JP2022536859A - Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２７産生ｂ細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、阻害性細胞表面受容体リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）を発現し、かつ、インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）を分泌する、約７５％以上のＢ－１ａ制御性細胞を含む、哺乳類細胞の単離された集団に関する。本発明は、前記細胞の集団を調製し、使用して、免疫系を抑制し、及び／又は、疾患を治療又は予防する方法にも関する。【選択図】図１９

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１９年６月１８日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６２／８６３，０５４号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。

連邦によって支援された研究開発に関する陳述
本発明は、連邦政府の支援を受け、プロジェクト番号Ｚ０１ＥＹ０００３５０－１８の下、国立衛生研究所の国立眼病研究所によりなされた。本発明において、連邦政府は一定の権利を有する。

電子的に提出された物件の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０２０年６月１２日付の「７４９４４７＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名前の２，６９２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。

ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および多発性硬化症（ＭＳ）は、有害な免疫学的活動の結果として開始または進行する疾患である。これらの病気は、失明、麻痺、および生活の質に影響を与える重大な病的状態を引き起こす可能性がある。ブドウ膜炎は、感染性または自己免疫性の病因の潜在的に視力を脅かす眼内炎症性疾患の多様なグループで構成され、自己反応性リンパ球はブドウ膜組織を攻撃および損傷することによって眼の病理に寄与する。同様に、自己免疫プロセスは、ＡＭＤに関連する網膜変性の進行に大きく寄与するが、ＡＭＤを開始するプロセスは明確に特定されていない。ＭＳは、有髄ニューロンを攻撃および／または破壊するリンパ球によって部分的に引き起こされ、それによってシナプスの伝達およびニューロン間通信を妨害する。ＧＶＨＤでは、同種異系移植物はレシピエントの体を異物と見なし、移植組織は宿主個体を攻撃する。ステロイドはブドウ膜炎や多発性硬化症の効果的な治療法だが、深刻な副作用のために長期間使用することはできない。ブドウ膜炎や多発性硬化症と同様に、ＧＶＨＤを治療するためのステロイドや免疫抑制剤の使用に関連する副作用があるかもしれない。さらに、現在ＡＭＤの効果的な治療法はなく、現行の治療法は進行性の網膜変性を遅らせることを目的とする。したがって、前述の疾患に対する安全で効果的な長期治療に対する満たされていない必要性が残っている。

本発明は、阻害性細胞表面受容体リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、およびＣＸＣケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、および分泌インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）を発現する約７５％以上のＢ－１ａ制御性細胞を含む哺乳類細胞の単離された集団を提供する。

本発明はまた、（ａ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して哺乳類末梢リンパ組織、哺乳類臍帯血、哺乳類腹水、または哺乳類骨髄のサンプルから分化５陽性（ＣＤ５＋）発現細胞のクラスターを単離して、単離ＣＤ５＋発現細胞を提供すること、（ｂ）該単離ＣＤ５＋発現細胞を細胞培養培地で培養して、培養細胞を提供すること、（ｃ）培養細胞をＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）またはＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）アゴニストで活性化して、活性化細胞を提供すること、および（ｄ）活性化された細胞をＩＬ－２７に曝露することを含む、本発明の実施形態の哺乳類細胞の集団を調製する方法を提供する。

本発明はさらに、哺乳類の免疫系を抑制する方法であって、本発明の実施形態の哺乳類細胞の集団を哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

本発明はさらに、移植片対宿主病を罹患する哺乳類を治療する方法であって、移植片対宿主病を罹患する哺乳類に本発明の実施形態の哺乳類細胞の集団を投与することを含む、方法を提供する。

本発明は、哺乳類における移植片対宿主病の重症度を予防または軽減する方法であって、哺乳類が同種異系移植物を受容する前に、本発明の実施形態の哺乳類細胞の集団を哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

本発明は、哺乳類における移植片対宿主病の重症度を予防または軽減する方法であって、（ａ）本発明の実施形態の哺乳類細胞の集団を移植材料と混合して移植混合物を形成すること、および（ｂ）該移植混合物を哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

