JP2015516156A - 制御性ｂ細胞の製造及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞、又はＩＬ−１０自体の調製方法に関する。また、本発明は、リンパ球と単離されたＩＬ−３５タンパク質とを接触させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのリンパ球の増殖を抑制する方法に関する。更に本発明は、哺乳動物にＩＬ−３５タンパク質又はＩＬ−１０を産生するＢ細胞を投与することにより、哺乳動物における自己免疫を抑制する方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１２年４月２５日出願の米国特許仮出願番号第６１／６３７，９１５号（参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）の利益を主張する。

電子提出された物件の参照による組み込み
明細書と同時提出され、且つ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、本明細書中、参照によりその全体が組み込まれる：２０１３年４月１１日作成のファイル名「７１２３３７＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」、２，２６８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。

発明の背景
後天性免疫介在性炎症の進行を抑制し、及び／又は当該炎症からの回復を促進する、独特なＢ細胞の集団が最近同定され、制御性Ｂ細胞、又は「Ｂｒｅｇ」と名付けられている。制御性Ｂ細胞は、自己免疫の制御において重要な役割を果たすことが示されており、それが存在しないか、又は失われると、いくつかの自己免疫疾患の病因となるとされている（例、Ｆｉｌｌａｔｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３９１−３９７（２００８），Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８６：５５６９−５５７９（２０１１），及びＤｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２１：３６４５−３６５６（２０１１）を参照）。制御性Ｂ細胞は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生、二次抗原提示、及び他の免疫細胞との直接的又は分泌された抗体を介した相互作用を含む、様々なメカニズムによって自己免疫を制御するようである（例、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６：７０５−７１０（２００６）を参照）。

制御性Ｂ細胞レベルの異常な増加により、病原体に対する殺菌免疫が妨害され得る。また腫瘍誘導性制御性Ｂ細胞は、最近、発癌の原因に関係があるとされている（例、Ｔａｄｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，６０：６０９−６１９（２０１１），Ｓｃｈｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１０６６２−１０６６７（２０１１），及びＭａｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：３４−４０１（２００８）を参照）。特に、制御性Ｂ細胞は、休止期ＣＤ４＋Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に変換することによって乳癌転移を促進することが示されている（例、Ｏｌｋｈａｎｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７１：３５０５−３５１５（２０１１）を参照）。

制御性Ｂ細胞は希少なＢ細胞集団であり、その産生の基礎となる生理的シグナルは完全には理解されていない。それらのシグナルの同定により、多様な疾患を治療するための、制御性Ｂ細胞ベースの治療薬の開発が可能となり得る。

従って、制御性Ｂ細胞の製造及び使用方法のニーズが依然としてある。本発明は、かかる方法を提供する。

発明の概要
本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を産生するＢ細胞の調製方法であって、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む、方法を提供する。

本発明は、ＩＬ−１０の製造方法であって、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む、方法を提供する。

本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのリンパ球の増殖を抑制する方法であって、１以上のリンパ球と単離されたＩＬ−３５タンパク質とを接触させることを含み、それによってリンパ球の増殖が抑制される、方法を提供する。

本発明は、哺乳動物における自己免疫を抑制する方法であって、単離されたＩＬ−３５タンパク質を哺乳動物に投与することを含み、それによって、哺乳動物においてＩＬ−１０を産生するＢ細胞が産生され、哺乳動物において自己免疫が抑制される、方法を提供する。

本発明は、哺乳動物における自己免疫を抑制する方法であって、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を哺乳動物に投与することを含み、それによって哺乳動物において自己免疫が抑制される、方法を提供する。

また、本発明は、哺乳動物における自己免疫を抑制するための、単離されたＩＬ−３５タンパク質、及び哺乳動物における自己免疫を抑制するための、単離された、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を提供する。

図１Ａ及び図１Ｂは、選別されたＣＤ１９＋初代Ｂ細胞及びＷＥＨＩ−２７９ Ｂ細胞の、ｐＭＩＢ、ｐ３５、Ｅｂｉ３又はｒＩＬ−３５に応答した増殖を示す実験データを、それぞれ図示するグラフである。図１Ｃは、ＷＥＨＩ−２７９ Ｂ細胞の、様々な濃度のｒＩＬ−３５に応答した増殖を示す実験データを図示するグラフである。図１Ｄは、ＥＬＩＳＡによってアッセイした、ｐＭＩＢ、ｐ３５、Ｅｂｉ３、又はｒＩＬ−３５に応答した、初代Ｂ細胞によるＩＬ−１０の産生を示す実験データを図示するグラフである。図１Ｅは、ＥＬＩＳＡによってアッセイした、ｐＭＩＢ又はｒＩＬ−３５に応答した、ＷＥＨＩ−２７９ Ｂ細胞によるＩＬ−１０の産生を示す実験データを図示するグラフである。図１Ｆは、選別された、ｒＩＬ−３５で刺激した初代Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）が、ＬＰＳで刺激したＢ細胞の増殖を抑制したことを示す実験データを図示するグラフである。 図２Ａは、^３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって測定された、ｒＩＬ−３５介在性のＢ細胞増殖阻害への、各ＩＬ−１２ファミリーの受容体サブユニットの必要性を示す実験データを図示するグラフである。図２Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定された、Ｂ細胞のＩＬ−１０産生への、各ＩＬ−１２ファミリーの受容体サブユニットの必要性を示す実験データを図示するグラフである。図２Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出された、ＷＥＨＩ−２７９ Ｂ細胞でのＩＬ２７Ｒα及びＩＬ−１２Ｒβ２の共発現を示す実験データを図示する画像である。図２Ｄは、ｒＩＬ−３５が、初代Ｂ細胞のＳＴＡＴ活性化を誘導したことを示す実験データを図示するウェスタンブロット画像である。図２Ｅは、ｒＩＬ−３５が、初代Ｔ細胞のＳＴＡＴ活性化を誘導したことを示す実験データを図示するウェスタンブロット画像である。 図３Ａは、ｒＩＬ−３５で治療したＩＲＢＰ免疫マウス又はコントロールのＥＡＵ疾患スコアを示す実験データを図示するグラフである。図３Ｂは、ＩＲＢＰ免疫マウスの血液中のＣＤ４^＋Ｔ細胞による、免疫後２１日目の、細胞内サイトカイン発現のＦＡＣＳ解析を示す実験データを記載する図である。図３Ｃは、ＩＲＢＰ免疫マウスの血液中のＣＤ４^＋Ｂ細胞による、免疫後２１日目の、細胞内サイトカイン発現のＦＡＣＳ解析を示す実験データを記載する図である。図３Ｄは、ＥＡＵ誘導の間にｒＩＬ−３５で治療したマウスにおけるＩＬ−１０の発現を示す実験データを図示するグラフである。図３Ｅは、［^３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイによって測定された、ｒＩＬ−３５の存在下で、ＩＲＢＰで再活性化されたＢｒｅｇの、Ｔ細胞増殖に対する作用を示す実験データを図示するグラフである。図３Ｆは、ＰＭＡ又はＬＰＳ及びＩＬ−４で刺激したヒトＣＤ１９^＋Ｂ細胞の増殖に対する、ヒトＩＬ−３５の作用を示す実験データを図示するグラフである。

