺伝子が突然変異又は欠失しているのかどうかを決定することなどにより、タンパク質を異常に発現させる細胞又は組織を同定するための診断用キットの一部として使用することができる。
本発明は、遺伝子コードの縮重に起因して、マーカータンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列と異なり、このため、同じタンパク質をコードする核酸分子も更に包含する。
当業者は、アミノ酸配列の変化をもたらすDNA配列の多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在しうることを理解するであろう。このような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に起因して、集団内の個体間に存在しうる。対立遺伝子とは、所与の遺伝子座においてあるいは生じる遺伝子群のうちの1つである。加えてまた、RNAの発現レベルに影響を与えるDNA多型も存在し、これらは、その遺伝子の網羅的発現レベルに影響を与えうる（例えば、調節又は分解に影響を与えることにより）ことも理解されるであろう。
本明細書で使用される「対立遺伝子バリアント」という語句とは、所与の遺伝子座において生じるヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。
本明細書で使用される「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然の対立遺伝子変異は、所与の遺伝子のヌクレオチド配列内に1〜5％の変異を結果としてもたらしうることが典型的である。代替的な対立遺伝子は、多数の異なる個体において、対象の遺伝子を配列決定することにより同定することができる。これは、様々な個体において、同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、容易に実行することができる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、機能活性を変化させない、任意且つ全てのこのようなヌクレオチド変異、並びに結果として得られるアミノ酸多型又はアミノ酸変異は、本発明の範囲内にあることを意図する。
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500又はそれ以上のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、マーカー核酸又はマーカータンパク質をコードする核酸とハイブリダイズする。本明細書で使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件であって、その下では、互いと少なくとも60％（65％、70％、好ましくは75％）同一なヌクレオチド配列が、互いとハイブリダイズした状態を維持することが典型的である条件について記載することを意図する。当業者には、このようなストリンジェントな条件が知られており、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、N.Y. (1989)の6.3.1〜6.3.6節において見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約45℃で、6倍濃度の塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中のハイブリダイゼーションに続いて、50〜65℃で0.2倍濃度のSSC、0.1％のSDS中の1回以上の洗浄である。
集団内に存在しうる、本発明の核酸分子の自然発生の対立遺伝子バリアントに加えて、当業者は、突然変異により配列変化を導入し、これにより、コードされるタンパク質の生物学的活性を変化させることなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらしうることを更に理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を施すことができる。「非必須」アミノ酸残基が、生物学的活性を変化させることなく野生型配列から変化させうる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、多様な種の相同体の間で保存的でないか又は半保存的であるに過ぎないアミノ酸残基は、活性に不可欠ではない可能性があり、したがって、変化のための標的となる可能性が高いであろう。あるいは、多様な種の相同体の間で（例えば、マウス相同体とヒト相同体との間で）保存的であるアミノ酸残基は、活性に必須である可能性があり、したがって、変化のための標的とはならない可能性が高いであろう。
したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含有する変異体のマーカータンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなバリアントマーカータンパク質は、自然発生のマーカータンパク質とはアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性は保持する。一実施形態において、このようなバリアントマーカータンパク質は、マーカータンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約40％同一であり、マーカータンパク質のアミノ酸配列と50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一のアミノ酸配列を有する。
バリアントマーカータンパク質をコードする単離された核酸分子は、1カ所以上のアミノ酸残基の置換、付加、又は欠失が、コードされるタンパク質へと導入されるように、1カ所以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加、又はヌクレオチド欠失を、マーカー核酸のヌクレオチド配列へと導入することにより創出することができる。突然変異は、部位指向突然変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発などの標準的な技法により導入することができる。1種以上の予測される非必須アミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を施すことが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえられるアミノ酸置換である。当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ-分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。あるいは、突然変異は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿って、ランダムに導入することができ、結果としてもたらされる突然変異体を、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発に続き、コードされるタンパク質を組換えにより発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。
本発明は、アンチセンスの核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸と相補的な分子、例えば、二本鎖のマーカーのcDNA分子のコード鎖と相補的であるか、又はマーカーのmRNA配列と相補的な分子を包含する。したがって、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のセンス核酸と水素結合（すなわち、アニール）しうる。アンチセンス核酸は、全コード鎖と相補的な場合もあり、その一部だけと相補的な場合もあり、例えば、タンパク質コード領域（又はオープンリーディングフレーム）の全部又は一部と相補的でありうる。アンチセンスの核酸分子はまた、マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全部又は一部に対してアンチセンスでもありうる。非コード領域（「5'側及び3'側の非翻訳領域」）とは、コード領域に隣接し、アミノ酸へと翻訳されない、5'側及び3'側の配列である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、又は50以上のヌクレオチド長でありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で知られる手順を使用する化学合成及び酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然発生のヌクレオチド、又は多様な形で修飾されたヌクレオチドであって、分子の生物学的安定性を増大させるか、又はアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるようにデザインされたヌクレオチドを使用して化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を作り出すために使用しうる修飾ヌクレオチドの例は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルクェオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルクェオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシルである(acp3)u、及び2,6-ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンスの配向性でサブクローニングした（すなわち、後続の小節で更に記載される通り、挿入された核酸から転写されたRNAは、対象の標的核酸に対してアンチセンスの配向性となろう）発現ベクターを使用して、生物学的に作製することもできる。
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的には、対象に投与されるか、あるいはこれがマーカータンパク質をコードする細胞mRNA及び／又はゲノムDNAとハイブリダイズする又は結合するようにin situで生成されて、それによりマーカーの発現を、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することにより、阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する慣用的なヌクレオチド相補性によって、又は例えば、DNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用によって、生じうる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位への直接注射、又は毒性状態と関連する体液へのアンチセンス核酸の注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を選択した細胞へ標的化するように修飾して、全身投与してもよい。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子が選択した細胞表面上に発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗原と連結することによって、アンチセンス分子を修飾することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達してもよい。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子を強力なpol II又はpol IIIプロモーターの制御下に配置したベクター構築物が好ましい。
本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子とすることもできる。α-アノマー核酸分子は、通常のα単位とは対照的に、相補的なRNAと特異的な二本鎖ハイブリッド（2つの鎖が互いに並行している）を形成する（Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた、2’-o-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）、又はキメラRNA-DNA類似体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330）を含んでもよい。
本発明はまたリボザイムを包含する。リボザイムは、それに対する相補性領域を有する一本鎖核酸、例えばmRNAを切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。したがって、リボザイム（例として、Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591に記載のようなハンマーヘッド型リボザイム）を用いて、mRNA転写物を触媒的に切断し、それによりそのmRNAによりコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。マーカータンパク質をコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、そのマーカーに対応するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が切断対象のヌクレオチド配列に対して相補的である、テトラヒメナ（Tetrahymena）L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる（Cech et al. 米国特許第4,987,071号、及びCech et al. 米国特許第5,116,742号参照）。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択することができる（例として、Bartel and Szostak, 1993, Science 261:1411-1418参照）。
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を包含する。例えば、本発明のマーカーの発現は、マーカー核酸又はタンパク質をコードする遺伝子の調節領域（例えばプロモーター及び／又はエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチド配列に標的化し、標的細胞における遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって阻害することができる。一般的には、Helene (1991) Anti抗癌薬 Des. 6(6):569-84；Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36；及びMaher (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照のこと。
多様な実施形態において、本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、又は可溶性を改善することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を作り出すことができる（Hyrupら、1996、Bioorganic & Medicinal Chemistry、4(1): 5〜23を参照されたい）。本明細書で使用される「ペプチド核酸」又は「PNA」という用語は、デオキシリボースリン酸骨格が、プソイドペプチド骨格により置きかえられ、4つの天然の核酸塩基だけが保持された核酸模倣体、例えば、DNA模倣体を指す。PNAの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、DNA及びRNAとの特異的なハイブリダイゼーションを可能とすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrupら(1996)、前出；Perry-O'Keefeら(1996)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:14670〜675において記載されている、標準的な固相ペプチド合成プロトコールを使用して実施することができる。
PNAは、治療用途及び診断用途において使用することができる。例えば、PNAは、例えば、転写若しくは翻訳の停止を誘導するか、又は複製を阻害することにより、配列特異的に遺伝子の発現をモジュレートするためのアンチセンス薬剤又はアンチジーン薬剤として使用することができる。PNAはまた、例えば、PNA指向PCRクランピングによる、例えば、遺伝子内の一塩基対突然変異の解析においても使用することができ、他の酵素、例えば、S1ヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合の人工制限酵素としても使用することができ（Hyrup (1996)、前出）、DNA配列及びハイブリダイゼーションのためのプローブ又はプライマーとしても使用することができる（Hyrup、1996、前出；Perry-O'Keefeら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:14670〜675）。
別の実施形態において、PNAを修飾して、例えば、親油性若しくは他のヘルパー基を、PNAへと結合させることによってPNA-DNAキメラを形成することにより、又はリポソーム若しくは当技術分野で公知の薬物送達の他の技法を使用することにより、それらの安定性又は細胞取込みを増強することができる。例えば、PNAの有利な特性とDNAの有利な特性とを組み合わせうる、PNA-DNAキメラを作り出すことができる。このようなキメラは、DNA認識酵素、例えば、RNアーゼH及びDNAポリメラーゼが、DNA部分と相互作用する一方で、PNA部分が高度な結合アフィニティー及び特異性をもたらすことを可能とする。PNA-DNAキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基の間の結合数、及び配向性との関係性で選択される適切な長さのリンカーを使用して連結することができる（Hyrup、1996、前出）。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup (1996)、前出；及びFinnら(1996)、Nucleic Acids Res.、24(17):3357〜63において記載されている通りに実施することができる。例えば、DNA鎖は、固体支持体上で、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学反応及び修飾ヌクレオシド類似体を使用して合成することができる。5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジンホスホルアミダイトなどの化合物は、PNAとDNAの5'端との間の連結として使用することができる（Magら、1989、Nucleic Acids Res.、17:5973〜88）。次いで、PNAの単量体を、段階的にカップリングして、5'側のPNAセグメント及び3'側のDNAセグメントを含むキメラ分子を作製する（Finnら、1996、Nucleic Acids Res.、24(17):3357〜63）。あるいは、キメラ分子は、5'側のDNAセグメント及び3'側のPNAセグメントにより合成することもできる（Peterserら、1975、Bioorganic Med. Chem. Lett.、5:1119〜11124）。
