JP2015502553A - 標的ポリマーの同定方法 - Google Patents

Abstract

標的ポリマー（２０）の同定方法は、フルオロフォア（２２）のような検出可能要素（２２）を有する標的ポリマー（２０）を検出窓（４０）を有するナノポア（２８）を備える分析デバイス（２４）を通して転位させるステップであって、前記分析デバイス（２４）は、プラズモン共鳴して、前記検出窓（４０）を画定する局在電磁場を生成することができる、ステップ；前記検出可能要素（２２）を、それらが前記検出窓（４０）を通過する際に検出し、前記標的ポリマー（２０）に沿った前記検出可能要素（２２）の分布プロファイルを生成するステップ；および前記分布プロファイルを既知のポリマーの分布プロファイルの参照セットと比較することにより、前記標的ポリマー（２０）を同定するステップを含む。好適な実施形態では、標的ポリマー（２０）は、核酸であり、検出可能要素（２２）は、その中の少なくとも２つの隣接するヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドである。６マーオリゴヌクレオチドの使用が例示される。

Description

本発明は、例えば、病原体の検出において有用である、核酸のような標的ポリマーを同定するための方法および装置に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は多様な病原体の検出に用いられる。ＰＣＲは、しかしながら、ポイントオブケア診断手段に適用するのに十分に迅速ではない。マイクロアレイは、ある程度の柔軟性を可能にするが、コストを低減するのが困難であることが証明されており、また、応答時間があまりにも長すぎる。それぞれ標的病原体に特異的な様々な抗体を含む試験の準備に関わる技術は、進化し続ける病原体の抗原性結合部位、輸送のためタンパク質を活性のまま脱水することの難しさ、ならびに各標的病原体の抗体の単離および作製に関連するコストに悩まされている。本発明は、これらの従来技術の方法に対する改善である、核酸等の標的ポリマーを同定するための方法および装置を提供しようとするものである。

国際公開第２００９／０３０９５３号は、配列決定装置、とくに、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド試料（例えば、天然発生するＲＮＡまたはＤＮＡ）中のヌクレオチド（塩基または塩基対）の配列がこれをナノポアの開口部内にまたはこれに隣接して並置されたプラズモンナノ構造を備えるナノ多孔質基板を通して転位させることにより読まれる配列決定装置について開示している。このデバイスでは、プラズモンナノ構造が、（任意で標識された）各ヌクレオチドが順に入射光との相互作用により特異的に光子を蛍光させるまたはラマン散乱するよう誘導される、検出窓（本質的には電磁場）を画定する。こうして生成された光子は、その後、遠隔で検出され、多重化され、その情報内容がポリヌクレオチドに関連するヌクレオチド配列に特異的なデータストリームに変換される。この配列は、その後、それと一体化したマイクロプロセッサまたはそれに付属した計算デバイス中にプログラムされた対応するソフトウェアにおいて具現化された計算アルゴリズムを用い、データストリームから回収することができる。

米国特許出願公開第２００５／００８４９１２号は、ナノポアを通って転位するＤＮＡ検体の連続するヌクレオチドの配列が、ナノレンズと１つ以上のプラズモン共鳴粒子を備えるチップ領域とを備える検出器を用いてラマン分光により決定される、改善されたナノ分光走査の方法および装置について開示している。

欧州特許第２１９６７９６号は、ＤＮＡがナノ多孔質膜を通して転位され、その構成するヌクレオチド配列が、電気的手段により、またはプラズモン共鳴で増強することができる透過光学分光により決定される、単一分子光学分光法について開示している。欧州特許第２３２４３３８２号は、プラズモンにより生成された力場が、ナノポアを通るＤＮＡの転位速度に影響を与えるように用いられる、一般的には同様の対象事項に関する。

