JP2015517665A - 多能性幹細胞由来の細胞培養物からニューロンを単離するための細胞表面特性 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例1
H9hESCの培養物をWiCell(Madison,WI)から得て増殖させた後、細胞を以下のようにして分化させた。
図10Aは、細胞を培養して分化する処理の概要を示す。H9hESCをWiCell(Madison,WI)から得た細胞から培養して増殖させ、その後、以下のようにして分化させた。
ニューロンの形成を前述のように生じさせた。細胞培養物をPE CD340、PE HLA−A、B、C及びPE CD49fの抗体と接触させた。次に、細胞に磁気枯渇を施した。細胞培養物に用いたPE結合抗体に結合するために、PEに結合する抗体と結合した磁気ナノ粒子を用いた。次に、細胞溶液を磁場の隣りに置くことにより、磁気ナノ粒子を細胞溶液から分離した。続いて、フローサイトメトリー及び画像解析により、濃縮して枯渇した画分を解析した。磁気枯渇前(図12A)及び磁気枯渇後(図12B)の神経培養物の画像解析を図12A及び12Bに示す。神経培養物を分離して結合抗体で染色した後、96ウェルイメージングプレートに塗布して、7日間培養した。ニューロンは、Tuj1の発現、並びにNestin及びki67の発現の欠如(Tuj1+ /Nestin- /ki67- )により同定される。核をDAPIで染色する。枯渇画分の流れ解析(図12C)は、DCXの発現、並びにSox2及びKi−67の発現の欠如により同定されるニューロン集団を示す。枯渇前(図12D)及び枯渇後(図12E)のサンプルの2Dプロットを示す。ニューロンは、DCXの発現、並びにSox2及びKi67の発現の欠如(DCX+ /Sox2- /ki67- )により同定される。データ解析から、PE CD340、PE HLA−A、B、C及びPE CD49fに特異的な磁気標識抗体と共にニューロンを含む細胞培養物中での細胞の枯渇により、細胞培養物中でニューロンが濃縮されることがわかる。
本出願は、米国特許法第119 条(e) に従って、2012年5月16日に出願された米国仮特許出願第61/647,951号明細書の優先権を主張しており、この出願の開示内容は、参照として本明細書に組み込まれる。
Claims (25)
- 細胞培養物中のニューロンを識別する方法であって、
CD200に特異的に結合する第1抗体、及びHLA−A、HLA−B、HLA−C、CD49f、CD151及びCD340からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第2抗体と、前記細胞培養物を接触させるステップ、並びに
CD200+ 細胞であって、HLA−A、HLA−B、HLA−C、CD49f、CD151及びCD340の一又は複数の低発現〜陰性発現を示す細胞を検出するステップ
を有することを特徴とする方法。 - 前記細胞培養物は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト胚性幹細胞(hESC)、神経堤細胞、線維芽細胞、神経幹細胞又はこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養物は、細胞の異種集団から得られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養物は、神経前駆細胞を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養物は、神経上皮を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記CD200+ 細胞は、CD200med 及び200highであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養物は、神経幹細胞濃縮ステップを経ていないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を検出するステップを、フローサイトメータを用いて行うことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1抗体及び前記第2抗体は、蛍光体との直接結合により検出可能且つ識別可能に標識されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光体は、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン、シアニン5及びBV421からなる群から選択されることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- CD200++細胞であって、HLA−A- 、HLA−B- 、HLA−C- 、CD49f- 、CD151- 又はCD340- の一若しくは複数である細胞の集団を濃縮するステップを更に有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 細胞培養物中のニューロンの内容物を濃縮する方法であって、
神経上皮を含む細胞培養物に神経分化を生じさせることにより、ニューロン及びグリアを形成するステップ、
CD200に特異的に結合する第1抗体、及びHLA−A、HLA−B、HLA−C、CD49f、CD151及びCD340からなるタンパク質の群から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも第2抗体と、前記細胞培養物を接触させるステップ、並びに
CD200+ であって、HLA−A- 、HLA−B- 、HLA−C- 、CD49f- 、CD151- 又はCD340- の一若しくは複数である細胞をフローサイトメトリーにより選択するステップ
を有することを特徴とする方法。 - ニューロンの形成を、神経上皮から直接生じさせることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- CD200+ である前記細胞は、200low ではないことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記細胞培養物は、神経幹細胞濃縮ステップを経ていないことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記第1抗体及び前記第2抗体は、蛍光体との直接結合により検出可能且つ識別可能に標識されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記蛍光体は、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質、フィコエリトリン、BV421及びシアニン5からなる群から選択されることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- ニューロンの内容物の濃縮は、
HLA−A、HLA−B、HLA−C、CD49f、CD151及びCD340からなる群の少なくとも1つに選択的であって、磁場に引き付けられ得る又は反発し得る表面に結合している抗体と、細胞培養物からの前記細胞を接触させることにより、抗体−細胞複合体を形成するステップ、及び
前記細胞に磁場を印加することにより、前記細胞培養物から前記抗体−細胞複合体を選択的に分離するステップ
を有することを特徴とする請求項12に記載の方法。 - 前記第1抗体及び前記第2抗体は、蛍光標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 4倍を超えて濃縮することを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記第2抗体は、HLA−A、HLA−B又はHLA−C- に結合し、
第2細胞培養物をCD49f、CD151又はCD340を含む第3抗体と接触させるステップ、及び
CD200+ であって、HLA−A- 、HLA−B- 又はHLA−C- であり、更にCD49f- 、CD151- 又はCD340- である細胞を選択するステップ
を更に有することを特徴とする請求項12に記載の方法。 - 細胞培養物からニューロンを単離又は濃縮するためのシステムであって、
CD200に特異的に結合する第1抗体、
HLA−A、HLA−B、HLA−C、CD49f、CD151及びCD340からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する第2抗体、
ニューロンを含む細胞培養物、並びに
CD200+ であって、HLA−A- 、HLA−B- 、HLA−C- 、CD49f- 、CD151- 又はCD340- の一若しくは複数である細胞を選別するように構成されたフローサイトメータ
を含むことを特徴とするシステム。 - 前記第1抗体及び前記第2抗体は、蛍光標識された抗体であることを特徴とする請求項22に記載のシステム。
- 前記第2抗体は、フェラスメタル材料で標識されることを特徴とする請求項22に記載のシステム。
- 細胞の集団内のニューロンを同定するためのシステムであって、
CD200に特異的に結合する第1抗体、
HLA−A、HLA−B及びHLA−Cからなるタンパク質の群から選択されるタンパク質に特異的に結合する第2抗体、
CD49f、CD151及びCD340からなるタンパク質の群から選択されるタンパク質に特異的に結合する第3抗体、
細胞サンプル、並びに
CD200+ であって、HLA−A- 、HLA−B- 又はHLA−C- の一若しくは複数であり、更にCD49f- 、CD151- 又はCD340- の一若しくは複数である細胞を同定するように構成されたフローサイトメータ
を含むことを特徴とするシステム。
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