図１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから選別されたＣＤ１９^＋ Ｂ細胞を示す共焦点顕微鏡画像のセットである。前記細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）または抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭ抗体（ＢＲ）による刺激によってｉｎ ｖｉｔｒｏで４８時間活性化された。前記細胞は蛍光標識抗ｐ２８または抗Ｅｂｉ３抗体とともにインキュベートされた。ＩＬ－２７（ｐ２８およびＥｂｉ３を共発現）発現細胞が、共焦点顕微鏡で検出された（白い矢印）。 図２Ａは、ＬＰＳまたはＢＣＲによる刺激によってインビトロで４８時間活性化されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹腔または脾臓から単離された選別されたＣＤ１９^＋ Ｂ細胞を示す一連のフローサイトメトリープロットである。プロットは、ＩＬ－２７を発現するＢ－１ａおよびＢ２細胞の百分率を示す。 図２Ｂは、ＩＬ－２７を発現する腹腔から図２ＡのＢ－１ａおよびＢ２細胞の百分率を示す棒グラフである。 図２Ｃは、ＩＬ－２７を発現する脾臓から図２ＡのＢ－１ａおよびＢ２細胞の百分率を示す棒グラフである。 図２Ｄは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による図２Ａの培養上清の分析結果を示すグラフである。 図３は、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭ抗体（ＢＣＲ）による刺激によって４８時間インビトロで活性化されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから選別されたＣＤ１９^＋ Ｂ細胞を示すフローサイトメトリープロットのセットである。該プロットは培養中のさまざまな細胞の頻度を示す。象限の数字は、ｐ２８、Ｅｂｉ３またはｐ２８、およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現するＢ細胞の百分率を示す。 図４は、図３のプロットに示される培養物中の様々な細胞の定量頻度を示す棒グラフである。 図５は、図３のプロットに示される培養物中の様々な細胞のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＲＮＡ分析（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ワシントン州シアトル）の結果を示すグラフで、ＢＣＲ／ＩＬ－２７がＩＬ－２７サブユニットｐ２８およびＩＬ－２７Ｒαの発現を相乗的にアップレギュレートし、ケモカイン受容体発現のパターンを変化させたことを示す。 図６は、図３のプロットに示される培養物中の様々な細胞の免疫蛍光／共焦点顕微鏡分析の結果を示す画像のセットで、ＢＣＲ／ＩＬ－２７がＩＬ－２７サブユニットｐ２８およびＩＬ－２７Ｒαの発現を相乗的にアップレギュレートし、ケモカイン受容体発現のパターンを変化させたことを示す。ＩＬ－２７（ｐ２８およびＥｂｉ３を共発現）を発現する細胞が共焦点顕微鏡で検出された（白い矢印）。 図７は、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭ抗体（ＢＣＲ）による刺激によってインビトロで４８時間活性化された野生型またはＩＬ－２７ＲαＫＯマウスからの選別されたＣＤ１９^＋ Ｂ細胞を示すグラフである。ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現するＢ細胞が、細胞内サイトカインアッセイによって検出され、棒グラフはさまざまな培養物におけるＩＬ－２７産生Ｂ細胞の百分率を示す。 図８は、野生型マウスの腹腔および脾臓から単離され、Ｂ－１ａまたはＢ２細胞に分類された細胞におけるＩＬ－２７Ｒαの発現についてのｑＰＣＲ結果を示すグラフである。 図９は、ＩＬ－２７の存在下、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）で活性化されたヒト志願者のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ１９^＋ Ｂ細胞を示す。 図１０は、ＩＬ－２７の存在下での図９のＣＤ１９^＋ Ｂ細胞を示すグラフである。 図１１は、ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞がヒトボランティアのＰＢＭＣから単離され、ＩＬ－２７の非存在下、ＰＭＡで活性化された後の、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）の両方かを発現するヒトＢ細胞の頻度を示すグラフである。 図１２は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）の両方かを発現する図１１の細胞の頻度を示すフローサイトメトリープロットである。 図１３Ａは、腹腔内のＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の頻度を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳ（５０μg／マウス）を注射（ｉ．ｖ）し、注射後第４日まで腹腔内のＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の頻度を毎日評価した。Ｂ－１ａ細胞は、腹腔から様々な時点で単離され、細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析された。 図１３Ｂは、腹腔内のＩＬ－２７産生Ｂ２細胞の頻度を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳ（５０μg／マウス）を注射（ｉ．ｖ）し、腹腔内のＩＬ－２７産生Ｂ２細胞の頻度を注射後第４日まで毎日評価した。Ｂ２細胞は、腹腔から様々な時点で単離され、細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析した。 図１４Ａは、脾臓におけるＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の頻度を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳ（５０μg／マウス）を注射（ｉ．ｖ）し、注射後第４日まで脾臓のＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の頻度を毎日評価した。Ｂ－１ａ細胞は、脾臓からさまざまな時点で分離され、細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析した。 図１４Ｂは、脾臓におけるＩＬ－２７産生Ｂ２細胞の頻度を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳ（５０μg／マウス）を注射（ｉ．ｖ）し、注射後第４日まで脾臓のＩＬ－２７産生Ｂ２細胞の頻度を毎日評価した。Ｂ２細胞は、脾臓からさまざまな時点で分離され、細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析した。 図１５は、ＣＸＣＲ３^＋のケモカイン受容体の百分率を示すフローサイトメトリーの棒グラフである。棒グラフの数値は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ Ｂ細胞を発現するケモカイン受容体の割合を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図１６は、ＣＸＣＲ４^＋のケモカイン受容体の百分率を示すフローサイトメトリーの棒グラフである。棒グラフの数値は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ Ｂ細胞を発現するケモカイン受容体の割合を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図１７は、ＣＸＣＲ５^＋のケモカイン受容体の百分率を示すフローサイトメトリーの棒グラフである。数字は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ Ｂ細胞を発現するケモカイン受容体の割合を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図１８は、ＩＬ－２７の注射後の臨床スコアの改善を示す網膜の眼底画像のセットである。実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）は、フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＩＲＢＰ_{６５１－６７０}－ペプチドによるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの免疫化によって誘発された（ｎ＝１２）。マウスを、免疫化の第（－１）日と、免疫化後第１２日まで隔日とに、ＩＬ－２７（１００ｎｇ／マウス）またはＰＢＳの腹腔内注射によって処置した。目は眼底検査、組織学、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、または網膜電図（ＥＲＧ）によって免疫化の１４日後または２１日後に分析した。 図１９は、図１８に示される網膜のＥＡＵスコアを示すグラフである。ＥＡＵの臨床スコアおよび疾患の重症度は、視神経乳頭または網膜血管、ならびに網膜および脈絡膜浸潤の変化に基づいて評価した。 図２０は、図１８の網膜のヘマトキシリンおよびエオシン組織学的切片の画像のセットである。スケールバー＝２００ｍＭ；Ｖ＝硝子体；ＧＣＬ＝神経節細胞層；ＩＮＬ＝内顆粒層；ＯＮＬ＝外顆粒層；ＲＰＥ／ＣＨ＝網膜色素上皮および脈絡膜。 図２１は、図１８の網膜のＯＣＴ分析を示す一組の画像である。網膜の層状構造を示す。白い矢印は、硝子体神経または視神経の炎症細胞（白い矢印）を示す。 図２２は、ＥＡＵ誘導後第２０日の図１８の網膜のＥＲＧ分析を示すグラフである。暗順応ＥＲＧａ波振幅の平均は、フラッシュ輝度の関数としてプロットし、その値は、各グループの４匹の動物からの平均±ＳＥＭである。 図２３は、ＥＡＵ誘導後第２０日の図１８の網膜のＥＲＧ分析を示すグラフである。暗順応ＥＲＧｂ波振幅の平均は、フラッシュ輝度の関数としてプロットし、その値は、各グループの４匹の動物からの平均±ＳＥＭである。 図２４は、ＥＡＵ誘導後第２０日の図１８の網膜のＥＲＧ分析を示すグラフである。明順応ＥＲＧａ波振幅の平均は、フラッシュ輝度の関数としてプロットし、その値は、各グループの４匹の動物からの平均±ＳＥＭである。 図２５は、ＥＡＵ誘導後第２０日の図１８の網膜のＥＲＧ分析を示すグラフである。明順応ＥＲＧｂ波振幅の平均は、フラッシュ輝度の関数としてプロットし、その値は、各グループの４匹の動物からの平均±ＳＥＭである。 図２６は、図１８のマウスの血清中のサイトカインＩＬ－２７の分析を示すグラフである。 図１８のマウスの血清中のサイトカインＩＬ－１７の分析を示すグラフである。 図２８は、図１８のマウスの血清中のサイトカインＩＬ－１０の分析を示すグラフである。 図２９は、図１８のマウスの血清中のサイトカインＩＬ－３５の分析を示すグラフである。 図３０は、ＩＬ－２７を発現するＢ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットである。象限の数字は、対照（ＰＢＳ処理）またはＩＬ－２７処理ＥＡＵマウスの脾臓におけるＣＤ１９^＋細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１^ｌｏｗ細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１^ｌｏｗ細胞の割合を示す。ゲーティング戦略は図示されるとおりである。 図３１は、図３０のＩＬ２７発現Ｂ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３２は、対照（ＰＢＳ処理）またはＩＬ－２７処理ＥＡＵマウスの脾臓におけるＩＬ－２７発現Ｂ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットである。ゲーティング戦略は図示されるとおりである。象限の数字は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現するＣＤ１９^＋Ｂ細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１^ｌｏｗＢ細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１^ｌｏｗＢ細胞のパーセントを示す。 図３３は、図３２の対照（ＰＢＳ処理）またはＩＬ２７処理ＥＡＵマウスの脾臓におけるＩＬ２７発現Ｂ１０細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３４は、図３２の対照（ＰＢＳ処理）またはＩＬ２７処理ＥＡＵマウスの脾臓におけるＩＬ２７発現Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３５は、眼底検査による養子移植の１７日後のマウスからの網膜の眼底画像のセットである。野生型ドナーＣＤ４５．２^＋ ＥＡＵマウスから精製した腹腔Ｂ－１ａ細胞（５×１０^５個／マウス；＞ ８０％ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）を、ナイーブ同系野生型またはＩＬ－２７ＲαＫＯＣＤ４５．１^＋に移した。養子移植の２４時間後、ＩＲＢＰ_{６５１－６７０}による免疫化によってレシピエントマウスにＥＡＵを誘導した（ｎ＝１２）。養子移植後１７日まで眼底検査により臨床疾患をモニターした。 図３６は、図３５に示される網膜のＥＡＵスコアを示すグラフである。 図３７は、ＦＡＣＳおよび細胞内サイトカインアッセイに供されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞からのフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ＩＬ－１７を発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の割合を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図３８Ａは、ＦＡＣＳおよび細胞内サイトカインアッセイに供されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞からのフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ＩＬ－１０を発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示す。 図３８Ｂは、ＩＦＮ－γを発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３８Ｃは、ＩＬ－１７を発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３８Ｄは、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７を発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３８Ｅは、ＩＬ－１０を発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図３９は、ＦＡＣＳに供されたＣＤ１９^＋ Ｔ細胞（眼）からのフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ｐ２８、ｐ３５、Ｅｂｉ３、ｐ２８、およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現するＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図４０は、ＦＡＣＳに供されたＣＤ１９^＋ Ｔ細胞（眼）からのフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）か、ｐ３５およびＥｂｉ３（ＩＬ－３５）かを発現するＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２の百分率を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図４１は、ｐ２８およびＥｂｉ３を発現する、図３９の眼におけるＢ－１ａ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図４２は、ｐ２８およびＥｂｉ３を発現する図４０の眼におけるＢ２細胞の百分率を示す棒グラフである。 図４３は、ｐ３５およびＥｂｉ３を発現する、図４０の眼におけるＢ２細胞の百分率を示す棒グラフである。 図４４は、免疫化後第１７日（元の倍率×２００）のマウスの脳（上段）および脊髄（中段）のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の顕微鏡写真のセットである。矢印は、脳または脊髄の炎症細胞を示す。ＥＡＥ誘発性脱髄の程度は、Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ染色によって評価した（下段；Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅは、アルコール可溶性で、ミエリン鞘のリポタンパク質に見られる塩基に引き付けられる銅フタロシアニン色素である）。矢印は脊髄の脱髄領域を示す。ＥＡＥは、ＣＦＡ中のＭＯＧ_{３５－５５}－ペプチドによるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの免疫化によって誘発した（ｎ＝１２）。マウスは、免疫化第０日および免疫化後第１２日まで隔日に、ＩＬ－２７（１００ｎｇ／マウス）またはＰＢＳの腹腔内注射によって処置した。 図４５は、図４４に記載の脊髄のＥＡＵスコアを示すグラフである。ＥＡＥの臨床スコアおよび疾患評価は、十分に確立された評価システムに従って、２人のマスクされた研究者によって確認した。 図４６は、免疫化後第１７日に単離し、コラゲナーゼ消化した未処理またはＩＬ－２７処理マウスの細胞内サイトカイン分析後の脳および脊髄の中の炎症細胞からのフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、脊髄および脳におけるＩＬ－１７またはＩＦＮ－γを発現するＣＤ４ Ｔ細胞の割合を示す。 図４７は、免疫化後第１７日に単離し、コラゲナーゼ消化した未処理またはＩＬ－２７処理マウスの細胞内サイトカイン分析後の脳および脊髄の中の炎症細胞からのフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、脊髄および脳の中のＩＬ－１０発現細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞の割合を示す。 図４８は、ＩＦＮ－γを発現する図４６および図４７のＣＤ４ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図４９は、ＩＬ－１７を発現する図４６および図４７のＣＤ４ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５０は、ＩＬ－１７およびＩＦＮ－γを発現する図４６および図４７のＣＤ４ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５１は、ＩＬ－１０を発現する図４６および図４７のＣＤ４ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５２は、ＩＬ－２７（ｐ２８およびＥｂｉ３）発現について細胞内サイトカイン染色アッセイにより分析した、未免疫化、ＰＢＳ処理またはＩＬ－２７処理されたＥＡＥマウスの脊髄および脳からのＩＬ－２７発現Ｂ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現する脊髄または脳のＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｈｉ Ｂ細胞、またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｌｏｗＢ細胞の百分率を示す。 図５３は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｌｏｗを発現する、図５２のＣＤ１９ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５４は、細胞内サイトカイン染色アッセイによりＩＬ－２７（ｐ２８およびＥｂｉ３）の発現を分析した、未免疫化、ＰＢＳ処理またはＩＬ－２７処理されたＥＡＥマウスの脾臓からのＩＬ－２７発現Ｂ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現する脾臓における、全ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｈｉ Ｂ細胞または全ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｌｏｗ Ｂ細胞の百分率を示す。 図５５は、ｐ２８およびＥｂｉ３を発現する、図５４のＣＤ１９ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５６は、ＩＬ－２７増殖についてのＰＢＳ処理またはＩＬ－２７処理されたＥＡＥマウスの脾臓細胞の分析を示すフローサイトメトリープロットのセットである。象限の数字は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｌｏｗ Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す。 図５７は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｈｉを発現する、図５６のＣＤ１９ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５８は、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｌｏｗを発現する、図５６のＣＤ１９ Ｔ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図５９は、エクスビボで再刺激し、ナイーブＣＤ４５．１^＋ ＷＴマウス（１×１０^７個／マウス）に移植した、ＭＯＧ_{３５－５５}免疫化（ＰＢＳ処理ＥＡＥまたはＩＬ－２７処理）ＣＤ４５．２^＋ マウスからの脾臓細胞のＥＡＵスコアを示すグラフである。ＥＡＥの臨床スコアおよび疾患評価は、２人のマスクされた研究者によって確認した。 図６０は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。ＰＢＳ処理またはＩＬ－２７処理マウスの脊髄、脳、リンパ節（ＬＮ）または脾臓を、養子移植後第２０日に単離し、コラゲナーゼ消化し、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＩＬ－２７産生Ｂ－１ａが細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析された。象限の数字は、ＩＬ－１７またはＩＦＮ－γを発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の割合を示す。データは、３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図６１は、ＩＬ－１７を発現する、図６０の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図６２は、ＩＬ－１７およびＩＦＮ－γを発現する、図６０の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図６３は、ＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。ＰＢＳ処理またはＩＬ－２７処理マウスの脊髄、脳、リンパ節（ＬＮ）または脾臓を、養子移植後第２０日に単離し、コラゲナーゼ消化し、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＩＬ－２７産生Ｂ－１ａが細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析した。象限の数字は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１１ｂ^＋ Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す。データは、３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図６４は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する、脊髄からの図６３のＢ－１ａ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図６５は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する、脳からの図６３のＢ－１ａ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図６６は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する、脾臓からの図６３のＢ－１ａ細胞の百分率を示す棒グラフである。 図６７は、ナイーブ同系野生型マウスに移植し、適応移植の２４時間後に、ＭＯＧ_{３５－５５}による免疫化によってレシピエントマウスにＥＡＥを誘導した（ｎ＝１２）、ＷＴドナーＣＤ４５．２^＋ からの精製腹腔Ｂ－１ａ細胞（５×１０^５個／マウス；＞８０％ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）からのフローサイトメトリープロットのセット（上）およびＥＡＥ臨床スコア（下）を示すグラフである。ＥＡＥ臨床スコアおよび疾患評価は２人のマスクされた研究者によって実行した。 図６８は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、またはＩＦＮ－γを発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。ＰＢＳ処理またはＢ－１ａ処理マウスの脊髄および脳を免疫化後第１５日に単離し、コラゲナーゼで消化し、細胞内サイトカイン染色アッセイで分析した。データは、３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図６９は、ＩＦＮ－γを発現する、図６８の脊髄および脳細胞の百分率を示す棒グラフである。 図７０は、ＩＬ－１７を発現する、図６８の脊髄および脳細胞の百分率を示す棒グラフである。 図７１は、ＩＬ－１０を発現する、図６８の脊髄および脳細胞の百分率を示す棒グラフである。 図７２は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを脊髄で発現する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。ＰＢＳ処理またはＢ－１ａ処理マウスの脊髄を免疫化後第１５日に単離し、コラゲナーゼで消化し、細胞内サイトカイン染色アッセイで分析した。データは３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図７３は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する、図７２の脊髄細胞の百分率を示す棒グラフである。 図７４は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを脳内で発現する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａまたはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。ＰＢＳ処理またはＢ－１ａ処理マウスの脳を免疫化後第１５日に単離し、コラゲナーゼで消化し、細胞内サイトカイン染色アッセイで分析した。データは、３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図７５は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する、図７４の脳細胞の百分率を示す棒グラフである。 図７６は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを腹腔内で発現する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３Ｂ－１ａ細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。ＰＢＳ処理またはＢ－１ａ処理マウスの腹腔からの体液を免疫化後第１５日に単離し、コラゲナーゼで消化し、細胞内サイトカイン染色アッセイで分析した。データは、３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図７７は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する腹腔からの図７４の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図７８は、下部ウェルに野生型ＥＡＵマウスからのＢ－１ａ細胞を含むトランスウェルシステムで培養されるＥＡＵマウスからのマクロファージを示す模式図である。Ｂ－１ａ細胞の増殖に対するマクロファージの効果は、［^３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイによって評価した。 図７９は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現する、図７８のＢ－１ａ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。 図８０は、図７８のＢ－１ａ細胞およびマクロファージのＣＰＭ平均値を示す棒グラフである。増殖応答は、５個のレプリケート培養で分析した。データは、少なくとも３回の独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図８１は、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）を発現する、図７８のＢ－１ａ細胞およびマクロファージの百分率を示す棒グラフである。 図８２は、ｐ２８を標的とするレンチウイルスガイドＲＮＡ（ｓｇｐ２８－１またはｓｐｇ２８－２）の存在下または非存在下、ＬＰＳで活性化した初代マウス腹腔マクロファージのＩＬ－２７の分泌のＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。 図８３は、ｐ２８を標的とするレンチウイルスガイドＲＮＡ（ｓｇｐ２８－１またはｓｐｇ２８－２）の存在下または非存在下、ＬＰＳで活性化したマウス腹膜初代Ｂ－１ａ細胞のＩＬ－２７分泌のＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。 図８４は、ＩＬ－２７の抑制を標的とするレンチウイルスガイドＲＮＡ（ｓｇｐ２８／Ｅｂｉ３）に感染したＢ－１ａ細胞を含むトランスウェルシステムで培養されるＥＡＵマウス由来病原性（ブドウ膜形成性）Ｔ細胞を示す模式図である。ブドウ膜形成性Ｔ細胞の増殖に対するＢ－１ａ細胞の効果は、［^３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイによって評価した。 図８５は、図８４の細胞のＣＰＭ平均値を示す棒グラフである。 図８６は、細胞内サイトカイン染色アッセイによって決定したＩＬ－１０、ＩＬ－１７および／またはＩＦＮ－γを発現する、ブドウ膜形成性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。 図８７は、ＩＦＮ－γを発現する図８６の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図８８は、ＩＬ－１７を発現する、図８６の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図８９は、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７を発現する、図８６の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図９０は、ＩＬ－１０を発現する、図８６の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図９１は、野生型ＥＡＵマウスのＢ－１ａ細胞またはＩＬ－２７の抑制を標的とするレンチウイルスガイドＲＮＡ（ｓｇｐ２８／Ｅｂｉ３）に感染したＢ－１ａ細胞を含むトランスウェルシステムで培養されるＥＡＵマウスの病原性（ブドウ膜形成性）Ｔ細胞を示す模式図である。ブドウ膜形成性Ｔ細胞の増殖に対するＢ－１ａ細胞の効果は、［^３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイによって評価した。 図９２は、細胞内サイトカイン染色アッセイによって決定した、ＬＡＧ－３を発現するブドウ膜形成性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率を示すフローサイトメトリープロットのセットである。 図９３は、ＬＡＧ－３を発現する、図９２の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図９４は、野生型ＥＡＵマウスのＢ－１ａ細胞またはＩＬ－２７の抑制を標的とするレンチウイルスガイドＲＮＡ（ｓｇｐ２８／Ｅｂｉ３）に感染したＢ－１ａ細胞を含むトランスウェルシステムで培養されるＥＡＵマウスの病原性（ブドウ膜形成性）Ｔ細胞を示す模式図である。ブドウ膜形成性Ｔ細胞の増殖に対するＢ－１ａ細胞の効果は、［^３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイによって評価した。 図９５は、ｐ３５、Ｅｂｉ３、またはＩＬ－３５（ｐ３５／Ｅｂｉ３）を発現する、ＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｆｏｘｐ３^＋ およびＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｆｏｘｐ３^－ のフローサイトメトリープロットのセットである。 図９６は、ｐ３５およびＥｂｉ３を発現する、図９５の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図９７は、ｐ３５、Ｅｂｉ３、またはＩＬ－３５（ｐ３５／Ｅｂｉ３）を発現する、ＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｆｏｘｐ３^＋ およびＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｆｏｘｐ３^－ のフローサイトメトリープロットのセットである。 図９８は、ＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｆｏｘｐ３^＋ である、図９７の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図９９は、ＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｆｏｘｐ３^－ である、図９７の細胞の百分率を示す棒グラフである。 図１００は、ＥＬＩＳＡによって分析した（左フローサイトメトリープロット）、ＬＰＳ刺激によりインビトロで４８時間活性化したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹腔から選別したＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ細胞の結果を示すフローサイトメトリープロットおよびグラフのセットである。腹腔内培養物からの上清をｑＰＣＲによって分析した（右）。 図１０１は、ＬＰＳを４８時間前に注射（ｉ．ｖ）したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹腔から精製したＢ－１ａ細胞のｑＰＣＲ分析の結果を示す棒グラフである。 図１０２は、磁気ビーズを使用して選別し、抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭ（ＢＣＲ）で活性化した後の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス腹腔または脾臓からの、それぞれ、Ｂ－１ａまたは形質細胞（Ｂ２）を示すフローサイトメトリープロットである。 図１０３は、Ｐｄ１ ｍＲＮＡ転写物の発現について定量化した、図１０２の細胞からのＲＮＡのｑＰＣＲ分析のグラフである。 図１０４は、Ｌａｇ３ ｍＲＮＡ転写産物の発現について定量化した、図１０２の細胞からのＲＮＡのｑＰＣＲ分析のグラフである。 図１０５は、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭで活性化したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス脾臓由来ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞のｑＲＴ－ＰＣＲによって分析したさまざまな時点で単離したＲＮＡを示すグラフのセットである。 図１０６は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ転写因子パネルを使ってＩＬ－２７によって差次的に誘導した遺伝子を検出してから２４時間後のボルケーノプロット分析である。 図１０７はウエスタンブロットの画像である。ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞は、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、ＬＰＳによる免疫化（インビボ）の２４時間後にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から、または、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、ＬＰＳによる活性化（インビトロ）した後のマウスＣＤ１９^＋ Ｂ細胞から単離した。核抽出物を細胞から調製し、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で分析して、ＩＬ－２７によって誘導されるＡＩＣＥ複合体を検出した。ＣＴＬＡ４－ＡＩＣＥまたはｐ２８－ＡＩＣＥの遺伝子座に動員された転写因子は、スーパーシフトアッセイによって同定した。ＩＬ－２７の存在下または非存在下、ＬＰＳで免疫したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＣＤ１９^＋ Ｂ細胞から調製した全細胞抽出物を、ウエスタンブロッティングによって分析した。 図１０８は、腹腔からのＢ－１ａ細胞の相対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。 図１０９は、ｐ２８か、Ｅｂｉ３か、ｐ２８およびＥｂｉ３（ＩＬ－２７）かを発現するＢ－１ａまたは形質芽細胞の百分率を示す、ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞のＦＡＣＳ分析のフローサイトメトリープロットのセットである。該ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞は、抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭで３日間活性化した後の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型）の脾臓、または、Ｂ細胞におけるｉｒｆＨの標的欠損を伴うマウス（ＣＤ１９－ＩＲＦ８ＫＯ）に由来する。ゲーティング戦略は図示されるとおりである。データは、３回を超える独立した実験を表す（^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 図１１０は、図１０９のＣＤ１９^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ３８３^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１１１は、図１０９のＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１１ｂ^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１１２は、ＬＰＳまたはＬＰＳ＋ＩＬ－２７で２４時間刺激したＢ－１ａ細胞で実行し、ｐ２８またはｅｈｉ３プロモーター領域へのＳＴＡＴ１結合が分析した、クロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）分析を示す棒グラフである。細胞溶解物を抗ＳＴＡＴ１抗体または対照ＩｇＧで免疫沈降させた。免疫沈降物および入力ＤＮＡは、ｐ２８またはｅｈｉ３プロモーター部位に対応するプライマーを使用したｑＰＣＲによって分析した。 図１１３は、ＬＰＳまたはＬＰＳ＋ＩＬ－２７で２４時間刺激したＢ－１ａ細胞で実行し、ｐ２８またはｅｈｉ３プロモーター領域へのＳＴＡＴ３結合が分析した、ＣＨＩＰ分析を示す棒グラフである。細胞溶解物を抗ＳＴＡＴ３抗体または対照ＩｇＧで免疫沈降させた。免疫沈降および入力ＤＮＡは、ｐ２８またはｅｈｉ３プロモーター部位に対応するプライマーを使用したｑＰＣＲによって分析した。 図１１４は、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧおよびＢＣＲ（抗ＣＤ４０または抗ＩｇＭ）とともに３日間培養した健康なヒトＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析のフローサイトメトリープロットのセットである。ヒトＢ－１細胞（ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ）をゲーティングすると、ヒトＰＢＭＣのＢＣＲ活性化Ｂ細胞の１９．９％がＩＬ－２７を産生することが明らかになった。 図１１５は図１１４のＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ｐ２８^＋ Ｅｂｉ３^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１１６は、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧおよびＢＣＲ（抗ＣＤ４０または抗ＩｇＭ）とともに３日間培養した健康なヒトＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析のフローサイトメトリープロットのセットである。ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１ｂ^＋ Ｂ－１細胞をゲーティングすると、３５％ものＢＣＲ活性化ヒトＢ－１細胞を含むことが明らかになった。 図１１７は図１１６のＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１ ｂ^＋ ｐ２８^＋ Ｅｂｉ３^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１１８は図１１６のＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１ｂ^－ ｐ２８^＋ Ｅｂｉ３^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１１９は、健康なヒトドナーからのヒト臍帯血のＦＡＣＳ分析のフローサイトメトリープロットのセットである。休止状態のＢ－１ａ細胞の１８．１％もの細胞がＩＬ－２７を構成的に産生し、ＩＬ－２７によるＢＣＲ活性化臍帯血Ｂ細胞の刺激は、臍帯血ｉ２７－Ｂｒｅｇの百分率を７３．９％に増加させた。 図１２０は、図１１９（上段）の細胞の量を示す棒グラフである。 図１２１は、図１１９（下段）の細胞の量を示す棒グラフである。 図１２２は、他のＢｒｅｇサブタイプ（ＩＬ－１０産生Ｂｒｅｇおよびｉ３５－Ｂｒｅｇ）と比較したｉ２７－Ｂｒｅｇの相対的な存在量を示すグラフのセットである。活性化したヒト臍帯血細胞は６日間増殖させた。Ｂｒｅｇ細胞の大部分はｉ２７－Ｂｒｅｇ（各円グラフの最大スライス、６１．２ ＋／－ ５．３から８７．１ ＋／－ ３．１％の範囲）で、はるかに低いレベルのＩＬ－１０産生Ｂｒｅｇ（２．６ ＋／－０．３から６．７ ＋／－ １．１％までの範囲）およびｉ３５－Ｂｒｅｇ（１０．２ ＋／－ ２．７から３２ ＋／－ ６．８ ５までの範囲）が検出した。 図１２３は、Ｂ－２細胞の相対的な存在量を示すグラフのセットである。これらのプロットは、ほとんどのｉ２７－ＢｒｅｇがナイーブまたはメモリーＢ細胞プールのいずれかにあることを明らかにした。 図１２４は、マウス種と同様に、ヒトｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞が抑制性受容体ＰＤ－１およびＬＡＧ３を構成的に発現することを示すグラフである。 図１２５は、図１２４のＰＤ１^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１２６は、図１２４のＬＡＧ３^＋ 細胞の量を示す棒グラフである。 図１２７は、ヒトｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞のＦＡＣＳ分析のフローサイトメトリープロットのセットである。ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、およびＩＦＮ－γを産生する炎症性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖反応を抑制した。 図１２８は、図１２７の細胞のＣＰＭ平均値を示す棒グラフである。 図１２９は、図１２７のＴＮＦα^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の量を示す棒グラフである。 図１３０は、図１２７のＩＦＮγ^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の量を示す棒グラフである。 図１３１は、図１２７のＩＬ－１７Ａ^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の量を示す棒グラフである。 図１３２は、ｐ２８とＥｂｉ３との間の物理的相互作用を示す近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）の結果を示す。 図１３３は、Ｂ細胞がヘテロ二量体（ｐ２８／Ｅｂｉ３）ＩＬ－２７サイトカインを産生することを示すゲルである。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳまたはＬＰＳ＋ＩＬ－２７を注射（ｉ．ｖ）し、２４時間後、培養Ｂ－１ａ細胞からの溶解物または上清を相互免疫沈降／ウエスタンブロット分析に供した。ＩＰまたはウエスタンブロッティングに使用した抗体を示している。 図１３４は、ＩＬ－２７が活性化Ｂ細胞におけるケモカイン受容体発現のパターンを変化させたことを示すＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＲＮＡ分析の結果を示すグラフである。 図１３５Ａは、腹腔内のチャレンジされていないＢ－１ａおよびｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞による天然ＩｇＭ抗体の分泌の違いを示すフローサイトメトリープロットを示す。 図１３５Ｂは、腹腔内のチャレンジされていないＢ－１ａおよびｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞による天然ＩｇＭ抗体の分泌の違いを示すグラフのセットを示す。 図１３６は、４つの異なる集団への細胞の分離を示す主成分分析（ＰＣＡ）プロットを示す。 図１３７は、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の機能的経路の濃縮を示す遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を示す。 図１３８は、チャレンジされていないＢ－１ａ細胞のシグネチャープログラムと比較した、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の遺伝子シグネチャーのヒートマップである。 図１３９は、ｉ２７－ＢｒｅｇｓおよびＢ－１ａ細胞で差次的に発現する遺伝子である、転写因子、シグナル伝達タンパク質、サイトカイン、ケモカインをコードする遺伝子、または細胞表面タンパク質をコード化する遺伝子を示すヒートマップのセットである。 図１４０は、抑制性受容体をコードする遺伝子のｑＰＣＲ発現からのグラフのセットである。 図１４１Ａは、抗ＣＤ４０またはＢＣＲに応答して、ＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ Ｂ－１細胞の有意な増大を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１４１Ｂは、抗ＣＤ４０またはＢＣＲに応答して、ＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ Ｂ－１細胞の有意な増大を示す散布図である。 図１４２Ａは、抗ＣＤ４０またはＢＣＲに応答して、ＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１^＋ またはＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１^－ Ｂ－１細胞の有意な増大を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１４２Ｂは、抗ＣＤ４０またはＢＣＲに応答して、ＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１^＋ またはＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１^－ Ｂ－１細胞の有意な増大を示す散布図のセットである。 図１４３Ａは、ＢＣＲか、ＢＣＲおよびＩＬ－２７かで活性化したヒト臍帯血ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞（上）または血液中の選別されたＢ－１ａ細胞（下）の代表的なフローサイトメトリープロットのセットで、ＩＬ－２７産生ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ Ｂ－１ａ細胞の有意な増大を示す。 図１４３Ｂは、ＢＣＲか、ＢＣＲおよびＩＬ－２７かで活性化したヒト臍帯血ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞（上）または血液中の選別されたＢ－１ａ細胞（下）の散布図のセットであり、ＩＬ－２７産生ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ Ｂ－１ａ細胞の有意な増殖を示す。 図１４４は、活性化したヒト臍帯血のＢ－１コンパートメントにおけるＩＬ－２７（ｉ２７－Ｂｒｅｇ）、ＩＬ－３５（ｉ３５－Ｂｒｅｇ）およびＩＬ－１０分泌Ｂｒｅｇの分布および相対存在量を示す代表的なｔ－ＳＮＥクラスタリングプロットおよびフローサイトメトリーの円グラフを示す。 図１４５は、ヒト血液中のヒトＣＤ１９^＋ Ｂ細胞が６日間活性化し、細胞内サイトカインアッセイによって分析した後の培養物中のさまざまなＢｒｅｇサブセット（例えば、ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ、ｉ３５－Ｂｒｅｇｓ、およびＢ１０細胞）の量を示すグラフおよび円グラフである。 図１４６は、従来のＣＤ１９^＋ Ｂ－２、ｉ２７－Ｂｒｅｇ、ｉ３５－Ｂｒｅｇ、またはＢ１０細胞からのＲＮＡを使用したＲＮＡ－Ｓｅｑ分析の結果を示す。 図１４７は、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞とｉ３５－Ｂｒｅｇ細胞との間で差次的に発現される遺伝子を示すヒートマップ分析を示すグラフである。 図１４８は、従来のＣＤ１９^＋ Ｂ－２細胞とｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞との間で異なって発現される遺伝子を示すヒートマップ分析を示すグラフである。 図１４９Ａは、活性化したＩＬ－２７産生Ｂ－１ａと形質細胞様樹状細胞との共培養（１：１）後のＩＬ－２７分泌ＣＤ１１ｂ^＋ Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１４９Ｂは、活性化したＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞と形質細胞様樹状細胞との共培養（１：１）後のＩＬ－２７分泌ＣＤ１１ｂ^＋ Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す代表的な棒グラフである。 図１５０は、ＷＴドナーＣＤ４５．２^＋ マウスから精製したＩＬ－２７分泌腹膜Ｂ－１ａ細胞（＞ ８０％ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）をナイーブ同系ＣＤ４５．１^＋ マウスに移植し、２４時間後、ＭＯＧ_{３５－５５}（ｎ＝１２）による免疫化によりレシピエントマウスにＥＡＥが誘発された後のＥＡＥの有意な抑制を示す散布図である。 図１５１Ａは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、またはＩＦＮ－γを発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の割合で示される、ｉ２７－Ｂｒｅｇで処置されたマウスのＥＡＥ症状の減弱を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１５１Ｂは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、またはＩＦＮ－γを発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞の百分率で示される、ｉ２７－Ｂｒｅｇで処置したマウスのＥＡＥ症状の減弱を示す散布図のセットである。 図１５２Ａは、脊髄でＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａ細胞またはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１５２Ｂは、脳でＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａまたはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞を示す散布図のセットである。 図１５３Ａは、脳内でＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａまたはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１５３Ｂは、脳内でＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａまたはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞を示す散布図のセットである。 図１５４Ａは、腹腔内でＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａまたはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロットのセットである。 図１５４Ｂは、腹腔内でＩＬ－２７を分泌する、ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ２３^－ Ｂ－１ａまたはＣＤ１９^＋ ＣＤ５^－ ＣＤ２３^＋ Ｂ２細胞を示す散布図のセットである。