ＤＮＡ試料中のヌクレオチドの正確な配列を検出するのに用いられる場合における、上述のもの等のデバイスに見られる１つの難点は、隣接するヌクレオチド塩基間を確実に区別することである。例えば、プラズモン共鳴で増強した蛍光による検出のため、核酸鎖中の隣接するヌクレオチドがともにフルオロフォアで標識される場合、フルオロフォアは互いに干渉する傾向があり、多かれ少なかれ相互消光を引き起こす。この現象は、ナノポアを通るＤＮＡ分子の転位速度が速く、高い検出率が必要になる場合に、悪化する。我々はここで、個別のヌクレオチドそのものに対して鎖中のヌクレオチドの高次構造を標識することにより、この難点を克服することができることを見出した。こうした高次構造は、消光の問題を低減または除去することもできるように、それらが互いに切り離されるように適切に選択される。こうした方法により得られたデータは、もはや試料中のヌクレオチドの完全配列ではないが、標識された高次構造の試料全体にわたる分布プロファイルを得ることができ、これ自体かなり有用な情報を提供することができる。

本発明の第１態様では、標的ポリマーの同定方法を提供する。適切には、この方法は、検出可能要素を有する標的ポリマーを、ナノポアおよび検出窓を備える分析デバイスに通して転位させるステップであって、前記分析デバイスが、プラズモン共鳴して、検出窓を画定する局在電磁場を生成することができる、ステップを含む。この方法において、検出可能要素は、それらが検出窓を通過する際に検出され、標的ポリマーに沿った検出可能要素の分布プロファイルを生成する。その後、標的ポリマーは、その分布プロファイルを既知のポリマーの分布プロファイルの参照セットと比較することにより、同定することができる。

本発明の方法は、原理的には、上述したナノポアに通す転位に適したサイズを有し、例えば、広範囲のポリオレフィンおよび縮合ポリマーを含む、１つ以上、好適には２つ以上のモノマー単位の繰り返し単位からなる実質的に線状の構造を有する、任意のタイプの標的ポリマーを同定するのに用いることができる。これは、しかしながら、主として、実質的に非分岐の、核酸等の線状ポリマーの生体分子、またはそれらから誘導される線状のポリペプチドもしくはタンパク質を分析するように設計され、とくに核酸の分析に適している。

本明細書において用いられる「核酸」の語は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。ヌクレオチドそのものは、（一本鎖の核酸分子における）塩基または（二本鎖の核酸分子における）塩基対を指すことがある。本発明において標的ポリマーとして用いるのに適した核酸は、一般的には天然発生する核酸ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの合成バージョンである。しかしながら、本方法は、所望に応じてＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）、ＧＮＡ（グリコール核酸）およびＴＮＡ（トレオース核酸）のような類似体に適用することもできる。核酸そのものは、順に適切には、以下のヌクレオチド：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、ワイブトシン、シュードウリジン、ケウオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンおよび２−Ｏ−メチルウリジンの少なくともいくつかの配列を含む。

一般的に、核酸配列の長さは、それが含有するヌクレオチドの数を単位として表される。例えば、「キロベース」（ｋｂ）の語はヌクレオチド１０００個を意味し、「メガベース」（Ｍｂ）はヌクレオチド１，０００，０００個を意味する。核酸は、いずれの長さも有し得るが、一般的には、少なくとも１０個の塩基（一本鎖の核酸中に）もしくは塩基対（二本鎖の核酸中に）の長さ、より一般的には少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００のもしくはそれより多い塩基／塩基対の長さ、または１ｋｂ、２ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２５０ｋｂ、５００ｋｂもしくは１Ｍｂまでまたはそれより長い長さである。とくに、本発明の方法は、配列長さの長い核酸、例えば細菌、ウィルスまたは真核生物遺伝子に特異的なものを迅速に同定するのに有用である。従って、本方法は、血液、唾液、尿または食品のような生物学的試料中の被疑病原体を迅速に同定するのに有利に用いることができる。