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、in vivoにおいて宿主細胞受容体ターゲティングするためのペプチド）、又は細胞膜（例えば、Letsingerら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:6553〜6556； Lemaitreら、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:648〜652； PCT公開第WO88/09810号を参照されたい）若しくは血液脳関門（例えば、PCT公開第WO89/10134号を参照されたい）を越える輸送を容易にする薬剤など、他の付属基を含みうる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Krolら、1988、Bio/Techniques、6:958〜976を参照されたい）又はインターカレート剤（例えば、Zon、1988、Pharm. Res.、5:539〜549を参照されたい）で修飾することができる。この目的で、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などへとコンジュゲートすることができる。
本発明はまた、分子ビーコンがサンプル中の本発明の核酸の存在を定量化するのに有用であるように、本発明の核酸と相補的な少なくとも1種の領域を有する分子ビーコン核酸も含む。「分子ビーコン」核酸とは、一対の相補的領域を含み、フルオロフォア及びそれと会合する蛍光消光剤を有する核酸である。フルオロフォア及び消光剤は、相補的領域が互いとアニールすると、フルオロフォアの蛍光が消光剤により消光されるような配向性で、核酸の異なる部分と会合する。核酸の相補的領域が互いとアニールしない場合は、フルオロフォアの蛍光が消光される程度が低下する。分子ビーコン核酸は、例えば、米国特許第5,876,930号において記載されている。
C. 単離されたタンパク質及び単離された抗体
本発明の一態様は、単離されたマーカータンパク質及びその生物学的活性部分、並びにマーカータンパク質又はその断片に対する抗体を生起するための免疫原としての使用に適するポリペプチド断片に関する。一実施形態において、天然のマーカータンパク質は、標準的なタンパク質精製法を使用する適切な精製スキームにより、細胞供給源又は組織供給源から単離することができる。別の実施形態において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドは、組換えDNA法により作製する。組換え発現に対する代替法として、このようなタンパク質又はペプチドは、標準的なペプチド合成法を使用して化学合成することもできる。
「単離」又は「精製」されたタンパク質又はその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する細胞供給源又は組織供給源からの細胞物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、又は化学合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、タンパク質が、それが単離されるか又は組換え法により作製される細胞の細胞内成分から分離された、タンパク質の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約30％、20％、10％、又は5％未満（乾燥重量で）の異種タンパク質（本明細書ではまた「夾雑タンパク質」とも称する）を有するタンパク質の調製物を含む。タンパク質又はその生物学的活性部分を組換え法により作製する場合、タンパク質又はその生物学的活性部分はまた、培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量のうちの約20％、10％、又は5％未満を表すことが好ましい。タンパク質を化学合成により作製する場合、タンパク質は、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離されていることが好ましい。したがって、このようなタンパク質の調製物は、約30％、20％、10％、又は5％未満（乾燥重量で）の、対象のポリペプチド以外の化学的前駆体又は化合物を有する。
マーカータンパク質の生物学的活性部分は、マーカータンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか又はこれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、全長タンパク質より少数のアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも1種の活性を呈示するポリペプチドを含む。生物学的活性部分は、対応する全長タンパク質の少なくとも1種の活性を伴うドメイン又はモチーフを含むことが典型的である。本発明のマーカータンパク質の生物学的活性部分は、例えば、10、25、50、100又はそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドでありうる。更に、マーカータンパク質の他の領域を欠失させた他の生物学的活性部分も、組換え法により調製し、マーカータンパク質の天然形態の機能活性のうちの1種以上について評価することができる。
好ましいマーカータンパク質は、実施例において記載される遺伝子のうちのいずれかをコードする配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる。他の有用なタンパク質は、これらの配列のうちの1つと実質的に（例えば、少なくとも約40％、好ましくは、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％）同一であり、対応する自然発生のマーカータンパク質の機能活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異又は突然変異誘発に起因して、アミノ酸配列が異なる。
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較を目的としてアライメントする（例えば、第2のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアライメントのために、第1のアミノ酸配列又は核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列内の位置が、第2の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占有されている場合、分子は、その位置において同一である。好ましくは、2つの配列の間の同一性パーセントを、グローバルアライメントを使用して計算する。あるいは、2つの配列の間の同一性パーセントを、ローカルアライメントを使用して計算する。2つの配列の間の同一性パーセントとは、2つの配列により共有される同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％=同一な位置の数/位置の総数（例えば、重複する位置）×100）である。一実施形態において、2つの配列は、同じ長さである。別の実施形態において、2つの配列は、同じ長さではない。
2つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。2つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschul (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:5873〜5877における通りに改変された、Karlin及びAltschul (1990)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:2264〜2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら(1990)、J. Mol. Biol.、215:403〜410のBLASTNプログラム及びBLASTXプログラムへと組み込む。BLAST ヌクレオチド検索は、スコア=100、ワード長=12とするBLASTNプログラムにより実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、スコア=50、ワード長=3とするBLASTPプログラムにより実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的として、ギャップを施したアライメントを得るために、Altschulら(1997)、Nucleic Acids Res.、25:3389〜3402において記載されている、ギャップBLASTと呼ばれるBLASTアルゴリズムの新たなバージョンであって、BLASTNプログラム、BLASTPプログラム、及びBLASTXプログラムのためのギャップを施したローカルアライメントを実施することが可能なバージョンを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子の間の遠隔の関係性を検出する、反復検索を実施することもできる。BLASTプログラム、ギャップBLASTプログラム、及びPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、BLASTX及びBLASTN）のデフォルトのパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMiller、(1988)、CABIOS、4:11〜17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）へと組み込む。アミノ酸配列を比較するために、ALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み残基表、ギャップ長ペナルティー12、及びギャップペナルティー4を使用することができる。局所的な配列類似性の領域及びアライメントを同定するための、更に別の有用なアルゴリズムは、Pearson及びLipman (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:2444〜2448において記載されているFASTAアルゴリズムである。ヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するために、FASTAアルゴリズムを使用する場合、PAM120重み残基表は、例えば、k-タプル（tuple）値を2として用いることができる。
2つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップを許容するか又はギャップを許容しない、上記で記載した技法と類似の技法を使用して決定することができる。同一性パーセントの計算では、正確なマッチだけをカウントする。
本発明はまた、マーカータンパク質又はそのセグメントを含むキメラタンパク質又は融合タンパク質も提供する。本明細書で使用される「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、マーカータンパク質以外のポリペプチド）へと機能的に連結したマーカータンパク質の全部又は一部（好ましくは、生物学的活性部分）を含む。融合タンパク質内で、「機能的に連結した」という用語は、マーカータンパク質又はそのセグメントと異種ポリペプチドとを、インフレームで互いと融合させることを指し示すことを意図する。異種ポリペプチドは、マーカータンパク質又はセグメントのアミノ末端又はカルボキシル末端と融合させることができる。
1つの有用な融合タンパク質は、マーカータンパク質又はセグメントを、GST配列のカルボキシル末端へと融合させたGST融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を容易としうる。
別の実施形態において、融合タンパク質は、そのアミノ末端に異種シグナル配列を含有する。例えば、マーカータンパク質の天然のシグナル配列は、除去し、別のタンパク質からのシグナル配列で置きかえることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列は、異種シグナル配列として使用することができる（Ausubelら編、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、NY、1992）。他の真核生物異種シグナル配列の例は、メリチン及びヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列（Stratagene； La Jolla、California）を含む。更に別の例では、有用な原核生物異種シグナル配列は、phoA分泌シグナル（Sambrookら、前出）及びプロテインA分泌シグナル（Pharmacia Biotech； Piscataway、New Jersey）を含む。
更に別の実施形態において、融合タンパク質は、マーカータンパク質の全部又は一部を、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列へと融合させた免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物へと組み込み、対象へと投与して、リガンド（可溶性リガンド又は膜に結合したリガンド）と、細胞（受容体）表面上のタンパク質との間の相互作用を阻害し、これにより、in vivoにおけるシグナル伝達を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、マーカータンパク質のコグネイトリガンドのバイオアベイラビリティーに影響を与えることができる。リガンド/受容体相互作用の阻害は、増殖分化障害の処置及び細胞生存のモジュレート（例えば、促進又は阻害）のいずれにも治療的に有用でありうる。更に、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、対象において、マーカータンパク質に対する抗体を産生させ、リガンドを精製し、スクリーニングアッセイにおいて、マーカータンパク質のリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として使用することもできる。
本発明のキメラタンパク質及び融合タンパク質は、標準的な組換えDNA法により作製することができる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動式DNA合成器を含む従来の技法により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続的な遺伝子断片の間で相補的な突出をもたらすアンカープライマーを使用して実行し、その後、これを、アニール及び再増幅して、キメラ遺伝子配列を作り出すこともできる（例えば、Ausubelら、前出を参照されたい）。更に、融合部分（例えば、GSTポリペプチド）を予めコードする多くの発現ベクターも市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分を、インフレームで、本発明のポリペプチドへと連結するように、このような発現ベクターへとクローニングすることができる。
シグナル配列を使用して、マーカータンパク質の分泌及び単離を容易とすることができる。シグナル配列は、一般に1回以上の切断イベントにおける分泌時に成熟タンパク質から切断される、疎水性アミノ酸のコアにより特徴付けられることが典型的である。このようなシグナルペプチドは、それらが、分泌経路を通過するときに、シグナル配列の成熟タンパク質からの切断を可能とするプロセシング部位を含有する。したがって、本発明は、シグナル配列を有するマーカータンパク質、融合タンパク質、又はこれらのセグメント、並びにシグナル配列がタンパク質分解により切断されたタンパク質（すなわち、切断産物）に関する。一実施形態において、シグナル配列をコードする核酸配列は、発現ベクター内で、マーカータンパク質又はそのセグメントなど、対象のタンパク質へと機能的に連結することができる。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換され、シグナル配列が、その後又は同時に切断される真核生物宿主などからのタンパク質の分泌を方向付ける。次いで、タンパク質は、当技術分野で認識された方法により、細胞外培地から容易に精製することができる。あるいは、シグナル配列は、GSTドメインによるなどの精製を容易とする配列を使用して、対象のタンパク質へと連結することもできる。
本発明はまた、マーカータンパク質のバリアントにも関する。このようなバリアントは、アゴニスト（模倣体）又はアンタゴニストとして機能しうるアミノ酸配列の変化を有する。バリアントは、突然変異誘発、例えば、離散点突然変異又は末端切断（トランケーション）により作り出すことができる。アゴニストは、タンパク質の自然発生形態の生物学的活性の実質的な同一物又はサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、対象のタンパク質を含む細胞内シグナル伝達カスケードの下流又は上流のメンバーに競合的に結合することにより、タンパク質の自然発生形態の活性のうちの1種以上を阻害しうる。したがって、特異的な生物学的効果を、機能を制限されたバリアントで処置することにより誘発することができる。タンパク質の自然発生形態の生物学的活性のサブセットを有するバリアントによる対象の処置は、対象における副作用を、タンパク質の自然発生形態による処置と比べて小さくすることができる。
アゴニスト（模倣体）又はアンタゴニストとして機能するマーカータンパク質の変異体は、本発明のタンパク質の突然変異体、例えば、切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。一実施形態において、多様化バリアントライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアルの突然変異誘発により作り出し、多様化遺伝子ライブラリーによりコードさせる。多様化バリアントライブラリーは、例えば、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、又はあるいは、大型の融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能となるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列へと酵素的にライゲーションすることにより作製することができる。潜在的なマーカータンパク質のバリアントのライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するのに使用しうる様々な方法が存在する。当技術分野では、縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法が公知である（例えば、Narang、1983、Tetrahedron、39:3； Itakuraら、1984、Annu. Rev. Biochem.、53:323； Itakuraら、1984、Science、198:1056； Ikeら、1983、Nucleic Acids Res.、11:477を参照されたい）。
