JP2015211667A - Search method of urine odor suppressor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、尿臭抑制剤の探索方法に関する。 The present invention relates to a method for searching for a urine odor inhibitor.
近年、下水道整備の向上により、トイレにおける便と尿が長期間接触することにより発生する強烈なアンモニア臭の問題は減少傾向にある。その反面、近年では、臭いの強度は弱いものの、トイレに飛び散った尿や、使用済みおむつから発する尿臭が問題にされている。 In recent years, due to the improvement of sewerage maintenance, the problem of intense ammonia odor caused by long-term contact between stool and urine in the toilet has been decreasing. On the other hand, in recent years, although the intensity of odor is weak, urine splattered in the toilet and urine odor emitted from used diapers have been a problem.
特許文献１には、飛び散って乾燥した尿や、使用後放置したおむつから発する尿臭に対する最も寄与の高い成分がｐ−クレゾールであることが記載されている。また特許文献１には、ｐ−クレゾールと、それ以外の炭素数６〜１０のフェノール化合物、例えば、フェノール、ジメチルフェノール、メトキシフェノール、メトキシビニルフェノール、ジヒドロキシベンゼンとの組成物により、当該尿臭を再現できることが記載されている。また、菌が産生するβ−グルクロニダーゼが尿に作用すると、フェノール、ｐ−クレゾール、４−ビニル−２−メトキシ−フェノール、４−ビニルフェノール、２−メトキシ−１，３−ベンゼンジオール、１，４−ベンゼンジオール、１，３−ベンゼンジオール、インドール等の成分が尿中に増加し、尿臭強度を顕著に増加させることが知られている（特許文献２）。これらの成分は尿臭への寄与の高い成分であると考えられている。 Patent Document 1 describes that p-cresol is the component most contributing to urine odor emitted from urine that has been scattered and dried and diapers left after use. Patent Document 1 discloses the urine odor by a composition of p-cresol and other phenol compounds having 6 to 10 carbon atoms, such as phenol, dimethylphenol, methoxyphenol, methoxyvinylphenol, and dihydroxybenzene. It is described that it can be reproduced. Further, when β-glucuronidase produced by bacteria acts on urine, phenol, p-cresol, 4-vinyl-2-methoxy-phenol, 4-vinylphenol, 2-methoxy-1,3-benzenediol, 1,4 -It is known that components such as benzenediol, 1,3-benzenediol, and indole increase in urine and remarkably increase urine odor intensity (Patent Document 2). These components are considered to be components having a high contribution to urine odor.
従来の香料物質や消臭物質の開発においては、匂いの評価は専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。 In the development of conventional fragrance substances and deodorant substances, odor evaluation has been carried out by sensory tests by experts. However, the sensory test has problems such as the need to train experts who can evaluate odors and low throughput.
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。 In mammals such as humans, the smell is bound to the olfactory receptor on the olfactory nerve cell located in the olfactory epithelium in the upper nasal cavity, and the response of the receptor is transmitted to the central nervous system. It is recognized by. In the case of humans, it is reported that there are about 400 olfactory receptors, and the genes encoding them are about 2% of all human genes. In general, olfactory receptors and odor molecules are associated with each other in a plurality of combinations. That is, each olfactory receptor receives a plurality of odor molecules with similar structures with different affinities, while each odorant receptor is received by a plurality of olfactory receptors. Furthermore, it has been reported that an odor molecule that activates one olfactory receptor acts as an antagonist that inhibits activation of another olfactory receptor. The combination of these multiple olfactory receptor responses has led to the recognition of individual odors.
したがって、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、特定の悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないことから、好ましい消臭手段である。特許文献３〜４には、嗅覚受容体の活性を指標として、嗅覚受容体アンタゴニズムによりヘキサン酸やスカトール等の悪臭を抑制する物質を探索することできることが記載されている。特許文献５にも、嗅覚受容体の活性を指標として汗臭を抑制する物質を探索することが記載されている。特許文献６には、イソ吉草酸やその等価体の存在下で嗅覚受容体をコードするポリペプチドの活性を測定することで、当該ポリペプチドの機能を調節する薬剤を同定する方法が記載されている。特許文献７には、嗅覚受容体をコードするポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定することにより、嗅覚の感覚に関連する化合物について化学物質のライブラリーをスクリーニングする方法が記載されている。 Therefore, even when the same odor molecule is present, if another odor molecule is present at the same time, the receptor response is inhibited by the other odor molecule, and the finally recognized odor may be completely different. This mechanism is called olfactory receptor antagonism. Unlike the deodorization method by adding another odor such as perfume or fragrance, the modulation of odor by this receptor antagonism can specifically lose recognition of specific bad odors. Since there is no discomfort due to the smell of the agent, this is a preferred deodorizing means. Patent Documents 3 to 4 describe that substances that suppress malodors such as hexanoic acid and skatole can be searched by olfactory receptor antagonism using the activity of the olfactory receptor as an index. Patent Document 5 also describes searching for a substance that suppresses sweat odor by using the activity of an olfactory receptor as an index. Patent Document 6 describes a method for identifying a drug that modulates the function of a polypeptide by measuring the activity of the polypeptide encoding an olfactory receptor in the presence of isovaleric acid or its equivalent. Yes. Patent Document 7 describes a method of screening a library of chemical substances for compounds related to olfactory sensation by identifying a compound that specifically binds to a polypeptide encoding an olfactory receptor.
本発明は、嗅覚受容体の応答を指標として尿臭抑制剤を効率良く探索する方法を提供する。 The present invention provides a method for efficiently searching for a urine odor inhibitor by using an olfactory receptor response as an index.
本発明者は、尿臭の主な原因物質であるｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。また本発明者は、当該嗅覚受容体又はそれと同様の機能を有するポリペプチドの応答を指標とすることにより、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによって尿臭を抑制する物質の評価及び選択が可能であることを見出した。 The present inventor succeeded in newly identifying an olfactory receptor that responds to p-cresol or 2-methoxy-4-vinylphenol, which are the main causative substances of urine odor. Further, the present inventor can evaluate and select a substance that suppresses urine odor by masking with olfactory receptor antagonism by using the response of the olfactory receptor or a polypeptide having the same function as an index. I found out.
したがって本発明は、尿臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び尿臭原因物質を添加すること；
該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法を提供する。
Therefore, the present invention is a method for searching for a urine odor suppressor, which comprises the following:
OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having at least 80% identity in amino acid sequence Add test substances and substances that cause urine odor;
Measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to the causative agent of urine odor; and
Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide based on the measured response;
A method comprising:
本発明によれば、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより尿臭を選択的に消臭することができる尿臭抑制剤を、効率よく探索することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the urine odor inhibitor which can selectively deodorize urine odor by masking by an olfactory receptor antagonism can be searched efficiently.