本発明の方法の特徴は、標的ポリマーが検出可能要素をさらに含むことである。これらの検出可能要素は、標的ポリマーが分析デバイスの検出窓を通過する際に検出可能な特徴を示す標的ポリマー中のまたはこれに付着した任意の要素とすることができる。一般的には、複数の同じまたは異なる検出可能要素が用いられる。標的ポリマー中のまたはこれに付着した検出可能要素の正確な数は、ある程度、標的ポリマーの特徴、例えばその長さ、それが含む異なるモノマー単位の数などと、その特徴づけに必要な特異度とによって決まるであろう。しかしながら、前記検出可能要素の数は、常に、標的ポリマーまたは分析する標的ポリマーのその一部中のモノマー単位の総数より少なく、鎖中の少なくとも２つの隣接するポリマー単位に特異的であるべきである。よって、標的ポリマーは、ＤＮＡのような核酸である場合、その中のまたはそれに付着した少なくとも２つの検出可能要素を有し、それぞれは４つの特異的な構成ヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴの配列に特異的である。適切には、検出可能要素は、検出窓を通過させた際にそれらが対応する特異的シグナルを、直接的または間接的に、生成することができるようなものである。本発明の好適な実施形態では、この特異的シグナルは、適切には、検出窓内の入射光を蛍光またはラマン散乱する検出可能要素に特異的な光子の放出により生成される。ラマン散乱の場合、検出可能要素は、標的ポリマーそのものの分子構造の一部を形成することができ、またはこれに付着したラマン分光を用いて同定可能な要素中に存在することができる。

本発明の１つの態様では、検出可能要素は、核酸中のヌクレオチドの特定の特異的配列、例えば少なくとも２つ、適切には少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの隣接するヌクレオチドの特異的配列（例えば、本明細書において以降２マー、３マー、４マー、５マー、６マー等と称される配列）のみに付着可能となるように設計された標識を用いて生成される。この実施形態において、標識は、好適には、フルオロフォア、またはオリゴヌクレオチドプローブ、例えばＴＴＧＴＴＴ、ＡＡＴＴＴＴ、ＴＣＧＣＣＧおよびＴＴＧＣＧＣのようなヌクレオチド６マーに付着したラマン散乱を発生させることができる部分要素を含む。かかるプローブは、その後、ハイブリダイゼーションにより核酸の一本鎖中の相補的配列に付着させ、これにより、プローブが適合する領域において核酸を標識することができる。これは、複数の検出可能要素を核酸にさまざまな点で付着させ、これは読み込み可能な「バーコード」に例えることができる特有の分布プロファイルを表す。同時に、検出可能要素は、核酸に付着した場合、個別の検出可能要素がヌクレオチド鎖上で、ヌクレオチド少なくとも１０個分、好適にはヌクレオチド少なくとも２０個分だけ離れるように設計される。実際、これは、ヌクレオチド１０〜１０００個、好適には２０〜１００個の範囲内で離れるべきであることを意味する。この分離は、一般的には、広範囲の種において発生することが見られるものの所定の核酸では高度に繰り返されないヌクレオチド配列を標的化することにより、達成することができる。これらのプローブの選択は、これらのプローブの広範囲の生物との結合のインシリコモデリングによって補助することができる。検出可能要素は、標的ポリマーの全部または一部にわたって付着することができ、これにより、その全部または少なくとも一部に特異的な分布プロファイルを生成することができる。好適には、分析する核酸中のまたはこれに付着したこうした検出可能要素の数は、１０００未満、好適には５００未満である。

特異的シグナルが蛍光により生成される場合、検出可能要素は、これに化学的または物理的に結合したフルオロフォア、すなわち蛍光標識、タグまたはマーカーを含むことが好ましい。適切なフルオロフォアとしては、以下の一般的に用いられる材料：Ａｌｅｘａ染料、シアニン染料、Ａｔｔｏ Ｔｅｃ染料、およびローダミン染料を含む。例としては：Ａｔｔｏ６３３（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）、Ａｔｔｏ７４０（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）、ローズベンガル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）７５０Ｃ_５−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５３２Ｃ_２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにローダミンレッドＣ_２−マレイミドおよびローダミングリーンが挙げられる。これらのフルオロフォアは、それぞれ当技術分野において知られる技術を用いてヌクレオチドに付着させることができる。