本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を産生するＢ細胞の調製方法、及びＩＬ−１０の製造方法を提供する。更に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのリンパ球の増殖を抑制する方法及び哺乳動物における自己免疫を抑制する方法を提供する。

本発明の、ＩＬ−１０を産生する（ｐｒｏｄｕｃｔ）Ｂ細胞の調製方法は、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む。同様に、本発明のＩＬ−１０の製造方法は、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む。

Ｂ細胞（又はＢリンパ球）は抗体を分泌する形質細胞に分化するリンパ球である。未熟Ｂ細胞は、大抵の哺乳動物では骨髄で産生される。これらの未熟Ｂ細胞は、骨髄中でＩｇＭ^＋未熟段階に達した後脾臓へ移行し（それらは移行Ｂ細胞と呼ばれる）、これらの細胞のいくつかが、最終的に成熟Ｂリンパ球に分化する（例、Ａｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１９７：１４７−１６０（２００４）を参照）。Ｂ細胞の発生はいくつかの段階を経て起こり、各段階ではゲノムの抗体遺伝子含有量の変化が示される。

成熟Ｂ細胞は、形質Ｂ細胞（形質細胞、プラズマ細胞、又はエフェクターＢ細胞としても知られる）か、又は記憶Ｂ細胞のいずれかとして分類され得る。形質Ｂ細胞は抗原に暴露され、大量の抗体を産生し分泌している、大型のＢ細胞である。形質Ｂ細胞は短命であり、特定の免疫応答を誘導する抗原が除去されたときにアポトーシスを起こす。対照的に、記憶Ｂ細胞は、暴露が繰り返されるプライミング抗原に対する迅速な応答のために用意された、長寿命の刺激Ｂ細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｂ−ｃｅｌｌｓ）である。記憶Ｂ細胞は、Ｂ細胞活性化／増殖の後、リンパ組織において生じ、骨髄、リンパ節、及び脾臓に存在している（例、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５^ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）を参照）。

各Ｂ細胞はその表面上に、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）と呼ばれる、一つの特定抗原に結合する特有の受容体タンパク質を有している。ＢＣＲは、Ｂ細胞を他のタイプのリンパ球から区別することを可能にする膜結合免疫グロブリンであり、Ｂ細胞活性化に関与する主要なタンパク質である。Ｂ細胞がその同種抗原に接触し、ヘルパーＴ細胞から更なるシグナルを受容すると、Ｂ細胞は形質Ｂ細胞又は記憶Ｂ細胞のどちらかに更に分化できる。Ｂ細胞は、直接、形質又は記憶Ｂ細胞に分化し得る。或いはＢ細胞は、胚中心反応と呼ばれる中間的な分化段階を経ることもあり得、そのＢ細胞では、免疫グロブリン遺伝子可変領域の体細胞超変異、そして恐らく、クラススイッチングが起きる。Ｂ細胞の他の機能としては、抗原提示、サイトカイン産生、及びリンパ組織形成が挙げられる。

急性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）からの完全な回復をもたらす免疫制御に関与する、免疫制御性Ｂ細胞の小亜集団は、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：２２７１−２２７８（１９９６）によって最初に記述された。慢性炎症の他の実験モデルからのデータにより、Ｂ細胞は炎症反応を阻害し免疫寛容を誘導することができる、機能的に異なる制御性の亜集団に分類され得ることが示される。後に、これらの「制御性」Ｂ細胞（又は「Ｂｒｅｇ」）が、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を発現することが見出されている（例、Ｆｉｌｌａｔｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：９４４−９５０（２００２）を参照）。従って、本発明の文脈において、「制御性Ｂ細胞」はＩＬ−１０を産生し分泌するＢ細胞である。

本発明の方法は、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む。インターロイキン３５（ＩＬ−３５）は、ヘテロ二量体サイトカインのＩＬ−１２ファミリーのメンバーであり、Ｅｂｉ３（エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）誘導性遺伝子３（またＩＬ２７ｂとしても知られる））によってコードされるβ鎖サブユニット及びＩＬ−１２αによってコードされるＩＬ１２ｐ３５αサブユニットから構成される（例、Ｃｏｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０：５６６−５６９（２００７）；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５：５２１−５３１（２００５）；Ｄｅｖｅｒｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２０４１−１２０４６（１９９７）；及びＮｉｅｄｂａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，３０２１−３０２９（２００７）を参照）。ＩＬ−３５は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって産生され、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性に必要である（例、Ｃｏｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記、及びＣｈａｔｕｒｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８６：６６６１−６６６６（２０１１）を参照）。