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段（例えば、封じ込め）、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、などが挙げられる。 In this specification, the term “masking” relating to odor refers to all means for making the target odor unrecognized or weakening recognition. “Masking” may include chemical means, physical means, biological means, and sensory means. For example, as masking, any means for removing odor molecules that cause the target odor from the environment (for example, adsorption and chemical decomposition of odor molecules), to prevent the target odor from being released into the environment. (For example, containment), a method of adding another odor such as a fragrance or a fragrance to make it difficult to recognize the target odor, and the like.
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。 In the present specification, “masking by olfactory receptor antagonism” is one form of the above-mentioned “masking” in a broad sense, and by applying the target odor molecule and other odor molecules together, It is a means of inhibiting the receptor response to a target odor molecule by a molecule and consequently changing the odor recognized by an individual. Masking by olfactory receptor antagonism is distinguished from means for canceling the target odor by another strong odor, such as a fragrance, even if the means uses other odor molecules. An example of masking by olfactory receptor antagonism is the case of using a substance that inhibits the response of the olfactory receptor, such as an antagonist (antagonist). If a substance that inhibits the response is applied to the receptor of the odor molecule that causes a specific odor, the response of the receptor to the odor molecule is suppressed, so that the odor finally perceived by the individual is changed. Can do.
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。 In the present specification, “olfactory receptor polypeptide” refers to an olfactory receptor or a polypeptide having a function equivalent thereto, and a polypeptide having a function equivalent to an olfactory receptor is similar to an olfactory receptor. A function that increases the amount of intracellular cAMP by activating adenylate cyclase in combination with intracellular Gαs, which can be expressed on the cell membrane and activated by binding of odor molecules (Nat. Neurosci., 2004, 5: 263-278).
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In the present specification, nucleotide sequence and amino acid sequence identity is calculated by the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 1985, 227: 1435-41). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), analysis is performed with Unit size to compare (ktup) as 2. Is calculated by
図１〜４に示すとおり、本発明者は、多くの嗅覚受容体の中から、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、及びＯＲ１０Ｇ７を、各種尿臭原因物質に対して特異的に応答する嗅覚受容体として同定した。これらの嗅覚受容体はいずれも、尿臭原因物質に対して濃度依存的に応答する。したがって、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４若しくはＯＲ１０Ｇ７、又はこれらと同様の機能を有するポリペプチドの応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより、中枢における尿臭の認識に変化を生じさせ、結果として、尿臭を選択的に抑制することができる。 As shown in FIGS. 1 to 4, the present inventor selected OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, and OR10G7 from various olfactory receptors for various urine odor-causing substances. It was identified as an olfactory receptor that responds specifically. All of these olfactory receptors respond in a concentration-dependent manner to substances that cause urine odor. Therefore, a substance that suppresses the response of OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, or OR10G7, or a polypeptide having a function similar to these, by masking based on olfactory receptor antagonism, It is possible to change the recognition of urine odor and, as a result, selectively suppress urine odor.
したがって、本発明は、尿臭抑制剤の探索方法を提供する。当該方法は、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び尿臭原因物質を添加すること；該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、尿臭抑制剤として選択される。 Therefore, the present invention provides a method for searching for a urine odor inhibitor. The method comprises at least one olfactory sensation selected from the group consisting of OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with these. Adding a test substance and a urine odor causing substance to the receptor polypeptide; measuring a response of the olfactory receptor polypeptide to the urine odor causing substance; and based on the measured response, the olfactory receptor Identifying a test substance that inhibits the response of the polypeptide. The identified test substance is selected as a urine odor suppressor.
上記本発明の方法において、尿臭原因物質としては、ｐ−クレゾール、２−メトキシ−４−ビニルフェノール、又はそれらの混合物が好適に使用される。より好ましくは、ｐ−クレゾール、又はｐ−クレゾールと２−メトキシ−４−ビニルフェノールとの混合物が使用される。あるいは、尿のβ−グルクロニダーゼ処理物、又はその抽出物は、ｐ−クレゾールと２−メトキシ−４−ビニルフェノールを含むことから、これらもまた、本発明の方法において尿臭原因物質として使用することができる。尿のβ−グルクロニダーゼ処理物としては、尿にβ−グルクロニダーゼを添加して処理したもの、尿中の菌が産生するβ−グルクロニダーゼで処理された尿、などが挙げられる。 In the method of the present invention, p-cresol, 2-methoxy-4-vinylphenol, or a mixture thereof is suitably used as the urine odor causing substance. More preferably, p-cresol or a mixture of p-cresol and 2-methoxy-4-vinylphenol is used. Alternatively, urinary β-glucuronidase-treated product or extract thereof contains p-cresol and 2-methoxy-4-vinylphenol, and these are also used as urine odor-causing substances in the method of the present invention. Can do. Examples of the urinary β-glucuronidase-treated product include those obtained by adding β-glucuronidase to urine, and urine treated with β-glucuronidase produced by bacteria in the urine.
したがって、本発明の別の実施形態は、ｐ−クレゾール臭抑制剤の探索方法である。当該方法は、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ９Ｑ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びｐ−クレゾールを添加すること；ｐ−クレゾールに対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。当該方法においては、ｐ−クレゾールの代わりに、上述した尿のβ−グルクロニダーゼ処理物又はその抽出物を使用してもよい。同定された試験物質は、ｐ−クレゾール臭抑制剤として選択される。 Therefore, another embodiment of the present invention is a method for searching for a p-cresol odor suppressor. The method comprises subjecting at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of OR2W1, OR4S2, OR5P3, OR9Q2, and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence thereto with a test substance and p. -Adding cresol; measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to p-cresol; and identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide based on the measured response ,including. In this method, the aforementioned urinary β-glucuronidase-treated product or an extract thereof may be used instead of p-cresol. The identified test substance is selected as a p-cresol odor suppressor.
本発明のさらに別の実施形態は、２−メトキシ−４−ビニルフェノール臭抑制剤の探索方法である。当該方法は、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び２−メトキシ−４−ビニルフェノールを添加すること；２−メトキシ−４−ビニルフェノールに対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。当該方法においては、２−メトキシ−４−ビニルフェノールの代わりに、上述した尿のβ−グルクロニダーゼ処理物又はその抽出物を使用してもよい。同定された試験物質は、２−メトキシ−４−ビニルフェノール臭抑制剤として選択される。 Yet another embodiment of the present invention is a method for searching for a 2-methoxy-4-vinylphenol odor inhibitor. The method comprises at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of OR1A1, OR2W1, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR10G4, OR10G7 and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with these. Adding a test substance and 2-methoxy-4-vinylphenol; measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to 2-methoxy-4-vinylphenol; and based on the measured response, Identifying a test substance that inhibits the response of the olfactory receptor polypeptide. In this method, instead of 2-methoxy-4-vinylphenol, the aforementioned urinary β-glucuronidase-treated product or an extract thereof may be used. The identified test substance is selected as a 2-methoxy-4-vinylphenol odor inhibitor.
上記本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる方法であり得る。本発明の方法においては、上記尿臭原因物質に応答性を有する嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質と該尿臭原因物質とが添加される。 The method of the present invention may be a method performed in vitro or ex vivo. In the method of the present invention, a test substance and the urine odor causing substance are added to the olfactory receptor polypeptide having responsiveness to the urine odor causing substance.