加えて、マーカータンパク質のセグメントのライブラリーを使用して、バリアントのマーカータンパク質又はこれらのセグメントをスクリーニングし、その後選択するためのポリペプチドの多様化集団を作り出すこともできる。例えば、対象のコード配列の二本鎖PCR断片を、ニッキングが分子1つ当たり約1回だけ生じる条件下においてヌクレアーゼで処理し、二本鎖DNAを変性させ、DNAを復元して、異なるニッキング産物からのセンス/アンチセンス対を含みうる二本鎖DNAを形成し、一本鎖部分を、S1ヌクレアーゼで処理することを介して、再形成された二本鎖から除去し、結果としてもたらされる断片ライブラリーを、発現ベクターへとライゲーションすることにより、コード配列断片のライブラリーを作り出すことができる。この方法により、対象のタンパク質のアミノ末端及び多様なサイズの内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
当技術分野では、点突然変異又は切断により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、cDNAライブラリーを、選択される特性を有する遺伝子産物についてスクリーニングするための複数の技法が公知である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技法であって、ハイスループット解析に適する技法は、遺伝子ライブラリーを、複製可能な発現ベクターへとクローニングするステップと、適切な細胞を、結果としてもたらされるベクターライブラリーで形質転換するステップと、コンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出により、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件下で発現させるステップとを含むことが典型的である。ライブラリー内の機能的な突然変異体の頻度を増大させる技法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（REM）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、本発明のタンパク質のバリアントを同定することができる（Arkin及びYourvan、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:7811〜7815； Delgraveら、1993、Protein Engineering、6(3):327- 331）。
本発明の別の態様は、本発明のタンパク質に対する抗体に関する。好ましい実施形態において、抗体は、マーカータンパク質又はその断片に特異的に結合する。本明細書では互換的に用いられる「抗体」及び「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分（すなわち、このような部分は、マーカータンパク質、例えば、マーカータンパク質のエピトープなどの抗原に特異的に結合する抗原結合性部位を含有する）を含む免疫グロブリン分子、並びにそのフラグメント及び誘導体を指す。本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、サンプル中、例えば、天然でタンパク質を含有する生物学的サンプル中の、タンパク質には結合するが、他の分子には実質的に結合しない抗体である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例は、一本鎖抗体（scAb）、F(ab)、及びF(ab')2フラグメントを含むがこれらに限定されない。
本発明の単離されたタンパク質又はその断片は、抗体を作り出すための免疫原として使用することができる。全長タンパク質を使用することもできるが、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原ペプチド断片も提供する。本発明のタンパク質の抗原ペプチドは、本発明のタンパク質のうちの1つのアミノ酸配列の少なくとも8アミノ酸残基（好ましくは、10、15、20、又は30アミノ酸残基以上）を含み、該ペプチドに対して作製される抗体が、タンパク質と特異的な免疫複合体を形成するように、タンパク質の少なくとも1種のエピトープを含む。抗原ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性領域である。疎水性配列解析、親水性配列解析、又は類似の解析を使用して、親水性領域を同定することができる。好ましい実施形態において、単離されたマーカータンパク質又はその断片を、免疫原として使用する。
免疫原は、ウサギ、ヤギ、マウス、若しくは他の哺乳動物、又は脊椎動物など、適切な（すなわち、免疫応答性の）対象を免疫化することにより、抗体を調製するのに使用されることが典型的である。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現タンパク質若しくは組換え発現ペプチド又は化学合成タンパク質若しくは化学合成ペプチドを含有しうる。調製物は、フロイント完全アジュバント若しくはフロイント不完全アジュバント、又は類似の免疫刺激剤などのアジュバントも更に含みうる。好ましい免疫原組成物は、例えば、本発明のタンパク質を組換え発現させるための非ヒト宿主細胞を使用して作製される免疫原組成物など、他のヒトタンパク質を含有しない免疫原組成物である。このようにして、結果としてもたらされる抗体組成物は、本発明のタンパク質以外のヒトタンパク質に対する結合が低減されているか、又はこれらに対して結合しない。
本発明は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合性部位の1つの分子種だけを含有する抗体分子の集団を指す。好ましいポリクローナル抗体組成物及びモノクローナル抗体組成物とは、本発明のタンパク質に対する抗体のために選択された、ポリクローナル抗体組成物及びモノクローナル抗体組成物である。特に好ましいポリクローナル抗体調製物及びモノクローナル抗体調製物は、マーカータンパク質又はその断片に対する抗体だけを含有するポリクローナル抗体調製物及びモノクローナル抗体調製物である。
ポリクローナル抗体は、適切な対象を、免疫原としての本発明のタンパク質で免疫化することにより調製することができる。免疫化された対象における抗体力価は、固定化されたポリペプチドを使用する酵素結合免疫アッセイ（ELISA）による技法など、標準的な技法により、時間経過に沿ってモニタリングすることができる。免疫化後の適切な時点、例えば、特異的抗体力価が最大となるときに、抗体産生細胞を対象から得、Kohler及びMilstein (1975)、Nature、256:495〜497により最初に記載されたハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（Kozborら、1983、Immunol. Today、4:72を参照されたい）、EBV-ハイブリドーマ法（Coleら、77〜96頁、「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」、Alan R. Liss, Inc.、1985を参照されたい）、又はトリオーマ法などの標準的な技法により、モノクローナル抗体（mAb）を調製するのに使用することができる。ハイブリドーマを作製するための技術は周知である（「Current Protocols in Immunology」、Coliganら編、John Wiley & Sons、New York、1994を一般に参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養物の上清を、例えば、標準的なELISAアッセイを使用して、対象のポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることにより検出する。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製に対する代替法として、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を、対象のポリペプチドでスクリーニングすることにより同定及び単離することもできる。ファージディスプレイライブラリーを作り出し、スクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、PharmaciaによるRecombinant Phage Antibody System、型番27-9400-01；及びStratagene SurfZAP Phage Display Kit、型番240612）。更に、抗体ディスプレイライブラリーを作り出し、スクリーニングするときの使用に特に適する方法及び試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号； PCT公開第WO92/18619号； PCT公開第WO91/17271号；PCT公開第WO92/20791号； PCT公開第WO92/15679号； PCT公開第WO93/01288号； PCT公開第WO92/01047号；PCT公開第WO92/09690号； PCT公開第WO90/02809号； Fuchsら(1991)、Bio/technology、9:1370〜1372； Hayら(1992)、Hum. Antibod. Hybridomas、3:81〜85； Huseら(1989)、Science、246:1275- 1281； Griffithsら(1993)、EMBO J.、12:725〜734において見出すことができる。
本発明はまた、本発明のタンパク質に特異的に結合する組換え抗体も提供する。好ましい実施形態において、組換え抗体は、マーカータンパク質又はその断片に特異的に結合する。組換え抗体は、ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体、一本鎖抗体、並びに多特異性抗体を含むがこれらに限定されない。キメラ抗体とは、マウスmAbに由来する可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子など、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Cabillyら、米国特許第4,816,567号；及びBossら、米国特許第4,816,397号を参照されたい）。一本鎖抗体は、抗原結合性部位を有し、単一のポリペプチドからなる。それらは、当技術分野で知られる技法により、例えば、Ladnerら、米国特許第4,946,778号（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）； Birdら(1988)、Science、242:423〜426； Whitlowら(1991)、Methods in Enzymology、2:1〜9； Whitlowら(1991)、Methods in Enzymology、2:97〜105；及びHustonら(1991)、Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications、203:46〜88において記載される方法を使用して作製することができる。多特異性抗体とは、異なる抗原に特異的に結合する少なくとも2つの抗原結合性部位を有する抗体分子である。このような分子は、当技術分野で知られる技法により、例えば、Segal、米国特許第4,676,980号（その開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）； Holligerら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444〜6448； Whitlowら(1994)、Protein Eng.、7:1017〜1026；及び米国特許第6,121,424号において記載される方法を使用して作製することができる。
ヒト化抗体とは、非ヒト種に由来する1種以上の相補性決定領域（CDR）及びヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する、非ヒト種に由来する抗体分子である（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Queen、米国特許第5,585,089号を参照されたい）。ヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA法により、例えば、PCT公開第WO87/02671号；欧州特許出願第184,187号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願第173,494号； PCT公開第WO86/01533号；米国特許第4,816,567号；欧州特許出願第125,023号； Betterら(1988)、Science、240:1041〜1043； Liuら(1987)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:3439〜3443； Liuら(1987)、J. Immunol.、139:3521- 3526； Sunら(1987)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:214〜218； Nishimuraら(1987)、Cancer Res.、47:999〜1005； Woodら(1985)、Nature、314:446〜449；及びShawら(1988)、J. Natl. Cancer Inst.、80:1553〜1559)； Morrison (1985)、Science、229:1202〜1207； Oiら(1986)、Bio/Techniques、4:214；米国特許第5,225,539号； Jonesら(1986)、Nature、321:552〜525； Verhoeyanら(1988)、Science、239:1534；及びBeidlerら(1988)、J. Immunol.、141:4053〜4060において記載される方法を使用して作製することができる。
より具体的には、ヒト化抗体は、例えば、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子及び内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を発現させることが不可能であるが、ヒト重鎖遺伝子及びヒト軽鎖遺伝子は発現させうるトランスジェニックマウスを使用して作製することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全部又は一部により、通常の形で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスにより保有されるヒト免疫グロブリントランスジーンは、B細胞分化時に再構成され、その後、クラススイッチ及び体細胞突然変異を経る。したがって、このような技法を使用して、治療的に有用なIgG抗体、IgA抗体、及びIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概観については、Lonberg及びHuszar (1995)、Int. Rev. Immunol.、13:65〜93を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術並びにこのような抗体を作製するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；及び米国特許第5,545,806号を参照されたい。加えて、Abgenix, Inc. （Freemont、CA）などの企業も、上記で記載した技術と類似の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに関与しうる。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と称する技法を使用して作り出すことができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Jespersら、1994、Bio/technology、12:899〜903）。
本発明の抗体は、作製の後、単離（例えば、対象の血液又は血清から）又は合成し、よく知られた技法により更に精製することができる。例えば、IgG抗体は、プロテインAクロマトグラフィーを使用して精製することができる。本発明のタンパク質に特異的な抗体は、選択（例えば、部分的に精製）することもでき、又は例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。例えば、組換えにより発現させ、精製（又は部分的に精製）した本発明のタンパク質は、本明細書で記載される通りに作製し、例えば、クロマトグラフィーカラムなど、固体支持体へと共有結合的又は非共有結合的にカップリングする。次いで、カラムを使用して、本発明のタンパク質に特異的な抗体を、多数の異なるエピトープに対する抗体を含有するサンプルからアフィニティー精製し、これにより、実質的に精製された抗体組成物、すなわち、夾雑抗体を実質的に含まない抗体組成物を作り出すことができる。この文脈において、実質的に精製された抗体組成物とは、抗体サンプルが、最大で30％（乾燥重量で）に限り、本発明の所望のタンパク質のエピトープ以外のエピトープに対する夾雑抗体を含有し、サンプルのうちの好ましくは最大で20％、更により好ましくは最大で10％であり、最も好ましくは最大で5％の（乾燥重量で）が夾雑抗体であることを意味する。精製された抗体組成物とは、組成物中の少なくとも99％の抗体が、本発明の所望のタンパク質に対するものであることを意味する。
好ましい実施形態において、実質的に精製された本発明の抗体は、本発明のタンパク質のシグナルペプチド、分泌配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン若しくは細胞質ドメイン、又は細胞膜に特異的に結合しうる。特に好ましい実施形態において、実質的に精製された本発明の抗体は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列の分泌配列又は細胞外ドメインに特異的に結合する。より好ましい実施形態において、実質的に精製された本発明の抗体は、マーカータンパク質のアミノ酸配列の分泌配列又は細胞外ドメインに特異的に結合する。
本発明のタンパク質に対する抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準的な技法によりタンパク質を単離することができる。更に、このような抗体を使用して、マーカータンパク質又はその断片（例えば、細胞溶解物又は細胞上清中の）を検出して、マーカーの発現レベル及び発現パターンを評価することができる。抗体はまた、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定するための臨床検査手順の一部として、組織内又は体液中（例えば、毒性状態に関連する体液中）のタンパク質レベルを診断的にモニタリングするのにも使用することができる。検出は、検出用物質へとカップリングされた本発明の抗体を含む抗体の誘導体を使用することにより容易とすることができる。検出用物質の例は、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含み；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアクォリンを含み；適切な放射性物質の例は、125I、131I、35S、及び3Hを含む。