単離されたＩＬ−３５タンパク質は、天然にＩＬ−３５を産生する制御性Ｔ細胞から単離される天然のＩＬ−３５であり得る。本実施形態においては、ＩＬ−３５タンパク質は、好ましくは哺乳動物（例、ヒト又はマウス）から単離される。或いは、単離されたＩＬ−３５は、所定の分子生物学的技術を用いて生成された組換えＩＬ−３５タンパク質（ｒＩＬ−３５）であり得る。組換えＩＬ−３５タンパク質は、ヒト又はマウスから単離された天然のＩＬ−３５タンパク質の全部又は一部を含有し得る。例えば、組換えＩＬ−３５タンパク質は、天然のヒトＩＬ−３５タンパク質全体又は天然のマウスＩＬ−３５タンパク質全体を含有し得る。他の実施形態においては、組換えＩＬ−３５タンパク質は、ヒトから単離された天然のＩＬ−３５タンパク質の一部及びマウスから単離された天然のＩＬ−３５タンパク質の一部を含有し得る（即ち、ＩＬ−３５「キメラ」タンパク質）。当業者は、組換えＩＬ−３５タンパク質は、Ｂ細胞におけるＩＬ−３５タンパク質の発現及び／又は安定性を最適化する他の要素を含有し得ることを理解するであろう。好ましい実施形態においては、単離されたＩＬ−３５タンパク質は、ＩＬ−１２ｐ３５αサブユニットタンパク質及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）誘導性遺伝子３（Ｅｂｉ３）タンパク質を含む組換え融合タンパク質である。ＩＬ−１２ｐ３５αサブユニットをコードする核酸配列としては、例えば配列番号１、及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００８８２．３が挙げられる。Ｅｂｉ３タンパク質をコードする核酸配列としては、例えば配列番号２、及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５７５５．２が挙げられる。ＩＬ−１２ｐ３５αサブユニット及びＥｂｉ３タンパク質のアミノ酸配列も既知であり、公に利用可能である（例、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１５２８９６．１及びＮＰ＿０３２３７７．１（ＩＬ−１２ｐ３５α）並びにＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＫ４１９２３．１及びＡＡＨ０８２０９．１（Ｅｂｉ３）を参照）。

アミノ酸配列の「一部」は、少なくとも３アミノ酸（例、約３〜約１，２００アミノ酸）を含む。好ましくは、アミノ酸配列の「一部」は、３以上（例、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上、又は５０以上）のアミノ酸であり、且つ１２００未満（例、１０００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、又は１００以下）の、アミノ酸を含む。好ましくは、アミノ酸配列の一部は、約３〜約５００アミノ酸（例、約１０、１００、２００、３００、４００、又は５００アミノ酸）、約３〜約３００アミノ酸（例、約２０、５０、７５、９５、１５０、１７５、又は２００アミノ酸）、又は約３〜約１００アミノ酸（例、約１５、２５、３５、４０、４５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５又は９９アミノ酸）、或いは上記のいずれか２つの値によって規定される範囲である。より好ましくは、アミノ酸配列の「一部」は、約５００超のアミノ酸は含まない（例、約３〜約４００アミノ酸、約１０〜約２５０アミノ酸、又は約５０〜約１００アミノ酸、或いは、上記のいずれか２つの値によって規定される範囲である）。

１以上のＢ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる。「ｅｘ ｖｉｖｏ」とは、自然条件の改変が最小限である、生体外の人工的な環境内、或いは該環境中の細胞又は組織において実施される方法を指す。対照的に、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、正常で無傷の状態の生体内で実施される方法を指し、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」法は、通常の生物学的状況から隔離された、生物の構成要素を用いて実施される。

単離されたＩＬ−３５タンパク質は、当該技術分野で公知の、任意の好適な方法を用いて、細胞、好ましくはＢ細胞に導入することができる。例えば、ＩＬ−３５タンパク質をコードする核酸配列は、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」によって細胞に導入することができる。用語「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」は、本明細書中で用いられる場合、１以上の外生ポリヌクレオチドを、物理的又は化学的方法により宿主細胞に導入することを指す。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）を参照）、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、陽イオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法、タングステン微粒子促進性マイクロパーティクルボンバードメント法（例、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６−７７７（１９９０）を参照）、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿法（例、Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：２０３１−２０３４（１９８７）を参照）が挙げられる。或いは、１以上のＢ細胞は、好適な量の、単離されたＩＬ−３５タンパク質を含有する培地中で培養することができる。例えば、Ｂ細胞が培養培地中に用意され得、ＩＬ−３５タンパク質が、それ自体か又は適切な溶媒中のＩＬ−３５タンパク質溶液として、培養培地に投入され得る。Ｂ細胞の形質転換、培養、増幅、スクリーニング、及び精製のために選択する好適な方法は、当該技術分野で公知である（例、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４７（３）：１９３−１９７（１９９５）；Ｗｈｉｔｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９（１１）：３６０８−３６１２（１９８２）；Ｗｈｉｔｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７（２）：３５３−３６９（１９８４）；及びＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，上記、を参照）。

１以上のＢ細胞は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、そして最も好ましくはヒトから得られ、又はこれらに由来する。１以上のＢ細胞は、初代Ｂ細胞であり得る。用語「初代細胞」とは、生体組織から（例、生検で）直接単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの増殖用に樹立されている細胞を指す。本発明の文脈では、初代Ｂ細胞は、例えば臍帯血、末梢血、及び脾臓を含む任意の好適なソースから単離され得、多様な商業的ソースから入手できる。或いは、１以上のＢ細胞は、Ｂ細胞株又はプレＢリンパ球起源の細胞株由来である。かかる細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能であり、例えば、ＲＡＭＯＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）、Ｊｉｙｏｙｅ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８７）、ＭＰＣ−１１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１６７）、ＥＢ−３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８５）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＣＬ−８６）、及びこれら由来のものが挙げられる。

１以上のＢ細胞は、１以上のＢ細胞がインターロイキン１０（ＩＬ−１０）を産生する条件下で培養される。ＩＬ−１０はＩＩ型サイトカインであり、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８、及びＩＬ−２９を含むサイトカインファミリーの基本的メンバーである（Ｃｏｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２１：１１０８−１１１１（２００８））。これらのサイトカインはすべて、構造が同様な受容体に結合し、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路を活性化する。ＩＬ−１０は、全ファミリーメンバー中で最も強力な抗免疫活性及び抗炎症活性を示す。ＩＬ−１０の主要な生物学的機能は、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージに対して発揮されているようである。ＩＬ−１０は、抗原提示及び炎症誘発性サイトカイン産生の強力な阻害剤である（例、Ｍｏｓｓｅｒ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２２６：２０５−２１８（２００８）を参照）。ＩＬ−１０は、例えば、２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞、制御性Ｔ細胞亜集団、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ヒトＢ細胞、単球、いくつかの樹状細胞亜集団、顆粒球、角化細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞等の、数種の免疫細胞及び非免疫細胞によって産生される（Ｍｏｓｓｅｒ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，上記）。

本発明の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのリンパ球の増殖を抑制する方法は、１以上のリンパ球と単離されたＩＬ−３５タンパク質とを接触させることを含み、それによってリンパ球の増殖が抑制される。