本発明の方法に使用される試験物質は、尿臭抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的若しくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。 The test substance used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance desired to be used as a urine odor suppressor. The test substance may be a naturally occurring substance, a substance artificially synthesized by a chemical or biological method, etc., or may be a compound, a composition or a mixture. Good.
本発明の方法に使用される嗅覚受容体ポリペプチドは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である。 Olfactory receptor polypeptides used in the methods of the present invention include OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and polypeptides having at least 80% identity in amino acid sequence with these. Is at least one selected from the group consisting of
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４及びＯＲ１０Ｇ７は、いずれもヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体である。ＯＲ１Ａ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２８９５４７６２２として登録されている。ＯＲ１Ａ１は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ２Ｗ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１６９２３４７８８として登録されている。ＯＲ２Ｗ１は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ４Ｓ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１１６５１７３２４として登録されている。ＯＲ４Ｓ２は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５Ｋ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１１５２７０９５４として登録されている。ＯＲ５Ｋ１は、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５Ｐ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２３５９２２２９として登録されている。ＯＲ５Ｐ３は、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ８Ｈ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２３５３２８９として登録されている。ＯＲ８Ｈ１は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ９Ｑ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２８４４１３７１０として登録されている。ＯＲ９Ｑ２は、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ１０Ｇ４は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２３１７１７１として登録されている。ＯＲ１０Ｇ４は、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ１０Ｇ７は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２２１８８２９として登録されている。ＯＲ１０Ｇ７は、配列番号１７で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。 OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, and OR10G7 are all olfactory receptors expressed in human olfactory cells. OR1A1 is registered in GenBank as GI: 289547622. OR1A1 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. OR2W1 is registered with GenBank as GI: 16234788. OR2W1 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3. OR4S2 is registered in GenBank as GI: 116517324. OR4S2 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5. OR5K1 is registered in GenBank as GI: 115270954. OR5K1 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7. OR5P3 is registered in GenBank as GI: 23592229. OR5P3 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9. OR8H1 is registered with GenBank as GI: 5235289. OR8H1 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11. OR9Q2 is registered in GenBank as GI: 284413710. OR9Q2 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13. The OR10G4 is registered in GenBank as GI: 523317171. OR10G4 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15. OR10G7 is registered in GenBank as GI: 52218829. OR10G7 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17.
ＯＲ１Ａ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR1A1 is at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Preferred is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and responsiveness to 2-methoxy-4-vinylphenol.
ＯＲ２Ｗ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR2W1 includes at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. A polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and having responsiveness to p-cresol or 2-methoxy-4-vinylphenol Is mentioned.
ＯＲ４Ｓ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity with OR4S2 in the amino acid sequence includes at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, Preferred is a polypeptide having an amino acid sequence having 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and responsiveness to p-cresol.
ＯＲ５Ｋ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR5K1 is at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. Preferred is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and responsiveness to 2-methoxy-4-vinylphenol.
ＯＲ５Ｐ３とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR5P3 includes at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. A polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and having responsiveness to p-cresol or 2-methoxy-4-vinylphenol Is mentioned.
ＯＲ８Ｈ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR8H1 is at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12. Preferred is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and responsiveness to 2-methoxy-4-vinylphenol.
ＯＲ９Ｑ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR9Q2 is at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. Preferred is a polypeptide having an amino acid sequence having 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and responsiveness to p-cresol.
ＯＲ１０Ｇ４とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity with OR10G4 in the amino acid sequence includes at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, Preferred is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and responsiveness to 2-methoxy-4-vinylphenol.
ＯＲ１０Ｇ７とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR10G7 is at least 80%, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, Preferred is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and responsiveness to 2-methoxy-4-vinylphenol.
本発明の方法では、上述した嗅覚受容体ポリペプチドから選択される少なくとも１種を使用すればよいが、いずれか２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の方法において、尿臭原因物質がｐ−クレゾールであるか又はそれを含む場合、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、好ましくは、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ４Ｓ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｐ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ９Ｑ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種、さらに好ましくは少なくとも３種、さらにより好ましくは全部が組み合わせて使用される。なお好ましくは、当該少なくとも１種、２種若しくは３種のポリヌクレオチド、又はその全部の組み合わせは、少なくとも、ＯＲ９Ｑ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む。なお好ましくは、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ９Ｑ２が組み合わせて使用される。 In the method of the present invention, at least one selected from the above-described olfactory receptor polypeptides may be used, but any two or more may be used in combination. In the method of the present invention, when the urine odor-causing substance is p-cresol or contains it, the olfactory receptor polypeptide is preferably OR2W1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with this. A peptide, a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR4S2, a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR5P3, and at least 80% in amino acid sequence with OR9Q2 or this At least one selected from the group consisting of polypeptides having identity, more preferably at least 2, more preferably at least 3, even more preferably all are used in combination. Still preferably, the at least one, two or three polynucleotides, or a combination of all of them, includes at least 80% identity of OR9Q2 or an amino acid sequence thereof. Preferably, OR2W1, OR4S2, OR5P3, and OR9Q2 are used in combination.
本発明の方法において、尿臭原因物質が２−メトキシ−４−ビニルフェノールであるか又はそれを含む場合、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｋ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｐ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ８Ｈ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ｇ４又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ１０Ｇ７又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種、さらに好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも４種、さらに好ましくは少なくとも５種、さらに好ましくは少なくとも６種、さらに好ましくは全部が組み合わせて使用される。なお好ましくは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ１０Ｇ４及びＯＲ１０Ｇ７が組み合わせて使用される。 In the method of the present invention, when the urine odor causative substance is 2-methoxy-4-vinylphenol or contains it, the olfactory receptor polypeptide is preferably OR1A1 or at least 80% in amino acid sequence thereof. Polypeptide having identity, OR2W1 or polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence, OR5K1 or polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence, OR5P3 or amino acid sequence with this A polypeptide having at least 80% identity, a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR8H1, or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR10G4, and O 10G7 or at least one selected from the group consisting of polypeptides having at least 80% identity in amino acid sequence, more preferably at least 2, more preferably at least 3, more preferably at least 4, Preferably at least 5, more preferably at least 6, more preferably all are used in combination. Preferably, OR1A1, OR2W1, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR10G4, and OR10G7 are used in combination.
本発明の方法において、上記嗅覚受容体ポリペプチドは、上記尿臭原因物質に対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、当該嗅覚受容体ポリペプチドは、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の、当該嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する当該組換え細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体ポリペプチドの範囲に含まれる。 In the method of the present invention, the olfactory receptor polypeptide can be used in any form as long as it does not lose responsiveness to the urine odor causing substance. For example, the olfactory receptor polypeptide is a tissue or cell that naturally expresses the olfactory receptor polypeptide, such as an olfactory receptor or olfactory cell isolated from a living body, or a culture thereof; the olfactory receptor A membrane of an olfactory cell carrying a polypeptide; a recombinant cell or culture thereof genetically engineered to express the olfactory receptor polypeptide; a membrane of the recombinant cell having the olfactory receptor polypeptide; It can be used in the form of an artificial lipid bilayer membrane having the olfactory receptor polypeptide. All of these forms fall within the scope of the olfactory receptor polypeptide used in the present invention.