入手後、標的ポリマーに特異的な分布プロファイルは、既知のポリマーに特異的な所定プロファイル、例えばさまざまな既知の病原体のＤＮＡに特異的なプロファイルの参照セットに対して比較することができる。本発明の方法の利点は、とくに標的ポリマーがＤＮＡである場合、分布プロファイルの情報内容は完全ＤＮＡ配列よりかなり少ないが、それにも関わらず、標的ＤＮＡを参照セットの中から同定するのに十分に特異的であることである。これにより、未知の病原体試料の同定が、完全デノボＤＮＡ配列決定よりかなり迅速かつ安価になる。標的ポリマーは、そのプロファイルを参照セットに対して最適の統計的方法または目視検査を用いて比較することにより、同定することができる。一般的に、比較は、計算的に行われ、一連のロジック決定ルール、さまざまな回帰分析および分類法（線形または非線形）、パターンマッチングおよび機械学習法（例えばニューラルネットワーク、カーネル法またはグラフィックモデル）に基づくことができる。例えば、比較は、データベースまたは標的ポリマーの分布プロファイルの参照セット、およびプロセッサにより実行されると標的ポリマーの分布プロファイルを参照セットと比較する命令を含むメモリを有するコンピュータにより、行うことができる。一致が見られない場合には、標的ポリマーを他の手段により同定し、分布プロファイルは今後の参照のため参照セットに追加することができる。

コンピュータ命令は、データベースにより未知の標的に対応する分布プロファイルを同定することもできる。これを用い、例えば、変異またはさらに新規病原体により引き起こされる新規突発を迅速に検出するのを助けることができる。

本発明の方法において、検出可能要素を有する標的ポリマーは、適切には、これをプラズモン共鳴により生成される局在電磁場により画定される検出窓を有するナノポアを備える分析デバイスを通して転位させることで分析される。これは、この電磁場、検出可能要素およびに検出窓に影響を及ぼすいずれかの入射電磁放射線の間の相互作用であり、これは容易に検出および分析することができる増加したレベルの蛍光またはラマン散乱を発生させる。この分析デバイスの特徴に関するさらなる情報は、国際公開第ＷＯ２００９／０３０９５３号に見ることができ、その内容は、本明細書に参照により組み入れる。簡潔に、分析デバイスは、試料供給室と収容室とを分離するナノ多孔質基板を備える。ナノ多孔質基板は、無機絶縁体または有機もしくは生物学的材料から製造することができる。好適には、ナノ多孔質基板は、炭化ケイ素ウエハのような無機絶縁体である。一般的に、ナノポアは、直径１ｎｍ〜１００ｎｍ、好適には１ｎｍ〜３０ｎｍ、１ｎｍ〜１０ｎｍ、１ｎｍ〜５ｎｍまたは２ｎｍ〜４ｎｍである。標的ポリマーは、適切には、電気泳動によりナノポアを通して試料供給室から収容室まで転位される。ナノポアの通過により、標的ポリマーがその開口部からモノマー単位で出るように一貫して直線的な方法で転位することができ、検出可能要素が順番に検出されることを可能にする。

分析デバイスは、ナノポア内にまたはその開口部に隣接して並置された検出窓を備える。一般的に、この検出窓は、レーザーのようなコーヒレント源からの入射電磁放射線の影響下でプラズモン共鳴を行うことができる金または銀で製造された１つ以上の金属部分により画定される。このプラズモン共鳴は、標的ポリマーが通過する強い局在電磁場を生成する。これらの金属部分の正確な形状が、検出窓の形状を決定し、よって、検出可能要素との相互作用の性質に影響を及ぼす。例えば、検出窓の形状は、横方向局在化ではなく、光子放出の増加について最適化するように選択することができる。これは、より大きなｚ長さ（ポリマーがこれに沿って転位する寸法）を有する検出窓を生成し、それらのピークプラズモン共鳴周波数が所望の波長で維持されるようにするため、それらの形状をｘおよびｙ寸法で適切に変更することにより達成される。検出窓を解像度ではなくシグナルの強度について異なって寸法決定することにより、サブナノメートルの局在化を必要としない検出可能要素を有する標的ポリマーの検出を改善することができる。好適には、検出窓は、２つ以上の検出可能要素が検出窓中に同時にあり得るようにサイズ決定され、ｚ寸法の長さが１〜１００、好適には１０〜５０ナノメートルとなるようなものである。

検出可能要素および電磁場の相互作用により生成されるシグナルは、蛍光の場合にフォトカウンター、またはラマン散乱の場合にスペクトロメーター、等の検出器により検出することができる。こうしたデバイスの出力は、一般的には標的ポリマーの分布プロファイルに特異的な電気シグナルである。

本発明の方法は、適切には、複数の検出器および複数の分析デバイスを用いることができる。例えば、数組の検出器および分析デバイスのアレイを、各検出器がその組み合わされた分析デバイスを用いて生成された光子を検出するようにアレンジして用いることができる。光電子倍増管または単一光子アバランシェダイオードのような蛍光を検出するための他の検出器を含む他の検出器を用いてもよい。

本発明の第２態様では、検出窓を有するナノポアを備える分析デバイスであって、プラズモン共鳴し、検出窓を画定する局在電磁場を生成することができる、分析デバイス；標的ポリマーの検出可能要素を、それらが検出窓を通過する際に検出し、ポリマーに沿った検出可能要素の分布プロファイルを生成するための検出器；および、その分布プロファイルを、既知のポリマーの分布プロファイルの参照セットと比較するためのコンピュータシステムを備える、標的ポリマーの同定装置を提供する。コンピュータシステムは、一般的に、メモリおよびプロセッサを備える。プロセッサにより実行されると標的ポリマーの分布プロファイルを標的ポリマーの分布プロファイルの参照セットと比較し、標的ポリマーを同定する、コンピュータ実行可能命令を備えることができる。

ここで、本発明を、以下の図面により例示する。
本開示のある態様による方法を示す流れ図である。 図１の方法の第１実施形態を行うための装置を概略的に示す。 図２に示される標的ポリマーを示す。 図３ａの標的ポリマーの分布プロファイルを示す。 図３ｂの分布プロファイルの代替図を示す。 いくつかの例となる分布プロファイルを示す。 いくつかの例となる分布プロファイルを示す。 いくつかの例となる分布プロファイルを示す。

図１は、本発明による方法を示す流れ図を表す。本方法は、検出可能要素（この場合フルオロフォア）を有する標的ポリマーを、検出窓を有するナノポアを通して転位させるステップＳ１０を含む。ナノポアは、入射レーザー光下でプラズモン共鳴し、検出窓を画定する局在電磁場を生成することができる金プラズモン構造を有する分析デバイスの一部である。ステップＳ１２では、検出可能要素が、それらが検出窓を通過する際に検出され、各種フルオロフォアにより生成される蛍光に特異的な分布プロファイルを生成する。ステップＳ１４では、標的ポリマーが、その分布プロファイルを既知のポリマーの分布プロファイルの参照セットと比較することにより同定される。

図２は、分析デバイス２４、光検出器３０、データ収集カード３２およびコンピュータ３４を備える、図１の方法を行うための装置を概略的に示す。２４は、複数の直径４ｎｍのナノポア２８を有する多孔質の非導電性炭化ケイ素ウエハおよび検出窓４０を画定する２８の開口部上に並置された関連する金プラズモン構造２６（ドーナツ形状）を備える。使用時には、病原体２０（血液試料から単離）の未知のＤＮＡ試料を配列特異的蛍光マーカー２２で標識し、電気泳動により２８および４０を通って転位させる。２６は、２８の開口部の周りに局在電磁場を生成し、これは２２と相互作用し、それらを蛍光して光子３８を放出し、これが３０により捕捉される。周波数７５０ｎｍおよびパワー１２ｕＷのレーザー（図示せず）を用い、プラズモン共鳴を誘導する。１つの例では、２２のそれぞれは４つのオリゴヌクレオチド６マーＴＴＧＴＴＴ、ＡＡＴＴＴＴ、ＴＣＧＣＣＧおよびＴＴＧＣＧＣの１つを含み、このそれぞれは異なるフルオロフォアに付着し、ハイブリダイゼーションにより２０中の相補的配列に結合する。２２のそれぞれは、２０上で互いに少なくともヌクレオチド１００個分離れて位置する。こうして作製された検出可能要素の総数は、４００である。