用語「増殖」は、本明細書中で用いられる場合、例えば細胞分裂（即ち、有糸分裂）、細胞成長（例、細胞の大きさの増大）、及び遺伝物質の増加（例、細胞分裂前）を含む、リンパ球の成長及び繁殖の任意の態様を包含する。リンパ球の増殖が、ＩＬ−３５非存在下でのリンパ球増殖と比較して、ＩＬ−３５に応答して少なくとも約１０％（例、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約２０％）、少なくとも約５０％（例、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％）、或いは少なくとも約９０％（例、少なくとも約９５％又は１００％）減少する場合、リンパ球の増殖は「抑制」される。好ましくは、リンパ球増殖は、ＩＬ−３５非存在下でのリンパ球増殖と比較して、ＩＬ−３５に応答して少なくとも約２５％（例、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％）減少する。より好ましくは、リンパ球増殖は、ＩＬ−３５非存在下でのリンパ球増殖と比較して、ＩＬ−３５に応答して少なくとも約５０％（例、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、又は少なくとも約７５％）減少する。最も好ましくは、リンパ球増殖は、ＩＬ−３５非存在下でのリンパ球増殖と比較して、ＩＬ−３５に応答して少なくとも約８０％（例、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、又は約１００％）減少する。リンパ球増殖は、多くが商業的ソースから入手できる、当該技術分野で公知の様々な細胞増殖アッセイを用いて測定できる。かかるアッセイとしては、例えば、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ、^３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、及びテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）細胞増殖アッセイが挙げられる。

リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞（Ｔリンパ球ともいわれる）、及びＢ細胞（Ｂリンパ球ともいわれる）を含む白血球である。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一要素であり、腫瘍及びウイルス感染細胞の両方からの、宿主の防御に大きく関与している。Ｔ細胞及びＢ細胞は、適応免疫応答の主要な細胞性構成要素であり、それぞれ、細胞性免疫及び体液性免疫に関与している。好ましい実施形態においては、ＩＬ−３５と接触させられるリンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞及びＴ細胞である。本発明の方法は、１以上のリンパ球と、単離されたＩＬ−３５タンパク質とをｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることを含む。方法がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合、当該技術分野で公知の、任意の好適な方法（本明細書中で検討される方法等）が、リンパ球と単離されたＩＬ−３５タンパク質とを接触させるために用いられ得る（例、ＩＬ−３５の存在下での細胞培養）。

好ましくは、１以上のリンパ球がｉｎ ｖｉｖｏで、望ましくは哺乳動物（好ましくはマウス、そして最も好ましくはヒト）の内部で、ＩＬ−３５と接触させられる。このように、単離されたＩＬ−３５タンパク質は、組成物の形態で哺乳動物に送達される。好ましくは、組成物は薬学的に許容される（例、生理学的に許容される）組成物であり、担体、好ましくは薬理学的に（例、生理学的に）許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ（ｅ．ｇ．，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）ｃａｒｒｉｅｒ）、及び単離されたＩＬ−３５タンパク質を含む。本発明の文脈内で、任意の好適な担体を用いることができ、かかる担体は当該技術分野において周知である。選択される担体は、組成物が投与され得る特定の部位及び組成物を投与するために用いられる特定の方法に基づいて、ある程度決定される。組成物は、必要に応じて無菌的であり得る。組成物は、保存のため凍結又は凍結乾燥され得、好適な無菌担体中で、使用前に再構成され得る。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）に記載された従来技術に従って生成され得る。

本発明の、哺乳動物における自己免疫を抑制する方法は、単離されたＩＬ−３５タンパク質を哺乳動物に投与することを含み、それによって、哺乳動物においてＩＬ−１０を産生するＢ細胞が産生され、哺乳動物において自己免疫が抑制される。或いは／更に、本発明の、哺乳動物における自己免疫を抑制する方法は、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を哺乳動物に投与することを含み、それによって哺乳動物において自己免疫が抑制される。また、本発明は、哺乳動物における自己免疫を抑制するための、単離されたＩＬ−３５タンパク質、及び哺乳動物における自己免疫を抑制するための、単離された、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を提供する。本発明の他の実施形態に関連して上記した、単離されたＩＬ−３５タンパク質及びＩＬ−１０を産生するＢ細胞、並びにそれらの構成成分の記述は、これらの、前述の方法と同様の態様にも適用可能である。

用語「自己免疫」は、本明細書中で用いられる場合、生物（例、ヒト）が、自身の構成部分を自己として認識することができないことを指し、生物自身の細胞及び組織に対する免疫応答を引き起こす。換言すれば、自己免疫は「自己」抗原に対する適応免疫応答であり、「自己抗体」の産生を特徴とする。低レベルの自己免疫は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識を支援し、それによって癌の発生率が減少することが示されている。更に、低レベルの自己免疫は、外来抗原の供給力が免疫応答を制限する場合（即ち、存在する病原体がわずかな場合）は、感染の初期段階における迅速な応答を可能にする役割を果たし得る（例、Ｓｔｅｆａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０（６９１４）：４２９−４３４（２００２）を参照）従って、低レベルの自己免疫は有益であり得る。しかしながら、典型的には、高レベルの自己免疫は病因となり、自己免疫疾患につながる。

「自己免疫疾患」は、組織傷害が、身体の構成要素に対する体液性及び／又は細胞性の免疫応答、又はより広い意味での、自己に対する免疫応答と関連する、一群の疾患又は障害のいずれか１つを指す。病的免疫応答は、全身的又は器官特異的であり得る。例えば、自己に対する免疫応答は、関節、皮膚、神経細胞を保護するミエリン鞘、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、副腎及び卵巣を冒し得る。免疫複合体形成は、自己免疫疾患の病因及び進行に関係する。免疫複合体形成の増加は、自己に対する抗体（自己抗体）の存在と相関している。免疫複合体の一部又は抗原に結合していない（遊離抗体）のいずれかとして存在する自己抗体は、組織の炎症の原因となり得る。いくつかの自己免疫疾患においては、遊離自己抗体の存在が疾患病状の重大な原因となる。自己免疫疾患の病因及び進行の特徴には、他に、炎症誘発性サイトカインの役割がある。正常な状況下では、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン１（ＩＬ−１）等の炎症誘発性サイトカインは、感染及び細胞性ストレスへの応答において防御的な役割を果たす。しかし、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１の慢性的及び／又は過剰な産生に起因する病理学的影響が、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、及び乾癬等の多くの自己免疫疾患が進行する原因になると考えられている。自己免疫疾患に関与する他の炎症誘発性サイトカインとしては、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１７及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が挙げられる（例、米国特許第８，０８０，５５５号を参照）。