好ましい態様においては、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、嗅細胞等の上記嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する細胞、又は当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。 In a preferred embodiment, the olfactory receptor polypeptide is a cell that naturally expresses the olfactory receptor polypeptide such as an olfactory cell, or a recombinant genetically engineered to express the olfactory receptor polypeptide. Cells or cultures thereof are used. The recombinant cell can be produced by transforming the cell using a vector incorporating a gene encoding the olfactory receptor polypeptide.
好適には、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに細胞に導入する。ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されており、配列番号１９で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。 Preferably, in order to promote cell membrane expression of the olfactory receptor polypeptide, a gene encoding RTP (receptor-transporting protein) is introduced into the cell together with the gene encoding the olfactory receptor polypeptide. Preferably, a gene encoding RTP1S is introduced into a cell together with a gene encoding the olfactory receptor polypeptide. An example of RTP1S includes human RTP1S. Human RTP1S is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, which is registered in GenBank as GI: 50234917 and is encoded by a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19.
本発明の方法によれば、上記嗅覚受容体ポリペプチドへの試験物質及び上記尿臭原因物質の添加に続いて、該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内ｃＡＭＰ量測定等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。したがって、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ等が挙げられる。上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する他の方法としては、カルシウムイメージング法が挙げられる。 According to the method of the present invention, following the addition of the test substance and the urine odor causing substance to the olfactory receptor polypeptide, the response of the olfactory receptor polypeptide to the urine odor causing substance is measured. The measurement may be performed by any method known in the art as a method for measuring the response of the olfactory receptor, for example, measurement of intracellular cAMP amount. For example, when the olfactory receptor is activated by an odor molecule, it is known to increase the amount of intracellular cAMP by activating adenylate cyclase in combination with intracellular Gαs (Nat. Neurosci., 2004, 5: 263-278). Therefore, the response of the olfactory receptor polypeptide can be measured by using the amount of intracellular cAMP after addition of the odor molecule as an index. Examples of the method for measuring the amount of cAMP include an ELISA method and a reporter gene assay. Other methods for measuring the response of the olfactory receptor polypeptide include calcium imaging.
次いで、測定された上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に基づいて、上記尿臭原因物質への応答に対して試験物質が及ぼす作用を評価し、当該応答を抑制する試験物質を同定する。試験物質による作用の評価は、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの該尿臭原因物質に対する応答を、対照群における該尿臭原因物質に対する応答と比較することによって行うことができる。対照群としては、異なる濃度の試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加しなかった該嗅覚受容体ポリペプチド、対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加する前の該嗅覚受容体ポリペプチドなどを挙げることができる。 Next, based on the measured response of the olfactory receptor polypeptide, the effect of the test substance on the response to the urine odor causing substance is evaluated, and the test substance that suppresses the response is identified. The effect of the test substance can be evaluated by comparing the response of the olfactory receptor polypeptide to which the test substance has been added to the urine odor causing substance in the control group. As a control group, the olfactory receptor polypeptide to which the test substance of different concentration was added, the olfactory receptor polypeptide to which the test substance was not added, the olfactory receptor polypeptide to which the control substance was added, and the test substance were added. Examples of the olfactory receptor polypeptide may be mentioned.
例えば、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に対して試験物質が及ぼす作用は、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間、試験物質添加群と非添加群との間、試験物質添加群と対照物質添加群との間、又は試験物質添加前後で、上記尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を比較することによって評価することができる。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が抑制される場合、当該試験物質を、該嗅覚受容体ポリペプチドの該尿臭原因物質に対する応答を抑制する物質として同定することができる。 For example, the effect of the test substance on the response of the olfactory receptor polypeptide is between the test substance addition group of the higher concentration and the test substance addition group of the lower concentration, the test substance addition group and the non-addition group. The olfactory receptor polypeptide can be evaluated by comparing the response of the olfactory receptor polypeptide to the urine odor causing substance between the test substance addition group and the control substance addition group, or before and after the test substance addition. When the response of the olfactory receptor polypeptide is suppressed by addition of a test substance or by addition of a higher concentration of the test substance, the test substance is suppressed from the response of the olfactory receptor polypeptide to the urine odor-causing substance. Can be identified.
例えば、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、上記尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することができる。あるいは、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に抑制されていれば、当該試験物質を、上記尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することができる。 For example, the response of the olfactory receptor polypeptide in the test substance addition group measured by the above procedure is preferably suppressed to 60% or less, more preferably 50% or less, and even more preferably 25% or less compared to the control group. If so, the test substance can be identified as a substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide to the urine odor-causing substance. Alternatively, if the response of the olfactory receptor polypeptide in the test substance addition group measured by the above procedure is statistically significantly suppressed as compared to the control group, the test substance is treated as the cause of urine odor. It can be identified as a substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide to the substance.
上記の手順で同定された試験物質は、上記尿臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答を抑制することによって、個体による尿臭の認識を抑制することができる物質である。したがって、上記手順で同定された試験物質は、尿臭抑制剤として選択することができる。本発明の方法によって尿臭抑制剤として選択された物質は、上記尿臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答抑制に基づく嗅覚マスキングによって、尿臭を抑制することができる。 The test substance identified by the above procedure is a substance that can suppress the recognition of urine odor by an individual by suppressing the response of the olfactory receptor to the urine odor causing substance. Therefore, the test substance identified by the above procedure can be selected as a urine odor inhibitor. A substance selected as a urine odor inhibitor by the method of the present invention can suppress urine odor by olfactory masking based on suppression of response of the olfactory receptor to the urine odor causing substance.
したがって、一実施形態において、本発明の方法によって選択された物質は、尿臭抑制剤の有効成分であり得る。あるいは、本発明の方法によって選択された物質は、尿臭を抑制するための化合物又は組成物に、尿臭を抑制するための有効成分として含有され得る。またあるいは、本発明の方法によって選択された物質は、尿臭の抑制剤の製造のため、又は尿臭を抑制するための化合物若しくは組成物の製造のために使用することができる。 Therefore, in one embodiment, the substance selected by the method of the present invention may be an active ingredient of a urine odor suppressor. Or the substance selected by the method of this invention may be contained in the compound or composition for suppressing urine odor as an active ingredient for suppressing urine odor. Alternatively, the substance selected by the method of the present invention can be used for the production of a urine odor inhibitor or for the production of a compound or composition for suppressing urine odor.
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 As exemplary embodiments of the present invention, the following compositions, production methods, uses or methods are further disclosed herein. However, the present invention is not limited to these embodiments.
＜１＞尿臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び尿臭原因物質を添加すること；
該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
<1> A method for searching for a urine odor inhibitor, comprising:
OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having at least 80% identity in amino acid sequence Add test substances and substances that cause urine odor;
Measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to the causative agent of urine odor; and
Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide based on the measured response;
Including methods.