発明の詳細な説明
制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）は、ＩＬ－１０またはＩＬ－３５を単独で、または阻害性細胞表面受容体と組み合わせて産生することにより、自己免疫疾患を抑制する。しかし、これまでに記載されたＢｒｅｇ（例えば、米国特許第９，６２９，８９７号）は、抗原特異的であり、Ｂ２リンパ球系譜に由来する。本発明は、インターロイキン－２７（ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）を産生および分泌するＢ－１ａ系譜の制御性Ｂ細胞の天然に存在しない高濃度の集団を含むヒト細胞の単離された集団を提供する。

インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）は、ＩＬ－１２サイトカインファミリーのメンバーである。ＩＬ－２７は、ｅｂｉ３（エプスタインバーウイルス誘導遺伝子３）およびＩＬ－２７ｐ２８によってコードされる２つの異なるタンパク質サブユニットで構成されるヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ－２７は細胞によって発現され、ＩＬ－２７受容体（ＩＬ－２７Ｒ）と相互作用する。ＩＬ－２７Ｒは、ＩＬ－２７α（ＩＬ－２７ ａｌｐｈａ）およびｇｐｌ３０の２つのタンパク質で構成されている。ＩＬ－２７は、免疫系のＴ細胞の多様な集団の分化を誘導する。炎症性刺激によるＢ－１ａ制御性細胞の天然の活性化は、ＩＬ－２７産生と、脾臓へのｉ２７－Ｂｒｅｇの同時流出とを引き起こし、脾臓で従来のリンパ球を再プログラムして免疫調節機能を獲得させる。

本発明の細胞の集団は、約２５％以上のＢ－１ａ制御性細胞（例えば、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５５％または以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８１％以上、約８２％以上、約８３％以上、約８４％以上、約８５％以上、約８６％以上、約８７％以上、約８８％以上、約８９％以上、または約９０％以上のＢ－１ａ制御性細胞）を含むことができる。細胞集団内の他の細胞型と比較してそのような比較的高い割合でのＢ－１ａ細胞の集団は、人体または自然界に存在しない。人体内のＢ－１ａ細胞は、末梢リンパ組織で少数検出される（＜２％）。２％未満のこの少数派の集団内では、ｉ２７－Ｂｒｅｇは２％未満であり、天然に存在するヒト細胞集団の約４／１０，０００までしか含まれていない（つまり、０．０２×０．０２＝０．０００４）。

本発明の細胞の集団は、阻害性細胞表面受容体リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）を発現する。細胞の集団は、それらの表面に受容体を有するか、またはそれらの表面に受容体を有することができる可能性がある。

ＬＡＧ－３（または分化クラスター２２３（ＣＤ２２３））は、ヒトのＬＡＧ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＬＡＧ３は免疫チェックポイント受容体である。

ＰＤ－１（または分化クラスター２７９（ＣＤ２７９））は、ヒトのＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ－１は免疫チェックポイント受容体でもある。ＰＤ－１は、リンパ節の抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促進し、制御性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）のアポトーシスを減少させる。

ＣＸＣＲ４（またはｆｕｓｉｎまたは分化クラスター１８４（ＣＤ１８４））は、ヒトのＣＸＣＲ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＸＣＲ４は、リンパ球の走化性活性を持つ分子である間質由来因子１（ＳＤＦ－１またはＣＸＣＬ１２）に特異的なアルファケモカイン受容体である。

細胞の集団は、必要に応じて、阻害性細胞表面受容体グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲまたは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）または活性化誘導性ＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ））も発現する。ＧＩＴＲは、ヒトのＴＮＦＲＳＦ１８遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＧＩＴＲは、Ｔ細胞の活性化により発現が増加することが示されている。

本発明の細胞の集団は、任意選択で、阻害性細胞表面受容体ＯＸ４０（または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）または分化クラスター１３４（ＣＤ１３４）））も発現する。ＯＸ４０は、ヒトのＴＮＦＲＳＦ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＯＸ４０は、休止状態のナイーブＴ細胞では構成的に発現していない。

本発明の細胞の集団はまた、任意選択で、阻害性細胞表面受容体細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４または分化クラスター１５２（ＣＤ１５２））を発現する。ＣＴＬＡ４は、ヒトのＣＴＬＡ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＴＬＡ４は免疫チェックポイントであり、免疫応答をダウンレギュレートする。ＣＴＬＡ４は制御性Ｔ細胞で構成的に発現するが、活性化後に従来のＴ細胞でのみアップレギュレートされる。

本発明の細胞の集団は、哺乳類に由来する場合がある。「哺乳類」という用語には、マウスなどの齧歯目、ウサギなどのウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）、ネコ（猫）およびイヌ（犬）を含む食肉目、ウシ（牛）とブタ（豚）を含む偶蹄目、ウマ科を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）、霊長目、オマキザル上科（Ｃｅｂｏｉｄｓ）またはシミオイド（Ｓｉｍｉｏｉｄｓ、猿）および真猿亜目（ヒトおよび類人猿）を含むが、これらに限定されない。より好ましくは、前記細胞の集団はヒト由来である。

本発明は、（ａ）哺乳類組織または液体サンプルから分化クラスター５陽性（ＣＤ５＋）発現細胞を単離して、単離されたＣＤ５＋発現細胞を提供すること、（ｂ）前記単離されたＣＤ５＋発現細胞を細胞培養培地中で培養して、培養細胞を提供すること、（ｃ）ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）またはＴＬＲ（トール様受容体）アゴニストで前記培養細胞を活性化して、活性化細胞を提供すること、および（ｄ）前記活性化した細胞をＩＬ－２７に曝露することを含む、細胞（例えば、ヒト細胞）の集団を調製する方法を提供する。これに関して、ＣＤ５＋（ＣＤ５はＴ細胞およびＢ－１ａ細胞の表面に発現される）発現細胞の単離は、任意の適切な方法によって、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、マイクロ流体細胞選別、または磁気細胞選別を使用することによって、実施することができる。

哺乳類組織または体液サンプルは、哺乳類末梢リンパ組織、哺乳類臍帯血、哺乳類腹水、哺乳類骨髄、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）その他のＢ－１ａ細胞を含む他のサンプルなどの任意の適切な供給源からのものであり得る。少なくともいくつかの実施形態では、サンプルとして腹水または臍帯血を使用することが望ましい場合がある。なぜなら、これらの供給源は、通常、他のサンプル（例えば、末梢リンパ組織）よりも高い割合のＢ－１ａ細胞を有するからである。いくつかの実施形態において、組織または液体の好ましい供給源は、本発明の細胞の集団で処置されるドナー対象からのものであり得る。

Ｂ－１ａ細胞の増殖をサポートできる任意の適切な細胞培養培地を使用することができる。たとえば、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地（ＲＰＭＩ １６４０）培地を使用できる。

前記培養細胞は、ＢＣＲアゴニストまたはＴＬＲアゴニストに曝露される。細胞を活性化することができる任意の適切なＢＣＲアゴニストまたはＴＬＲアゴニストを使用することができる。ＢＣＲアゴニストの例には、抗ＣＤ４０および抗ＩｇＭ抗体が含まれる。ＴＬＲアゴニストの例には、ＴＬＲ９およびＴＬＲ４アゴニストが含まれる。すべてのリンパ球の場合と同様に、生物学的活性を引き出すにはＢ－１ａ細胞を活性化する必要があり、したがってＣＤ５＋ Ｂ－１ａ細胞はＢＣＲアゴニストまたはＴＬＲアゴニストで活性化される。ＣＤ４０は、抗原提示細胞に見られる共刺激タンパク質であり、Ｂ細胞受容体とＩｇＭに対する抗体との相互作用に続くＢ細胞の活性化に必要である。ただし、活性化したＢ－１ａ細胞によるＩＬ－２７の最大分泌には、Ｂ－１ａ細胞上の同族受容体へのＩＬ－２７の結合およびＩＬ－２７受容体のさらなるアップレギュレートによって提供されるＩＬ－２７シグナルが必要である。

本明細書で使用される場合、「トール様受容体」および「ＴＬＲ」という用語は、病原体関連分子パターンを認識し、自然免疫における重要なシグナル伝達要素として作用する、高度に保存された哺乳類タンパク質のファミリーの任意のメンバーを指す。ＴＬＲポリペプチドは、ロイシンリッチリピートを持つ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＬＲシグナル伝達に関与する細胞内ドメインを含む特徴的な構造を共有する。

「トール様受容体４」および「ＴＬＲ４」という用語は、公的に利用可能なＴＬＲ４配列と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸またはポリペプチドを指す。
適切なＴＬＲ４アゴニストはＬＰＳである。

「トール様受容体９」および「ＴＬＲ９」という用語は、公的に利用可能なＴＬＲ９配列と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸またはポリペプチドを指す。適切なＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。

活性化した細胞はＩＬ－２７に曝露される。ＩＬ－２７への曝露は、ｉ２７－Ｂｒｅｇの増大を促進し、ｉ２７－Ｂｒｅｇの割合と量を効率的に継続的に増加させる。

本発明の方法は、哺乳類の疾患の治療に有用である。治療は免疫系の望ましい抑制をもたらすかもしれない。

本発明の方法は、ＧＶＨＤの治療、抑制、または予防に有用である。患者は、固形臓器または同種異系の骨髄または造血幹細胞の移植物を受容することができる。ＧＶＨＤの重症度を予防または軽減するために、本発明の哺乳類細胞の集団は、哺乳類が同種異系移植物を受容する前に哺乳類に投与される。あるいは、本発明の細胞のｉ２７－Ｂｒｅｇ集団を移植材料と混合して移植混合物を形成し、次いで移植混合物を哺乳類に投与することにより、ＧＶＨＤを予防または抑制することができる。この点に関して、移植材料は同種異系リンパ球を含むことができる。１つの実施形態では、移植された細胞は、ｉＰＳ細胞に由来する細胞（例えば、心臓細胞、膵臓細胞、網膜細胞）である。

本発明の哺乳類細胞の集団は、エクスビボで移植材料と混合することができる。「エクスビボ」とは、天然条件の変化を最小限に抑えた、生物の外の人工環境において、細胞または組織内か、細胞または組織上かで行われる方法を指す。対照的に、「インビボ」という用語は、通常の無傷の状態で生物内で行われる方法を指し、一方、「インビトロ」の方法は、通常の生物学的状況から単離された生物の成分を使用して行われる。

哺乳類細胞の集団は、薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）組成物の形状で投与することができる。前記組成物は、担体、好ましくは薬学的に（例えば、生理学的に許容される）担体、および哺乳類細胞の集団を含み得る。本発明の文脈内で任意の適切な担体を使用することができ、そのような多くの担体が当技術分野で知られている。担体の選択は、部分的には、組成物を投与することができる特定の部位および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されるであろう。前記組成物は、任意選択で無菌にすることができる。前記組成物は、保存のために凍結または凍結乾燥し、使用前に適切な滅菌担体で再構成することができる。前記組成物は、例えば、レミントン：薬局の科学および実践、第２１版、リッピンコットウィリアムズ＆ウィルキンス、ペンシルベニア州フィラデルフィア（２００１）に記載されている従来の技術に従って作成することができる。

哺乳類細胞の集団は、哺乳類に投与することができる（本明細書で先に定義したように）。好ましくは、哺乳類はマウスまたはヒトである。

本発明は、哺乳類の免疫系を抑制する方法を提供し、該方法は、本発明の哺乳類細胞の集団を必要とする哺乳類に投与することによって哺乳類の免疫系を抑制することを含む。したがって、本発明は、単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における自己免疫を抑制する方法を提供し、その後、前記哺乳類におけるインビボＩＬ－２７産生が人工的に高レベルに増加し、これにより、前記哺乳類では自己免疫が抑制される。ＩＬ－２７はインビボで急速に除去されるが、単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団の投与により、ｉ２７－Ｂｒｅｇの増殖とインビボでの持続的なＩＬ－２７分泌が可能になる。これは、ＩＬ－２７の直接投与に依存する可能性のある治療法に比べて明確な利点を提供する。

ＩＬ－２７およびＩＬ－３５は、ＩＬ－１２ファミリーのサイトカインの２つの免疫抑制メンバーである。ＩＬ－３５またはＩＬ－２７は自己免疫疾患の抑制に大きな期待を寄せられているが、サイトカイン、特にヘテロ二量体サイトカインを生物製剤として使用することの主な欠点は、半減期が比較的短く、生物活性が一過性であり、薬物動態学的特徴が予測できないことである。もう１つの重要な障害は、投薬の問題に関連する。ＩＬ－３５またはＩＬ－２７サブユニットタンパク質の結合は強くない（非共有結合）ため、ＩＬ－３５およびＩＬ－２７サブユニットタンパク質は容易に解離し、生物活性のあるｐ３５：Ｅｂｉ３またはｐ２８：Ｅｂｉ３ヘテロダイマーの疾患を改善するために投与または必要とされる有効量を確認することが困難になる。ｉ２７－Ｂｒｅｇの治療的使用は、ＢｒｅｇまたはＴｒｅｇ細胞によって産生される最も効果的なサイトカインであるＩＬ－１０、ＩＬ－２７、またはＩＬ－３５などの生物製剤の使用に比べていくつかの治療上の利点を提供する。ｉ２７－Ｂｒｅｇはインビボで増殖し、それによってレシピエント宿主組織でのＩＬ－２７の産生を持続させた。（ｉｉ）エクスビボで生成されたｉ２７－Ｂｒｅｇはインビボで増殖し、レシピエントリンパ球をＩＬ－１０、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５産生ＢｒｅｇおよびＴｒｅｇに再プログラムし、それによってレシピエント宿主組織におけるこれらの免疫抑制性サイトカインの産生を持続させることができる；（ｉｉｉ）自然免疫（ｉｎｎａｔｅ）ｉ２７－Ｂｒｅｇによる疾患抑制は、疾患を誘発する自己抗原による事前の活性化を必要とせず、自己免疫疾患に使用される疾患特異的Ｂｒｅｇ／Ｔｒｅｇ療法よりも潜在的な治療上の利点を提供する。

本明細書で使用される「自己免疫」という用語は、生物（例えば、ヒトまたはマウスなどの哺乳類）がそれ自体の構成部分を自己として認識できないことを指し、これは、生物自身の細胞および組織に対する免疫応答をもたらす。言い換えれば、自己免疫は「自己」抗原に対する適応免疫応答であり、宿主組織に損傷を与えることによって病状を媒介する炎症性サイトカインの産生、または補体媒介性疾患を引き起こす可能性のある「自己抗体」の産生によって特徴づけられる。

「自己免疫疾患」は、組織損傷が体の構成要素に対する体液性および／または細胞性免疫応答、またはより広い意味での自己に対する免疫応答に関連する疾患または障害のグループのいずれか１つを指す。病理学的免疫応答は、全身性または臓器特異的である可能性がある。たとえば、自己に対する免疫応答は、関節、皮膚、脳、ニューロンを保護するミエリン鞘、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、副腎、目（ブドウ膜炎など）、および卵巣に影響を与える可能性がある。免疫複合体の形成は、自己免疫疾患の病因と進行に関与する。免疫複合体形成の増加は、自己に向けられた抗体（自己抗体）の存在と相関する。自己抗体の存在は、免疫複合体の一部として、または抗原に結合していない（遊離抗体）で、組織炎症に寄与する場合がある。一部の自己免疫疾患では、遊離自己抗体の存在が疾患の病理に大きく影響する。自己免疫疾患の病因と進行の別の側面は、炎症性サイトカインの役割である。通常の状況下では、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）やインターロイキン－１（ＩＬ－１）などの炎症性サイトカインは、感染や細胞ストレスへの応答において保護的な役割を果たす。しかし、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１の慢性的および／または過剰な産生に起因する病理学的結果は、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、乾癬などの多くの自己免疫疾患の進行の根底にあると考えられている。自己免疫疾患に関与する他の炎症性サイトカインには、インターロイキン－６、インターロイキン－８、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が含まれる（例えば、米国特許第８，０８０，５５５号を参照）。

本発明の細胞集団および方法は、任意の自己免疫疾患に関連する自己免疫を抑制するために使用することができる。当技術分野で知られている８０を超える自己免疫疾患があり、その例には、多発性硬化症（ＭＳ）、インスリン依存性真性糖尿病、全身性紅斑性ループス（ＳＬＥ）、乾癬、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重力筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、脳脊髄炎、全身性自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、強皮症、および若年性関節炎）が含まれる。

自己免疫疾患の１つまたは複数の症状が、自己免疫疾患に冒された哺乳類（例えば、ヒト）において減少または軽減される場合、自己免疫は「抑制」される。症状の改善、悪化、退行、または進行は、任意の客観的または主観的な尺度によって決定することができ、その多くは当技術分野で知られている。当業者は、自己免疫疾患の症状が、疾患と、異常な免疫応答の位置とに基づいて変化することを理解するであろう。いくつかの自己免疫疾患に共通する症状には、例えば、倦怠感、筋肉および／または関節の痛み、筋力低下、発熱、腺の腫れ、炎症、感染症への感受性、体重の増減、アレルギー、消化器系の問題、血圧の変化、およびめまいを含む。

本発明の細胞集団および方法を使用して、膵臓の炎症を減少または抑制することができる。

本発明の細胞集団および方法は、ＡＭＤの症状を減少または抑制するために使用することができる。

本明細書で使用される場合、「治療」、「処置」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。

好ましくは、薬理学的および／または生理学的効果は治療的であり、すなわち、その効果は、疾患および／または疾患に起因する有害な症状を部分的または完全に治癒する。この目的のために、本発明の方法は、「治療上有効な量」の単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団を投与することを含む。「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。治療有効量は、病状、年齢、性別、および個体の体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団の能力などの要因に応じて変化し得る。

あるいは、薬理学的および／または生理学的効果は予防的であり得る、すなわち、その効果は、自己免疫疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する。この点に関して、本発明の方法は、自己免疫疾患の素因がある、またはそうでなければ発症するリスクがある哺乳類に、「予防的に有効な量」の単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団を投与することを含む。「予防的に有効な量」とは、所望の予防的結果（例えば、発病の予防または疾患の再燃の防止）を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。

本発明の単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団か、単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団かを含む組成物は、任意の適切な投与技術を使用して哺乳類に投与することができ、その多くは、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔内、舌下、または坐薬の投与を含み当技術分野で知られている。組成物は、好ましくは非経口投与に適する。本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、および腹腔内投与を含む。より好ましくは、組成物は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達を使用して哺乳類に投与される。

本発明の方法が、単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団を哺乳類に投与することを含む場合、単離されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞集団は、ＩＬ－２７を産生し、哺乳類の自己免疫を抑制するＢ細胞の生成を誘導するのに十分な用量で哺乳類に投与される。治療効果または予防効果は、治療を受けた患者を定期的に評価することで監視できる。数日以上の反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が繰り返される。しかしながら、他の投与計画が有用であり得、そして本発明の範囲内である。所望の投与量は、前記組成物の単回ボーラス投与、前記組成物の複数回ボーラス投与、または前記組成物の持続注入投与によって送達することができる。

哺乳類（例えば、ヒト）に投与される細胞の典型的な量は、例えば、５００，０００から１億個の細胞の範囲であり得るが、この例示的な範囲より下または上の量は、本発明の文脈において適切であり得る。例えば、細胞の１日量は、約５０万から約５０００万個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約１５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約３５００万個の細胞、約４５００万個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって定義される範囲、好ましくは約１０００万から約１億細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって定義される範囲）、より好ましくは、約１０００万個の細胞から約５０００万個の細胞（例えば、約１２００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約３５００万個の細胞、約４５００万個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって定義される範囲）であり得る。

本発明は、自己免疫疾患のための他の既存の治療と組み合わせて利用することができる。例えば、本発明の細胞集団は、本明細書に開示される自己免疫疾患などの自己免疫疾患の治療または予防のために、免疫抑制剤または免疫調節剤その他の抗炎症剤と組み合わせて投与することができる。この点で、本発明の方法は、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、メトトレキサート、Ｄ－ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、およびグルココルチコイド）、と組み合わせて使用することができる。）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６）、リンパ球再循環のモジュレーター（例えば、ＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０アナログ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、４０－０－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、またはＴＡＦＡ－９３）、免疫抑制特性を有するアスコマイシン（例えば、ＡＢＴ－２８１、ＡＳＭ９８１など）、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプレン、メトトレキサート、レフルノミド、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５－デオキシスペルグアリン、またはその免疫抑制ホモログ、類似体または誘導体、免疫抑制モノクローナル抗体（例えば、 ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの白血球受容体、またはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体）、他の免疫調節化合物、接着分子阻害剤（例えば、ＬＦＡ－１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ－１または－３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ－４アンタゴニスト、またはＶＬＡ－４アンタゴニスト）、化学療法剤薬剤（例えば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチナム、ドキソルビシン、または５－フルオロウラシル）、抗ＴＮＦ剤（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０などのＴＮＦに対するモノクローナル抗体、または、ＥＮＢＲＥＬ（商標）（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）またはＰＥＧ－ＴＮＦ－ＲＩのようなＴＮＦ－ＲＩまたはＴＮＦ－ＲＩＩに対する受容体コンストラクト、向炎症性サイトカインの遮断薬、ＩＬ－１遮断薬（例えば、ＫＩＮＥＲＥＴ（商標）（アナキンラ）またはＩＬ－１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ ８８５、およびＩＬ－６遮断薬）、ケモカイン遮断薬（例えば、プロテアーゼの阻害剤または活性化因子）、抗ＩＬ－１５抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＣＤ２０抗体、ＮＳＡＩＤ、および／または抗感染剤と組み合わせて使用することができる。

本発明は、インターロイキン－３５（ＩＬ－３５）を産生するＢ細胞の投与と組み合わせて利用することができる。ＩＬ－３５を産生するＢ細胞（ｉ３５－Ｂｒｅｇ）は、哺乳類に、本発明の細胞集団とともに逐次的に（前または後に）または同時に投与することができる。

本発明の実施形態は、単独で、または１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本発明の特定の非限定的な実施形態が、１～２６の番号が付けられた実施形態として以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個別に番号が付けられた実施形態のそれぞれは、先行または後続の個別に番号が付けられた実施形態のいずれかと使用または組み合わせられ得る。したがって、本発明は、これらの実施形態のすべての組み合わせを提供し、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。

（１）
（ａ）阻害性細胞表面受容体リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）を発現し、かつ、
（ｂ）インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）を分泌する、
約７５％以上のＢ－１ａ制御性細胞を含む、哺乳類細胞の単離された集団。

（２） 前記制御性細胞が阻害性細胞表面受容体糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）をさらに発現する、実施形態（１）に記載の哺乳類細胞の集団。

（３） 前記制御性細胞が阻害性細胞表面受容体ＯＸ４０をさらに発現する、実施形態（１）または（２）に記載の哺乳類細胞の集団。

（４） 制御性細胞が阻害性細胞表面受容体細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）をさらに発現する、実施形態（１）～（３）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団。

（５） 実施形態（１）～（４）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団を調製する方法であって、
（ａ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、哺乳類末梢リンパ組織、哺乳類臍帯血、哺乳類腹水、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、または哺乳類骨髄のサンプルから分化クラスター５陽性（ＣＤ５＋）発現細胞を単離して、単離されたＣＤ５＋発現細胞を提供すること、
（ｂ）前記単離されたＣＤ５＋発現細胞を細胞培養培地で培養して、培養細胞を提供すること、
（ｃ）前記培養細胞をＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）またはＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）アゴニストで活性化して、活性化細胞を提供すること、および
（ｄ）前記活性化された細胞をＩＬ－２７に曝露することを含む、方法。

（６） 哺乳類の免疫系を抑制する方法であって、実施形態（１）～（４）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団を哺乳類に投与することを含む、方法。

（７） インターロイキン－３５（ＩＬ－３５）を産生するＢ細胞を前記哺乳類に逐次的または同時に投与することをさらに含む、実施形態（６）に記載の方法。

（８）投与が前記哺乳類の疾患を治療する、実施形態（６）または（７）に記載の方法。

（９） 前記哺乳類が自己免疫疾患を有する、実施形態（６）～（８）のいずれか１つに記載の方法。

（１０） 前記自己免疫疾患が眼の疾患である、実施形態（９）に記載の方法。

（１１） 前記自己免疫疾患が中枢神経系の疾患である、実施形態（９）に記載の方法。

（１２） 前記自己免疫疾患が脳の疾患である、実施形態（９）に記載の方法。

（１３） 前記自己免疫疾患がブドウ膜炎である、実施形態（９）に記載の方法。

（１４） 前記自己免疫疾患が脳脊髄炎である、実施形態（９）に記載の方法。

（１５） 前記哺乳類が多発性硬化症を有する、実施形態（６）～（８）のいずれか１つに記載の方法。

（１６） 投与が膵臓の炎症を抑制する、実施形態（６）～（８）のいずれか１つに記載の方法。

（１７） 前記哺乳類が同種異系の骨髄または造血幹細胞の移植物を受容している、実施形態（６）または（７）に記載の方法。

（１８） 前記哺乳類が同種異系の固形臓器移植物受容している、実施形態（６）または（７）に記載の方法。

（１９） 前記哺乳類が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する、実施形態（１７）または（１８）に記載の方法。

（２０） 前記哺乳類が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を有する、実施形態（６）～（８）のいずれか１つに記載の方法。

（２１） 移植片対宿主病を有する哺乳類を治療する方法であって、移植片対宿主病を有する哺乳類に実施形態（１）～（４）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団を投与することを含む方法。

（２２）前記哺乳類が、前記哺乳類細胞の集団の投与の前に同種異系の骨髄または造血幹細胞の移植物受容している、実施形態（２１）に記載の方法。

（２３） 前記哺乳類が、前記哺乳類細胞の集団の投与の前に同種異系の固形臓器移植物受容している、実施形態（２１）に記載の方法。

（２４） 哺乳類における移植片対宿主病の重症度を予防または軽減する方法であって、哺乳類が同種異系移植物を受容する前に、実施形態（１）～（４）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団を哺乳類に投与することを含む方法。

（２５） 前記同種異系移植物が同種異系骨髄または造血幹細胞の移植物である、実施形態（２４）に記載の方法。

（２６） 前記同種異系移植物が同種異系固形臓器移植物である、実施形態（２４）に記載の方法。

（２７） 哺乳類における移植片対宿主病の重症度を予防または軽減する方法であって、
（ａ）実施形態（１）～（４）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団を移植材料と混合して、移植混合物を形成すること、および
（ｂ）前記移植混合物を哺乳類に投与することを含む、方法。

（２８） 前記移植材料が同種異系リンパ球を含む、実施形態（２７）に記載の方法。

（２９） 前記哺乳類がヒトである、実施形態（１）～（４）のいずれか１つに記載の哺乳類細胞の集団、または、実施形態（５）～（２８）のいずれか１つに記載の方法。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、もちろん、その範囲を制限するものとして解釈すべきではない。

以下の材料および手順は実施例１～５で使用した。

マウスおよびヒトＰＢＭＣと、ヒト臍帯血とのＣＤ１９^＋ Ｂ細胞。
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＩＬ－２７ＲαＫＯマウスは、ジャクソンラボラトリー（メイン州バーハーバー）から購入した。雌のマウスを使用し、記載されているすべての研究のためにマウスをランダム化した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＮＩＨ輸血局が管理する国立衛生研究所（ＮＩＨ）血液銀行から入手した。初代ヒト臍帯血ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（バンクーバー、カナダ）から購入した。

マウスおよびヒトＢ細胞の分離。
正常なヒト被験者のＰＢＭＣは、市販のリンパ球分離培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、バージニア州マナッサス）を使用した密度勾配遠心分離によってバフィーコートから分離した。ヒトＣＤ１９^＋ Ｂ細胞は、抗ＣＤ１９抗体結合磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）を使用して選別した。マウスＢ２細胞は、Ｂ細胞分離キット（１３０－０９０－８６２）、ＣＤ１９マイクロビーズ（１３０－０５２－２０１）、および形質細胞分離キット（１３０－０９２－５３０）（すべてＭｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を使用して脾臓から分離した。Ｂ１細胞はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹腔から分離した。一部のマウスは、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、ＬＰＳで免疫化した。Ｂ－１ａ細胞の場合、分離は、メーカーが推奨するとおり、Ｂ－１ａ Ｃｅｌｌ ＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ；カタログ番号１３０－０９７－４１３）を使用して２段階の手順で実行した。簡潔には、腹腔からのＢ－１ａ細胞は、ビオチン結合非Ｂ－１ａ抗体のカクテルで標識した磁気ビーズとＢ－１ａ細胞とからなるＭＡＣＳ（商標）磁気細胞カラムでネガティブに選択した。次に、Ｂ－１ａ細胞は、Ｂ－１ａ特異的抗体と結合した磁気ビーズでポジティブに選択した。

免疫蛍光染色および共焦点イメージング分析
ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞は、ＩＬ－２７の存在下または非存在下、ＬＰＳまたは抗ＣＤ４０／抗ＩｇＭ抗体で刺激することによりインビトロで４８時間活性化した。細胞を固定し、５％ヤギ血清でブロックした後、蛍光標識抗ｐ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、マサチューセッツ州ウォルサム）または抗Ｅｂｉ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）とインキュベートした。細胞を洗浄し、４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）５６８－、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）４８８－、またはＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）６４７標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートし、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパスコーポレーション、東京、ＪＰ、またはＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ ｓ ＡＧ）（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２８７：３０４３６－３０４４３（２０１２）を参照せよ。）。

実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）
ＥＡＵは、を含む０．２ｍｌエマルジョン（結核菌Ｈ３７ＲＡ株（２．５ｍｇ／ｍｌ）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と体積比１：１）中の光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）_{６５１－６７０}ペプチドによるＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＩＬ－２７ＲαＫＯマウスの能動免疫によって誘導した。マウスはまた、免疫化と同時に百日咳菌毒素（１μg／マウス）を投与した。マウスは、免疫化の第－１日および免疫化後第１２日まで隔日にＩＬ－２７（１００ｎｇ／マウス）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の腹腔内注射により処置した。各研究では、グループごとに８匹のマウスを使用し、マウスの年齢と性別を一致させた。臨床疾患は、眼底検査および組織学によって確立され、採点された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０：６３３－６４１（２０１４）、およびＯｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８７：３３３８－３３４６（２０１１）を参照せよ。）。同軸照明を備えた双眼顕微鏡を使用して、眼の疾患の重症度を調べた。組織学用の眼は、免疫化の２１日後に除核し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、垂直瞳孔視神経面で連続的に切断した。すべての切片はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。

眼底検査
眼底検査は、ＥＡＵ誘導後第１０～２１日に実施した。簡潔には、全身麻酔の全身投与（ケタミン（１．４ｍｇ／マウス）およびキシラジン（０．１２ｍｇ／マウス）の腹腔内注射）に続いて、１％トロピカミド点眼液（Ａｌｃｏｎ Ｉｎｃ．、テキサス州フォートワース）の局所投与により瞳孔を拡張させた。眼底画像は、小型齧歯動物用のＭｉｃｒｏｎ ＩＩＩ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、カリフォルニア州）またはＮｉｋｏｎＤ９０デジタルカメラと組み合わせた改良型ＫａｒｌＳｔｏｒｚ獣医耳内視鏡（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， （２０１２）、上記、およびＰａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４８：２７６９－２７７４（２００７）を参照せよ。）を使用してキャプチャした。主観的な偏見を避けるために、マスクされた観察者により、マウスのアイデンティティの知識なしに眼底写真の評価が行われた。内視鏡を配置し、上、下、外側、および内側の視野から観察することにより、各眼から少なくとも６つの画像（２つの後部網膜中心像、４つの周辺網膜像）を撮影し、個々の病変を特定、マッピング、および記録した。網膜炎症の臨床評価システムが使用された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，８７：３１９－３２６（２００８）、およびＣｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．，３：２４７－２５５（１９９０）を参照せよ。）。

スペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）によるマウス網膜のイメージング
光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）は、生きている動物のさまざまな眼の構造の内部微細構造の視覚化を可能にする非侵襲的手法である。８２０ｎｍの中心波長広帯域光源を備えたＳＤ－ＯＣＴシステム（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州モリスビル）を、対照またはＥＡＵマウスの眼のインビボ非接触イメージングに使用した。マウスに麻酔をかけ、瞳孔を上記のように拡張させた。次に、水平または垂直スキャン走査（ｓｃａｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ）を可能にする簡単に回転できる調整可能なホルダーを使用して、マウスを固定した。各スキャンは少なくとも２回実行し、毎回再調整する。スキャンの寸法（深さと横方向の範囲）は、最適な信号強度とコントラストが達成されるまで調整した。網膜の厚さは、システムソフトウェアを使用して、同じ眼からの水平スキャンと垂直スキャンの両方から得られたすべての画像の網膜中心領域から測定し、平均化した。既知の方法を使用して、システムソフトウェアの網膜の厚さを決定した（Ｇａｂｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ５２： ２２５０－２２５４ （２０１１）を参照せよ。）。

網膜電図（ＥＲＧ）
ＥＲＧ記録の前に、マウスを一晩暗順応させ、薄暗い赤色の照明の下で実験を行った。ケタミン（１．４ｍｇ／マウス）およびキシラジン（０．１２ｍｇ／マウス）の単回腹腔内注射でマウスを麻酔し、瞳孔は０．５％トロピカミドおよび０．５％フェニレフリン塩酸塩を含むＭＩＤＲＩＮ（商標）Ｐ（参天製薬、大阪、日本）で拡張した。ＥＲＧは、光刺激を生成および制御する網膜電図コンソール（Ｅｓｐｉｏｎ Ｅ２；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ、マサチューセッツ州ローウェル）を使用して記録した。暗順応ＥＲＧは、ガンツフェルトドームでシングルフラッシュを使用して記録し、強度－４～１ ｌｏｇ ｃｄ ｓ／ｍ^２、６ステップで送達した。明順応ＥＲＧは２０ｃｄ／ｍ^２バックグラウンドで得られ、光刺激は５ステップで０．３～３０ ｃｄ ｓ／ｍ^２で開始した。ゴニ雄コピックプリズムソリューション（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｓ、テキサス州フォートワース）が良好な電気的接触を提供し、角膜の水分を維持するために使用した。参照電極（金線）を口に入れ、接地電極（皮下ステンレス鋼針）を尾の付け根に配置した。信号は、１ｋＨｚのレートで差動増幅およびデジタル化した。自動および手動の方法を使用して、主要なＥＲＧコンポーネント（ａ波およびｂ波）の振幅を測定した（Ｅｓｐｉｏｎソフトウェア；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ、マサチューセッツ州ローウェル）。ＥＲＧ記録の直後に、眼底の画像化が前述のように実行した。

網膜細胞の分離
ＥＡＵ中に血液網膜関門を通過する炎症細胞を特徴づけるために、マウスを麻酔し、１×ＰＢＳで灌流した。解剖顕微鏡下で網膜を即座に分離するために、除核された眼を培養培地（ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ １６４０））を含むペトリ皿に入れた。眼は角膜輪部に沿って切断し、水晶体と角膜は注意深く取り除かれた。次に、網膜を剥がし、付着した視神経を除去してから、新たに単離した網膜を、１０μg／ｍｌ ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中のコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間消化した。インキュベーション中、細胞を３０分ごとに断続的にピペットで移し、ＲＰＭＩ １６４０培地中の５～１０倍量の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で消化反応を停止させた。細胞を完全ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、ＶＩ－ＣＥＬＬ（商標）ＸＲ細胞生存率アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア）を使用して細胞をカウントした。

細胞の共培養
ＥＡＵ、Ｂ－１ａ、マクロファージ、および樹状細胞を有するマウスのリンパ節および脾臓から単離したブドウ膜形成細胞は、第１７日にＥＡＵ免疫化マウスから単離した。Ｂ－１ａ、マクロファージ、および樹状細胞は、磁気カラムビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）によって分離した。共培養実験は、トランスウェルシステム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で実施した。下部ウェルにブドウ膜形成細胞またはＢ－１ａ細胞（５×１０^５個）を播種した後、マクロファージまたは樹状細胞（５×１０^５個）を上部チャンバー（孔径：０．４ ｐｍ）に播種し、ＩＲＢＰ_{６５１－６７０}（２０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。共培養の７２時間後、フローサイトメトリーおよびチミジン取り込みアッセイによる分析のために細胞を回収した。ヒトＢ－１ａ細胞の機能分析のために、健康な対照からのＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ Ｂ１細胞を細胞選別によって精製し、ｒｈＩＬ－２７（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、７２時間抗ＣＤ４０（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ）で刺激した。

実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
ＥＡＥは、熱殺菌し粉砕した結核菌Ｈ３７ＲＡ株２．５ ｍｇ／ｍｌを含む、ＣＦＡエマルジョン中の２００μgミエリンオリゴデンドロ部位糖タンパク質ペプチド３５－５５（ＭＯＧ_{３５－５５}）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）による皮下免疫によって誘導した。マウスはまた、０．１％正常マウス血清を含む１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地百日咳菌毒素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）０．３μgを第０日および免疫化後第２日に２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。一部のマウスは、ＭＯＧ_{３５－５５}による免疫化と同時に、および免疫化後第１２日まで隔日に、ＩＬ－２７（１００ｎｇ／マウス）を投与した。対照群またはＩＬ－２７処置群（ｎ＝１２）は、免疫化の第１７日に安楽死させた。マウスをモニターし、マスクされた観察者が疾患の重症度を毎日評価した。ＥＡＥの臨床徴候は、以下の尺度に従って等級分けした。０、臨床症状なし。１、巧緻運動障害、失禁または脱力性膀胱、たるんだ尾；２、軽度の対麻痺（運動開始障害（ｔｒｏｕｂｌｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｍｏｖｅｍｅｎｔ））；３、中等度の対麻痺（後肢の脱力）；４、完全な前肢および後肢の麻痺；５、瀕死状態（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０：６０７０－６０７６（２００８）を参照せよ。）。脊髄と脳は免疫化の１７日後に採取し、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。養子移植研究では、ＩＬ－２７の有無にかかわらず処置したＥＡＥのマウスを免疫化後第１０日に屠殺し、脳炎誘発細胞の養子移植によるＥＡＥの受動的誘導のドナーとして使用した。脾臓細胞を単離し、ＭＯＧ_{３５－５５}ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍｌ）でＩＬ－２７の存在下または非存在、３日間刺激し、ナイーブ同系レシピエントに静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。マウス（１０×１０^６個／マウス；ｎ＝１２）。養子細胞移植の２０日後、疾患を評価し、レシピエントマウスから脳または脊髄組織を回収し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、組織病理学的検査のために切片にした。中枢神経系（ＣＮＳ）浸潤物を脳および脊髄から回収し、リンパ球／単核細胞をコラゲナーゼ消化とそれに続く分析のためのパーコール勾配によって分離した。

Ｂ－１ａ細胞の養子移植
Ｂ－１ａ細胞は、ドナーマウスの腹腔から分離し、磁気ビーズを使用して分類した。ＬＰＳ（１μg／ｍｌ）を含む完全ＲＰＭＩ １６４０で４８時間Ｂ－１ａ細胞を培養し、洗浄（２×）して残留ＬＰＳを除去し、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＩＬ－２７ＲαＫＯマウスに養子移植（５×ｌ０^５個）した。

ＬＰＳ誘発性炎症のインビボモデル
ＬＰＳ（５０μｇ／マウス）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射し、一部のマウスは、静脈注射によるＬＰＳ注射の１時間前にＩＬ－２７（１００ｎｇ／マウス）を投与した。対照群およびＩＬ－２７処置群（ｎ＝５）のマウスは、注射の２４時間後に安楽死させ、脾臓細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析に供した。

増殖アッセイ
ブドウ膜形成細胞またはＢ－１ａ細胞は、免疫化後第１７日にＩＲＢＰ免疫化Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＩＬ－２７ＲαＫＯマウスから採取した。前記細胞は、Ｂ－１ａ、樹状細胞、およびマクロファージの存在下または非存在下、ＩＲＢＰペプチドを用いてインビトロで７２時間再刺激した。インビトロ研究のために、ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞をＩＬ－２７の存在下または非存在下、抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩｇＭ抗体（５μｇ／ｍｌ）で刺激した。培養の最後の２４時間、細胞に^３Ｈ－チミジン（０．５μＣｉ／１０μｌ／ウェル）をパルスした。提示したデータは、５つのレプリケート培養の応答の平均ＣＰＭ±Ｓ．Ｅ．Ｍである。

ＦＡＣＳによるサイトカイン発現リンパ球の検出
ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞（＞９８％）は、ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）で刺激されるか、上述のとおり抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩｇＭ抗体（５μｇ／ｍｌ）で活性化された。細胞内サイトカイン検出のために、細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（５０ｎｇ／ｍｌ）／イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）で５時間再刺激した。ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ（商標）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）が最後の３時間に追加され、細胞内サイトカイン染色は、推奨されるＢＤ ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）キット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して実行された。ＦＡＣＳ分析はタンパク質特異的モノクローナル抗体および対応するアイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用するＭＡＣＳＱＵＡＮＴ（商標）アナライザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で実行された（Ａｍａｄｉ－Ｏｂｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１３：７１１－７１８（２００７）、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０：６３３－６４１（２０１４）を参照せよ。）。ＦＡＣＳ分析は、蛍光色素と結合したモノクローナル抗体（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ１３８、およびＣＤ１１ｂを含む）で染色されたサンプルで実行された。細胞は色補正され、象限ゲートは、０．３％未満のバックグラウンドを持つアイソタイプ対照を使用して設定された。生細胞は、側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）分析に供された。

制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）および制御性Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）の特性評価
未免疫化ＥＡＥまたはＥＡＵマウスの脳、脊髄、網膜、腹腔、血液、脾臓、または流入領域リンパ節（ＬＮ）から分離した初代Ｂ細胞は、ＣＤ１９^＋ 細胞について分類され、表面および細胞内ＦＡＣＳ分析に使用した。一部の細胞は、ＬＰＳ、ＩＲＢＰ_{６５１－６７０}－ペプチドおよび抗ＣＤ４０抗体、ＭＯＧ_{３５－５５}－ペプチドおよび抗ＣＤ４０で再活性化された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．，２０：６３３－６４１（２０１４）、およびＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ。、８：１２５８（２０１７）を参照せよ。）。細胞内サイトカイン検出のために、細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）で５時間再刺激した。ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ（商標）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を最後の１時間に追加し、推奨されるＢＤ ＢＤ ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）キット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して細胞内サイトカイン染色を行った。ＦＡＣＳ分析は、ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ（商標）アナライザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で、タンパク質特異的モノクローナル抗体と対応するアイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して前述したように、タンパク質特異的モノクローナル抗体と対応するアイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して実行した。死細胞を死細胞排除色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＤｙｅＥＦＬＵＯＲ（商標）４５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、生細胞を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）分析に供した。ＢｒｅｇおよびＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、Ｂ２２０、ＣＤ１ｄ、ＩＬ－１０、ｐ２８、ｐ３５またはＥｂｉ３の発現の分析によって特徴づけられた。ＦＡＣＳ分析は、蛍光色素と結合したモノクローナル抗体で染色された細胞で実行され、死んだ細胞は除外され、細胞の各チューブは色補正された。象限ゲートは、バックグラウンドが０．５％未満のアイソタイプ対照を使用して設定された。

ＣＲＩＳＰＲＪＣａｓ９を介した遺伝子欠損
既知の手法（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．，１１：７８３－７８４（２０１４）を参照せよ。）を使用してｓｇＲＮＡが生成され、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２、ｐＭＤ２．Ｇにクローン化された。標的上の結合効率と標的外のヒットの確率によってｓｇＲＮＡ部位をラック（ｒａｃｋｉｎｇ）するオンラインツールであるＣＲＩＳＰＲＳＣＡＮによって、ｓｇＲＮＡは選択された。ＩＬ－２７の場合、３つのｓｇＲＮＡが選択され、Ｕ６プロモーターによって駆動されるＳｐＣａｓ９ｓｇＲＮＡ足場を運ぶレンチウイルスベクターにクローン化された。ｓｇＲＮＡ配列は以下のとおりであった：ｓｇｐ２８標的部位１、５’－ＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＡＣＣ ＡＣ ＡＣＴ－３’（配列番号１）、部位２；５’－ＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴ ＣＴＣ－３’（配列番号２）；部位３ ５’－ＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号３）。Ｅｂｉ３ターゲティングでは、同じレンチウイルスベクターを３つのｓｇＲＮＡのクローニングに使用した。５’－ＧＴＣＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣ ＡＴＣＧＧＧ－３’（配列番号４）；部位２ ５’－ＴＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＡＣＴＡＡＣＴ－３’（配列番号５）；部位３ ５’－ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣ－３’（配列番号６）。ＩＬ－２７を削除するために、精製されたＢ－１ａ細胞またはマクロファージにｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスクローンを形質導入した。感染の２日後、細胞をＬＰＳで４８時間活性化し、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡで分析した。

ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌の検出
ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞またはＢ－１ａ細胞は、ＬＰＳ、抗ＣＤ４０と抗ＩｇＭおよび／またはＩＬ－２７の存在下または非存在下、インビトロで活性化された。培養４８時間後に上清を回収した。ＩＬ－２７およびＩＬ－３５は、マウスＩＬ－２７またはＩＬ－３５に特異的なヘテロ二量体ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して定量した。ＩＬ－１７またはＩＬ－１０は、製造者が推奨するとおりにＲ＆Ｄシステムのキットを使用して定量化した。

ＲＮＡ抽出、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析、およびＰＣＲ
ＲＮＥＡＳＹ（商標）ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を使用して、腹腔または脾臓から全ＲＮＡを単離した。既知の技術に従って、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ－ＰＣＲおよびｑＰＣＲ分析を行った（Ａｍａｄｉ－Ｏｂｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１３：７１１－７１８（２００７）を参照せよ。）。ＲＴ－ＰＣＲ分析に使用される各遺伝子特異的プライマー対は、少なくとも1つのイントロンにまたがっている。ｑＰＣＲに使用される以下のプライマーおよびプローブはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した：ＩＲＦ８（Ｍｍ＿００４９２５６７）、ＩＲＦ４（Ｍｍ＿００５１６４３１）、ＢＣＬ６（Ｍｍ＿００４７７６３３）、Ｂｌｉｍｐｌ（Ｍｍ＿００４７６１２８）、Ｐａｘ５（Ｍｍ＿００４３５５０１）、Ｌａｇ－３（Ｍｍ＿０１１８５０９１ ）、ＰＤ－１（Ｍｍ＿００４３５５３２）、ＩＬ－ ２７（Ｍｍ＿００４４６１１６２）、ＩＬ－１２ａ（Ｍｍ＿００４３４１６９）、ＩＬ－１０（Ｍｍ＿００４３９６１４）、ＩＬ－２７Ｒα（Ｍｍ＿００４９７２５９）、ｐ２１（Ｍｍ＿００８１７６９９）、ｐ２７（Ｍｍ＿００４３８１６８）、Ｃｄｋ１（Ｍｍ＿００７７２４７２）、Ｃｄｋ２（Ｍｍ＿００４４３９４７）、Ｃｄｋ４（Ｍｍ＿００７２６３３４）。ｍＲＮＡ発現はＧＡＤＰＨ（Ｍｍ＿９９９９９９１５）遺伝子のレベルに正規化された。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析では、サンプルあたり合計１００ｎｇのＲＮＡを使用した。カスタムｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現ＣｏｄｅＳｅｔ免疫学パネルが使用された。データはハウスキーピング遺伝子を使用して正規化され、ｎＳｏｌｖｅｒＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン３で分析された。

免疫沈降およびイムノブロッティング
全細胞溶解物は、既知の技術に従って調製された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．，４０：９７６－９８２（１９９９）を参照せよ）。清澄化した溶解物または細胞上清を、既知の技術に従ってプロテインＧ－セファロースビーズに事前に結合した抗体で免疫沈降させた（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：３０８８８－３０８９７（２０１４）を参照せよ。）。免疫沈降物はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、ブロットは特定の抗体でプローブされた。以下の抗体を免疫沈降および／またはウエスタンブロッティングに使用した：ｐ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｂｉ３、およびβ－アクチン（Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。免疫前血清を対照として並行して使用し、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用してＨＲＰコンジュゲート2次Ｆ（ａｂ’）２（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でシグナルを検出した。

ウエスタンブロッティング分析
全細胞溶解物の調製およびウエスタンブロット分析の実施は、既知の技術に従って実施した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．，２０：６３３－６４１（２０１４）およびＥｇｗｕａｇｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：３１８１－３１８７（２００２）を参照せよ）。細胞抽出物（２０～４０μｇ／レーン）を還元状態の１０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画し、ｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ｐ２８、ｐ３５、Ｅｂｉ３、ＩＬ－２７Ｒα、ＧＰ１３０、ＩＲＦ８またはβ－アクチン（サンタクルスバイオテクノロジーおよびセルシグナリングテクノロジー、マサチューセッツ州ダンバーズ）に特異的な抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った。免疫前血清を対照として並行して使用し、ＥＣＬ－ＰＬＵＳシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してＨＲＰ結合2次Ｆ（ａｂ’）２ Ａｂ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でシグナルを検出した。各ウエスタンブロッティング分析を少なくとも３回繰り返した。

クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析
ＣｈＩＰアッセイは、ＥＺ－ＣＨＩＰ（商標）クロマチン免疫沈降キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して実施した。Ｂ細胞をＩＬ－２７の存在下または非存在下、ＬＰＳで活性化し、ＤＮＡ－タンパク質複合体を最終濃度１％で培地に新鮮なホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することにより、１０分間架橋し、その後１３５ｍＭ グリシンでクエンチングした。次に、細胞を冷ＰＢＳ（２×）で洗浄し、溶解した（ＥＺ－ＣＨＩＰ（商標）溶解バッファー） １５秒のバーストで超音波処理（５×）する（Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ １０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの出力５）。次に、溶解物をプロテインＧ－アガロースで１時間清澄化し、ペレット化し、対照ＩｇＧまたは抗ＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに一晩インキュベートした。抗体をインキュベートする前に、インプットサンプルを溶解物から取り出し、抽出するまで－８０℃で保存した。免疫沈降は、製造元の指示（ＥＺ－ＣＨＩＰ（商標））に従って実行した。免疫沈降および入力されたＤＮＡは、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の結合活性を検出するために、プライマーを使用してＰＣＲおよびｑＰＣＲに供された。ＩＬ－２７ｐ２８遺伝子プロモーターのプライマー（５’－ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡ－３’（配列番号７）および５’－ＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＡＧＧＧＧＧＧＴＣＴＴＡＴＡＣＴ－３’（配列番号８））は、－１３４から－３０３であり、ＳＴＡＴ結合モチーフＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡ ７７ ＡＣＧＴＴ（配列番号９）である。ＥＢＩ３遺伝子のプロモーター領域のプライマー（５’－ＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴ－３’（配列番号１０）および５’－ＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＧＡ－３’（配列番号１１））は－１から－１５０であり、ＳＴＡＴ結合モチーフはＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＣ（配列番号１２）である。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは、よく知られた手順に従って実行した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：１２６－１３７（１９９６）を参照せよ。）。ＡＰ１－ＩＲＦ－１複合要素（ＡＩＣＥ）５’ＴＧＡｎＴＣＡ／ＧＡＡＡ－３’（配列番号１３）からのモチーフを含む2本鎖オリゴヌクレオチドを、クレノウポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ）を使用したフィルイン反応によって［α－Ｐ^３２］ ｄＡＴＰまたは（ａｌｐｈａ－３２Ｐ）ｄＧＴＰ（３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（ＰｅｒｋｉｎＥ標識した。ｌｍｅｒ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）で標識した。選別されたＣＤ１９^＋ Ｂ細胞をＩＬ－２７（２０μg／ｍｌ）の存在下または非存在下、ＬＰＳ（１μg／ｍｌ）で３日間刺激し、既知の手順（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：１２６－１３７（１９９６）を参照せよ。）に従って、核抽出物を以下のプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで調製した：２μＭ ロイペプチン、２μＭ ペプスタチン、０．１μＭ アプロチニン、１ｍＭ ［４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド、塩酸塩］、０．５ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、および１μＭ Ｅ－６４［Ｎ－（Ｎ－ｌ－トランス－カルボキシオキシラン－２－カルボニル）－１－ロイペプチン］アグマチン。タンパク質レベルは推奨されるＢＣＡ法で測定し、抽出物は使用するまで－７０℃で保存した。ＤＮＡ－タンパク質結合反応は、５μｇの核タンパク質と１μｇの2本鎖ポリ（ｄＬＣ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、バルセロナ、スペイン）、１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．９）、６０ｍＭ ＫＣＩ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１２％グリセロール、２．５ｍＭ ＭｇＣｌを含む２０μｌ混合物で行った。氷上で１５分間インキュベートした後、サンプルを１μｌ Ｐ^３２標識プローブ（１５，０００ｃｐｍ）で室温で２０分間、さらにインキュベートし、０．２５ｘＴｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡバッファー中の５％ネイティブポリアクリルアミドゲルで分画した。スーパーシフト分析では、^３２Ｐ標識プローブを追加する前に、抽出物を塩基性ロイシンジッパー転写因子（ＢＡＴＦ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｊｕｎ Ｂ、Ｊｕｎ Ｄ、ＩＲＦ－４、ＩＲＦ－８またはＩＲＦ－１（Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に特異的な１μｌの抗体とプレインキュベートした。

近接ライゲーションアッセイ
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）は、Ｄｕｏｌｉｎｋ ＰＬＡキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用して実行した。活性化されたＢ細胞をスライドに付着させ、ブロッキング溶液で１時間ブロックした後、マウス抗ｐ２８（ウサギ）および抗Ｅｂｉ３（マウス）1次抗体とともに一晩インキュベートした。次に、1次抗体に結合するオリゴヌクレオチド標識２次抗体（ＰＬＡプローブ）の対を追加し、１時間インキュベートした後、ハイブリダイズするコネクターオリゴを含むライゲーション溶液を追加した。次に、近接した（４０ｎｍ以内の）ＰＬＡプローブが相互作用し、コネクターオリゴにライゲーションされた。得られた閉じた環状ＤＮＡテンプレートは、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅された。次に、アンプリコンおよびｐ２８：Ｅｂｉ３ヘテロダイマーの反復配列にハイブリダイズした蛍光色素に結合した相補的検出オリゴを、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、ドイツ、オーバーコッヘン）によって個別の蛍光スポットとして検出する。

ＲＮＡ－Ｓｅｑと分析
ＲＮＡ－Ｓｅｑの場合、ｍＲＮＡはｏｌｉｇｏ－ｄＴビーズによって分離され、ライブラリは標準のＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．ライブラリプロトコル（キットＲＳ－１２２－２１０１ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ＬＴ Ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐキット、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、 ＣＡ）。ライブラリは、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）でシーケンスされた。遺伝子の相対的な存在量は、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅを使用してＲｅａｄ Ｃｏｕｎｔで測定した。統計分析は、サンプル中の各遺伝子の存在量の推定値を使用して、差次的に発現する遺伝子を見つけるために実行した。サンプル中の０に調整された（ｚｅｒｏｅｄ）Ｒｅａｄ Ｃｏｕｎｔ値より１つ多い遺伝子は除外された。ｌｏｇ２変換を容易にするために、フィルター処理された遺伝子の各Ｒｅａｄ Ｃｏｕｎｔ値に１が追加された。フィルタリングされたデータはｌｏｇ２変換され、Ｍ値のトリム平均（ＴＭＭ）正規化法に供された。差次的発現データの統計的有意性は、ｅｄｇｅＲを使用した正確なｔ検定と、グループ間に差が存在しないという帰無仮説である倍率変化を使用して決定された。Ｐ値は、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの偽発見率（ＦＤＲ）補正を使用して、多重検定用に調整された。ヒートマップの場合、ＲパッケージヒートマップとＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅツールのＭｏｒｐｈｅｕｓとを使用してカウントを正規化した。｜倍数変化｜＞ ２および独立したｔ検定の生ｐ値＜０．０５を満たす差次的に発現された転写産物の発現パターンを表示するための類似性の尺度としての完全なリンケージおよびユークリッド距離を使用して階層的クラスタリング分析は実行された。

統計分析
グラフは、実験に応じて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０、両側の対応のないスチューデントのｔ検定、ノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定、または一元配置分散分析を使用してプロットおよび分析した。＜０．０５の確率値は統計的に有意であると見なされた。一部のデータは、平均＋ＳＥＭとして提供される。アスタリスクは、ｐ値を以下のように表す：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

サンプルサイズは図または図の凡例（ｌｅｇｅｎｄｓ）で示され、動物の数を指す。ヒト臍帯血またはＰＢＭＣを使用したインビトロアッセイは、少なくとも３人の無関係なドナーからの細胞を使用して独立して繰り返された。示される結果は、凡例に記載されているように、少なくとも３回の独立した実験を表す。光コヒーレンストモグラフィー、ＥＲＧおよび共焦点画像分析は盲目的に実行された。ＥＡＥおよびＥＡＵスコアリングは、マスクされた研究者によって実行された。ＥＡＵにおけるｉ２７－Ｂｒｅｇの本質的な免疫療法効果が検証され、ＥＡＥモデルで再現された。マウスは年齢／性別が一致し、ランダム化され、同数の雄と雌で構成されていた。

実施例１
本実施例は、腹膜Ｂ１細胞がＩＬ－２７（ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）を分泌し、炎症中のｉ２７－Ｂｒｅｇｓの活性化が２次リンパ組織への脱出を引き起こすことを証明した。

免疫組織化学的／共焦点顕微鏡は、活性化したマウスＣＤ１９^＋ Ｂ細胞上でｐ２８およびＥｂｉ３の発現を共局在させ（図１、白い矢印）、Ｂリンパ球がＩＬ－２７を産生することを示す。Ｂ１リンパ球（Ｂ－１ａおよびＢ－ｌｂ）は、主に腹腔に局在する自然免疫のＢ細胞であり、Ｂ２は脾臓の従来の抗原特異的Ｂ細胞である。マウス腹腔または脾臓の活性化Ｂ細胞のフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色により、これらの発生的および機能的に異なるＢ細胞系譜の両方がＩＬ－２７を産生できることが明らかになった（図２）。しかしながら、Ｂ－細胞の活性化刺激または供給源に関係なく、Ｂ－１ａ細胞はＩＬ－２７の主要な産生者であり（図２Ａ）、Ｂ－１ａ細胞によるＩＬ－２７の産生はＥＬＩＳＡによって確認した（図２Ｄ）。相互ＩＰ／Ｗｅｓｔｅｒｎ分析により、活性化Ｂ－１ａ細胞の溶解物および上清でｐ２８およびＥｂｉ３の共発現が検出され、Ｂ－１ａ細胞が実際にヘテロ二量体ＩＬ－２７（ｐ２８／Ｅｂｉ３）を分泌するというさらなる証拠を提供した。ＰＬＡはさらにｐ２８とＥｂｉ３の間の物理的相互作用を示し（図１３２）、Ｂ細胞がヘテロ二量体ＩＬ－２７サイトカインを分泌するという直接的な証拠を提供した。活性化Ｂ－１ａ細胞の全細胞抽出物または上清の相互免疫沈降およびウエスタンブロット（ＩＰ／Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析により、ｐ２８およびＥｂｉ３の共発現が検出され（図１３３）、Ｂ細胞がヘテロ二量体ＩＬ－２７を分泌することがさらに確認された。

活性化されたＢ細胞のＦＡＣＳ分析は、ＩＬ－２７に応答して増加する（２．８５倍）（図３）、ＩＬ－２７を産生するＢ細胞の別個の集団（約７．７３％）を明らかにし、ＩＬ－２７への曝露がｉ２７－Ｂｒｅｇの増大を誘発しうることを示唆した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＲＮＡ分析（図５）およびウエスタンブロッティングはまた、ＢＣＲ／ＩＬ－２７が相乗的にＩＬ－２７サブユニットｐ２８、ＩＬ－２７Ｒαの発現をアップレギュレートし、ケモカイン受容体発現のパターンを変化させたことを示した（図５）。免疫組織化学的／共焦点顕微鏡分析はまた、ＩＬ－２７／ＢＣＲシグナル伝達に応答したＢ細胞によるＩＬ－２７のアップレギュレートされた発現（白い矢印）を検出し（図６）、ＢＣＲおよびＩＬ－２７シグナルがｉ２７－Ｂｒｅｇｓの最適な増大に必要かもしれないことを示唆する。さらに、クロマチン免疫沈降アッセイは、活性化されたＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のＵ２７ａ近位プロモーターへの結合をＩＬ－２７が誘導することによってその効果を媒介することを証明した（図１１２および１１３）。ＢＣＲ／ＩＬ－２７誘導シグナルはＩＬ－２７産生細胞の増大を促進したが、ＢＣＲ／ＩＬ－２７誘導シグナルは、ＩＬ－２７受容体（ＩＬ－２７ＲαＫＯ）を欠くＢ細胞の培養においてこれらの細胞を増大させることができず（図７）、ＩＬ－２７産生Ｂ細胞の生成のためにＩＬ－２７シグナルが必要であることを明確にした。ＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞のオートクリン増殖のためのＩＬ－２７の要件と一致するのは、ＩＬ－２７がＢ１細胞におけるＩＬ－２７Ｒα発現をアップレギュレートするという観察である（図８）。重要なことに、免疫療法へのＩＬ－２７産生Ｂ細胞の適用可能性の文脈において、自然免疫様（ｉｎｎａｔｅ－ｌｉｋｅ）ヒトＢ１細胞もＩＬ－２７を産生することが見出された（図９－１１）。

Ｂ細胞がインビボでＩＬ－２７を産生できるかどうかを調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳを注射（ｉ．ｖ）し、腹腔または脾臓でＩＬ－２７を産生するＢ－１ａまたはＢ２細胞の割合を測定した。ＰＢＳ処理マウスの腹腔内のＢ－１ａ細胞の約１９．４％が２４時間の時点でＩＬ－２７を産生していたが、ＬＰＳを注射したマウスではこれらの細胞の割合が約５５．６％に増加した（図１３Ａ－１４Ｂ）。この反応の急速な動態は、増殖ではなく動員を示す。興味深いことに、ＩＬ－２７を分泌するＢ－１ａ細胞の割合は、腹腔で時とともに急速に低下し、最終的には炎症の第４日までに基底レベルに戻った（図１３Ａ－１４Ｂ）。同様の分析により、ＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の脾臓への動員の異なるパターンが明らかになった。ＬＰＳ注射後第１日から、脾臓に動員されたＢ－１ａ細胞の百分率は２．０１％から徐々に増加し、第３日までに８．８％のピークに達し、その後炎症の第４日に基底レベルに戻った（図１３Ａ－１４Ｂ）。脾臓または腹腔内のＩＬ－２７産生Ｂ２細胞が２％を超えることは決してないことに留意せよ（図１３Ｂおよび１４Ｂ）。これらの結果は、ＬＰＳの注射がＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の急速な増加を誘発し、続いて腹腔からのそれらの退出を誘発し、これらの事象がその後の脾臓へのＢ－１ａ細胞の動員と一時的に相関したことを示す。

本データは、脾臓におけるＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ５を発現するＢ－１ａ細胞の時間依存的な増加を示しており、これは、腹腔内のＣＸＣＲ４を発現するＢ－１ａ細胞の有意な減少と時間的に一致した（図１５－１７）。これらの結果は、ＩＬ－２７に応答したＢ－１ａ細胞によるＣｘｃｒ５のアップレギュレートおよびＣｘｃｒ４転写のダウンレギュレートを示したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータ（図５）と一致する（図５および１３４）。

まとめると、これらの観察結果は、ＩＬ－２７に応答したＢ－１ａ細胞によるケモカイン受容体発現の異なる調節が、腹腔からのＢ－１ａ細胞の放出およびその後の脾臓への輸送を促進することを示唆する。

実施例２
本実施例は、ＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞（ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）が重篤なブドウ膜炎からの保護をもたらすことを示した。

ＥＡＵは、ヒトブドウ膜炎の動物モデルであり、ＣＦＡの網膜タンパク質／ペプチドによる免疫化によって誘発される主にＴ細胞を介した眼内炎症性疾患である。ＥＡＵモデルを使用して、ｉ２７－Ｂｒｅｇがブドウ膜炎中の免疫調節に寄与するかどうかを調査した。ＥＡＵは、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ_{６５１－６７０}）に由来するペプチドで免疫化することにより、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで誘導され、免疫化と同時にマウスをＰＢＳ（対照）またはＩＬ－２７で処理した。ＰＢＳ処置マウスの眼底画像は、視神経乳頭縁のかすみ、乳頭近傍領域の拡大、中等度から重度の網膜血管炎、および細胞浸潤を含むブドウ膜炎の特徴を明らかにした（図１８）。対照的に、ＩＬ－２７処置マウスはＥＡＵから保護され、細胞が少なく、疾患スコアが低い軽度のＥＡＵを示した（図１９）。ＰＢＳ処置された眼の組織学的分析は、硝子体、脈絡膜炎、光受容体細胞の損傷および網膜のひだに炎症細胞を示すが、ブドウ膜炎のこれらの特徴的な特徴は、ＩＬ－２７処置されたマウスの眼では観察されなかった（図２０）。光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）は、ＰＢＳで処置したマウスでは、硝子体および視神経乳頭に炎症細胞が実質的に蓄積するが、ＩＬ－２７したマウスでは炎症細胞がないことを示し（図２１）、ＩＬ－２７処置マウスの網膜電図（ＥＲＧ）では対照マウスの視覚障害は検出されなかった（図２２－２５）。ＥＡＵの改善と一致して、ＩＬ２７処置マウスの血清中のＩＬ２７の増加およびＩＬ１７の減少が検出された（図２６－２９）。ＩＬ－１０およびＩＬ－３５を含む他の免疫抑制性サイトカインもまた、ＩＬ－２７処置マウスの血清において上昇した（図２６－２９）。細胞内サイトカイン分析は、ＰＢＳ処置マウスの脾臓中の約８．２％のＢ細胞がＩＬ－２７を分泌したことを示すが、ｉ２７－Ｂｒｅｇの百分率はＩＬ－２７処置マウスにおいて１５％以上に増加し（図３０および３１）、ｉ２７－Ｂｒｅｇの増加とＥＡＵの改善との相関関係を示す。Ｂ１０（ＣＤ １９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｈｉ）およびＢ－１ａ（ＣＤ１９^＋ ＣＤ５^＋ ＣＤ１ｄ^ｌｏｗ）細胞はＣＤ５＋であり、自然免疫様Ｂｒｅｇ機能を示すので、ＥＡＵ中に誘導されたｉ２７－ＢｒｅｇがＢ－１ａまたはＢ１０プールに由来するかどうかを調べた。ＰＢＳ処理マウスの脾臓には中程度のレベルのＩＬ－２７産生Ｂ１０細胞が含まれていたが（約２．９７％）、これらのｉ２７－Ｂｒｅｇの割合はＩＬ－２７処理マウスではＥＡＵ中に増加しなかった（図３２－３４）。対照的に、ＰＢＳ処理マウスの脾臓におけるＢ－１ａ細胞の約６％以上がｉ２７－Ｂｒｅｇであり、ＩＬ－２７処理マウスでは約１１％以上に増加し（図３２－３４）、ＩＬ－２７へのインビボ曝露はｉ２７産生Ｂ－１ａ細胞のＥＡＵ中の増大をさらに誘導した。

ｉ２７－Ｂｒｅｇｓの潜在的な治療上の重要性を調査するために、腹腔Ｂ－１ａ細胞（＞８０％ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）をＷＴドナーＣＤ４５．２^＋ マウスからＥＡＵで精製し、５×１０^５個／マウスをナイーブ同系ＷＴまたはＩＬ－２７ＲａＫＯＣＤ４５．１^＋ マウスに移植し、Ｂ－１ａ細胞の予防的投与の２４時間後にＥＡＵを誘発した。免疫化後第１７日の眼底画像は、ＩＬ－２７Ｒα欠損マウスにおける重度のブドウ膜炎を示し（図３５および３６）、これは、眼におけるＴｈｌおよびＴｈｌ７細胞の増加と相関していた（図３７－３８Ｅ）。ＰＢＳを注射したグループは、ＩＬ－２７ＲαＫＯマウスと比較して重症度は低いものの、ブドウ膜炎の特徴を示した。対照的に、予防的Ｂ－１ａ細胞を与えられたマウスは、Ｔｈｌ／Ｔｈｌ７細胞の減少（図３７）および付随する眼におけるＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の増加（約１０．７％）（図３９）と相関する軽度のＥＡＵ（図３５および３６）のみを発症した。この改善はＩＬ－２７Ｒαレシピエントでは観察されず、改善がＩＬ－２７によって媒介されたことを証明した。興味深いことに、Ｂ－１ａ療法は、ＩＬ－３５産生Ｂｒｅｇ細胞（ｉ３５－Ｂｒｅｇ）の約２．２倍の増殖を誘導した（図４０）。

さらに、形質細胞様樹状細胞は、活性化ＩＬ－２７産生Ｂ－１ａと形質細胞様樹状細胞との共培養（１：１）後のフローサイトメトリーによって確認されるように、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の増殖を誘導することが見出された（ＩＬ－２７を分泌するＣＤ１１ｂ^＋ Ｂ－１ａ細胞の百分率を示す、図１４９Ａ－１４９Ｂを参照せよ。）。

実施例３
本実施例は、脳と脊髄のｉ２７－Ｂｒｅｇが神経炎症と脳脊髄炎を抑制することを証明した。

これらの研究では、多発性硬化症（ＭＳ）と本質的な免疫病原性の特徴を共有し、進行性および再発寛解型のヒト疾患を示す、ＥＡＥモデルが使用された。ＥＡＥは、ＭＯＧ_{３５－５５}－ペプチド／ＣＦＡによるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの免疫化によって誘発された。対照ＰＢＳ処置マウスは、脳および脊髄への炎症細胞の浸潤、弛緩性尾部、対麻痺、前／後肢麻痺、および瀕死状態を特徴とするＥＡＥを発症した（図４４）。しかしながら、組織学およびより低いＥＡＥ臨床スコアによって示されるように、ＥＡＥのこれらの顕著な特徴はＩＬ－２７処置マウスにおいてはるかに減少した（図４５）。疾患の減弱は、ＩＬ－２７処置マウスの脳および脊髄におけるＴｈｌ７またはＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７発現Ｔｈｌ７細胞の頻度の有意な減少、および、ＩＬ－１０発現ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増加と相関していた（図４６－５１）。さらに重要なことに、ＥＡＥマウスの脊髄および脳におけるｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞（図５２および５３）と、脊髄における有意なレベルのＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞（図５２および５３）と、ＩＬ－２７で処理されたマウスの脾臓における有意なレベルのＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞（図５４－５８）が検出された。

ＥＡＥの抑制におけるｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の役割は、ＣＤ４５．１^＋ およびＣＤ４５．２^＋ コンジェニックマウス系譜を使用した養子移植研究でさらに実証された。
ＣＤ４５．２^＋ マウスを、ＭＯＧ_{３５－５５}－ペプチド／ＣＦＡで免疫し、ＰＢＳまたはＩＬ－２７で処理した。免疫化の２１日後に脾臓およびＬＮから脳炎誘発性細胞を採取し、ＰＢＳ処理またはＩＬ－２７処理ＣＤ４５．２^＋ マウスからの１０×１０^６個の細胞を、免疫化されていないＣＤ４５．１^＋ マウスに養子移植し、ＥＡＥの発症および重症度を評価した。ＰＢＳ処理マウスからの細胞の移植はＥＡＥの特徴を伴う疾患を誘発したが、ＩＬ－２７処理マウスからＣＤ４５．２^＋ 細胞を投与されたＣＤ４５．１^＋ マウスは遅発性のＥＡＥを軽度に発症した（図５９）。レシピエントマウスにおけるＥＡＥの低下は、Ｔｈｌ７応答の抑制（図６０）およびＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の同時増殖（図６３－６６）に部分的に由来した。ＣＤ４５．２^＋ ＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞のレベルが、レシピエントＩＬ－２７処置マウスの脊髄、脳、および脾臓でわずかに増加したことは注目に値し（図６３－６６）、これは、移植されたＣＤ４５２^＋ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ細胞はインビボで増殖した可能性があることを示した。最も注目に値するのは、ＣＮＳ組織へのＣＤ４５．２^＋ Ｂｒｅｇの動員が、内因性ＣＤ４５．１^＋ Ｂｒｅｇの増大を促進したことである（図６３－６６）。したがって、脊髄および脳における移植したｉ２７－Ｂｒｅｇおよび内因性ＣＤ４５．１^＋ Ｂｒｅｇの増大は、宿主組織におけるＩＬ－２７の長期産生を維持したであろう。したがって、ｉ２７－Ｂｒｅｇ療法は、インビボで急速に除去されるＩＬ－２７の投与よりも治療上の利点を提供する可能性がある。

実施例４
本実施例は、自然免疫のＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞が抗原非依存的にＥＡＥおよびＥＡＵを抑制することを示した。

Ｂｒｅｇｓは主に抗原特異的であり、同じコグネイトの自己抗原を認識するリンパ球によって媒介される疾患を抑制するのに効果的である。したがって、ＬＰＳのような無関係な刺激によって誘発されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞がＥＡＥを媒介する脳炎誘発性リンパ球を抑制できるかどうかを調べた。ＣＤ４５．２^＋ Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳを注射し、２日後に腹腔から精製Ｂ－１ａ細胞を取得した（＞８０％Ｂ－１ａ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）。次に、ｉ２７－ＢｒｅｇをナイーブＣＤ４５．１^＋ コンジェニックマウスに移した。ＥＡＥは、養子移植の２４時間後にＭＯＧ_{３５－５５}（ｎ＝７）で免疫化することにより、レシピエントＣＤ４５．１^＋ マウスに誘発された。エクスビボで生成されたＢ－１ａ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ（５×１０^５個／マウス）の移植はＥＡＥを抑制し（図６７）、疾患の改善は、脳および脊椎におけるＩＬ－１７－単独陽性およびＩＬ－１７／ＩＦＮ－γ二重陽性Ｔ細胞の減少と、ＩＬ－１０産生調節ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増加（図６８－７１）と相関していた。ＥＡＥの抑制は、脊髄（図７２および７３）、脳（図７４および７５）および腹腔（図７６および７７）におけるｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の増加と相関しており、大部分のｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞はＢ－１ａ細胞であることが観察された。ＥＡＵモデルでも同様の結果が得られた。したがって、その発生学的起源と一致して、自然免疫ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞によるＣＮＳ自己免疫疾患の抑制は、ＥＡＥまたはＥＡＵを誘発した自己抗原による事前の活性化を必要としない。この結果は、抗原特異的免疫抑制を仲介するＢ２ Ｂｒｅｇ療法とは対照的であり、自家の自然免疫ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の移植が、より幅広い自己免疫疾患の治療として利用できることを示唆する。

実施例５
本実施例は、ＩＬ－２７を産生するＢ－１ａとＣＮＳのリンパ球または骨髄細胞との間にクロストークが存在することを示す。

本研究では、ＥＡＥまたはＥＡＵの際にＣＮＳに入るｉ２７－Ｂｒｅｇが、ＣＮＳの免疫抑制環境に寄与するＩＬ－２７の供給源である可能性があるかどうかを調べた。ＩＲＢＰ免疫化野生型由来のＢ－１ａ細胞およびマクロファージを選別し、トランスウェルシステムでの３日間の細胞の共培養がＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞を有意に増加させることが見出され（図７８－８１）、骨髄細胞によって産生される可溶性メディエーターが、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の増殖を促進することにより、ブドウ膜炎の間に網膜のＩＬ－２７レベルを増加させる可能性があることを示唆した。データはさらに、Ｂ－１ａ細胞のように、マクロファージがＩＬ－２７を産生することによって炎症性刺激に応答することを示す（図８２および８３）。しかしながら、ｐ２８およびｅｈｉ３発現を標的とするｓｇｐ２８／ｓｇｐＥｂｉ３ガイドＲＮＡを発現するレンチウイルスによるいずれかの細胞型の感染は、ＩＬ－２７を産生するマクロファージまたはＢ－１ａ細胞の能力を抑制し（図８２および８３）、ｉ２７－ Ｂｒｅｇｓは骨髄細胞と相乗作用して、炎症時にＣＮＳのＩＬ－２７レベルを上昇させる可能性があることを示唆した。ＣＮＳ自己免疫疾患を媒介するｉ２７－Ｂｒｅｇとリンパ球の間の潜在的なクロストークも調べられた。Ｂ－１ａ細胞との共培養は、ＥＡＵマウスの脾臓およびリンパ節におけるブドウ膜形成性Ｔ細胞の増殖（図８４－９０）を抑制した。Ｂ－１ａ細胞がＩＬ－２７発現に欠陥がある場合、Ｔｈｌ７誘導性炎症反応を抑制する能力は減少した（図８６－９０）。これらの結果は、網膜に入るＢ－１ａ細胞が、分泌するＩＬ－２７のパラクリン効果を介してＥＡＵ中にＴｈｌ７細胞を抑制できることを示唆する。

データは、Ｂ－１ａ細胞とブドウ膜形成性Ｔ細胞の共培養が、ＩＬ－２７依存的に、阻害性受容体であるＬＡＧ－３（ＬＡＧ－３^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞）を発現するＣＤ４^＋ Ｔ細胞（図９１－９３）およびｉ３５－Ｂｒｅｇｓ（図９４－９６）の増殖を誘導したことを示す。興味深いことに、ＩＬ－２７によって誘導されたＩＬ－３５産生細胞の大部分はＦｏｘｐ３陰性であった（図９７－９９）。これらの結果は、ｉ２７－Ｂｒｅｇが、エフェクターＴ細胞に調節的な表現型および機能を獲得させることにより、少なくとも部分的に眼内炎症を抑制できることを示唆する。

実施例６
本実施例は、ＩＬ－２７がＢ１細胞およびＢ２細胞を異なる方法で調節することを示す。

本研究では、ＩＬ－２７の産生を通じてＥＡＵおよびＥＡＥを抑制するＢ－１ａ細胞が、阻害分子を発現することによって炎症も抑制するかどうかを調べる。Ｂ－１ａ細胞は、選別によってマウス腹腔から分離された。次に、細胞をＬＰＳで４８時間刺激し、ＩｇＭを産生する能力によってそれらがＢ－１ａ細胞であることを示した（図１００）。ｑＰＣＲによる細胞から調製したｃＤＮＡの分析は、Ｂ－１ａ細胞が実際にＬａｇ３およびＰｄｌを発現できることを明らかにした（図１００）。インビボＬＰＳモデルを使用して、ＥＡＥ、ＥＡＵ、または敗血症の際に起こるように、自然免疫Ｂ－１ａ細胞が炎症性チャレンジに応答してこれらの抑制性受容体も発現するかどうかを調査した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＰＳを注射（ｉ．ｖ）し、磁気ビーズソーティングによって腹腔から精製Ｂ－１ａ細胞を単離した。ＬＰＳ投与の４８時間後の細胞に由来するｃＤＮＡのｑＰＣＲ分析の結果は、Ｌａｇ３およびＰｄｌの転写が腹腔内のＢ－１ａ細胞によってアップレギュレートされることを確認した（図１０１）。天然のＬＡＧ－３^＋ ＣＤ１３８^＋ 制御性形質細胞が抗原特異的メカニズムを介して発達するにつれて、マウス腹腔または脾臓から選別されたＢ－１ａおよびＢ２細胞と、抗ＩｇＭ／抗ＣＤ４０で刺激された細胞とは、Ｂ－１ａおよび形質細胞の両方がｑＰＣＲ分析によって示されるように、ＢＣＲシグナル伝達に応答してＬａｇ３およびＰｄ１の転写をアップレギュレートする（図１０２－１０４）ことを示した。まとめると、これらの観察結果は、病原体（ＴＬＲアゴニストなど）または自己抗原による刺激に応答して、Ｂ－１ａ細胞が免疫調節活性を増強する阻害分子を発現する能力を獲得できることを示唆する。

以前の報告では、ＩＬ－３５を産生するＢ細胞はもっぱらＢ２ ＣＤ１３８^＋ プラズマ細胞であることが示されていた（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ、５０７：３６６－３７０（２０１４））。しかし本研究は、ＩＬ－２７産生Ｂ細胞がＢ１コンパートメントに由来することを示す。活性化Ｂ細胞をｉ２７－Ｂｒｅｇの発生プログラムに偏らせるメカニズムを理解するために、ＩＬ－２７で刺激された活性化ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞のトランスクリプトームのプロファイルを作成した。ｑＰＣＲ（図１０５）およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（図１０６）ＲＮＡ分析により、ＩＬ－２７によって特異的に活性化されるいくつかの遺伝子（Ｉｒｆ８、Ｉｒｆｌ、Ｔｂｘ２１、Ｎｆｌｌ３、Ｉｒｆ７、Ｘｂｐｌ、およびＢａｔｆ）が特定され、そのうちのいくつかはＢ細胞の重要な経路を調節することが知られている。特に興味深いのは、ＩＲＦ－８およびＩＲＦ－４の異なるアップレギュレートであった。これらの転写因子は、Ｂ細胞の発生とエフェクター機能に関係するからである。ＩＲＦ－４とＩＲＦ－８との間の相互拮抗作用がＢ－を調節するという報告を考慮して、形質細胞の発生に有利なＩＬ－４の増加を伴う細胞の発生が増加する（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１２７４－１２８１（２０１５）を参照せよ。）ので、Ｂ－１ａ細胞によるＩｒｆ８の優先的なアップレギュレートは、ｉ２７－Ｂｒｅｇ発生プログラムを促進する可能性がある。ＩＬ－２７はｉ２７－Ｂｒｅｇの増殖を誘導するため、ＩＲＦ－８がＩＬ－２７ｐ２８サブユニットタンパク質をコードする１１２７ａの転写を活性化するかどうかを調べた。したがって、ＩＲＦ－８およびＩＲＦ－４は、ＥＴＳ／ＰＵ－１またはＢＡＴＦファミリーの転写因子とのヘテロ二量体化によって転写を活性化し、ＥＴＳ－ＩＲＦ（ＥＩＣＥ）またはＡＰ１－ＩＲＦ（ＡＩＣＥ）免疫調節遺伝子の複合要素に動員されることに留意すべきである。Ｉｌ２７ａまたはＣｔｌａ４の発現に関連する検証済みのＡＩＣＥ部位を使用したＥＭＳＡおよびスーパーシフト分析は、ＩＬ－２７がインビボまたはインビトロ条件下で活性化Ｂ細胞にＡＩＣＥ複合体の形成を誘導することを示す。さらに、ＩＲＦ－４およびＩＲＦ－８の両方がＣｔｌａ４のＡＩＣＥに動員され、ＩＲＦ－４ではなくＩＲＦ－８がｉ／２７ａのＡＩＣＥに動員された。これにより、ＩＲＦ－８がＢ細胞におけるＩＬ－２７の発現を促進することが示唆される。ウエスタンブロット分析は、ＩＬ－２７がＢ細胞においてＩＲＦ－８をアップレギュレートすることを確認し（図１０７）、ＲＮＡ分析は、ＬＰＳを注射したマウスから単離されたＢ－１ａ細胞によるＩｒｆ８のアップレギュレートされた転写を示し（図１０８）、Ｂ－１ａ細胞におけるＩＲＦ－８およびＩＬ－２７の発現を促進する相互の自己調節ループを調整する可能性のあるＩＲＦ－８／ＩＬ－２７軸を示唆する。ＣＤ１９－ＩＲＦ８ＫＯマウスのＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞の有意な減少（図１０８－１１１）も観察され、これは、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の増殖を促進する際のＩＲＦ－８の役割をさらに強調する。これらの結果は、Ｂ１コンパートメントのＩＲＦ－８／ＩＬ－２７軸の優先的な活性化が、活性化されたＢ－１ａ細胞をｉ２７－Ｂｒｅｇ発生プログラムに偏らせる可能性があることを示唆する。

実施例７
本実施例は、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞がヒトに存在し、炎症性刺激に応答して増殖できることを示した。

本研究では、健康なヒトＰＢＭＣをＴＬＲアゴニストＣｐＧおよびＢＣＲ（抗ＣＤ４０または抗ＩｇＭ）とともに３日間培養することにより、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞がヒトに存在し、炎症性刺激に応答して増殖するかどうかを調べた。
ヒトＢ－１細胞のゲーティング（ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ）は、ヒトＰＢＭＣのＢＣＲ活性化Ｂ細胞の１９．９％がＩＬ－２７を産生することを明らかにした（図１１４および１１５）。ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１^＋ Ｂ－１細胞は適切な刺激とこれに対するゲーティングとに応答して、脾臓および抗体産生の他の部位に移動する準備ができているＢ－１ａ細胞のサブセットを表する細胞集団は、３５％ものＢＣＲ活性化ヒトＢ－１ａ細胞が炎症性疾患の際に脾臓および炎症部位に動員される可能性があることを明らかにした（図１１６－１１８）。健康なヒトドナーからのヒト臍帯血の分析により、休止状態のＢ－１ａ細胞の１８．１％が構成的にＩＬ－２７を産生し、ＩＬ－２７でＢＣＲ活性化臍帯血Ｂ細胞を刺激すると臍帯血ｉ２７－の割合が７３．９％に増加することが明らかになった（図１１９－１２１）。他のＢｒｅｇサブタイプ（ＩＬ－１０産生Ｂｒｅｇｓおよびｉ３５－Ｂｒｅｇｓ）に対してｉ２７－Ｂｒｅｇｓの相対的な存在量を決定するために、活性化された臍帯血細胞を６日間増殖させた。Ｂｒｅｇ細胞の大部分はｉ２７－Ｂｒｅｇであったが、低レベルのＩＬ－１０産生Ｂｒｅｇおよびｉ３５－Ｂｒｅｇが検出され、それらのレベルは時間依存的に増加した（図１２２）。Ｂ－２細胞の同様の分析は、ほとんどのｉ２７－ＢｒｅｇがナイーブまたはメモリーＢ細胞プールのいずれかにあることを明らかにした（図１２３）。マウス種と同様に、ヒトｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞は、抑制性受容体ＰＤ－１およびＬＡＧ３を構成的に発現し（図１２４－１２６）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、および／またはＩＦＮ－γを産生する炎症誘発性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖応答を抑制した（図１２７－１３１）。臍帯血はヒト白血球抗原（ＨＬＡ；ヒトの主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体）の顕著なミスマッチがある患者についてアロ（非自己）移植のための好ましい造血幹細胞の出所源であるから、臍帯血ｉ２７－Ｂｒｅｇの濃縮は、臨床的に興味深い。したがって同種造血後の同種反応性応答を抑制し、ＧＶＨＤから保護するために臍帯血ｉ２７－Ｂｒｅｇを利用することができる。

実施例８
本実施例は、ヒトｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞を使用して、病気に罹患している、または病気に罹患するリスクのある人間をうまく治療できることを示す。

ヒトｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞は、ブドウ膜炎、ＭＳ、ＡＭＤ、および／またはＧＶＨＤなどの疾患に罹患するヒト、またはＧＶＨＤなどの疾患の予防を必要とするヒトに注射または静脈内投与によって投与される。ヒトｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の投与後、疾患の重症度および／または症状は軽減および／または予防される。

実施例９
本実施例は、ｉ２７－Ｂｒｅｇが独自のトランスクリプトームを持っていることを示す。

ＢＣＲおよびＩＬ－２７での活性化によってｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞が濃縮された腹腔Ｂ－１ａ細胞を使用して、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の発生に必要な遺伝子発現プログラムを決定した。高度に濃縮されたＩＬ－２７産生Ｂ－１ａ細胞（＞８３％ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）の特性評価により、Ｂ－１ａ細胞は構成的に天然ＩｇＭ抗体を分泌する一方で、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞の表現型への発生はＩｇＭ抗体産生能力の喪失と一致することが明らかになった（図１３５Ａ－１３５Ｂ）。チャレンジされていないＢ－１ａ細胞に加えて、マウス脾臓からの従来のＢ－２およびＩＬ－３５産生Ｂ－２細胞（＞５７％ ｉ３５－Ｂｒｅｇ）を、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析のコンパレーターとして使用した。差次的に調節された遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）は、Ｂ細胞を４つの別個の集団に明確に分離した（図１３６）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞のユニークな免疫抑制活性をさらに特徴付ける分子プロセスおよび経路を強化するタンパク質をコードする高度に濃縮された遺伝子が同定された（図１３７）。グローバルＲＮＡ－Ｓｅｑ分析から得られたヒートマップは、ｉ２７－Ｂｒｅｇでアップレギュレートされた１，９９８個の遺伝子と、ダウンレギュレートされた１，１７９個の遺伝子とを特定した（図１３７）。ｉ２７－Ｂｒｅｇで差次的に誘導される遺伝子（＞２倍高い発現）には、サイトカイン、サイトカイン受容体およびケモカイン受容体（１１２７、Ｅｂｉ３、１１１０、１１７ｒ、Ｉ１２１ｒ、Ｃｘｃｒ３、Ｃｘｃｒ５）、阻害性受容体（Ｐｄｃｄｌ、Ｌａｇ３）シグナル伝達分子（Ｎｏｔｃｈ４、Ｓｔａｔｌ、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５、Ａｋｔｌ、Ａｋｔ２）、転写因子（Ｉｒｆ８、Ｉｒｆｌ、Ｂａｔｆ、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｘｂｐｌ、Ａｒｉｄ３ａ、Ｉｋｚｆｌ、Ｉｋｚｆ２、Ｉｋｚｆ４）をコードする遺伝子が含まれる。抑制された遺伝子には、１１１２ａ、Ｎｏｔｃｈ２ Ｃｘｃｒ４、Ｃｃｒ２、Ｃｃｒ７）、抑制性受容体（Ｐｄｃｄ２、Ｃｄｌｄｌ、Ｃｔｌａ４）および転写因子（Ｉｒｆ４、Ｉｋｚｆ３、Ｂａｃｈ２、Ｐａｘ５、Ｅｂｆｌ、Ｒｕｎｘｌ、Ｆｏｘｏｌ、Ｅｔｓｌ）をコードする遺伝子が含まれる（図１３９）。ＩＬ－２７がｉ２７－Ｂｒｅｇトランスクリプトームの維持に必要であることをさらに検証するために、ＩＬ－２７欠損Ｂ－１ａ細胞はＩＬ－３５（ｐ３５およびＥＢｉ３）を発現するが、抑制性受容体遺伝子（Ｌａｇ３、Ｐｄｌ、同様に、Ｐｄ－１１、Ｐｄ－１２）の発現には欠陥があることを示す（図１４０）。まとめると、これらの結果は、ｉ２７－ＢｒｅｇトランスクリプトームがＢ－１ａの発生に必要な遺伝子（Ｂｈｌｈｅ４０、Ａｒｉｄ３ａ、およびＣｄ５）の有意な増加を示し、自然免疫のＢ－１細胞からのｉ２７－Ｂｒｅｇの発生起源を強調することを示唆する。ただし、ｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞は、分化中の胚中心Ｂ細胞の転写の特徴的性質（Ｉｒｆ８↑、Ｂａｔｆ↑、Ｐａｘ５↑、Ｂａｃｈ２↑、Ｅｂｆｌ↑）を示すが、最終分化した形質細胞の転写の特徴的性質（Ｐｒｄｍｌ↑、Ｂａｃｈ２↑、Ｐａｘ５↑、Ｅｂｆｌ↑）は示さない。これは、ｉ２７－Ｂｒｅｇが独自のトランスクリプトームを持っていることを証明する。

実施例１０
本実施例は、ヒト臍帯血およびＰＢＭＣのｉ２７－Ｂｒｅｇおよびｉ３５－Ｂｒｅｇが異なるトランスクリプトームプロファイルを有することを証明する。

ヒトＰＢＭＣおよび臍帯血（ＣＢ）Ｂ細胞はＩＬ－２７を産生し、ＰＢＭＣでは活性化Ｂ－１様細胞（ＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ）の約１９．９％がｉ２７－ｂｒｅｇｓである（図１４１Ａおよび１４１Ｂ）。４０％を超えるｉ２７－Ｂｒｅｇ細胞がＣＤ１９^＋ ＣＤ２０^＋ ＣＤ２７^＋ ＣＤ４３^＋ ＣＤ１１ｂ^＋ 表現型、炎症に応答して局所リンパ節に再分布することが知られている体腔内のＢ－１ａサブセットを示す（図１４２Ａ－１４２Ｃ）。他方、ＣＢ中の休止Ｂ－１ａ細胞の約１８．１％が構成的にＩＬ－２７を分泌し、ＩＬ－２７の存在下で活性化すると、ＣＢ ｉ２７－Ｂｒｅｇの百分率は７３．９％まで劇的に増加し（図１４３Ａ－１４３Ｃ）、ｉ２７－ＢｒｅｇがヒトＣＢの天然Ｂｒｅｇとして機能し、炎症に応答して局所リンパ節に迅速に動員される準備ができていることを示唆する。ｔ－ＳＮＥクラスタリング分析は、ＣＢ内のＢｒｅｇ細胞を異なる空間的に分離された３つのサブセット：Ｂ１０、ｉ２７－Ｂｒｅｇおよびｉ３５－Ｂｒｅｇにグループ化した。ｉ２７－Ｂｒｅｇは第３日の培養では８５％を超えるＢｒｅｇを含み最も豊富であったが、第６日の培養では６１％未満に減少した（図１４４）。Ｂ１０およびｉ３５－Ｂｒｅｇ細胞は第３日の培養では比較的まばらであったが、ｉ３５－Ｂｒｅｇは第６日までに実質的に（３２％）増加した（図１４４）。興味深いことに、発生のすべての段階のＢ細胞はＩＬ－１０、ＩＬ－２７、またはＩＬ－３５を産生することができたが、ｉ２７－Ｂｒｅｇは未成熟およびメモリーＢ細胞が最も豊富であった（図１４５）。主成分分析およびＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、ｉ２７－Ｂｒｅｇおよびｉ３５－Ｂｒｅｇが異なるトランスクリプトームプロファイルを有することが明らかになった（図１４６）。３，７４４個の差次的に発現した遺伝子のうち、１，５７５個がｉ２７－Ｂｒｅｇで上昇し、２，１６９個がダウンレギュレートされた（図１４７）。ＣＤ１９^＋ Ｂ細胞とｉ２７－Ｂｒｅｇとの間の同様の比較により、差次的に発現した６，１５９個の遺伝子のうち、３，２０７個がｉ２７－Ｂｒｅｇでアップレギュレートされたことがわかった（図１４８）。したがって、ヒトＰＢＭＣまたはＣＢの分析結果は、炎症反応の過程で異なるＢｒｅｇサブセットが誘導され、各サブセットの相対的な存在量が炎症チャレンジの性質に応じて変動することを示唆する。

実施例１１
本実施例は、自然免疫のｉ２７－ＢｒｅｇがＢＣＲに依存しないメカニズムを通じてＣＮＳ自己免疫疾患を抑制することを証明する。

腹腔Ｂ－１細胞は、ＢＣＲによって誘発されるシグナルに大部分は反応しないが、病原体やＴＬＲアゴニストによって誘発される自然免疫シグナルには非常に反応し、ｉ２７－Ｂｒｅｇの免疫抑制活性を示唆する。ｉ２７－Ｂｒｅｇを介したＥＡＵまたはＥＡＥの抑制に、ＩＲＢＰまたはＭＯＧ自己抗原による事前の活性化が必要かどうか明らかにするために、ＬＰＳの注射により、ＣＤ４５．２^＋ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに「敗血症」が誘発され、腹腔由来の選別されたＢ－１ａ細胞（＞８３．５％ ｉ２７－Ｂｒｅｇｓ）と、ｉ２７－Ｂｒｅｇを濃縮した細胞（５×ｌ０^５個／マウス）とが、ナイーブＣＤ４５．１^＋ コンジェニックマウスに養子移植された。２４時間後、マウスはＥＡＥ誘導によってチャレンジされた。前記マウスの臨床評価は、同等の数のＢ－１ａ細胞（＜７％ ｉ２７－Ｂｒｅｇ）を投与された対照マウスと比較して、ＥＡＥ（図１５０）またはＥＡＵの有意な抑制を明らかにした。疾患の改善は、ＩＬ－１７－単独陽性およびＩＬ－１７／ＩＦＮ－ｙ－二重陽性のＴｈｌ７細胞の減少、ならびに脳および脊髄におけるＴｒｅｇの増大（図１５１Ａ－１５１Ｂ）、脊髄（図１５２Ａ～１５２Ｂ）、脳（図１５３Ａ～１５３Ｂ）および腹腔（図１５４Ａ～１５４Ｂ）におけるＢ－１ａ ｉ２７Ｂｒｅｇ細胞の増大と相関していた。これらの結果は、養子移植ｉ２７－Ｂｒｅｇ療法が自己免疫疾患の治療として有用である可能性があることを裏付けている。

まとめると、上記実施例は、それぞれ多発性硬化症およびブドウ膜炎のモデルである、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）または実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を罹患したマウスの脳、脊髄、網膜、および腹腔だけでなく、ヒト臍帯血、ＰＢＭＣに自然免疫のＩＬ－２７産生Ｂｒｅｇ集団が存在することを示した。共焦点顕微鏡、ＦＡＣＳ利用細胞選別、ＲＮＡ－ｓｅｑ、Ｃｈｉｐアッセイおよび免疫組織化学を含むインビトロ実験システムは、ＩＬ－２７を産生するＢｒｅｇが独自のトランスクリプトームを有し、他のＢｒｅｇとは機能的に異なることを示す。ｉ２７－Ｂｒｅｇの養子移植は、ブドウ膜、脳、脊髄に輸送され、病原性Ｔ細胞を抑制したｉ３５－Ｂｒｅｇ細胞に休止Ｂ細胞を再プログラミングすることにより、ＥＡＥとＥＡＵを改善し、ｉ２７－Ｂｒｅｇ免疫療法の有効性を示した。

本明細書で引用される刊行物、特許出願、および特許を含むすべての文献は、各文献が個別にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈での（特に以下の特許請求の範囲の文脈での）“ａ”および“ａｎ”および“ｔｈｅ”という用語および同様の指示物の使用は、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。それ以外の場合は、本書に示されているか、文脈によって明らかに矛盾する。「含む」、「有する」、「含む」、および「含む」という用語は、特に断りのない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書の数値範囲の列挙は、本明細書に別段の記載がない限り、範囲内にある各個別の数値を個別に参照する略記法として役立つことを単に意図し、各個別の数値は、本明細書に個別に記載されているかのように仕様に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる文言も、特許請求の範囲に記載のない構成要素が本発明の実施に不可欠であることを示すとして解釈されるべきではない。

本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために発明者に知られている最良の様式を含めて、本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形例は、前述の説明を読むと、当業者には明らかになる可能性がある。本発明者らは当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、本発明者らは本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施することを意図する。したがって本発明は、適用可能な法律によって許可されるとおり、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての修正および均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。

Claims (27)

1. 約７５％以上のＢ－１ａ制御性細胞を含む、哺乳類細胞の単離された集団であって、
   （ａ）阻害性細胞表面受容体リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）を発現し、かつ、
   （ｂ）インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）を分泌する、
   集団。
2. 前記制御性細胞が阻害性細胞表面受容体糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）をさらに発現する、請求項１に記載の哺乳類細胞の集団。
3. 前記制御性細胞が阻害性細胞表面受容体ＯＸ４０をさらに発現する、請求項１または２に記載の哺乳類細胞の集団。
4. 制御性細胞が阻害性細胞表面受容体細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）をさらに発現する、請求項１～３のいずれか１項に記載の哺乳類細胞の集団。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の哺乳類細胞の集団を調製する方法であって、
   （ａ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、哺乳類末梢リンパ組織、哺乳類臍帯血、哺乳類腹水、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、または哺乳類骨髄のサンプルから分化クラスター５陽性（ＣＤ５＋）発現細胞を単離して、単離されたＣＤ５＋発現細胞を提供すること、
   （ｂ）前記単離されたＣＤ５＋発現細胞を細胞培養培地で培養して、培養細胞を提供すること、
   （ｃ）前記培養細胞をＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）またはＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）アゴニストで活性化して、活性化細胞を提供すること、および
   （ｄ）前記活性化された細胞をＩＬ－２７に曝露すること
   を含む、方法。
6. 哺乳類の免疫系の抑制に使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の哺乳類細胞の集団。
7. インターロイキン－３５（ＩＬ－３５）を産生するＢ細胞を前記哺乳類に逐次的または同時に投与することをさらに含む、請求項６に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
8. 前記哺乳類は疾患を処置される、請求項６または７に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
9. 前記哺乳類が自己免疫疾患を有する、請求項６～８のいずれか１項に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
10. 前記自己免疫疾患が眼の疾患である、請求項９に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
11. 前記自己免疫疾患が中枢神経系の疾患である、請求項９に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
12. 前記自己免疫疾患が脳の疾患である、請求項９に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
13. 前記自己免疫疾患がブドウ膜炎である、請求項９に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
14. 前記自己免疫疾患が脳脊髄炎である、請求項９に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
15. 前記哺乳類が多発性硬化症を有する、請求項６～８のいずれか１項に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
16. 投与が膵臓の炎症を抑制する、請求項６～８のいずれか１項に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
17. 前記哺乳類が同種異系骨髄または造血幹細胞の移植物を受容している、請求項６または７に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
18. 前記哺乳類が同種異系の固形臓器移植物を受容している、請求項６または７に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
19. 前記哺乳類が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する、請求項１７または１８に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
20. 前記哺乳類が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を有する、請求項６～８のいずれか１項に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
21. 移植片対宿主病を有する哺乳類の治療に使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の哺乳類細胞の集団。
22. 前記哺乳類が、前記哺乳類細胞の集団の投与の前に、同種異系の骨髄または造血幹細胞の移植物を受容している、請求項２１に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
23. 前記哺乳類が、前記哺乳類細胞の集団の投与の前に同種異系の固形臓器移植物を受容している、請求項２１に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
24. 哺乳類における移植片対宿主病の重症度の予防または軽減に使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の哺乳類細胞の集団。
25. 前記同種異系移植物が同種異系骨髄または造血幹細胞の移植物である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記同種異系移植物が同種異系固形臓器移植物である、請求項２２に記載の使用のための哺乳類細胞の集団。
27. 前記哺乳類がヒトである、請求項１～４のいずれか１項に記載の哺乳類細胞の集団又は請求項５～２６のいずれか１項に記載の使用。

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