本発明の方法、単離されたＩＬ−３５タンパク質、及びＩＬ−１０を産生する、単離されたＢ細胞は、任意の自己免疫疾患に関連する自己免疫を抑制するために用いられ得る。当該技術分野で公知の、８０を超える既知の自己免疫疾患があり、その例としては、多発性硬化症（ＭＳ）、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（例、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、全身性の自己免疫疾患（例、関節リウマチ（ＲＡ）、強皮症、及び若年性関節炎）が挙げられる。

自己免疫疾患に罹患した哺乳動物（例、ヒト）において、自己免疫疾患の１以上の症状が減少又は軽減される場合、自己免疫は「抑制」される。症状の改善、悪化、退行、又は進行は、当該技術分野で公知の、任意の客観的又は主観的尺度によって決定され得る。当業者は、自己免疫疾患の症状は、異常な免疫応答の疾患及び部位によって異なることを理解するであろう。いくつかの自己免疫疾患に共通する症状としては、例えば、疲労、筋肉痛及び／又は関節痛、筋力低下、発熱、腫れ腺、炎症、感染症への感受性、体重の減少又は増加、アレルギー、消化器系の異常、血圧の変化及びめまいが挙げられる。

従って、一実施形態においては、本発明の方法は、哺乳動物における自己免疫疾患を治療するために用いられる。用語「治療」、「治療すること」等は、本明細書中で用いられる場合、所望の薬理及び／又は生理効果を得ることを指す。好ましくは、該効果は治療的であり、即ち、該効果は、疾患及び／又は該疾患に起因する有害な症状を部分的に又は完全に治癒する。このために、本発明の方法は、「治療有効量」の、単離されたＩＬ−３５タンパク質又はＩＬ−１０を産生するＢ細胞を投与することを含む。「治療有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重等の要因、並びに、ＩＬ−３５タンパク質又はＩＬ−１０を産生するＢ細胞の、個体において所望の応答を引き起こす能力によって異なり得る。例えば、本発明の、単離されたＩＬ−３５タンパク質の治療有効量は、ＩＬ−１０産生を誘導し、リンパ球増殖を抑制する（自己免疫の抑制につながる）量である。

或いは、薬理及び／又は生理効果は予防的であり得、即ち、該効果は、自己免疫疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防する。これに関して、本発明の方法は、自己免疫疾患に罹患しやすいか、又は自己免疫疾患を発症するリスクを負った哺乳動物に、「予防有効量」の、単離されたＩＬ−３５タンパク質又はＩＬ−１０を産生するＢ細胞を投与することを含む。「予防有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の予防結果（例、疾患発症の予防又は疾患再発の予防）を達成するために有効な量を指す。

本発明の方法が、ＩＬ−３５タンパク質を哺乳動物に投与することを含む場合、本発明の、ＩＬ−３５タンパク質を含む組成物は、標準的な投与技術（経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔、舌下又は坐剤投与を含む）を用いて、哺乳動物に投与され得る。組成物は、好ましくは、非経口投与に好適である。用語「非経口」は、本明細書中で用いられる場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内及び腹腔内投与を含む。より好ましくは、組成物は、静脈内、腹腔内又は皮下注射による末梢全身送達を用いて哺乳動物に投与される。

本発明の方法が、単離されたＩＬ−３５タンパク質を哺乳動物に投与することを含む場合、ＩＬ−３５タンパク質は、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞の生成を誘導し、哺乳動物における自己免疫を抑制するのに十分な用量で投与される。典型的な投与量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲内であり得る；しかしながら、この例示的な範囲に満たないか、又は超える量は、本発明の範囲内である。一日の非経口投与量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（全体重）（例、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（全体重）（例、約．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）、より好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ（全体重）（例、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）、なおより好ましくは１日当たり約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）（例、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）であり得る。治療又は予防の効果は、治療された患者の定期的な評価によってモニターされ得る。数日以上にわたる反復投与のために、状態によっては、治療は、病徴の所望の抑制が起こるまで、繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有用なこともあり得、それらは本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の１回のボーラス投与により、組成物の複数回のボーラス投与により、又は組成物の継続的注入投与により送達され得る。

本発明の方法が、ＩＬ−１０を産生するように改変されたＢ細胞を哺乳動物に投与することを含む場合、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を含む組成物は、標準的な細胞移入及び免疫療法の技術を用いて哺乳動物に投与することができる。かかる技術の例としては、自己細胞療法、同種細胞療法、及び造血幹細胞療法が挙げられる。好ましい実施形態においては、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を含む組成物は、養子移入法によって哺乳動物に投与される（例、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３０：６５６−６６５（２００９），及びＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，上記、を参照）。ＩＬ−１０を産生するＢ細胞は、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞の導入によって哺乳動物における自己免疫が抑制される限り、任意の好適な量で投与され得る。哺乳動物（例、ヒト）に投与される典型的な細胞量は、例えば、百万〜一億細胞の範囲であり得るが、この例示的な範囲に満たないか、又は超える量は、本発明の範囲内である。ＩＬ−１０を産生するＢ細胞の１日用量は、例えば、約１００万〜約５０００万細胞（例、約５００万細胞、約１５００万細胞、約２５００万細胞、約３５００万細胞、約４５００万細胞、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）、好ましくは約１０００万〜約１億細胞（例、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）、より好ましくは約１０００万細胞〜約５０００万細胞（例、約１２００万細胞、約２５００万細胞、約３５００万細胞、約４５００万細胞、又は上記のいずれか２つの値によって規定される範囲）であり得る。

本発明の方法は、既存の他の自己免疫疾患治療法と組み合わせて実施され得る。例えば、ＩＬ−３５タンパク質又はＩＬ−１０を産生するＢ細胞は、本明細書中に開示された、自己免疫疾患の治療又は予防のための免疫抑制剤又は免疫調節剤或いは他の抗炎症剤と組み合わせて投与され得る。これに関して、本発明の方法は、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド及びグルココルチコイド）、カルシニューリン阻害剤（例、シクロスポリンＡ又はＦＫ ５０６）、リンパ球再循環のモジュレーター（例、ＦＴＹ７２０及びＦＴＹ７２０のアナログ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３又はＴＡＦＡ−９３）、免疫抑制特性を有するアスコマイシン（例、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１等）、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）、メトトレキサート、レフルノミド、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスペルグアリン、又はその免疫抑制ホモログ、アナログ若しくは誘導体、免疫抑制モノクローナル抗体（例、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６等の白血球の受容体又はそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体）、他の免疫調節化合物、接着分子阻害剤（例、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１若しくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト又はＶＬＡ−４アンタゴニスト）、化学療法剤（例、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン又は５−フルオロウラシル）、抗ＴＮＦ剤（例、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０等のＴＮＦに対するモノクローナル抗体、又はＥＮＢＲＥＬ（商標）（エタネルセプト）若しくはＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ等のＴＮＦ−ＲＩ若しくはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体コンストラクト）、炎症誘発性サイトカインのブロッカー、ＩＬ−１ブロッカー（例、ＫＩＮＥＲＥＴ（商標）（アナキンラ）又はＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ ８８５及びＩＬ−６ブロッカー）、ケモカインブロッカー（例、プロテアーゼの阻害剤又は活性化剤）、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＣＤ２０抗体、ＮＳＡＩＤ、及び／又は抗感染剤と組み合わせて用いられ得る。