＜２＞ｐ−クレゾール臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ９Ｑ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びｐ−クレゾールを添加すること；
ｐ−クレゾールに対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
<2> A method for searching for a p-cresol odor inhibitor, which is as follows:
A test substance and p-cresol are added to at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of OR2W1, OR4S2, OR5P3, OR9Q2, and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence thereto To do;
measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to p-cresol; and
Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide based on the measured response;
Including methods.
＜３＞２−メトキシ−４−ビニルフェノール臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び２−メトキシ−４−ビニルフェノールを添加すること；
２−メトキシ−４−ビニルフェノールに対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
<3> A method for searching for 2-methoxy-4-vinylphenol odor inhibitor, which is as follows:
A test substance comprising at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of OR1A1, OR2W1, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR10G4, OR10G7, and a polypeptide having at least 80% identity with an amino acid sequence thereof And adding 2-methoxy-4-vinylphenol;
Measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to 2-methoxy-4-vinylphenol; and
Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide based on the measured response;
Including methods.
＜４＞上記＜１＞記載の方法であって、上記尿臭原因物質が、
好ましくは、ｐ−クレゾール、２−メトキシ−４−ビニルフェノール、それらの混合物、又は尿のβ−グルクロニダーゼ処理物若しくはその抽出物であり、
より好ましくは、ｐ−クレゾール、ｐ−クレゾールと２−メトキシ−４−ビニルフェノールとの混合物、又は尿のβ−グルクロニダーゼ処理物若しくはその抽出物である、
方法。
<4> The method according to <1> above, wherein the urine odor causing substance is
Preferably, p-cresol, 2-methoxy-4-vinylphenol, a mixture thereof, or a urinary β-glucuronidase-treated product or an extract thereof,
More preferably, it is p-cresol, a mixture of p-cresol and 2-methoxy-4-vinylphenol, or a urinary β-glucuronidase-treated product or an extract thereof.
Method.
＜５＞上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、
上記ＯＲ１Ａ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ２Ｗ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ４Ｓ２が配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ５Ｋ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ５Ｐ３が配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ８Ｈ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ９Ｑ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ１０Ｇ４が配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ１０Ｇ７が配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、
方法。
<5> The method according to any one of <1> to <4> above, preferably
OR1A1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
The OR2W1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
The OR4S2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6,
The OR5K1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8,
The OR5P3 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10,
The OR8H1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12,
OR9Q2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14,
The OR10G4 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16,
The OR10G7 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18,
Method.
＜６＞上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の方法であって、
上記ＯＲ１Ａ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ２Ｗ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくはｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ４Ｓ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくはｐ−クレゾールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５Ｋ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５Ｐ３とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくはｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ８Ｈ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ９Ｑ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくはｐ−クレゾールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ１０Ｇ４とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ１０Ｇ７とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１８で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドである、
方法。
<6> The method according to any one of <1> to <5> above,
A polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with the OR1A1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Preferably, it is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and preferably responsive to 2-methoxy-4-vinylphenol ,
The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR2W1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. Preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more amino acid sequence, and preferably responsive to p-cresol or 2-methoxy-4-vinylphenol A polypeptide,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with the OR4S2 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. Preferably, it is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and preferably responsive to p-cresol,
The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR5K1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 Preferably, it is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and preferably responsive to 2-methoxy-4-vinylphenol ,
A polypeptide having at least 80% identity with the OR5P3 in the amino acid sequence is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. Preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more amino acid sequence, and preferably responsive to p-cresol or 2-methoxy-4-vinylphenol A polypeptide,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with the OR8H1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12. Preferably, it is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and preferably responsive to 2-methoxy-4-vinylphenol ,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR9Q2 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 Preferably, it is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and preferably responsive to p-cresol,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with the OR10G4 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. Preferably, it is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and preferably responsive to 2-methoxy-4-vinylphenol ,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with the OR10G7 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 Preferably, it is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and preferably responsive to 2-methoxy-4-vinylphenol ,
Method.
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法であって、上記尿臭原因物質がｐ−クレゾールであるか又はそれを含む場合、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、
好ましくは、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ４Ｓ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｐ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ９Ｑ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ４Ｓ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｐ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ９Ｑ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドの組み合わせであり、
なお好ましくは、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ９Ｑ２の組み合わせである、
方法。
<7> The method according to any one of <1> to <6> above, wherein the urine odor causing substance is p-cresol or contains it, the OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, At least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with these,
Preferably, OR2W1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR2W1, or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR4S2, OR5P3 or at least 80% in amino acid sequence with this A polypeptide having identity, and at least one selected from the group consisting of OR9Q2 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR9Q2,
More preferably, OR2W1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR2W1, or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR4S2, OR5P3 or at least 80% in amino acid sequence with this And a combination of OR9Q2 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR9Q2,
Preferably, it is a combination of OR2W1, OR4S2, OR5P3 and OR9Q2.
Method.
＜８＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法であって、上記尿臭原因物質が２−メトキシ−４−ビニルフェノールであるか又はそれを含む場合、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、
好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｋ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｐ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ８Ｈ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ｇ４又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ１０Ｇ７又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｋ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５Ｐ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ８Ｈ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ｇ４又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ１０Ｇ７又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドの組み合わせであり、
なお好ましくは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ１０Ｇ４及びＯＲ１０Ｇ７の組み合わせである、
方法。
<8> The method according to any one of <1> to <6> above, wherein the urine odor-causing substance is 2-methoxy-4-vinylphenol or contains the same, OR1A1, OR2W1 OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having at least 80% identity in amino acid sequence,
Preferably, OR1A1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence, OR2W1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence, OR5K1 or at least 80% in amino acid sequence thereof Polypeptide having identity, OR5P3 or polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence, OR8H1 or polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence, OR10G4 or amino acid sequence with this A polypeptide having at least 80% identity, and at least one selected from the group consisting of OR10G7 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR10G7,
More preferably, OR1A1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR1A1, or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR2W1, or OR5K1 or at least 80% in amino acid sequence with this A polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR5P3, OR8H1 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR5G3, or OR10G4 or an amino acid sequence thereof A polypeptide having at least 80% identity in OR10G7 or a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR10G7,
Preferably, it is a combination of OR1A1, OR2W1, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR10G4 and OR10G7.
Method.
＜９＞上記＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、対照群における上記尿臭原因物質に対する応答を測定することをさらに含み、かつ該対照群が、以下：
上記試験物質を添加しなかった上記嗅覚受容体ポリペプチド；
対照物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチド；又は
上記試験物質添加前の上記嗅覚受容体ポリペプチド
である、方法。
<9> The method according to any one of <1> to <8> above,
Preferably, the method further comprises measuring a response to the urine odor-causing substance in the control group, and the control group includes the following:
The olfactory receptor polypeptide to which the test substance has not been added;
The olfactory receptor polypeptide to which a control substance is added; or the olfactory receptor polypeptide before the addition of the test substance.
＜１０＞上記＜９＞記載の方法であって、好ましくは、
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの上記尿臭原因物質に対する応答が、上記対照群における該尿臭原因物質に対する応答と比べて統計学的に有意に抑制されていた場合に、該試験物質を該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
<10> The method according to <9> above, preferably
When the response to the urine odor causing substance of the olfactory receptor polypeptide to which the test substance is added is statistically significantly suppressed as compared to the response to the urine odor causing substance in the control group, Identifying a test substance as a substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide to the substance causing urine odor;
Further comprising a method.
＜１１＞上記＜９＞記載の方法であって、好ましくは、
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの上記尿臭原因物質に対する応答が、上記対照群における該尿臭原因物質に対する応答に対して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていた場合に、該試験物質を該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
<11> The method according to <9> above, preferably
The response of the olfactory receptor polypeptide to which the test substance is added is preferably 60% or less, more preferably 50% or less, more preferably 50% or less, with respect to the response to the urine odor causing substance in the control group. Identifying the test substance as a substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide to the causative substance of urine odor when preferably suppressed to 25% or less,
Further comprising a method.
＜１２＞上記＜１＞、＜４＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの上記尿臭原因物質に対する応答を抑制する試験物質を、尿臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。 <12> The method according to any one of <1> and <4> to <11>, preferably a test substance that suppresses a response of the olfactory receptor polypeptide to the urine odor causing substance. And further comprising selecting as a urine odor inhibitor.
＜１３＞上記＜２＞、＜５＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドのｐ−クレゾールに対する応答を抑制する試験物質を、ｐ−クレゾール臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。 <13> The method according to any one of <2> and <5> to <11>, wherein a test substance that suppresses a response of the olfactory receptor polypeptide to p-cresol is preferably p. -A method further comprising selecting as a cresol odor suppressor.
＜１４＞上記＜３＞、＜５＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの２−メトキシ−４−ビニルフェノールに対する応答を抑制する試験物質を、２−メトキシ−４−ビニルフェノール臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。 <14> The method according to any one of <3> and <5> to <11>, wherein the response of the olfactory receptor polypeptide to 2-methoxy-4-vinylphenol is preferably suppressed. The method further comprising selecting the test substance as a 2-methoxy-4-vinylphenol odor inhibitor.
＜１５＞上記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、
方法。
<15> The method according to any one of <1> to <14> above,
Preferably, at least one olfactory sensation selected from the group consisting of OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with these. The receptor polypeptide is expressed on a recombinant cell genetically engineered to express the olfactory receptor polypeptide;
Method.
＜１６＞上記＜１５＞記載の方法であって、上記組換え細胞が、
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞であり、
より好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、配列番号２０で示されるアミノ酸配列からなるヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞である、
方法。
<16> The method according to <15> above, wherein the recombinant cell is
Preferably, a cell into which a gene encoding the olfactory receptor polypeptide and a gene encoding RTP1S are introduced,
More preferably, a cell into which a gene encoding the olfactory receptor polypeptide and a gene encoding human RTP1S consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 have been introduced.
Method.
＜１７＞上記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドとして、上記＜１５＞又は＜１６＞記載の組換え細胞又はその培養物が使用される、
方法。
<17> The method according to any one of <1> to <14> above,
Preferably, at least one olfactory sensation selected from the group consisting of OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and a polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with these. As the receptor polypeptide, the recombinant cell according to <15> or <16> or a culture thereof is used.
Method.
＜１８＞上記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡ若しくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによる測定である、方法。
<18> The method according to any one of <1> to <17> above,
Preferably, the measurement of the response of the olfactory receptor polypeptide is measurement of intracellular cAMP amount by ELISA or reporter gene assay, or measurement by calcium imaging.
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 EXAMPLES Hereinafter, an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely.
実施例１ 尿臭原因物質に応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組み込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
Example 1 Identification of olfactory receptor responding to urine odor causing substance 1) Cloning of human olfactory receptor gene The human olfactory receptor is a human genomic DNA female (G1521: Promega) based on sequence information registered in GenBank. Cloning was carried out by PCR using as a template. Each gene amplified by the PCR method is incorporated into a pENTR vector (Invitrogen) according to the manual, and NotI and AscI prepared downstream of the Flag-Rho tag sequence on the pME18S vector using the NotI and AscI sites present on the pENTR vector. Recomposed to the site.
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ＲＴＰ１Ｓ（配列番号２０）をコードするＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号１９）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
2) Preparation of pME18S-human RTP1S vector The RTP1S gene (SEQ ID NO: 19) encoding RTP1S (SEQ ID NO: 20) was incorporated into the EcoRI and XhoI sites of the pME18S vector.
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体約４００種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μＬずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
3) Preparation of olfactory receptor-expressing cells HEK293 cells each expressing about 400 types of human olfactory receptors were prepared. A reaction solution having the composition shown in Table 1 was prepared and allowed to stand in a clean bench for 15 minutes, and then added to each well of a 96-well plate (BD). Next, 100 μL of HEK293 cells (3 × 10 5 cells / cm 2 ) were seeded in each well and cultured in an incubator maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製した匂い物質（ｐ−クレゾール１ｍＭ、又は２−メトキシ−４‐ビニルフェノール３００μＭ）を含む溶液を７５μＬ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で２．５時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
4) Luciferase assay The olfactory receptor expressed in HEK293 cells increases the amount of intracellular cAMP by coupling with intracellular Gαs and activating adenylate cyclase. For the measurement of odor response in this study, a luciferase reporter gene assay was used which monitors the increase in intracellular cAMP level as a luminescence value derived from the firefly luciferase gene (fluc2P-CRE-hygro). In addition, a renilla luciferase gene fused to the downstream of the CMV promoter (hRluc-CMV) was introduced at the same time, and used as an internal standard for correcting errors in gene transfer efficiency and cell number.
The medium was removed from the culture prepared in the above 3), and 75 μL of a solution containing an odorant (p-cresol 1 mM or 2-methoxy-4-vinylphenol 300 μM) prepared with CD293 medium (Invitrogen) was added. The cells were cultured for 2.5 hours in a CO 2 incubator to fully express the luciferase gene in the cells. The luciferase activity was measured using a Dual-Glo ™ luciferase assay system (Promega) according to the operation manual of the product. A value obtained by dividing the luminescence value derived from firefly luciferase induced by odor substance stimulation by the luminescence value in cells not subjected to odor substance stimulation was calculated as a fold increase, and used as an index of response intensity.
５）結果
３８７種類の嗅覚受容体についてｐ−クレゾール１ｍＭに対する応答を測定した結果、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ９Ｑ２が応答を示した（図１）。これらの嗅覚受容体のｐ−クレゾールに対する応答は、濃度依存的であった（図２）。ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ９Ｑ２は、これまでｐ−クレゾールに応答することが見出されていない、新規のｐ−クレゾール受容体である。
5) Results As a result of measuring the response to 1 mM of 387 types of olfactory receptors, OR2W1, OR4S2, OR5P3, and OR9Q2 showed responses (FIG. 1). The response of these olfactory receptors to p-cresol was concentration dependent (FIG. 2). OR2W1, OR4S2, OR5P3 and OR9Q2 are novel p-cresol receptors that have not previously been found to respond to p-cresol.