３２を用い、３０の出力を受信し、これを分析のため３４へ転送する。出力は、２０の少なくとも一部の長さにわたる蛍光のプロファイルの形態で分布プロファイルを表す電気シグナルである。３４は、ディスプレイアダプタによってディスプレイおよび１つ以上の入力デバイス（例えばマウスおよび／またはキーボード）に順に接続する、中央バス構造に接続したプロセッサおよびメモリを備える。３４は、同様に中央バスに接続した通信アダプタをさらに備える。通信アダプタは、インターネットのような適切な通信リンクによってコンピュータに送信することができる通信、とくに新規ポリマーの新規分布プロファイルを含む通信を受信することができる。

コンピュータ３４は、データベースまたは既知のポリマーの分布プロファイルの参照セット３６を有し、コンピュータのメモリは、プロセッサにより実行されると標的ポリマーの測定された分布プロファイルをこの参照セットと比較し、パターンマッチングソフトウェアを用いて標的ポリマーを同定する命令を含む。

図３ａは、核酸の形態の２０および蛍光マーカー２２の形態の検出可能要素を示す。図３ｂは、２０の少なくとも一部の長さにわたって検出された蛍光の強度の形態の分布プロファイルを示す。図３ｃは、図３ｂの分布プロファイルの代替図を示す。

図４ａ〜４ｃは、図３ｂと同様の図を用いており、それぞれクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）およびボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の分布プロファイルを示す。

Claims (13)

1. 検出可能要素を有する標的ポリマーを、検出窓を有するナノポアを備える分析デバイスに通して転位させるステップであって、前記分析デバイスは、プラズモン共鳴して前記検出窓を画定する局在電磁場を生成することができる、ステップ；
   前記検出可能要素を、それらが前記検出窓を通過する際に検出し、前記標的ポリマーに沿った前記検出可能要素の分布プロファイルを生成するステップ；および
   前記分布プロファイルを既知のポリマーの分布プロファイルの参照セットと比較することにより、前記標的ポリマーを同定するステップ
   を含む、標的ポリマーの同定方法。
2. 前記検出可能要素の数が、前記標的ポリマー中のモノマー単位の数より少ない、請求項１に記載の方法。
3. 前記標的ポリマーが核酸であり、前記検出可能要素がその中の少なくとも２つの隣接するヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
4. 前記検出可能要素が、前記核酸中の少なくとも４つの隣接するヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
5. 前記検出可能要素が、前記核酸中の少なくとも６つの隣接するヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
6. 前記検出可能要素がフルオロフォアを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
7. 前記検出可能要素が、ラマン分光を用いて同定可能である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
8. 前記分布プロファイルが、前記標的ポリマーの少なくとも一部の長さにわたる蛍光のプロファイルであり、且つ、前記プラズモン共鳴が、前記検出可能要素の蛍光特性を増強する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
9. 前記分布プロファイルが、前記標的ポリマーの少なくとも一部の長さにわたるラマン散乱のプロファイルであり、且つ、前記プラズモン共鳴が、前記検出可能要素からのラマン散乱のレベルを増加させる、請求項７に記載の方法。
10. 前記ナノポアが、無機絶縁体であるナノ多孔質基板に位置する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記検出窓が、２つ以上の検出可能要素が同時に前記検出窓中にあり得るようにサイズ決定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記検出窓が１ナノメートル〜１００ナノメートルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
13. 前記検出窓が１０〜５０ナノメートルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。