以下の実施例により、本発明を更に説明するが、当然ながら、いかなる形でもその範囲を制限すると解釈されるべきでない。

実施例１
本実施例により、組換えＩＬ−３５タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴリンパ球及びＢリンパ球の増殖を抑制し、Ｂ細胞によるＩＬ−１０の産生を誘導することが証明される。

ＰＣＲにより、組換えマウスＩＬ−３５（ｒＩＬ−３５）のコンストラクトを作製した。コンストラクトには、メリチン（ＨＢＭ）アミノ末端の分泌シグナル配列をコードする核酸配列にアミノ末端で融合し、ＥＢＶ誘導性遺伝子３（Ｅｂｉ３）のβ鎖サブユニットをコードするｃＤＮＡにカルボキシ末端で融合した、ＩＬ１２ｐ３５−αサブユニット（Ｐ３５）をコードするｃＤＮＡを含めた。ｒＩＬ−３５コンストラクトにはまた、組換えタンパク質の単離及び特性解析を容易にするために、Ｖ５−エピトープ並びにＦｌａｇ及びポリヒスチジンのタグをコードさせた。コンストラクトを、ｐＭＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａ，Ｂ，ａｎｄ Ｃ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に対して記載されたように、ＦＬＡＧ−ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）及びＶ５−Ｈｉｓの配列を含有する３．６キロベース（ｋｂ）の２シストロン性ｐＭＩＢベクターにクローニングした。コントロールとして、ｆｌａｇタグ付きｐ３５（ｐ３５）及びＶ５タグ付きＥｂｉ３（Ｅｂｉ３）の一本鎖組換えタンパク質をコードするプラスミドを作製した。次いでｒＩＬ−３５コンストラクトを、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にトランスフェクトし、安定したトランスフェクタントをブラスチシジンＳ（８０μｇ／ｍｌ）中でのセレクションに供した。昆虫細胞によって分泌された組換えタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに続く、セントリコン濾過ユニットによる分画遠心及びセファロースクロマトグラフィーによって精製した。更に組換えタンパク質を、変性ＳＤＳゲル、非変性ネイティブゲル、及びＨＰＬＣによって特性解析した。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を含有する培養物中で増殖させ、Ｂ細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）（１．５μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。Ｔ細胞、Ｂ細胞、マウスＢ細胞リンパ腫株ＷＥＨＩ−２７９由来の細胞を、ｒＩＬ−３５（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下又は非存在下で増殖させた。幾通りかの共培養実験のため、精製したＢ細胞を、ｒＩＬ−３５の存在下でＬＰＳ（１．５μｇ／ｍｌ）又はヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質の１〜２０アミノ酸残基（ＩＲＢＰ_１−２０）を含むペプチド断片（４０μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ４０抗体（５μｇ／ｍｌ）で刺激した。次いで、細胞を洗浄し、ＬＰＳで刺激したＢ細胞又はＩＲＢＰで刺激したリンパ球と共培養した。７２時間後、Ｏｌｋｈａｎｕｄ ｅｔ ａｌ．，上記、に記載のように、培養物を^３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／１０μｌ／ウェル）でパルスした。

ｒＩＬ−３５タンパク質は、Ｔ細胞及びＢ細胞の増殖を抑制した。Ｂ細胞に対するＩＬ−３５の作用を確認するために、Ｂ２２０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓及びリンパ節（ＬＮ）から精製した。精製されたＢ細胞は、ＬＰＳで刺激し、上記のようにｒＩＬ−３５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で増殖させた。ｒＩＬ−３５は、ＬＰＳで刺激した初代Ｂ細胞の増殖を、空のプラスミドベクター（ｐＭＩＢ）及びＩＬ１２ｐ３５−αサブユニット又はＥｂｉ３を発現させるプラスミドでトランスフェクトした細胞と比較して、有意に抑制した（図１Ａ参照）。マウスｒＩＬ−３５も、用量依存的にＷＥＨＩ−２７９細胞の増殖を阻害した（図１Ｂ及び１Ｃ参照）。このことから、抑制作用が、初代Ｂ細胞の調製物中にコンタミネーションした細胞に由来する可能性は排除された。

ｒＩＬ−３５は、Ｂ細胞によるＩＬ−１０産生を有意に促進した（図１Ｄ参照）。ＷＥＨＩ−２７９ Ｂ細胞も、ｒＩＬ−３５に応答してＩＬ−１０を産生した（図１Ｅ参照）。このことにより、未熟Ｂ細胞の制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）への変換は、ｒＩＬ−３５によって直接的に調節されることが示された。更にｒＩＬ−３５は、Ｂｒｅｇにｐ３５タンパク質の発現を上方制御させ（これは最初、ＩＬ−１０を産生するＢｒｅｇにおいて明らかであった）、ｐ３５及びＥｂｉ３のｍＲＮＡの発現を上方制御させた。これらの結果により、ｒＩＬ−３５がＢｒｅｇにＩＬ−３５を産生する能力を与えることが示唆される（「ｉ３５−Ｂｒｅｇ」）。ＩＬ−３５が、Ｂ細胞をＢｒｅｇ又はｉ３５−Ｂｒｅｇに、そしてナイーブの初代ＣＤ４ Ｔ細胞をＴｒｅｇに変換できるという事実により、ＩＬ−３５が、Ｂ細胞及びＴ細胞において、同様の生物学的作用を調節することが示唆される。

ＩＬ−３５誘導性ＢｒｅｇがＢ細胞の増殖を抑制することを直接的に立証するために、選別された初代Ｂ細胞をｒＩＬ−３５で刺激した。すると共培養実験において、ＬＰＳで刺激したＢ細胞（図１Ｆ参照）及びＴＣＲ活性化エフェクターＴ細胞の増殖が抑制された。