本発明の抗体はまた、癌の処置における治療剤としても使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の完全ヒト抗体を、ヒト癌患者、特に、癌を有する癌患者の治療的処置に使用する。別の好ましい実施形態において、マーカータンパク質又はその断片に特異的に結合する抗体を、治療的処置に使用する。更に、このような治療的抗体は、細胞毒素、治療剤、又は放射性金属イオンなどの治療部分へとコンジュゲートされた抗体を含む抗体の誘導体又は免疫毒素でありうる。細胞毒素又は細胞傷害薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例は、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又は相同体を含む。治療剤は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、及びロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びcis-ジクロロジアミン白金（II） （DDP；シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称:ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン（旧称:アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（AMC））、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むがこれらに限定されない。
本発明のコンジュゲート抗体は、所与の生物学的応答を修飾するために使用することができるが、これは、薬物部分は、古典的な化学的治療剤へと限定されると解釈されるべきではないからである。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質又はポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、リボソーム阻害タンパク質（その開示がその全体において本明細書に組み込まれる、Betterら、米国特許第6,146,631号を参照されたい）、アブリン、リシンA、シュードモナス（Pseusomonas）属外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血漿板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質；又は例えば、リンホカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、又は他の成長因子などの生物学的応答修飾剤を含みうる。
このような治療部分を抗体へとコンジュゲートするための技法は周知である（例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、243〜56頁(Alan R. Liss, Inc.、1985)； Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery、(2版)、Robinsonら(編)、623〜53頁(Marcel Dekker, Inc.、1987)； Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Bilological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、475〜506頁(1985)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編)、303〜16頁(Academic Press、1985)；及びThorpeら、「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev.、62:119〜58 (1982)を参照されたい）。
したがって、一態様では、本発明は、それらの全てが本発明のタンパク質に特異的に結合し、好ましくは、マーカータンパク質に特異的に結合する、実質的に精製された抗体、抗体フラグメント、及び抗体の誘導体を提供する。多様な実施形態において、実質的に精製された本発明の抗体又はそれらのフラグメント若しくは誘導体は、ヒト抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、及び/又はヒト化抗体でありうる。別の態様では、本発明は、それらの全てが本発明のタンパク質に特異的に結合し、好ましくは、マーカータンパク質に特異的に結合する、非ヒト抗体、非ヒト抗体のフラグメント、及び非ヒト抗体の誘導体を提供する。このような非ヒト抗体は、ヤギ抗体、マウス抗体、ヒツジ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体、又はラット抗体でありうる。あるいは、本発明の非ヒト抗体は、キメラ抗体及び/又はヒト化抗体でありうる。加えて、本発明の非ヒト抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。なおさらなる態様では、本発明は、それらの全てが本発明のタンパク質に特異的に結合し、好ましくは、マーカータンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、及びモノクローナル抗体の誘導体を提供する。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び/又は非ヒト抗体でありうる。
本発明はまた、検出用物質へとコンジュゲートされた本発明の抗体及び使用のための指示書を含有するキットも提供する。本発明のなおも別の態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。一実施形態において、医薬組成物は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む。
D. 予測医学
本発明は、診断アッセイ、予後診断アッセイ、ゲノム薬理学、及び臨床試験のモニタリングを、予後診断（予測）の目的で使用し、これにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の一態様は、個体に、薬物誘発毒性を発症する危険性があるのかどうかを決定するために、1種以上のマーカータンパク質又はマーカー核酸の発現レベルを決定するための診断アッセイに関する。このようなアッセイを予後診断の目的又は予測の目的で使用し、これにより、障害が発症する前に個体を予防的に処置することができる。
本発明の更に別の態様は、臨床試験において、薬剤（例えば、薬物誘発毒性を阻害又は処置又は予防するために投与される{すなわち、このような処置が及ぼしうる、任意の薬物誘発毒性作用を理解するための}薬物又は他の化合物）の、本発明のマーカーの発現又は活性に対する影響をモニタリングすることに関する。これらの薬剤及び他の薬剤については、以下の節で更に詳細に記載する。
E. 診断アッセイ
生物学的サンプル中のマーカータンパク質又はマーカー核酸の存在又は非存在を検出するための例示的な方法は、生物学的サンプル（例えば、毒性に関連する体液サンプル又は組織サンプル）を、検査対象から得るステップと、生物学的サンプルを、ポリペプチド又は核酸（例えば、mRNA、ゲノムDNA、又はcDNA）を検出することが可能な化合物又は薬剤と接触させるステップとを含む。したがって、本発明の検出方法を使用して、例えば、in vitro並びにin vivoにおける生物学的サンプル中のmRNA、タンパク質、cDNA、又はゲノムDNAを検出することができる。例えば、mRNAを検出するためのin vitro法は、ノーザンハイブリダイゼーション、及びin situハイブリダイゼーションを含む。マーカータンパク質を検出するためのin vitro法は、酵素結合免疫アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光を含む。ゲノムDNAを検出するためのin vitro法は、サザンハイブリダイゼーションを含む。mRNAを検出するためのin vivo法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ノーザンハイブリダイゼーション、及びin situハイブリダイゼーションを含む。更に、マーカータンパク質を検出するためのin vivo法は、対象へと、タンパク質又はその断片に対する標識抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置を、標準的な造影法により検出しうる、放射性マーカーで標識することができる。
このような診断アッセイ及び予後診断アッセイの一般原理は、マーカー及びプローブを含有しうるサンプル又は反応混合物を、適切な条件下で、マーカー及びプローブが、相互作用して結合し、これにより、反応混合物から除去しうる複合体及び/又は反応混合物中に検出しうる複合体を形成することを可能とするのに十分な時間にわたり調製することを含む。これらのアッセイは、様々な方法で実行することができる。
例えば、このようなアッセイを実行する1つの方法は、マーカー又はプローブを、基板ともまた称する固相支持体へとアンカーするステップと、反応の終了時に固相上にアンカーされた標的のマーカー/プローブ複合体を検出するステップとを含むであろう。このような方法の一実施形態において、マーカーの存在及び/又は濃度についてアッセイされる、対象由来のサンプルは、担体又は固相支持体へとアンカーすることができる。別の実施形態において、プローブを、固相へとアンカーすることができ、対象由来のサンプルを、アッセイのアンカーされない成分として反応させうる、逆の状況も可能である。
アッセイ成分を固相へとアンカーするための多くの方法が確立されている。これらは、限定せずに述べると、ビオチンとストレプトアビジンとのコンジュゲーションにより固定化されるマーカー分子又はプローブ分子を含む。このようなビオチニル化されたアッセイ成分は、当技術分野で公知の技法（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals、Rockford、IL）を使用して、ビオチン-NHS （N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェル内に固定化することができる。特定の実施形態において、アッセイ成分が固定化された表面を予め調製し、保存することができる。
このようなアッセイに適する他の担体又は固相支持体は、マーカー又はプローブが属する分子のクラスに結合することが可能な任意の物質を含む。よく知られた支持体又は担体は、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然セルロース及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、及びマグネタイトを含むがこれらに限定されない。
上記で言及した手法によるアッセイを実行するために、固定化されていない成分を、その上に第2の成分がアンカーされた固相へと添加する。反応の完了後、形成された任意の複合体が、固相上における固定化を維持するような条件下で、複合体化されていない成分を除去することができる（例えば、洗浄による）。固相へとアンカーされたマーカー/プローブ複合体の検出は、本明細書で概括される多数の方法で達成することができる。
好ましい実施形態において、アンカーされないアッセイ成分である場合のプローブは、アッセイの検出及びリードアウトを目的として、本明細書で論じられ、当業者に周知の検出用標識で、直接的又は間接的に標識することができる。
また、例えば、蛍光エネルギー移動の技法を利用することにより、いずれの成分（マーカー又はプローブ）のさらなる操作又は標識化を伴わずに、マーカー/プローブ複合体の形成を直接的に検出することも可能である（例えば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号； Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照されたい）。第1の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、適切な波長の入射光により励起されると、その発光蛍光エネルギーが、第2の「アクセプター」分子上の蛍光標識により吸収され、これが、吸収されたエネルギーに起因して蛍光発光することが可能であるように選択される。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーだけを使用することも可能である。「アクセプター」分子の標識を、「ドナー」の標識と差別化しうるように、異なる波長の光を発光する標識を選択する。標識間のエネルギー移動の効率は、分子を隔てる距離に関連するので、分子間の空間的関係性を評価することができる。結合が分子間で生じる状況では、アッセイ中の「アクセプター」分子の標識による蛍光発光が最大となろう。FET結合イベントは、当技術分野で周知の標準的な蛍光分析検出手段により（例えば、蛍光光度計を使用して）簡便に測定することができる。
別の実施形態において、マーカーを認識するプローブの能力の決定は、リアルタイムの生体分子相互作用解析（BIA）などの技術（例えば、Sjolander, S.及びUrbaniczky, C.、1991、Anal. Chem.、63:2338〜2345；並びにSzaboら、1995、Curr. Opin. Struct. Biol.、5:699〜705を参照されたい）を利用することにより、いずれのアッセイ成分（プローブ又はマーカー）も標識化せずに達成することができる。本明細書で使用される「BIA」又は「表面プラズモン共鳴」とは、生体特異的な相互作用を、リアルタイムで、相互作用体のいずれも標識化せずに研究するための技術（例えば、BIAcore）である。結合表面における質量の変化（結合イベントを示す）は、表面近傍における光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（SPR）の光学現象）を結果としてもたらすことから、検出可能なシグナルを結果としてもたらし、これは、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
あるいは、別の実施形態において、マーカー及びプローブを液相中の溶質とする、類似の診断アッセイ及び予後診断アッセイを実行することができる。このようなアッセイでは、複合体化されたマーカー及びプローブを、差次的遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、及び免疫沈降を含むがこれらに限定されない、多数の標準的な技法のうちのいずれかにより、複合体化されていない成分から分離する。差次的遠心分離では、それらの異なるサイズ及び密度に基づく、複合体の異なる沈殿平衡のために、一連の遠心分離ステップにより、マーカー/プローブ複合体を、複合体化されていないアッセイ成分から分離することができる（例えば、Rivas, G.及びMinton, A.P.、1993、Trends Biochem Sci.、18(8):284〜7を参照されたい）。また、標準的なクロマトグラフィー法も、複合体化された分子を、複合体化されていない分子から分離するのに利用することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づき、且つ、適切なゲル濾過樹脂をカラムフォーマット内で利用することにより分子を分離し、例えば、比較的大型の複合体を、比較的小型の複合体化されていない成分から分離することができる。同様に、マーカー/プローブ複合体の、複合体化されていない成分と比較して相対的に異なる電荷特性を利用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂を利用することにより、複合体を、複合体化されていない成分から差別化することができる。当業者には、このような樹脂及びクロマトグラフィー法が周知である（例えば、Heegaard, N.H.、1998年冬季、J. Mol. Recognit.、11(1〜6):141〜8； Hage, D.S.及びTweed, S.A.、J Chromatogr B Biomed Sci Appl、1997年10月10日；699(1〜2):499〜525を参照されたい）。また、ゲル電気泳動も、複合体化されたアッセイ成分を、結合していない成分から分離するのに使用することができる（例えば、Ausubelら編、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York、1987〜1999を参照されたい）。この技法では、タンパク質複合体又は核酸複合体を、例えば、サイズ又は電荷に基づき分離する。電気泳動プロセスにおける結合相互作用を維持するために、典型的には、非変性ゲルマトリクス物質及び還元剤の非存在下にある条件が好ましい。当業者には、特定のアッセイ及びその成分に適する条件が周知である。
特定の実施形態において、当技術分野で公知の方法を使用して、生物学的サンプル中で、in situフォーマット及びin vitroフォーマットのいずれによっても、マーカーmRNAのレベルを決定することができる。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞、生物学的流体、及びその単離物、並びに対象内に存在する組織、細胞、及び体液を含むことを意図する。多くの発現検出法では、単離RNAを使用する。in vitro法には、mRNAの単離に限定されない任意のRNA単離法を、RNAを細胞から精製するために利用することができる（例えば、Ausubelら編、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York 1987〜1999を参照されたい）。更に、多数の組織サンプルを、例えば、Chomczynski （1989、米国特許第4,843,155号）による単一ステップのRNA単離工程など、当業者に周知の技法を使用して容易に処理することができる。
単離mRNAは、サザンブロット法又はノーザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応解析、及びプローブアレイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅アッセイにおいて使用することができる。mRNAレベルを検出するのに好ましい1つの診断法は、単離mRNAを、検出される遺伝子によりコードされるmRNAとハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させるステップを含む。核酸プローブは、例えば、少なくとも7、15、30、50、100、250、又は500ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、本発明のマーカーをコードするmRNA又はゲノムDNAと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなど、全長cDNA又はその一部でありうる。本明細書では、本発明の診断アッセイにおける使用に適する他のプローブについても記載する。mRNAのプローブとのハイブリダイゼーションにより、対象のマーカーが発現していることが明示される。
1つのフォーマットでは、例えば、単離mRNAをアガロースゲル上を泳動させ、mRNAをゲルから、ニトロセルロースなどの膜へと転写することにより、mRNAを、固体表面上に固定化させ、プローブと接触させる。代替的なフォーマットでは、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイ内で、プローブ（複数可）を固体表面上に固定化させ、mRNAをそのプローブ（複数可）と接触させる。当業者は、既知のmRNA検出法を、本発明のマーカーによりコードされるmRNAのレベルの検出における使用に容易に適合させることができる。
サンプル中のmRNAマーカーのレベルを決定するための代替的な方法は、核酸増幅の工程、例えば、RT-PCR（実験的実施形態は、Mullis、1987、米国特許第4,683,202号に示されている）、リガーゼ連鎖反応（Barany、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:189〜193）、自己持続配列複製（Guatelliら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:1874〜1878）、転写増幅系（Kwohら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:1173〜1177）、Q-ベータレプリカーゼ（Lizardiら、1988、Bio/technology、6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardiら、米国特許第5,854,033号）、又は他の任意の核酸増幅法に続いて、当業者に周知の技法を使用する、増幅された分子の検出による工程を含む。これらの検出スキームは、核酸分子を、このような分子が極めて少数で存在する場合に検出するのにとりわけ有用である。本明細書で使用される増幅プライマーは、遺伝子の5'領域又は3'領域（それぞれ、プラス鎖及びマイナス鎖、又はこの逆）へとアニールし、中間の短い領域を含有しうる核酸分子の対であると規定される。一般に、増幅プライマーは、約10〜30ヌクレオチド長であり、約50〜200ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で、且つ、適切な試薬を伴って、このようなプライマーは、プライマーに挟まれるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
in situ法では、mRNAは、検出の前に単離する必要がない。このような方法では、細胞サンプル又は組織サンプルを、既知の組織学的方法を使用して調製/処理する。次いで、サンプルを、支持体、典型的には、スライドガラス上に固定化し、次いで、マーカーをコードするmRNAとハイブリダイズしうるプローブと接触させる。
マーカーの絶対発現レベルに基づき決定を行うことに対する代替法として述べると、決定は、マーカーの正規化した発現レベルに基づきうる。発現レベルは、マーカーの絶対発現レベルを、その発現を、マーカーではない遺伝子、例えば、構成的に発現するハウスキーピング遺伝子の発現と比較することを介して補正することにより正規化する。正規化に適する遺伝子は、アクチン遺伝子又は上皮細胞特異的遺伝子などのハウスキーピング遺伝子を含む。この正規化により、1つのサンプル、例えば、患者サンプル中の発現レベルの、別のサンプル、例えば、非疾患サンプル若しくは非毒性サンプルとの比較、又は異なる供給源由来のサンプルの間の比較が可能となる。
あるいは、発現レベルは、相対発現レベルとして提示することができる。マーカーの相対発現レベルを決定するために、マーカーの発現レベルを、疾患細胞単離物又は毒性細胞単離物と対比した正常細胞単離物の10以上のサンプル、好ましくは、50以上のサンプルについて決定してから、対象のサンプルについての発現レベルを決定する。多数のサンプル中でアッセイした遺伝子の各々の平均発現レベルを決定し、これを、マーカーについてのベースラインの発現レベルとして使用する。次いで、被験サンプルについて決定されたマーカーの発現レベル（絶対発現レベル）を、そのマーカーについて得られた平均発現値で除する。これにより、相対発現レベルがもたらされる。
ベースラインの決定で使用したサンプルは、非毒性細胞に由来することが好ましいであろう。細胞供給源の選択は、相対発現レベルの使用に依存する。正常組織内で見出される発現を、平均発現スコアとして使用することは、アッセイされたマーカーが、毒性特異的（正常細胞と対比して）であるのかどうかを検証する一助となる。加えて、より多くのデータが蓄積されるにつれ、平均発現値を修正し、蓄積されたデータに基づき、相対発現値の改善をもたらすことができる。疾患細胞又は毒性細胞からの発現データは、疾患状態又は毒性状態の重症度をグレード決定するための手段をもたらす。
本発明の別の実施形態において、マーカータンパク質を検出する。本発明のマーカータンパク質を検出するのに好ましい薬剤は、このようなタンパク質又はその断片に結合することが可能な抗体、好ましくは、検出用標識を伴う抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体の場合もあり、より好ましくは、モノクローナル抗体の場合もある。無傷抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体（例えば、Fab又はF(ab')2）を使用することができる。プローブ又は抗体に関する「標識された」という用語は、検出用物質を、プローブ又は抗体へとカップリング（すなわち、物理的に連結）することによる、プローブ又は抗体の直接的な標識化、並びに直接的に標識された別の試薬との反応性による、プローブ又は抗体の間接的標識化を含むことを意図する。間接的標識化の例は、蛍光標識された二次抗体、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出されうるように、ビオチンによるDNAプローブの末端標識化を使用する一次抗体の検出を含む。
細胞からのタンパク質は、当業者に周知の技法を使用して単離することができる。使用されるタンパク質単離法は、例えば、Harlow及びLane （Harlow及びLane、1988、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York）において記載されている単離法などでありうる。
様々なフォーマットを使用して、サンプルが、所与の抗体に結合するタンパク質を含有するのかどうかを決定することができる。このようなフォーマットの例は、酵素イムノアッセイ（EIA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ウェスタンブロット解析、及び酵素結合免疫アッセイ（ELISA）を含むがこれらに限定されない。当業者は、既知のタンパク質/抗体を、細胞が本発明のマーカーを発現させるのかどうかの決定における使用のための検出法に容易に適合させることができる。
1つのフォーマットでは、抗体又は抗体のフラグメント若しくは誘導体を、ウェスタンブロット法又は免疫蛍光法などの方法において使用して、発現したタンパク質を検出することができる。このような使用では一般に、抗体又はタンパク質を固体支持体上に固定化することが好ましい。適切な固相支持体又は担体は、抗原又は抗体に結合することが可能な任意の支持体を含む。よく知られた支持体又は担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、及びマグネタイトを含む。
当業者は、抗体又は抗原への結合に適する他の多くの担体について承知しており、このような支持体を、本発明における使用に適合させることが可能であろう。例えば、疾患細胞又は毒性細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースなどの固相支持体へと固定化することができる。次いで、支持体を、適切な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識された抗体による処理を施すことができる。次いで、固相支持体を、緩衝液で2回目に洗浄して、結合していない抗体を除去することができる。次いで、固体支持体上で結合した標識の量を、慣用的な手段により検出することができる。
本発明はまた、生物学的サンプル中のマーカータンパク質又はマーカー核酸の存在を検出するためのキットも包含する。このようなキットを使用して、対象が、薬物誘発毒性を生じているか、又はこれを発症する危険性が高いのかどうかを決定することができる。例えば、キットは、生物学的サンプル中のマーカータンパク質又はマーカー核酸を検出することが可能な、標識された化合物又は薬剤、及びサンプル中のタンパク質又はmRNAの量を決定するための手段（例えば、タンパク質若しくはその断片に結合する抗体、又はタンパク質をコードするDNA若しくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含みうる。キットはまた、キットを使用して得られる結果を解釈するための指示書も含みうる。
抗体ベースのキットでは、キットは、例えば、（1）マーカータンパク質に結合する第1の抗体（例えば、固体支持体に結合されている）；及び、任意選択で、（2）タンパク質又は第1の抗体に結合し、検出用標識へとコンジュゲートされた第2の異なる抗体を含みうる。
オリゴヌクレオチドベースのキットでは、キットは、例えば、（1）マーカータンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、又は（2）マーカー核酸分子を増幅するのに有用であるプライマー対を含みうる。キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、又はタンパク質安定化剤も含みうる。キットは、検出用標識（例えば、酵素又は基質）を検出するのに必要な成分も更に含みうる。キットはまた、アッセイし、被験サンプルと比較しうる、対照サンプル又は一連の対照サンプルも含有しうる。キットの各成分は、個別の容器内に封入し、多様な容器の全てを、単一のパッケージ内に、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための指示書と共に封入することができる。
F. ゲノム薬理学
本発明のマーカーはまた、ゲノム薬理学マーカーとしても有用である。本明細書で使用される「ゲノム薬理学マーカー」とは、その発現レベルが、患者における特異的な臨床薬物応答又は臨床薬物感受性と相関する客観的生化学マーカーである（例えば、McLeodら(1999)、Eur. J. Cancer、35(12): 1650〜1652を参照されたい）。ゲノム薬理学マーカー発現の存在又は量は、予測される患者の応答、及び、より具体的には、患者の疾患細胞又は毒性細胞の特定の薬物又は特定のクラスの薬物による治療への予測される応答に関連する。患者における1種以上のゲノム薬理学マーカー発現の存在又は量を評価することにより、患者にとって最も適切であるか、又は最大限の奏効をもたらすことが予測される薬物治療を選択することができる。例えば、患者における特定の腫瘍マーカーによりコードされるRNA又はタンパク質の存在又は量に基づき、患者において存在する可能性が高い特定の腫瘍を処置するのに最適化された薬物又は処置コースを選択することができる。したがって、ゲノム薬理学マーカーを使用することにより、異なる薬物又はレジメンを試すことなく、各癌患者に最も適切な処置を選択又はデザインすることが可能となる。
ゲノム薬理学の別の側面は、身体が薬物に対して作用する形を変化させる遺伝子状態を扱う。これらの薬理遺伝学的状態は、まれな欠陥として生じる場合もあり、多型として生じる場合もある。例えば、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）欠損症は、主要な臨床的合併症が、酸化薬（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の服用後、及びソラマメの摂取後における溶血である、一般的な遺伝性酵素病である。
例示的な実施形態として述べると、薬物代謝酵素の活性が、薬物作用の強度及び持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、N-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT 2）、並びにシトクロムP450酵素であるCYP2D6及びCYP2C19）の遺伝子多型の発見は、なぜ一部の患者は、期待される薬物効果を得ないのか、又は標準的な安全用量の薬物を服用した後で、過剰な薬物応答及び重篤な毒性を示すのかについての説明をもたらした。これらの多型は、集団内で、高代謝群（EM）及び低代謝群（PM）という2つの表現型により発現する。PMの発生率は、異なる集団間で異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は、高度に多型性であり、PMでは、複数の突然変異が同定されており、これらは全て、機能的なCYP2D6の非存在をもたらす。CYP2D6及びCYP2C19の低代謝群は、標準的な用量を施されても、極めて高頻度に過剰な薬物応答及び副作用を被る。代謝物が活性の治療部分である場合、PMは、CYP2D6により形成されるその代謝物であるモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛剤効果について裏付けられている通り、治療的応答を示さないであろう。他の極致（extreme）は、標準的な用量に応答しない、いわゆる超高代謝群である。近年、超高代謝の分子的基盤が、CYP2D6の遺伝子増幅に起因することが同定された。
したがって、個体における本発明のマーカーの発現レベルを決定して、これにより、個体の治療的処置又は予防的処置に適切な薬剤（複数可）を選択することができる。加えて、薬理遺伝学的研究を使用して、薬物代謝酵素をコードする多型性対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬物応答性の表現型の同定へと適用することができる。この知識を、投薬又は薬物の選択へと適用すると、有害反応又は治療的不奏効を回避し、したがって、本発明のマーカーの発現のモジュレーターで対象を処置する場合の治療効率又は予防効率を増強することができる。
G. 臨床試験のモニタリング
薬剤（例えば、薬物化合物）の、本発明のマーカーの発現レベルに対する影響をモニタリングすることは、基礎的な薬物スクリーニングだけでなく、また、臨床試験にも適用することができる。例えば、マーカーの発現に影響を与える薬剤の有効性は、心臓毒性又は薬物誘発毒性のための処置を施される対象についての臨床試験においてモニタリングすることができる。好ましい実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、又は他の薬物候補物質）による対象の処置の有効性をモニタリングするための方法であって、（i）投与前サンプルを、対象から、薬剤を投与する前に得るステップと；（ii）投与前サンプル中の、本発明の、1種以上の選択されたマーカーの発現レベルを検出するステップと；（iii）1種以上の投与後サンプルを、対象から得るステップと；（iv）投与後サンプル中の、マーカー（複数可）の発現レベルを検出するステップと；（v）投与前サンプル中のマーカー（複数可）の発現レベルを、1種以上の投与後サンプル中のマーカー（複数可）の発現レベルと比較するステップと；（vi）これにしたがって、薬剤の対象への投与を変化させるステップとを含む方法を提供する。例えば、処置コース中のマーカー遺伝子（複数可）の発現の増大は、投与量が有効でなく、投与量の増大が所望であることを示しうる。逆に、マーカー遺伝子（複数可）の発現の減少は、処置が有効であり、投与量を変化させる必要がないことを示しうる。
H. アレイ
本発明はまた、本発明のマーカーを含むアレイも含む。アレイを使用して、アレイにおける1種以上の遺伝子の発現をアッセイすることができる。一実施形態において、アレイを使用して、組織内の遺伝子の発現をアッセイして、アレイにおける遺伝子の組織特異性を確認することができる。このようにして、最大で約7600の遺伝子を、発現について同時にアッセイすることができる。これにより、とりわけ、1種以上の組織内で発現する遺伝子のバッテリー（battery）を示すプロファイリングを開発することが可能となる。
このような定性的決定に加えて、本発明では、遺伝子の発現の定量化も可能となる。したがって、組織特異性だけでなく、また、組織内の遺伝子バッテリーの発現レベルも確認可能である。したがって、それらの組織発現それ自体及びその組織内の発現レベルに基づき、遺伝子を群分けすることができる。これは、例えば、組織間の遺伝子の発現の関係性を確認するときに有用である。したがって、1つの組織を変動させ、第2の組織内の遺伝子の発現に対する効果（影響）を決定することができる。この文脈において、生物学的刺激に応答した、1つの細胞型の、別の細胞型に対する影響を決定することができる。このような決定は、例えば、遺伝子の発現レベルにおける細胞間相互作用の影響を知るのに有用である。薬剤を治療的に投与して、1つの細胞型を処置するのであるが、別の細胞型に対して望ましくない影響を与える場合、本発明は、望ましくない影響の分子的基盤を決定するためのアッセイを提供し、これにより、反対に作用する薬剤を共投与するか、又は望ましくない影響を他の形で処置する機会を提供する。同様に、単一の細胞型内であっても、望ましくない生物学的影響を分子レベルで決定することができる。したがって、薬剤の、標的遺伝子以外の発現に対する影響を確認し、これに対抗することができる。
別の実施形態において、アレイを使用して、アレイにおける1種以上の遺伝子の発現の時間経過をモニタリングすることができる。これは、本明細書で開示される通り、多様な生物学的文脈、例えば、薬物誘発毒性の発生、薬物誘発毒性の進行、及び薬物誘発毒性に関連する細胞の形質転換などのプロセスで生じうる。
アレイはまた、遺伝子の発現の、同じ細胞内又は異なる細胞内の他の遺伝子の発現に対する影響を確認するのにも有用である。これにより、例えば、最終的標的又は下流の標的を調節することができない場合に、治療的介入のための代替的な分子標的の選択がもたらされる。
アレイはまた、正常細胞内及び異常細胞内の1種以上の遺伝子の差次的な発現パターンを確認するのにも有用である。これにより、診断的介入又は治療的介入のための分子的標的として用いられうる遺伝子バッテリーがもたらされる。
VII. サンプルを得るための方法
本発明の方法において有用なサンプルは、本発明のマーカーを発現させる任意の組織サンプル、細胞サンプル、生検サンプル、又は体液サンプルを含む。一実施形態において、サンプルは、組織、細胞、全血液、血清、血漿、口腔内掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、又は気管支肺胞洗浄液でありうる。好ましい実施形態において、組織サンプルは、毒性状態サンプルである。より好ましい実施形態において、組織サンプルは、心血管サンプル、又は薬物誘発毒性サンプルである。
体内サンプルは、例えば、生検の使用、領域の掻爬若しくはスワビング、又は体液を吸引するための注射針の使用を含む、当技術分野で公知の様々な技法により、対象から得ることができる。当技術分野では、多様な体内サンプルを回収するための方法が周知である。
本発明のマーカーを検出及び定量化するのに適する組織サンプルは、採取したての場合もあり、凍結させる場合もあり、あるいは当業者に公知の方法により固定する場合もある。適切な組織サンプルは、さらなる解析のために、切片化し、顕微鏡用スライド上に置くことが好ましい。あるいは、固体サンプル、すなわち、組織サンプルは、可溶化及び/又はホモジナイズし、その後、可溶性抽出物として解析することもできる。
一実施形態において、得られたばかりの生検サンプルは、例えば、液体窒素又はジフルオロジクロロメタンを使用して凍結させる。凍結させたサンプルは、例えば、OCTを使用して、切片化するように取り付け、低温保持装置内で逐次的に切片化する。逐次的な切片を、顕微鏡用スライドガラス上に回収する。免疫組織化学染色では、スライドを、例えば、クロム-ミョウバン、ゼラチン、又はポリ-L-リシンでコーティングして、切片が、スライドに付着していることを確保することができる。別の実施形態において、切片化の前に、サンプルを固定及び包埋する。例えば、組織サンプルを、例えば、ホルマリン中に固定し、例えば、パラフィン中に逐次的に脱水及び包埋することができる。
サンプルが得られたら、本発明のマーカーを検出及び定量化するのに適することが当技術分野で知られる任意の方法を使用する（核酸レベル又はタンパク質レベルで）ことができる。当技術分野では、このような方法がよく知られており、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、免疫組織化学、ELISA、例えば、増幅ELISA、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、質量分析、例えば、MALDI-TOF及びSELDI-TOF、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、及び核酸増幅法を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のマーカーの発現は、例えば、これらのタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して、タンパク質レベルで検出する。
サンプルは、本発明のマーカーを、抗体への結合に利用可能とするために、修飾する必要のある場合がある。免疫細胞化学法又は免疫組織化学法の特定の態様では、スライドを前処理用緩衝液へと移し、任意選択で加熱して、抗原のアクセス可能性を増大させることができる。前処理用緩衝液中でサンプルを加熱することにより、細胞の脂質二重層を急速に破壊し、抗原に抗体の結合へのアクセス可能性を増大させる（採取したての検体の場合は該当しうるが、固定された検体で典型的に生じるわけではない）。本明細書では、「前処理用緩衝液」及び「調製用緩衝液」という用語を互換的に使用して、特に、本発明のマーカーの、抗体の結合へのアクセス可能性を増大させることにより、免疫染色のための細胞学サンプル又は組織学サンプルを調製するのに使用される緩衝液を指す。前処理用緩衝液は、pH特異的な塩溶液、ポリマー、洗浄剤、あるいは、例えば、エチルオキシル化されたアニオン性界面活性剤若しくは非イオン性界面活性剤、アルカノエート若しくはアルコキシレート、なおあるいはこれらの界面活性剤のブレンドなどの非イオン性界面活性剤又はアニオン性界面活性剤、なおあるいは胆汁塩の使用を含みうる。前処理用緩衝液は、例えば、0.1％〜1％のデオキシコール酸（ナトリウム塩）の溶液、又はラウレス-13-カルボン酸ナトリウム（例えば、Sandopan LS）若しくはエトキシル化されたアニオン性複合体の溶液でありうる。一部の実施形態において、前処理用緩衝液はまた、スライド保存用緩衝液としても使用することができる。
本発明を実施するときには、本発明のマーカータンパク質の、抗体の結合へのアクセス可能性を増大させるための任意の方法であって、当技術分野で公知の抗原回収法を含む方法を使用することができる。例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Bibboら(2002)、Acta. Cytol.、46:25〜29； Saqiら(2003)、Diagn. Cytopathol.、27:365〜370； Bibboら(2003)、Anal. Quant. Cytol. Histol.、25:8〜11を参照されたい。
マーカータンパク質のアクセス可能性を増大させるための前処理に続き、適切なブロッキング剤、例えば、過酸化水素などのペルオキシダーゼブロッキング試薬を使用して、サンプルをブロッキングすることができる。一部の実施形態において、タンパク質ブロッキング試薬を使用して、サンプルを、ブロッキングして、抗体の非特異的結合を予防することができる。タンパク質ブロッキング試薬は、例えば、精製カゼインを含みうる。次いで、抗体、特に、本発明のマーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を、サンプルとインキュベートする。当業者は、場合によっては、患者サンプル中の本発明のマーカータンパク質上の複数のエピトープを検出することにより、より正確な予後診断又は診断を得うることを理解するであろう。したがって、特定の実施形態において、本発明のマーカーの異なるエピトープに対する少なくとも2つの抗体を使用する。複数の抗体を使用する場合、これらの抗体は、単一のサンプルへと、個別の抗体試薬として逐次的に添加することもでき、抗体カクテルとして同時に添加することもできる。あるいは、各個別の抗体を、同じ患者からの個別のサンプルへと添加し、結果としてもたらされるデータをプールすることもできる。
当技術分野では、抗体の結合を検出するための技法が周知である。本発明のマーカーへの抗体の結合は、抗体結合のレベルに対応し、したがって、マーカータンパク質の発現レベルに対応する、検出可能なシグナルを発生させる化学試薬を使用することにより検出することができる。本発明の免疫組織化学法又は免疫細胞化学法のうちの1つでは、抗体の結合を、標識されたポリマーへとコンジュゲートされた二次抗体を使用することにより検出する。標識されたポリマーの例は、ポリマー-酵素コンジュゲートを含むがこれらに限定されない。これらの複合体内の酵素は、抗原-抗体の結合部位における色原体の析出を触媒し、これにより、対象のバイオマーカーの発現レベルに対応する細胞染色を結果としてもたらすのに使用されることが典型的である。特に対象の酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）及びアルカリホスファターゼ（AP）を含むがこれらに限定されない。
1つの特定の、本発明の免疫組織化学法又は免疫細胞化学法では、本発明のマーカーへの抗体の結合を、二次抗体へとコンジュゲートされた、HRPで標識されたポリマーを使用することにより検出する。抗体の結合はまた、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体に結合する、分子種特異的なプローブ試薬、及び分子種特異的なプローブ試薬に結合する、HRPへとコンジュゲートされたポリマーを使用することによっても検出することができる。スライドは、任意の色原体例えば、色原体である3,3-ジアミノベンジジン（DAB）を使用して、抗体の結合について染色し、次いで、ヘマトキシリンで対比染色し、任意選択では、水酸化アンモニウム又はTBS/Tween-20などの青み剤で対比染色する。他の適切な色原体は、例えば、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）を含む。本発明の一部の態様では、スライドを、細胞検査技師及び/又は病理学者に、顕微鏡で再検討させて、細胞染色、例えば、蛍光染色（すなわち、マーカーの発現）を評価する。あるいは、サンプルは、自動式顕微鏡により再検討することもでき、陽性染色細胞の同定を容易とするコンピュータソフトウェアを一助として、検査員に再検討させることもできる。
抗体の結合の検出は、抗マーカー抗体を、検出用物質へとカップリングすることにより容易とすることができる。検出用物質の例は、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含み；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み；適切な放射性物質の例は、125I、131I、35S、14C、又は3Hを含む。
本発明の一実施形態において、凍結サンプルを、上記で記載した通りに調製し、その後、例えば、トリス緩衝生理食塩液（TBS）を使用して適切な濃度まで希釈された、本発明のマーカーに対する抗体で染色する。一次抗体は、スライドを、ビオチニル化された抗免疫グロブリン中でインキュベートすることにより検出することができる。このシグナルは、任意選択で増幅し、抗原のジアミノベンジジン沈殿を使用して可視化することができる。更に、スライドは、任意選択で、例えば、ヘマトキシリンにより対比染色して、細胞を可視化することができる。
別の実施形態において、固定及び包埋されたサンプルを、本発明のマーカーに対する抗体で染色し、凍結させた切片について上記で記載した通りに対比染色する。加えて、サンプルは、任意選択で、薬剤により処理して、シグナルを増幅して、抗体の染色を可視化することができる。例えば、ペルオキシダーゼでコンジュゲートしたストレプトアビジン（Catalyzed Signal Amplification （CSA) System、DAKO、Carpinteria、CA）と反応する、ビオチニル-チラミドのペルオキシダーゼ触媒析出を使用することができる。
組織ベースのアッセイ（すなわち、免疫組織化学）は、本発明のマーカーを検出及び定量化する好ましい方法である。一実施形態において、本発明のマーカーの存在又は非存在は、免疫組織化学により決定することができる。一実施形態において、免疫組織化学解析で、マーカーを欠く細胞が染色されないように、低濃度の抗マーカー抗体を使用する。別の実施形態において、本発明のマーカーの存在又は非存在を、マーカータンパク質を欠く細胞が濃く染色されるように、高濃度の抗マーカー抗体を使用する、免疫組織化学法を使用して決定する。染色されない細胞は、突然変異したマーカーを含有して、抗原として認識可能なマーカータンパク質を産生することがないか、又はマーカーレベルを調節する経路が調節異常を帰している結果として、安定状態における無視できるマーカータンパク質の発現を生じる細胞である。
当業者は、本発明の方法を実施するのに使用される特定の抗体の濃度が、結合時間、本発明のマーカーに対する抗体の特異性のレベル、及びサンプル調製の方法などの因子に応じて変化することを認識するであろう。更に、複数の抗体を使用する場合、必要とされる濃度は、抗体をサンプルへと適用する順序、例えば、カクテルとして同時であるのか、又は個々の抗体試薬として逐次的であるのかに影響を受ける可能性がある。更に、本発明のマーカーへの抗体の結合を可視化するのに使用される検出化学反応もまた、所望のシグナル対ノイズ比をもたらすように最適化しなければならない。
本発明の一実施形態において、プロテオミクス法、例えば、質量分析、を使用して、本発明のマーカータンパク質を検出及び定量化する。例えば、血清などの生物学的サンプルのタンパク質結合性チップへの適用を伴う、マトリクス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間質量分析（MALDI-TOF MS）又は表面増強レーザー脱離/イオン化飛行時間質量分析（SELDI-TOF MS）（Wright, G.L., Jr.ら(2002)、Expert Rev Mol Diagn、2:549； Li, J.ら(2002)、Clin Chem、48:1296； Laronga, C.ら(2003)、Dis Markers、19:229； Petricoin, E.F.ら(2002)、359:572； Adam, B.L.ら(2002)、Cancer Res、62:3609； Tolson, J.ら(2004)、Lab Invest、84:845； Xiao,Z.ら(2001)、Cancer Res、61:6029）を使用して、PY-Shcタンパク質及び/又はp66-Shcタンパク質を検出及び定量化することができる。質量分析法は、例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,622,824号、同第5,605,798号、及び同第5,547,835号において記載されている。
他の実施形態において、本発明のマーカーの発現は、核酸レベルで検出する。当技術分野では、発現を評価するための核酸ベースの技法がよく知られており、例えば、対象由来のサンプル中のマーカーmRNAのレベルを決定するステップを含む。多くの発現検出法では、単離RNAを使用する。mRNAの単離に限定されない任意のRNA単離法を、本発明のマーカーを発現する細胞からRNAを精製するために利用することができる（例えば、Ausubelら編、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York 1987〜1999を参照されたい）。更に、多数の組織サンプルを、例えば、Chomczynski （1989、米国特許第4,843,155号）による単一ステップのRNA単離工程など、当業者に周知の技法を使用して容易に処理することができる。
「プローブ」という用語は、本発明のマーカー、例えば、ヌクレオチド転写物及び/又はタンパク質に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者が合成することもでき、適切な生物学的調製物から誘導することもできる。プローブは、とりわけ、標識するようにデザインすることができる。プローブとして利用しうる分子の例は、RNA、DNA、タンパク質、抗体、及び有機分子を含むがこれらに限定されない。
単離mRNAは、サザンブロット法又はノーザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応解析、及びプローブアレイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅アッセイにおいて使用することができる。mRNAレベルを検出するための1つの方法は、単離mRNAを、マーカーmRNAとハイブリダイズしうる核酸分子（プローブ）と接触させるステップを含む。核酸プローブは、例えば、少なくとも7、15、30、50、100、250、又は500ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、マーカーのゲノムDNAと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどの全長cDNA又はその一部でありうる。
一実施形態において、例えば、単離mRNAをアガロースゲル上を泳動させ、mRNAをゲルから、ニトロセルロースなどの膜へと転写することにより、mRNAを固体表面上に固定化させ、プローブと接触させる。代替的な実施形態において、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイにおいて、プローブ（複数可）を固体表面上に固定化させ、mRNAをプローブ（複数可）と接触させる。当業者は、既知のmRNA検出法を、マーカーmRNAのレベルの検出における使用に容易に適合させることができる。
サンプル中のmRNAマーカーのレベルを決定するための代替的な方法は、核酸増幅の工程、例えば、RT-PCR（実験的実施形態は、Mullis、1987、米国特許第4,683,202号に示されている）、リガーゼ連鎖反応（Barany、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:189〜193）、自己持続配列複製（Guatelliら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:1874〜1878）、転写増幅システム（Kwohら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:1173〜1177）、Q-ベータレプリカーゼ（Lizardiら、1988、Bio/technology、6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardiら、米国特許第5,854,033号）、又は他の任意の核酸増幅法に続いて、当業者に周知の技法を使用する、増幅された分子の検出による工程を含む。これらの検出スキームは、核酸分子を、このような分子が極めて少数で存在する場合に検出するのにとりわけ有用である。本発明の特定の態様では、マーカーの発現を、定量的蛍光RT-PCR（すなわち、TaqMan(商標)System）により評価する。このような方法は、本発明のマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対を使用することが典型的である。当技術分野では、既知の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをデザインするための方法が周知である。
本発明のマーカーの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザンブロット法、サザンブロット法、ドット解析などのハイブリダイゼーション解析で使用されるメンブレンブロットなど）、又はマイクロウェル、サンプル管、ゲル、ビーズ、又はファイバー（又は結合した核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニタリングすることができる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,770,722号、同第5,874,219号、同第5,744,305号、同第5,677,195号、及び同第5,445,934号を参照されたい。マーカーの発現の検出はまた、溶液中の核酸プローブの使用も含みうる。
本発明の一実施形態において、マイクロアレイを使用して、本発明のマーカーの発現を検出する。マイクロアレイは、異なる実験間の再現性のために、この目的に特に好適である。DNAマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定するための1つの方法をもたらす。各アレイは、固体支持体へと結合された、再現可能なパターンの捕捉プローブからなる。標識されたRNA又はDNAを、アレイ上の相補的なプローブとハイブリダイズさせ、次いで、レーザー走査により検出する。アレイ上の各プローブについて、ハイブリダイゼーション強度を決定し、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量値へと変換する。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,040,138号、同第5,800,992号、及び同第6,020,135号、同第6,033,860号、及び同第6,344,316号を参照されたい。高密度のオリゴヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のRNAの遺伝子の発現プロファイリングを決定するのに特に有用である。
本発明のマーカーのマーカー量及び/又はマーカー量の数学的関係性は、当業者に公知の回帰分析法を含みうる、本発明の方法を使用して、薬物で処置されている対象における、毒性状態、例えば、薬物誘発毒性又は薬物誘発心臓毒性の危険性、毒性状態を処置、予防又は対処するための処置レジメンの有効性などを計算するのに使用することができる。例えば、適切な回帰モデルは、CART回帰モデル（例えば、Hill, T及びLewicki, P. (2006)、「STATISTICS Methods and Applications」、StatSoft、Tulsa、OK）、Cox回帰モデル（例えば、www.evidence-based-medicine.co.uk）、指数回帰モデル、ノーマル回帰モデル、及び対数ノーマル回帰モデル（例えば、www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html）、ロジスティック回帰モデル（例えば、www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression）、パラメトリック回帰モデル、ノンパラメトリック回帰モデル、セミパラメトリック回帰モデル（例えば、www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion）、線形回帰モデル（例えば、www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression）、又は加算回帰モデル（例えば、www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model）を含むがこれらに限定されない。
一実施形態において、回帰分析は、マーカー量を含む。別の実施形態において、回帰分析は、マーカーの数学的関係性を含む。更に別の実施形態において、マーカー量及び/又はマーカーの数学的関係性についての回帰分析は、さらなる臨床共変量及び/又は分子共変量を含みうる。このような臨床共変量は、結節状態、腫瘍病期、腫瘍グレード、腫瘍サイズ、処置レジメン、例えば、化学療法及び/又は放射線療法、臨床転帰（例えば、再発、疾患特異的な生存、治療の不奏効）、並びに/又は診断後の時間、治療開始後の時間、及び/若しくは処置完了後の時間の関数としての臨床転帰を含むがこれらに限定されない。
VIII. キット
本発明はまた、薬物誘発毒性、例えば心臓毒性を生じる危険性のある作用物質（薬剤）を同定するため、あるいは心臓毒性状態、例えば薬物誘発心臓毒性、心臓毒性の再発、又は心臓毒性について処置されている対象の生存について予後診断するための組成物及びキットも提供する。これらのキットは、以下:本発明のマーカーに特異的に結合する検出可能な抗体、染色のための対象の組織サンプルを得、且つ/又はこれを調製するための試薬、及び使用のための指示書のうちの1つ以上を含む。
本発明のキットは、任意選択で、本発明の方法を実施するのに有用なさらなる成分を含みうる。例を目的として述べると、キットは、相補的な核酸のアニーリング、又は抗体の、それが特異的に結合するタンパク質との結合に適する流体（例えば、SSC緩衝液）、1つ以上のサンプルコンパートメント、本発明の方法の実施について記載する指示書、及び組織特異的な対照/基準物質を含みうる。
IX. スクリーニングアッセイ
本発明の標的は、本明細書で列挙される遺伝子及び/又はタンパク質を含むがこれらに限定されない。本明細書で出願人らが記載する実験の結果に基づき、毒性状態においてモジュレートされる鍵となるタンパク質は、細胞骨格成分、転写因子、アポトーシス応答、五炭糖リン酸経路、生合成経路、酸化的ストレス（酸化促進剤）、膜の変化、及び酸化的リン酸化による代謝を含む、異なる経路若しくは分子群に関連するか、又は異なる経路若しくは分子群へと分類することができる。したがって、本発明の一実施形態において、マーカーは、表2に列挙したマーカーから選択される1種以上の遺伝子（又はタンパク質）を含みうる。一部の実施形態において、マーカーは、前出の遺伝子（又はタンパク質）の、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160種又はそれ以上の遺伝子の組合せである。
同定されたマーカーのモジュレーターを同定するのに有用なスクリーニングアッセイについては、下記に記載する。
本発明はまた、本発明のマーカーの発現及び/又は活性をモジュレートすることにより、毒性状態を処置又は予防するのに有用なモジュレーター、すなわち、候補物質又は被験化合物又は薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、低分子又は他の薬物）を同定するための方法（本明細書ではまた「スクリーニングアッセイ」とも称する）も提供する。このようなアッセイは、本発明のマーカーと1種以上のアッセイ成分との間の反応を含むことが典型的である。他の成分は、被験化合物それ自体の場合もあり、被験化合物と、本発明のマーカーの天然の結合パートナーとの組合せの場合もある。本明細書で記載される化合物など、アッセイにより同定された化合物は、例えば、疾患状態又は毒性状態の侵襲性をモジュレートする、例えば、阻害、緩和、処置、又は予防するのに有用でありうる。
本発明のスクリーニングアッセイで使用される被験化合物は、天然化合物及び/又は合成化合物の体系的ライブラリーを含む、任意の入手可能な供給源から得ることができる。被験化合物はまた、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの官能基を有するが、新規の非ペプチド骨格であって、酵素分解に対して耐性であるが、にもかかわらず、生理活性を維持する非ペプチド骨格を伴う分子のライブラリー；例えば、Zuckermannら、1994、J. Med. Chem.、37:2678〜85を参照されたい。）；空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリー又はパラレル液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ-1化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における、多数の手法のうちのいずれかによっても得ることができる。生物学的ライブラリー法及びペプトイドライブラリー法は、ペプチドライブラリーへと限定されるが、他の4つの手法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は低分子のライブラリー化合物へと適用可能である（Lam、1997、Anti抗癌薬 Des.、12:145）。
当技術分野では、分子ライブラリーを合成するための方法の例を、例えば、DeWittら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、90:6909； Erbら(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:11422； Zuckermannら(1994)、J. Med. Chem.、37:2678； Choら(1993)、Science、261:1303； Carrellら(1994)、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、33:2059； Carellら(1994)、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、33:2061；及びGallopら(1994)、J. Med. Chem.、37:1233において見出すことができる。
化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Houghten、1992、Biotechniques、13:412〜421）中に存在させることもでき、ビーズ（Lam、1991、Nature、354:82〜84）上に存在させることもでき、チップ（Fodor、1993、Nature、364:555〜556）上に存在させることもでき、細菌及び/又は胞子（Ladner、米国特許第5,223,409号）上に存在させることもでき、プラスミド（Cullら、1992、Proc Natl Acad Sci USA、89:1865〜1869）上に存在させることもでき、ファージ（Scott及びSmith、1990、Science、249:386〜390； Devlin、1990、Science、249:404〜406； Cwirlaら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci.、87:6378〜6382； Felici、1991、J. Mol. Biol.、222:301〜310； Ladner、前出）上に存在させることもできる。
本発明のスクリーニング法は、毒性状態細胞を、被験化合物と接触させるステップと、細胞内の本発明のマーカーの発現及び/又は活性をモジュレートする被験化合物の能力を決定するステップとを含む。本発明のマーカーの発現及び/又は活性は、本明細書で記載される通りに決定することができる。
別の実施形態において、本発明は、本発明のマーカー又はその生物学的活性部分の基質である候補物質又は被験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。更に別の実施形態において、本発明は、本発明のマーカー又はその生物学的活性部分に結合する候補物質又は被験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。マーカーに直接結合する被験化合物の能力の決定は、例えば、複合体内の標識されたマーカー化合物を検出することにより、化合物のマーカーへの結合を決定しうるように、化合物を、放射性同位元素又は酵素標識とカップリングすることにより達成することができる。例えば、化合物（例えば、マーカー基質）は、131I、125I、35S、14C、又は3Hで直接的又は間接的に標識し、放射性同位元素は、放射性発光の直接的なカウンティング又はシンチレーションカウンティングにより検出することができる。あるいは、アッセイ成分は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識し、酵素標識は、適切な基質の産物への転換を決定することにより検出することができる。
本発明は更に、上記で記載したスクリーニングアッセイにより同定される新規の薬剤にも関する。したがって、本明細書で記載される通りに同定される薬剤を、適切な動物モデルで更に使用することも、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書で記載される通りに同定される本発明のマーカーの発現及び/又は活性をモジュレートすることが可能な薬剤を、動物モデルにおいて使用して、このような薬剤による処置の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。あるいは、本明細書で記載される通りに同定される薬剤を、動物モデルにおいて使用して、このような薬剤の作用機構も決定することができる。更に、本発明は、上記で記載したスクリーニングアッセイにより同定される新規の薬剤の、上記で記載した処置のための使用にも関する。
［実施例1］
薬物誘発心臓毒性モデルを構築するためのプラットフォーム技術の使用
本実施例では、国際PCT出願PCT/US2012/027615号で詳細に記載したプラットフォーム技術を使用して、特注の薬物誘発心臓毒性モデルから得られるデータを統合し、薬物の発症機序/心臓毒性を駆動する新規のタンパク質/経路を同定した。この解析から結果として得られる関係性マップにより、薬物誘発心臓毒性バイオマーカーがもたらされた。
健常な心臓では、収縮機能は、脂肪酸の酸化と炭水化物の酸化との均衡に依存する。非脂肪組織（心臓及び肝臓）における、取込み、利用、オルガネラの生合成、及び分泌の慢性的な不均衡が、ミトコンドリアの損傷及び機能不全並びに薬物誘発心臓毒性の鍵となる要素の中心にあると考えられる。本明細書で、出願人らは、タンパク質サイン及び脂質サインを、とりわけ、細胞生体エネルギー及びミトコンドリア膜の機能に注目する、機能的エンドポイントアッセイと組み合わせる、系統的手法について記載する。過剰な脂肪酸及び高血糖を供給された糖尿病性心筋細胞と正常心筋細胞とを比較するin vitroモデルを、毒性のサイン及び潜在的な機構を創出する薬物のパネルで処置した。出願人らは、エネルギー代謝の成分を破壊することにより、ミトコンドリアを不安定化させるときの薬物の多様な効果（影響）を、（i）ミトコンドリアのエネルギー代謝遺伝子の発現を制御する転写ネットワークの調節異常；（ii）糖尿病性心筋細胞内でGPAT1及びタファジンを誘導し、これにより、デノボのリン脂質合成を開始し、ミトコンドリア膜をリモデリングすること；並びに（iii）取込み、脂肪酸の酸化、及びATPの合成に影響を与える、糖尿病性心筋細胞内の脂肪酸の運命の変化を含む多様なレベルで裏付けた。更に、ベイズモデルに基づき、因果ネットワークを作成するために、出願人らは、ウェットラボ生物学の効力と、AIベースのデータマイニングプラットフォームの効力とを組み合わせた。正常細胞機能の喪失の原因となるタンパク質及び脂質のネットワークを使用して、薬物誘発毒性機構を、細胞保護機構から識別した。この新規の手法は、表現型の変化を是正するより安全な治療剤の開発を可能としながら、毒性の機構を理解するための強力で新たなツールとして用いられるであろう。
ヒト心筋細胞を、in vivoにおいて疾患関与性の細胞が経る糖尿病性環境をシミュレートする条件に供した。具体的には、細胞を、高血糖条件及び高脂血条件へと曝露した。高血糖条件は、22mMグルコースを含有する培地中で細胞を培養することにより誘導した。高脂血条件は、1mM L-カルニチン、0.7mMオレイン酸、及び0.7mMリノール酸を含有する培地中で細胞を培養することにより誘導した。
心臓毒性を引き起こすことが公知の糖尿病薬（T）、レスキュー分子（R）、又は糖尿病薬及びレスキュー分子の両方（T＋R）で処置することを介して、細胞を「環境変動」へと曝露することにより、上記で記載した各条件へと曝露した上述の細胞を含む細胞モデルを更に「照合（interrogate）」した。具体的には、細胞を、糖尿病薬で処置するか；又はレスキュー分子である0、50μM若しくは100μMのコエンザイムQ10で処置するか；又は糖尿病薬及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方で処置した。
各変動処置を伴う各条件からの細胞サンプルを、処置の6時間後を含む、処置後の多様な時点で回収した。特定の条件については、培地サンプルもまた、回収及び解析した。
上記の「発明を実施するための形態」で記載した技法を使用して、各条件について、且つ、各「環境変動」、すなわち糖尿病薬処置、コエンザイムQ10処置、又はこれらの両方を伴って回収された細胞サンプル及び培地サンプルについての定量的プロテオミクスにより、全細胞タンパク質発現の変化のiProfilingを実施した。Biorad cfx-384増幅システムを使用して、転写プロファイリング実験を実行した。データ回収（Ct）後、製造元のプロトコールで概括されている通りに、δCt法を使用して、対照に対する最終的な倍数変化を決定した。質量分析を使用して、リピドミクス実験を実行した。本質的に、製造元により推奨される通りに、Seahorse解析器を使用することにより、酸素消費速度であるOCRなどの機能アッセイを測定した。OCRは、カートリッジをSeahorse培養プレートに押し当てることにより創出される、7μlのチャンバー内の電極により記録した。
図20に示す通り、糖尿病性心筋細胞（高血糖及び高脂血で条件化された心筋細胞）内の転写ネットワーク及びヒトミトコンドリアのエネルギー代謝遺伝子の発現を、変動処置と非変動処置との間で比較した。具体的には、転写ネットワーク及びヒトミトコンドリアのエネルギー代謝遺伝子の発現のデータを、糖尿病薬で処置された糖尿病性心筋細胞サンプル（T）と、非処置の糖尿病性心筋細胞サンプル（UT）との間で比較した。転写ネットワーク及びヒトミトコンドリアのエネルギー代謝遺伝子の発現のデータを、糖尿病薬及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方で処置された糖尿病性心筋細胞サンプル（T＋R）と、非処置の糖尿病性心筋細胞サンプル（UT）との間で比較した。糖尿病性心筋細胞を、糖尿病薬で処置したところ、非処置の糖尿病性心筋細胞からのデータと比較して、特定の遺伝子の発現及び転写が変化した。レスキュー分子であるコエンザイムQ10は、糖尿病薬の毒性作用を逆転し、遺伝子の発現及び転写を正常化することが実証された。
図21Aに示す通り、心筋細胞を、正常血糖（NG）条件又は高血糖（HG）条件で培養し、糖尿病薬単独（T）又は糖尿病薬及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方（T＋R）で処置した。各条件及び各処置に対するGPAT1及びTAZのタンパク質発現のレベルを、ウェスタンブロット法で調べた。高血糖条件化され、且つ、糖尿病薬で処置された心筋細胞では、GPAT1及びTAZのいずれもが上方調節された。高血糖条件化された心筋細胞を、糖尿病薬及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方で処置したところ、上方調節されたGPAT1及びTAZのタンパク質発現のレベルは正常化された。
図22Aに示す通り、ミトコンドリア酸素消費速度（％）実験を、高血糖条件化された心筋細胞サンプルについて実行した。高血糖条件化された心筋細胞は、処置しない（UT）か、心臓毒性を引き起こすことが公知の糖尿病薬T1で処置するか、心臓毒性を引き起こすことが公知の糖尿病薬T2で処置するか、糖尿病薬T1及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方で処置する（T1＋R）か、又は糖尿病薬T2及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方で処置した（T2＋R）。高血糖条件化された心筋細胞を、糖尿病薬T1又はT2で処置したところ、非処置の対照サンプルと比較して、ミトコンドリアのOCRは低下した。しかし、高血糖条件化された心筋細胞を、糖尿病薬及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方（T1＋R又はT2＋R）で処置したところ、ミトコンドリアのOCRは正常化された。
図22Bに示す通り、ミトコンドリアによるATP合成実験を、高血糖条件化された心筋細胞サンプルについて実行した。高血糖条件化された心筋細胞は、処置しない（UT）か、糖尿病薬で処置する（T）か、又は糖尿病薬及びレスキュー分子であるコエンザイムQ10の両方で処置した（T＋R）。高血糖条件化された心筋細胞を、糖尿病薬で処置した（T）ところ、非処置の対照サンプルと比較して、ミトコンドリアによるATP合成は抑制された。
図23に示す通り、収集されたプロテオミクスデータに基づき、薬物処置により下方調節されるタンパク質を、GO termでアノテートした。高血糖条件化された心筋細胞を、心臓毒性を引き起こすことが公知の糖尿病薬で処置したところ、ミトコンドリアのエネルギー代謝に関与するタンパク質は、下方調節された。
次いで、各条件について、且つ、各変動を伴って収集されたプロテオミクス、リピドミクス、転写プロファイリング、機能アッセイ、及びウェスタンブロット法のデータを、REFS(商標)システムにより処理した。複合変動ネットワークは、各変動（例えば、糖尿病薬、CoQ10、又はこれらの両方）へと曝露された、1つの特定の条件（例えば、高血糖又は高脂血）から得られる組合せデータから作成した。複合非変動ネットワークは、変動を伴わない（処置されない）、同じ1つの特定の条件（例えば、高血糖又は高脂血）から得られる組合せデータから作成した。同様に、複合変動ネットワークは、各変動（例えば、糖尿病薬、CoQ10、又はこれらの両方）へと曝露された、第2の対照条件（例えば、正常血糖）について得られる組合せデータからも作成した。複合非変動ネットワークは、変動を伴わない（処置されない）、同じ第2の対照条件（例えば、正常血糖）から得られる組合せデータからも作成した。
上記の「発明を実施するための形態」で詳細に記載した通り、REFS(商標)を使用して、上記で記載したコンセンサス複合ネットワーク内の各ノードをシミュレートして（10倍に増大するか又は10分の1に低減することにより）、シミュレーションネットワークを作成した。
シミュレーションネットワーク内の親ノードを子ノードへと接続する各エッジについての曲線下面積及び倍数変化を、Rプログラミング言語を使用する特注のプログラムにより抽出した（ここで、Rプログラミング言語とは、統計学的計算及びグラフ表示のための、オープンソースソフトウェア環境である）。
デルタネットワークは、シミュレートされた複合ネットワークから作成した。糖尿病薬に応答した、正常条件と対比した薬物誘発心臓毒性条件の差次的ネットワーク（デルタネットワーク）を作成するために、図24に示す通りに、PERLプログラミング言語を使用する特注のプログラムにより、比較ステップを実施した。