同様に、４１７種類の嗅覚受容体について２−メトキシ−４−ビニルフェノール３００μＭに対する応答を測定した結果、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ１０Ｇ４及びＯＲ１０Ｇ７が応答を示した（図３）。これらの嗅覚受容体の２−メトキシ−４−ビニルフェノールに対する応答は、濃度依存的であった（図４）。ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ１０Ｇ４及びＯＲ１０Ｇ７は、これまで２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答することが見出されていない、新規の２−メトキシ−４−ビニルフェノール受容体である。 Similarly, as a result of measuring responses to 300 μM of 2-methoxy-4-vinylphenol for 417 types of olfactory receptors, OR1A1, OR2W1, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR10G4, and OR10G7 showed responses (FIG. 3). The response of these olfactory receptors to 2-methoxy-4-vinylphenol was concentration dependent (FIG. 4). OR1A1, OR2W1, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR10G4 and OR10G7 are novel 2-methoxy-4-vinylphenol receptors that have not previously been found to respond to 2-methoxy-4-vinylphenol. .
実施例２ 嗅覚受容体応答に基づく尿臭抑制物質の探索
１）尿臭受容体ンタゴニストの同定
実施例１で同定した尿臭原因物質に応答する嗅覚受容体（尿臭受容体）のアンタゴニストを探索し、その尿臭抑制作用を評価した。尿臭受容体の例として、ｐ−クレゾール受容体ＯＲ９Ｑ２を用いた。
実施例１と同様の手順でＨＥＫ２９３細胞に発現させたＯＲ９Ｑ２に対して、１００μＭのｐ−クレゾール刺激下で試験物質を適用し、該試験物質による該受容体のｐ−クレゾール応答の抑制作用を調べた。試験物質存在下でのｐ−クレゾールに対するＯＲ９Ｑ２の応答強度は以下のとおり算出した。各種刺激条件について、ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃを算出した。ｐ−クレゾール単独での匂い刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｘ）を、同じ受容体を導入し刺激を行わなかった細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）で引き算し、ｐ−クレゾール単独刺激による受容体活性（Ｘ−Ｙ）を求めた。同様に、ｐ−クレゾールと試験物質との混合物での刺激によるｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｚ）を、刺激を行わない細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）で引き算し、試験物質添加時の受容体活性（Ｚ−Ｙ）を求めた。次いで、以下の計算式により、ｐ−クレゾール単独刺激による受容体活性（Ｘ−Ｙ）に対する試験物質添加時の受容体活性（Ｚ−Ｙ）の割合を算出し、試験物質による受容体の応答強度（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ％）を求めた。独立した実験を３回行い、各回の実験の平均値を得た。
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（％）＝（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）×１００
Example 2 Search for Urinary Odor Receptor Substance Based on Olfactory Receptor Response 1) Identification of Urinary Odor Receptor Agent Tagonist Search for antagonists of olfactory receptor (urine odor receptor) that respond to the urine odor causing substance identified in Example 1 The urine odor suppressing action was evaluated. As an example of the urine odor receptor, p-cresol receptor OR9Q2 was used.
A test substance was applied to OR9Q2 expressed in HEK293 cells in the same procedure as in Example 1 under stimulation with 100 μM of p-cresol, and the inhibitory action of the p-cresol response of the receptor by the test substance was examined. It was. The response intensity of OR9Q2 to p-cresol in the presence of the test substance was calculated as follows. For various stimulation conditions, a value fLuc / hRluc obtained by dividing the luminescence value derived from firefly luciferase by the luminescence value derived from Renilla luciferase was calculated. The fLuc / hRluc value (X) induced by odor stimulation with p-cresol alone was subtracted by the fLuc / hRluc value (Y) in cells that had not been stimulated by introduction of the same receptor, and p-cresol alone Receptor activity (XY) by stimulation was determined. Similarly, the fLuc / hRluc value (Z) by stimulation with a mixture of p-cresol and the test substance is subtracted by the fLuc / hRluc value (Y) in cells without stimulation, and the receptor at the time of addition of the test substance Activity (ZY) was determined. Next, the ratio of the receptor activity (ZY) at the time of addition of the test substance to the receptor activity (XY) by p-cresol single stimulation is calculated by the following formula, and the response intensity of the receptor by the test substance (Response%) was determined. Independent experiments were performed three times, and the average value of each experiment was obtained.
Response (%) = (Z−Y) / (XY) × 100
実験の結果、Ｎｅｃｔａｒｙｌ（３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）プロピオンアルデヒド）及びＢｏｕｒｇｅｏｎａｌ（２−（２−（４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル）プロピル）シクロペンタノン）がＯＲ９Ｑ２アンタゴニストであることが分かった。これらの物質によるＯＲ９Ｑ２のｐ−クレゾール応答の抑制効果を図５に示す。Ｎｅｃｔａｒｙｌ及びＢｏｕｒｇｅｏｎａｌはいずれも、種々の濃度でＯＲ９Ｑ２のｐ−クレゾール応答を抑制した。 As a result of the experiment, Netheryl (3- (4-tert-butylphenyl) propionaldehyde) and Bourgeonal (2- (2- (4-methyl-3-cyclohexen-1-yl) propyl) cyclopentanone) are OR9Q2 antagonists. I found out. The inhibitory effect of OR9Q2 on the p-cresol response by these substances is shown in FIG. Nectaryl and Bourgeonal both suppressed the p9-cresol response of OR9Q2 at various concentrations.
２）尿臭受容体アンタゴニストによる尿臭抑制能
上記１）で同定したアンタゴニストＢｏｕｒｇｅｏｎａｌ及びＮｅｃｔａｒｙｌによる尿臭抑制効果を官能試験により確認した。
尿臭物質として、β−グルクロニダーゼ処理した尿の抽出物を調製した。人尿原液を３７℃で２時間β−グルクロニダーゼ処理し、次に塩酸を用いてｐＨ４程度に調整し、ジクロロメタンで抽出を行った。得られたジクロロメタン層に水酸化ナトリウム水溶液を添加して、酸性成分を水層に移行させて抽出し、中性成分を除去した。得られた水層を塩酸を用いて酸性とした後、ジエチルエーテルで再抽出を行い、濃縮して抽出物を得た。尿原液８０ｍＬ相当量の抽出物を１ｍＬのエタノールに溶解し、これを尿抽出液とした。この尿抽出液をミネラルオイルで１．２５容量％になるよう希釈したものを尿臭物質として使用した。
Ｂｏｕｒｇｅｏｎａｌ又はＮｅｃｔａｒｙｌをミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）に溶解させて１％（ｖ／ｖ）溶液を調製し、試験物質溶液として用いた。
２０ｍＬ容のガラス瓶（マルエム、Ｎｏ．６）に２つの綿球を入れ、１つの綿球には尿臭物質３０μＬを、もう１つの綿球にはＢｏｕｒｇｅｏｎａｌ又はＮｅｃｔａｒｙｌのいずれかの試験物質溶液３０μＬを染み込ませた。綿球を入れたガラス瓶は蓋をして３７℃で１時間静置した後、匂いサンプルとして官能試験に用いた。基準サンプルとして尿臭物質のみ、対照サンプルとしてミネラルオイルのみ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を準備した。
2) Urinary odor suppression ability by urine odor receptor antagonist The urine odor suppression effect by the antagonists Bourgeonal and Nectaryl identified in 1) above was confirmed by a sensory test.
A urine extract treated with β-glucuronidase was prepared as a urine odor substance. The human urine stock solution was treated with β-glucuronidase at 37 ° C. for 2 hours, then adjusted to about pH 4 with hydrochloric acid, and extracted with dichloromethane. A sodium hydroxide aqueous solution was added to the resulting dichloromethane layer, and the acidic component was transferred to the aqueous layer and extracted to remove the neutral component. The obtained aqueous layer was acidified with hydrochloric acid, re-extracted with diethyl ether, and concentrated to obtain an extract. An extract equivalent to 80 mL of the urine stock solution was dissolved in 1 mL of ethanol to obtain a urine extract. The urine extract diluted with mineral oil to 1.25% by volume was used as a urine odor substance.
Bourgeonal or Nectaryl was dissolved in mineral oil (Sigma) to prepare a 1% (v / v) solution, which was used as a test substance solution.
Place two cotton balls into a 20 mL glass bottle (Marem, No. 6), 30 μL of urine odor substance in one cotton ball, and 30 μL of either Bourgeonal or Nectaryl test substance solution in the other cotton ball. Soaked. The glass bottle containing the cotton ball was covered and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour, and then used as an odor sample in the sensory test. Only the urine odor substance was prepared as a reference sample, and only mineral oil (Vehicle) was prepared as a control sample.
官能試験は、１０名の評価者により単盲式にて行った。試験は、食後１時間半以上を経過した１４時以降から開始した。匂いの拡散を防ぐため、試験は基本的にドラフト付近で行った。匂いへの順応の影響を排除するため、試験中には適宜、尿臭物質からの尿臭の認知強度を確認させ、必要であれば休憩をとった。評価者を二群に分け、一方の群はＢｏｕｒｇｅｏｎａｌを含む匂いサンプルから、他方の群はＮｅｃｔａｒｙｌを含む匂いサンプルから評価を始めて、２つの試験物質の尿臭抑制効果を評価した。匂いサンプルは、３名の評価者による評価後に新しいものと交換した。
匂いサンプルの評価では、次の５段階の基準「尿抽出物の匂いが、１：わからない、２：感知できる、３：楽にわかる、４：強く感じる、５：耐えられないほど強く感じる」を設定し、尿臭物質単独での尿臭強度を３としたときの各匂いサンプルからの尿臭強度を、１．０から０．５刻みで５．０までの９段階で評価した。
The sensory test was conducted in a single blind manner by 10 evaluators. The test was started from 14:00 after 1 and a half hours had passed since the meal. In order to prevent the spread of odors, the test was basically performed near the draft. In order to eliminate the effect of adaptation to odor, the cognitive intensity of urine odor from urine odor substances was confirmed as needed during the test, and a break was taken if necessary. The evaluators were divided into two groups, one group was evaluated from an odor sample containing Bourgeonal, and the other group was evaluated from an odor sample containing Nectaryl, and the urine odor suppression effect of the two test substances was evaluated. The odor sample was replaced with a new one after evaluation by three evaluators.
In the evaluation of odor samples, the following five levels of criteria are set: “Urgent odor of urine extract: 1: I do not know 2: Can be detected 3: Easy to understand 4: Feel strong 5: Feel unbearably strong” Then, the urine odor intensity from each odor sample when the urine odor intensity of the urine odor substance alone was 3, was evaluated in 9 stages from 1.0 to 5.0 in increments of 0.5.
各評価者による官能試験の評価結果の平均値を図６に示す。ＯＲ９Ｑ２アンタゴニストであるＢｏｕｒｇｅｏｎａｌ及びＮｅｃｔａｒｙｌはいずれも、統計学的に有意な尿臭抑制効果を有していた（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｎｅｄ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０１）。本実施例の結果から、実施例１で同定された尿臭受容体の応答に基づいて、尿臭抑制物質を探索することができることが示された。 The average value of the evaluation results of the sensory test by each evaluator is shown in FIG. Both the OR9Q2 antagonists Bourgeonal and Nectaryl had a statistically significant urine odor suppression effect (Wilcoxon Sinde-rank test, p <0.01). From the results of this example, it was shown that a urine odor suppressing substance can be searched based on the response of the urine odor receptor identified in Example 1.
Claims (8)
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ９Ｑ２、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び尿臭原因物質を添加すること；
該尿臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。 A method for searching for a urine odor suppressor comprising:
OR1A1, OR2W1, OR4S2, OR5K1, OR5P3, OR8H1, OR9Q2, OR10G4, OR10G7, and at least one olfactory receptor polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having at least 80% identity in amino acid sequence Add test substances and substances that cause urine odor;
Measuring the response of the olfactory receptor polypeptide to the causative agent of urine odor; and
Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor polypeptide based on the measured response;
Including methods.
前記ＯＲ２Ｗ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ４Ｓ２が配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ５Ｋ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ５Ｐ３が配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ８Ｈ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ９Ｑ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ１０Ｇ４が配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ１０Ｇ７が配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、
請求項１記載の方法。 OR1A1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
OR2W1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
The OR4S2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6,
The OR5K1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8,
The OR5P3 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10,
The OR8H1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12,
The OR9Q2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14,
The OR10G4 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16,
The OR10G7 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18,
The method of claim 1.
前記ＯＲ１Ａ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ２Ｗ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ４Ｓ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５Ｋ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５Ｐ３とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾール又は２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ８Ｈ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ９Ｑ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ−クレゾールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ｇ４とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドであり、
かつ
前記ＯＲ１０Ｇ７とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ２−メトキシ−４−ビニルフェノールに応答性を有するポリペプチドである、
方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR1A1 is composed of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and is 2-methoxy-4-vinylphenol. A responsive polypeptide,
The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR2W1 comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and p-cresol or 2-methoxy-4 -A polypeptide responsive to vinylphenol,
A polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR4S2 comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and is responsive to p-cresol A peptide,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR5K1 is composed of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and 2-methoxy-4-vinylphenol A responsive polypeptide,
The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR5P3 comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and is p-cresol or 2-methoxy-4 -A polypeptide responsive to vinylphenol,
The polypeptide having at least 80% identity in amino acid sequence with OR8H1 is composed of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and 2-methoxy-4-vinylphenol A responsive polypeptide,
A polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR9Q2 comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and is responsive to p-cresol A peptide,
The polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR10G4 is composed of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and 2-methoxy-4-vinylphenol A responsive polypeptide,
And the polypeptide having at least 80% identity in the amino acid sequence with OR10G7 comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and 2-methoxy-4-vinylphenol A polypeptide responsive to
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