本実施例の結果により、ＩＬ−３５によってリンパ球増殖、特にＴ細胞及びＢ細胞の増殖が抑制され、初代Ｂ細胞が、ＩＬ−１０を発現する制御性Ｂ細胞に変換され得ることが証明される。

実施例２
本実施例により、ＩＬ−３５が、Ｂ細胞に対するその生物学的作用を、新規なＩＬ−３５受容体を介して調節することが証明される。

ＩＬ−３５シグナルの伝達及びリンパ球上に発現したＩＬ−３５同族受容体を検証した。具体的には、ＷＥＨＩ−２７９細胞を、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１２Ｒβ２、ＩＬ−２７Ｒα、及びｇｐ１３０を含む、ＩＬ−１２ファミリーのサイトカインによって活用される受容体サブユニットを特異的に標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。

増殖又はＩＬ−１０産生のｒＩＬ−３５介在性阻害について、各受容体サブユニットの必要性を、それぞれ、［^３Ｈ］−チミジン取込みアッセイ又はＥＬＩＳＡによって評価した。ＩＬ−１２Ｒβ１又はｇｐ１３０のサブユニットのサイレンシングによっては、ｒＩＬ−３５介在性の、Ｂ細胞の増殖阻害（図２Ａ参照）及びそのＩＬ−１０産生の増強（図２Ｂ参照）は影響されなかった。対照的に、ＩＬ−１２Ｒβ２及びＩＬ−２７Ｒαのサイレンシングにより、Ｂ細胞増殖及びＩＬ−１０産生（図２Ａ及び２Ｂを参照）に対するｒＩＬ−３５の作用が完全に抑止された。ＲＴ−ＰＣＲによって測定された通り、ＩＬ−１２Ｒβ２及びＩＬ−２７Ｒαの両方が、刺激したＢ細胞に発現した（図２Ｃ参照）。相互免疫共沈降解析により、活性化Ｂ細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２とＩＬ−２７Ｒαとの間の相互作用が確認された。これらの結果により、ＩＬ−１２Ｒβ２／ＩＬ−２７Ｒαのヘテロ二量体は、マウスにおいてＩＬ−３５の生物学的作用を調節する、機能的なＩＬ−３５受容体であることが示唆される。

ＩＬ−３５シグナル伝達に応答して活用されるＳＴＡＴタンパク質を特定するために、活性化したＢ細胞又はＴ細胞を上記のようにｐＭＩＢ、ｒＩＬ−３５、又はＩＬ−１２の存在下で培養して、ＳＴＡＴの活性化をＦＡＣＳ又はウェスタンブロッティングによって解析した。ウェスタン及びＦＡＣＳの両方の解析により、Ｔ細胞においてはｒＩＬ−３５によってＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４が優先的に活性化されるが（図２Ｅ参照）、Ｂ細胞においてはＳＴＡＴ４ではなく、主にＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３（図２Ｄ参照）を介してｒＩＬ−３５シグナルが伝達されることが明らかになった。このことにより、Ｔ細胞とＢ細胞においては、これらの、ＩＬ−３５によって活用されるＳＴＡＴに違いがあることが示された。

本実施例の結果により、ＩＬ−１２Ｒβ２／ＩＬ−２７Ｒαのヘテロ二量体が、機能的ＩＬ−３５受容体であることが証明される。また、本実施例の結果により、ＩＬ−３５シグナルが、Ｔ細胞においてはＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４の経路の活性化を介して伝達され、Ｂ細胞においてはＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の活性化を介して伝達されることが証明される。

実施例３
本実施例により、ＩＬ−３５で治療したマウスにおける、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を抑制する方法が実証される。

非感染性ブドウ膜炎は、自己反応性のＴｈ１７細胞及びＴｈ１細胞によって媒介される、失明に至る可能性がある眼内炎症性疾患である（例、Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１４：３０３−３０８（１９９０）；Ａｍａｄｉ−Ｏｂｉ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１３：７１１−７１８（２００７）；及びＬｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５：７９９−８１０（２００８）を参照）。該疾患のげっ歯類モデル、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）は、本質的な特徴をヒトのブドウ膜炎（ｕｖｖｅｉｔｉｓ）と共有する（例、Ｃａｓｐｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１４９０−１４９５（１９８８），及びＮｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３２：３１３１−３１４１（１９９１）を参照）。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲＡ株（２．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を伴う、ウシ光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）１５０μｇ及びヒトＩＲＢＰの１〜２０アミノ酸残基（ＩＲＢＰ_１−２０）を含有するペプチド断片３００μｇ（０．２ｍｌ乳液中で１：１（ｖ／ｖ））による能動免疫により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＡＵを誘導した。マウスにはまた、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（０．３μｇ／マウス）を免疫と同時に受容させた。臨床疾患を引き起こし、以前の記載のように眼底検査によってスコア化した（例、Ｆｉｌｌａｔｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３９１−３９７（２００８）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，上記；及びＤｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記、を参照）。

マウスには、ＥＡＵ誘導後６日のＩＲＢＰ免疫と同時に、１００μｇ／マウスのｐＭＩＢ又はｒＩＬ−３５を受容させた。疾患の進行は、眼底検査によりモニターした（例、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４８：２７６９−２７７４（２００７），Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，５２：４６７１−４６７７（２０１１），及びＭｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（２０１１），印刷に先立つ電子出版、を参照）。疾患の重篤度及びＥＡＵスコアを評価するために、網膜、脈絡膜及び視神経乳頭における炎症性浸潤及び変性の程度に基づく、十分に確立された半定量的グレード評価方法を用いた（例、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．，３：２４７−２５５（１９９０），及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，８７：３１９−３２６（２００８）を参照）。免疫後２１日目に、ＩＲＢＰ免疫マウス血液中のＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＢ細胞による細胞内サイトカイン発現を、ＦＡＣＳによって評価した。更に、２１目のＩＲＢＰ免疫マウス由来の、選別されたＣＤ１９^＋Ｂ細胞をＩＲＢＰ_１−２０及び抗ＣＤ４０抗体で３日間再活性化し、ｒＩＬ−３５誘導性のＩＬ−１０発現をＦＡＣＳ、定量的ＰＣＲ、及びＲＴ−ＰＣＲにより解析した。次いでＣＤ１９^＋Ｂ細胞を、ＩＲＢＰ存在下で４日間、ＥＡＵマウスの排出リンパ節細胞と共培養（１：５）し、Ｔ細胞増殖、Ｆｏｘｐ３又はｐ３５及びＥｂｉ３の発現に対するｒＩＬ−３５の作用を、［^３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイ、又はＲＴ−ＰＣＲによって評価した。