具体的には、図24に示す通り、未処置とは、高血糖条件における処置されない対照心筋細胞のタンパク質発現ネットワークを指す。薬物とは、高血糖条件における糖尿病薬で処置された心筋細胞のタンパク質発現ネットワークを指す。薬物∩未処置デルタネットワーク内の薬物からの特有のエッジを図25に提示する。
具体的には、高血糖条件における糖尿病薬で処置された心筋細胞の特有のエッジを作成するために、特製のPerlプログラムを使用して、高血糖条件における処置されない心筋細胞のシミュレートされた複合マップと、高血糖条件における糖尿病薬で処置された心筋細胞のシミュレートされた複合マップを比較した。PERLプログラム及びRプログラムからの出力は、オープンソースプログラムであるCytoscapeへと入力して、デルタネットワークの視覚的表示を作成した。図25に示される通り、ネットワークは、高血糖条件下の心筋細胞/心臓毒性モデルにおいて、非処置と対比した糖尿病薬により駆動されるデルタネットワークを表す。
図25に示される正常条件と対比した薬物誘発毒性条件の差次的ネットワークから、GRP78、GRP75、TIMP1、PTX3、HSP76、PDIA4、PDIA1、CA2D1など、薬物誘発心臓毒性の病態生理を駆動するタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、他の心臓毒性誘発薬物を同定するためのバイオマーカーとして機能しうる。これらのタンパク質はまた、心臓毒性を緩和しうる薬剤を同定するためのバイオマーカーとしても機能しうる。
本実施例において記載した実験は、薬物処置へと曝露された糖尿病性心筋細胞内の変動膜生物学及び遊離脂肪酸の運命の変化が、薬物誘発毒性の中央部的要素を表すことを実証する。データの統合及びネットワーク生物学により、心臓毒性の理解の増進及び心臓毒性を予測する新規のバイオマーカーの同定が可能となった。
［実施例2］
心臓毒性の追加的なマーカーを同定するための薬物誘発心臓毒性モデルの使用
上の実施例1で記載したプラットフォーム技術を同様に使用して、同じ特注心臓毒性モデルから得られたさらなるデータを統合した。5つの患者心筋細胞株を使用して、上の発明を実施するための形態において説明したように、心臓毒性のモデルを創出した。次いで、5つの心筋細胞株をミトコンドリアATPアッセイに供して、糖尿病条件（高血糖）及び正常条件（正常血糖）において、薬物処置又はその不在（＋及び−として示される）により現れるミトコンドリア機能障害についてアッセイした。5つの心臓毒性モデルのうち2つのみにおいて、薬物処置時に糖尿病条件下でミトコンドリアATPの還元が観察された（図30参照）。これらのさらなる実験の結果から、図26〜34にまとめるような、薬物の心臓毒性の発症「を駆動する、さらなる新規なタンパク質/経路の同定に至る。
因果相互作用ネットワークにより、薬物誘発心臓毒性についての数種の新規なバイオマーカー及び潜在的な治療標的が同定された。図28、29、31〜33に示されるこの解析から得られる関係性マップにより、以下の表2に列挙される追加的な薬物誘発心臓毒性バイオマーカーが得られた。これらのバイオマーカーは、薬物の薬物誘発心臓毒性を予測するため、薬物誘発心臓毒性の診断/予後診断のため、並びに薬物誘発心臓毒性を軽減若しくは緩和することができるレスキュー薬を同定するために用いることができる。
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一実施形態において、TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 (IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、HSPA4からなる群より選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、又は13種のマーカーのパネルを、薬物の薬物誘発心臓毒性を予測するため、薬物誘発心臓毒性の診断/予後診断のため、並びに薬物誘発心臓毒性を軽減若しくは緩和することができるレスキュー薬を同定するために用いることができる。
表2に列挙したマーカーのうち、PTX3、PAI1、IBP7 (IGFBP7)は、以前に心筋症のマーカーとして報告されている。GRP78及びPDIA3は、ERストレス及び低酸素傷害の重要な指標の役割を果たすものとして報告されている。これらのマーカーが薬物誘発心臓毒性についての上記プラットフォーム技術により同定されたという事実により、新規な薬物誘発心臓毒性バイオマーカーを探索するためのこのプラットフォーム技術が検証validatedされた。
表2に列挙したマーカーのsDNA配列は、付属書類Aに示され、これらは当技術分野で公知である。
参照による組込み
本出願全体で引用されうる、全ての引用された参考文献（参考文献、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、それらの中で引用された参考文献と同様に、参照によりそれらの全体として明示的に本明細書に組み込まれる。別段に明示されない限り、本発明の実施は、当技術分野で周知の、タンパク質製剤化の従来の技法を使用するであろう。
均等物
本発明は、その精神又は本質的特徴から逸脱しない限りにおいて、他の特定の形態でも実施することができる。したがって、前出の実施形態は、全ての点において、本明細書で記載される本発明に対して、制限的ではなく例示的であると考えるものとする。したがって、本発明の範囲は、前出の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲により明示され、したがって、特許請求の範囲の均等性の意味及び範囲内に収まる全ての変化が、本明細書に包含されることを意図する。
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Claims (35)

  1. 薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性がある薬物を同定する方法であって、（i）薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現レベルを、（ii）薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーは、表2に列挙したマーカーから選択され、第1のサンプルと比較した、第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの発現レベルのモジュレーションは、該薬物が、薬物誘発心臓毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である、上記方法。
  2. 薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうるレスキュー薬を同定する方法であって、（i）心臓毒性誘発薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現の正常レベルを決定するステップ、（ii）心臓毒性誘発薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの発現の処置レベルを決定して、処置細胞サンプルにおける発現の変化を有する1種以上のバイオマーカーを同定するステップ、（iii）心臓毒性誘発薬物及びレスキュー薬による処置の後で得られる第3の細胞サンプル中に存在する、心臓毒性誘発薬物で処置したサンプルにおいて発現レベルが変化した1種以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップ、並びに（iv）第3のサンプル中で決定した1種以上のバイオマーカーの発現レベルを、第1のサンプル中に存在する1種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーは、表2に列挙したマーカーから選択され、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの正常化された発現レベルは、レスキュー薬が、薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防しうることの指標である、上記方法。
  3. 薬物誘発心臓毒性を緩和、軽減又は予防する方法であって、対象に、請求項２に記載の方法により同定されるレスキュー薬を投与することを含み、それにより対象において薬物誘発心臓毒性を軽減又は予防する方法。
  4. 1種以上のバイオマーカーが、TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7 （IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010、及びHSPA4からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 薬物誘発心臓毒性が、心筋症、心不全、心房細動、心筋症及び心不全、心不全及びLV（左心室）機能不全、心房粗動及び細動、又は心臓弁障害及び心不全である、請求項４に記載の方法。
  6. 細胞サンプルが、心筋細胞又は糖尿病性心筋細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 薬物が、抗癌薬、糖尿病薬、神経薬、又は抗炎症薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 薬物が、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、又はTNFアンタゴニストである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 対象が、哺乳動物、ヒト、又は非ヒト動物である、請求項３に記載の方法。
  10. レスキュー薬が、心臓毒性誘発薬物で既に処置された対象に投与される、請求項３に記載の方法。
  11. レスキュー薬が、心臓毒性誘発薬物による対象の処置と同時に対象に投与される、請求項３に記載の方法。
  12. レスキュー薬が、心臓毒性誘発薬物による対象の処置の前に対象に投与される、請求項３に記載の方法。
  13. レスキュー薬がコエンザイムQ10である、請求項３に記載の方法。
  14. レスキュー薬がコエンザイムQ10ではない、請求項３に記載の方法。
  15. 薬物誘発心臓毒性について対象をモニタリングするステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  16. 薬物誘発毒性のモジュレーターを同定する方法であって、
    （1）薬物誘発毒性の特徴的な側面を表すために、薬物誘発毒性に関連する細胞を用いて薬物誘発毒性のモデルを確立するステップ、
    （2）上記薬物誘発毒性のモデルから第1のデータセットを取得するステップであって、第1のデータセットが、薬物誘発毒性に関連する細胞に特徴的なゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、及び一塩基多型（SNP）データのうち1種以上を表す、上記ステップ、
    （3）上記薬物誘発毒性のモデルから第2のデータセットを取得するステップであって、第2のデータセットが、薬物誘発毒性に関連する細胞の機能活性又は細胞応答を表す、上記ステップ、
    （4）第1のデータセット及び第2のデータセットのみに基づき、プログラムされた計算装置を用いて、ゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、及び一塩基多型（SNP）データのうち1種以上の発現レベル、並びに機能活性又は細胞応答の間でコンセンサス因果関係ネットワークを作成するステップであって、コンセンサス因果関係ネットワークの作成が、第1のデータセット及び第2のデータセット以外のいかなる公知の生物学的関係性にも基づくものではない、上記ステップ、
    （5）上記コンセンサス因果関係ネットワークから、薬物誘発毒性に特有の因果関係を同定するステップであって、特有の因果関係に関連する遺伝子、脂質、タンパク質、代謝物、転写物又はSNPが、薬物誘発毒性のモジュレーターとして同定される、上記ステップ
    を含む方法。
  17. 細胞の機能活性又は細胞応答を表す第2のデータセットが、薬物誘発毒性に関連する細胞の、生体エネルギー、細胞増殖、アポトーシス、オルガネラ機能、ATP、ROS、OXPHOS及びSeahorseアッセイから選択される機能モデルによって実現される遺伝子型-表現型相関性、網羅的酵素活性、並びに酵素代謝基質に対する網羅的酵素活性の影響の1以上を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 網羅的酵素活性が網羅的キナーゼ活性であり、酵素代謝基質に対する網羅的酵素活性の影響がホスホプロテオームである、請求項１７に記載の方法。
  19. 第1のデータセットが、ゲノミクス、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、及び一塩基多型（SNP）データのうち2種以上を含む、請求項１〜３及び１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. ステップ（4）が、人工知能（AI）に基づくインフォマティクスプラットフォームにより行われる、請求項１６に記載の方法。
  21. AIに基づくインフォマティクスプラットフォームがREFS(商標)を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. AIに基づくインフォマティクスプラットフォームが、統計的カットオフポイントを適用せずに、第1のデータセット及び第2のデータセットから入力された全てのデータを受け取る、請求項２１に記載の方法。
  23. ステップ（4）において確立されたコンセンサス因果関係ネットワークが、入力データに基づくin silicoシミュレーションにより、ステップ（5）の前にシミュレーション因果関係ネットワークへと更に精緻化されて、コンセンサス因果関係ネットワーク内の1種以上の因果関係のための予測の信頼レベルをもたらす、請求項１６に記載の方法。
  24. 特有の因果関係が、細胞において特有に存在し、適合する対照細胞において存在しない、差次的因果関係ネットワークの一部として同定される、請求項１６に記載の方法。
  25. 同定される特有の因果関係が、遺伝子の発現と脂質のレベル；遺伝子の発現と転写物のレベル；遺伝子の発現と代謝物のレベル；第1の遺伝子の発現と第2の遺伝子の発現；遺伝子の発現とSNPの存在；遺伝子の発現と機能活性；脂質のレベルと転写物のレベル；脂質のレベルと代謝物のレベル；第1の脂質のレベルと第2の脂質のレベル；脂質のレベルとSNPの存在；脂質のレベルと機能活性；第1の転写物のレベルと第2の転写物のレベル；転写物のレベルと代謝物のレベル；転写物のレベルとSNPの存在；第1の転写物のレベルと機能活性；第1の代謝物のレベルと第2の代謝物のレベル；代謝物のレベルとSNPの存在；代謝物のレベルと機能活性；第1のSNPのレベルと第2のSNPの存在；及びSNPの存在と機能活性、からなる群より選択される少なくとも1対の間の関係性である、請求項１６に記載の方法。
  26. 機能活性が、生体エネルギー、細胞増殖、アポトーシス、オルガネラ機能、キナーゼ活性、プロテアーゼ活性、並びにATP、ROS、OXPHOS及びSeahorseアッセイから選択される機能モデルによって実現される遺伝子型-表現型相関性からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 薬物誘発毒性において同定された特有の因果関係を検証するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  28. 薬物誘発毒性が、薬物誘発心臓毒性、肝毒性、腎臓毒性、神経毒性、腎毒性、又は筋毒性である、請求項１６に記載の方法。
  29. 薬物誘発心臓毒性が、心筋症、心不全、心房細動、心筋症及び心不全、心不全及びLV（左心室）機能不全、心房粗動及び細動、又は心臓弁障害及び心不全である、請求項２８に記載の方法。
  30. 薬物誘発毒性のモデルが、細胞心筋細胞、糖尿病性心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、腎細胞、又は筋芽細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
  31. 薬物誘発毒性のモデルが、毒性誘発薬物、抗癌薬、糖尿病薬、神経薬、又は抗炎症薬を含む、請求項１６に記載の方法。
  32. 薬物が、アントラサイクリン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、カベルゴリン、ペルゴリド、スマトリプタン、ビスホスホネート、又はTNFアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。
  33. 薬物誘発毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性がある薬物を同定する方法であって、（i）薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーのレベルを、（ii）薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーのレベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーは、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法により同定されたモジュレーターから選択され、第1のサンプルと比較した、第2のサンプル中の1種以上のバイオマーカーのレベルのモジュレーションは、該薬物が、薬物誘発毒性を引き起こすか、又はこれを引き起こす危険性があることの指標である、上記方法。
  34. 薬物誘発毒性を軽減又は予防しうるレスキュー薬を同定する方法であって、（i）毒性誘発薬物による処置の前に得られる第1の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの正常レベルを決定するステップ、（ii）毒性誘発薬物による処置の後で得られる第2の細胞サンプル中に存在する、1種以上のバイオマーカーの処置レベルを決定して、処置細胞サンプルにおけるレベルの変化を有する1種以上のバイオマーカーを同定するステップ、（iii）毒性誘発薬物及びレスキュー薬による処置の後で得られる第3の細胞サンプル中に存在する、毒性誘発薬物で処置したサンプルにおいてレベルが変化した1種以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップ、並びに（iv）第3のサンプル中で決定した1種以上のバイオマーカーのレベルを、第1のサンプル中に存在する1種以上のバイオマーカーのレベルと比較するステップを含み、1種以上のバイオマーカーは、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法により同定されたモジュレーターから選択され、第1のサンプルと比較して、第3のサンプル中の1種以上のバイオマーカーの正常化されたレベルは、レスキュー薬が、薬物誘発毒性を軽減又は予防しうることの指標である、上記方法。
  35. 薬物誘発毒性を緩和、軽減又は予防する方法であって、対象に、請求項３４に記載のレスキュー薬を投与することを含み、それにより対象において薬物誘発毒性を軽減又は予防する方法。
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