免疫後２１日までに、コントロールのマウス又はｐＭＩＢを受容したマウスの眼底画像により、乳頭浮腫、網膜血管炎、並びに網膜及び脈絡膜での浸潤を伴う、重篤な炎症が明らかになった。対照的に、ｒＩＬ−３５で治療したマウスは、ＥＡＵスコアが有意に低い、非常に軽微なＥＡＵを示した（図３Ａ参照）。ｒＩＬ−３５で治療したマウスにおけるＥＡＵの改善には、血液中のＴｒｅｇ及びＢｒｅｇの同時上昇（図３Ｃ参照）による、Ｔｈ１７細胞及びＴｈ１細胞の割合の実質的減少（図３Ｂ参照）が伴っていた。

更に、ＥＡＵ誘導の間にｒＩＬ−３５で治療したマウスでは、含有するｉｎ−ｖｉｖｏのＢｒｅｇの数が増加し、ｅｘ ｖｉｖｏでのＩＬ−３５による刺激によって、Ｂｒｅｇ数とＩＬ−１０の産生（図３Ｄ参照）が更に増加した。ＥＡＵ時にｒＩＬ−３５によって誘導されるＢｒｅｇは、共培養実験において、ＩＲＢＰ特異的ブドウ膜炎原性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖を抑制し、ｒＩＬ−３５の存在下、ＩＲＢＰでＢｒｅｇを再活性化した場合には抑制効果が増強された（図３Ｅ参照）。Ｂｒｅｇは、Ｔｅｆｆ細胞の誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）への変換も、ＩＬ−３５依存的に促進した。このことにより、ｒＩＬ−３５及びＢｒｅｇによるＥＡＵ抑制に寄与する更なるメカニズムが示唆された。更にｒＩＬ−３５は、ＥＡＵ時に新規のｉ３５−Ｂｒｅｇ亜集団の増大を誘導するようであった。このことにより、ｉｎ ｖｉｖｏでＢｒｅｇ数を増幅するために機能し得る、正のフィードバックループが示唆された。

未免疫マウス又はＥＡＵのマウス由来の、活性化されたＣＤ１９^＋Ｂ細胞を、ＩＲＢＰの存在下で４日間、ＥＡＵに罹ったマウス由来のＴ細胞と共培養し、次いでナイーブの同系マウスに養子移入し、眼底検査によってＥＡＵの進行を評価した。正常マウス又はＥＡＵ（治療なし）マウス由来のＢ細胞と共培養したＴ細胞は重篤なＥＡＵを誘導したが、ｒＩＬ−３５で治療したマウス由来のＢ細胞と共培養したＴ細胞はＥＡＵを移すことができなかった。ヒトＩＬ−３５により、ヒトＢ細胞のＢｒｅｇへの変換が誘導され、ヒトＢ細胞の増殖が阻害された（図３Ｆ参照）。

本実施例の結果により、哺乳動物においてＩＬ−１０を産生する制御性Ｂ細胞の産生を誘導するＩＬ−３５タンパク質を投与することによって、哺乳動物において自己免疫を抑制できることが証明される。

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度又はその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。

本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例えば、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をより明瞭にすることのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のどの語句も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。

発明者が知る、発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載される主題の全ての変更形態及び同等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

Claims (19)

1. インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を産生するＢ細胞の調製方法であって、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む、方法。
2. ＩＬ−１０の製造方法であって、１以上のＢ細胞と単離されたインターロイキン３５（ＩＬ−３５）タンパク質とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、及びＩＬ−１０を産生する１以上のＢ細胞を提供する条件下で１以上のＢ細胞を培養することを含む、方法。
3. ＩＬ−１０を産生するＢ細胞が制御性Ｂ細胞である、請求項１又は２の方法。
4. 単離されたＩＬ−３５タンパク質が、ＩＬ−１２ｐ３５αサブユニットタンパク質及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）誘導性遺伝子３（Ｅｂｉ３）タンパク質を含む組換え融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
5. １以上のＢ細胞が初代Ｂ細胞である、請求項１〜４のいずれか１項の方法。
6. ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのリンパ球の増殖を抑制する方法であって、１以上のリンパ球と単離されたＩＬ−３５タンパク質とを接触させることを含み、それによってリンパ球の増殖が抑制される、方法。
7. 単離されたＩＬ−３５タンパク質が、ＩＬ−１２ｐ３５αサブユニットタンパク質及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）誘導性遺伝子３（Ｅｂｉ３）タンパク質を含む組換え融合タンパク質である、請求項６の方法。
8. リンパ球がＴ細胞である、請求項６又は７の方法。
9. リンパ球がＢ細胞である、請求項６〜８のいずれか１項の方法。
10. リンパ球が哺乳動物内に存在する、請求項６〜９のいずれか１項の方法。
11. 哺乳動物がマウス又はヒトである、請求項１０の方法。
12. 哺乳動物における自己免疫を抑制する方法であって、単離されたＩＬ−３５タンパク質を哺乳動物に投与することを含み、それによって、哺乳動物においてＩＬ−１０を産生するＢ細胞が産生され、哺乳動物において自己免疫が抑制される、方法。
13. 単離されたＩＬ−３５タンパク質が、ＩＬ−１２ｐ３５αサブユニットタンパク質及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）誘導性遺伝子３（Ｅｂｉ３）タンパク質を含む組換え融合タンパク質である、請求項１２の方法。
14. 哺乳動物における自己免疫を抑制する方法であって、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞を哺乳動物に投与することを含み、それによって哺乳動物における自己免疫が抑制される、方法。
15. ＩＬ−１０を産生するＢ細胞が制御性Ｂ細胞である、請求項１２〜１４のいずれか１項の方法。
16. 哺乳動物が自己免疫疾患に罹っている、請求項１２〜１５のいずれか１項の方法。
17. 自己免疫疾患がブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、クローン病、乾癬又は関節リウマチである、請求項１６の方法。
18. 哺乳動物における自己免疫を抑制するための、単離されたＩＬ−３５タンパク質。
19. 哺乳動物における自己免疫を抑制するための、単離された、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞。