JP2015199755A - 医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】哺乳類被検者における心筋梗塞のサイズを低下させる方法に使用される腫瘍壊死因子刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む医薬組成物であって、前記方法は、前記心筋梗塞の発生後に前記TSG−6タンパク質を前記哺乳類被検者に投与することを含み、前記TSG−6タンパク質が0.001〜1000mg/kg/日の量で投与される医薬組成物。
【選択図】なし
Description
本出願は、2008年6月18日に出願された本出願人の米国仮特許出願第61/073739号の優先権の利益を主張し、あらゆる目的において、その全体を本願明細書においても参照して取り入れられる。
も「MSC」)と称される骨髄からの幹細胞又は前駆細胞を用いた細胞治療に関し、上記の課題のいくつかにおいて、重要な進展を達成した。とりわけ、本発明者は、致死的肺動脈塞栓を発生する傾向の減少、マウスの梗塞心臓への生着の増加、及び当該分野の殆どの研究者に現在採用されているMSC標本よりも効率的な分化、を実証するMSC亜集団(RS−MSCと定義)を規定する表面エピトープを見出した。ここで、本発明者は、ヒトMSCのマウスへの静脈(IV)注入後、肺に捕捉されたMSCが活性化され、「TNFα刺激遺伝子」(TSG−6)として知られる多能性抗炎症性遺伝子を非常な高レベルで発現することを実証した。TSG−6は、「腫瘍壊死因子α誘導タンパク質6」又はTNFAIP6としても知られており、その発現は、インターロイキン−1(IL1)及びリポ多糖体(LPS)によっても誘導される。MSCによるTSG−6の発現は、梗塞に対する有害な炎症反応を抑制し、心筋梗塞症(MI)のマウスにおける機能改善は、主に、MSCの活性化とTSG−6の発現に由来する。即ち、本発明者は、心筋梗塞症(MI)の後、MSCのIV注入が、注入された細胞の殆どが肺に捕捉されるにもかかわらず機能を改善するといった、多数の人によって報告されている奇妙な事象に対する説明を提供する。さらに、データは、MIに対する細胞に基づく治療の有益な効果の少なくとも一部が、(1)高いレベルのTSG−6の発現するためにTNF−α、IL1、及び/又はLPSを用いたプレインキュベーションで活性化されたMSCを含む注入、(2)高いレベルのTSG−6の発現するように操作されたMSC(例、TSG−6を過剰発現させる形質移入MSC)を含む注入、及び(3)組換え型TSG−6(例、組換え型ヒトTSG−6)を含む注入、によって得ることができることを示唆する。本明細書における「注入」は、特に明記しない限り、静脈注入と心臓内注入の双方を含む。
SC)の精製集団を提供する。
質−1(MCP−1)、マクロファージ炎症性タンパク質−1α(MIP−1α)、βトロンボグロブリン、可溶性ST2受容体、C反応性タンパク質(CRP)、及びナトリウム利尿ペプチドの2つ以上(3、4、5、6等)の血清レベルの増加を、組織における無菌性炎症を有しない対照標準の哺乳類被検者に比較して検出することを含む、哺乳類被検者の組織における無菌性炎症を検出する方法を提供する。1つの態様において、組織は心筋組織を含む。もう1つの態様において、本方法は、さらに、(c)(i)精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む組成物、(ii)高いレベルのTSG−6タンパク質を発現する条件下でTNF−α、IL1、及びLPSの1つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞(MSC)の集団、及び(iii)TSG−6タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでTSG−6タンパク質を発現する遺伝子組換え間葉系幹細胞(RS−MSC)の集団の1つ又は複数の治療的有効量を前記被検者に投与することを含み、前記投与は治療被検者を産出し、さらに(d)前記治療被検者において、工程(b)で検出した血清レベルに比較して、プラスミン活性、MCP−1、MIP−1α、βトロンボグロブリン、可溶性ST2受容体、C反応性タンパク質、CRP、及びナトリウム利尿ペプチドの2つ以上の血清レベルの減少を検出することを含む。
R−MSC)、等)、及び/又は現象(例、プラスミン活性、病気の症状、細胞増殖、細胞分化、細胞移植、細胞死、細胞予定死、細胞生存能力、細胞生存、分子への結合、結合の親和性、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性、等)のレベルに関し、当該分野で認められている何らかの統計的方法を用いた統計的に有意な量によって、第1サンプル(又は患者)の分子、細胞、及び/又は現象の量が、第2サンプル(又は治療された患者)よりも低いことを意味する。1つの態様において、減少は、例えば、患者が痛み、疲労、呼吸困難、視覚の明瞭性、吐気、等のような病徴の主観的感じ方について述べるときは、主観的に判定することがある。もう1つの態様において、第1サンプルにおける分子、細胞、及び/又は現象の量が、第2サンプルにおける分子、細胞、及び/又は現象の量よりも、5%〜100%の数値割合の範囲で、例えば、限定されるものではないが、10%〜100%、20%〜100%、30%〜100%、40%〜100%、50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、及び90%〜100%の範囲で低い。
α刺激遺伝子6」、及び「TNFAIP6タンパク質」は、互換的に用いることができ、ヒアルロン酸結合ドメインを含む分泌タンパク質、即ち、ヒアルロン酸結合タンパク質ファミリーのメンバーを指称する。ヒアルロン酸結合ドメインは、細胞外マトリックス安定性と細胞移動に関与することが知られている。このタンパク質は、インターαインヒビター(IαI)とともに安定な複合体を形成することが実証されており、即ち、IαIのセリンプロテアーゼの阻害活性を高め、このことは、炎症に伴うプロテアーゼネットワークにおいて重要である。この遺伝子の発現は、腫瘍壊死因子αとインターロイキン−1によって誘導することができる。また、この発現は、血管平滑筋細胞の機械的刺激によって誘導することができ、プロテオグリカンの合成と凝集に関与することが見出されている。TSG−6タンパク質は、図19Aのヒトアミノ酸配列によって例示され、これは、図19Bのヌクレオチド配列によってコードされる(ジェンバンクNo.NM_007115)。組換え型精製ヒトTSG−6タンパク質は市販されている(R&Dシステムズ社、ミネアポリス、カタログ#2104−TS−050)。TSG−6に特異的に結合する抗体は市販されている(ELISA、TSG−6特異的モノクローナル抗体(クローンA38.1.20);サンタクルス・バイオテクノロジー社、カタログ#BAF2104;ビオチニル化抗ヒトTSG−6(TSG−6ビオチニル化PAb検出抗体;R&Dシステムズ社、ミネアポリス))。
ンプロテアーゼを阻害する多機能抗炎症性タンパク質TSG−6を多量に分泌するため、hMSCのIV注入後にMIマウスの心臓機能が改善すること、及び(4)MIにおけるhMSCの一部の保護効果が、rhTSG−6の体系的注入によって再生され得ることを、本明細書において開示する。
100年以上前に行われた最初の実験は、哺乳類の骨髄からの血液感染症細胞が組織修復と再生に関与することを示唆した(プロコップ、1997年に概説)。多数の組織の修復に寄与すると考えられる骨髄細胞についての最初の直接的証明のいくつかは、フリーデンシュタインらによって40年以上前に発表され(オーエンとフリーデンシュタイン、1988年に概説)、組織培養物表面に付着した骨髄からのごく僅かの細胞が、培養物とインビボの双方で、骨芽細胞と軟骨細胞の中に分化し得ることを実証した。その後、骨髄細胞からの同じプラスチック付着細胞が、造血幹細胞にとって有効なフィーダー層であることが見出された(参照:エバンスら、2001年)。フリーデンシュタインらによる最初の観察は、多数の以降の研究者によって確認・拡大された(カストロ−マラスピナら、1980年;メッツとベルドンク、1981年;ピエルスマ、1983年;オーエンとフリーデンシュタイン、1988年;カプラン、1990年;プロコップ、1997年)。その後の研究は、細胞が培養下で含脂肪細胞、筋肉細胞(ワキタニら、1995年)、心筋細胞(フクダとユアサ、2006年)の中で分化できることを実証した。MSCが神経系前駆体の中に分化し得るといった本発明者による最初の報告は(ウッドベリーら、2000年;デングら、2001年)、決定的ではないと批評されたが、神経系細胞の電気生理学的性質を果たす細胞にMSCが培養下で分化し得るという、別な研究機関による粘り強い報告があった(キムら、2006年;マレシら、2006年;クランペラら、2007年)。また、骨髄に非常によく似た特性を有する細胞が、末梢血(クズネツォーフら、2001年)、脂肪組織(ギラックら、2004年)、臍帯血(ロサダら、2003年)、滑膜(デバリら、2001年)、及び歯周靭帯(セオら、2005年)などの多数の組織で特定された。これらの結果は、多くの組織の中のMSC状の幹/前駆細胞の広範囲なネットワークの存在を示唆した。このネットワークは、恐らく、負傷に対して最初に応答するが、その後必要時に骨髄からのMSCによって補充されるレスポンダーを含む。
85年;プロコップとキビリッコ、1995年)においてであった。試験は、本発明者らの研究室で開発した遺伝子組換えマウスのモデルにおける実験データに基づいて立案された(ペレイラら、1998年)。その後の試験は、ムコ多糖症の患者(コックら、2002年)、移植片対宿主病(GVHD)の患者におけるものであり、免疫反応を抑制する細胞の能力を利用するものであった(アガワルとピッテンジャー、2005年;リンデンら、2006年)。MSCを用いた新たな臨床試験の最近の急増が、この1年半以内に新規株式公開(IPO)を成功裏に行った3つのバイオ企業によって大きく促進された。これらの最初の企業のオシリス・セラピーティクス(ボルチモア、メリーランド州)は、関節炎、心臓病、クローン病(フェーズIII)、1型糖尿病(フェーズII)、移植片対宿主病(フェーズIII)における臨床試験を公表した。他の企業は、脳卒中などの広範囲な疾病の試験を公表した。
の最も早期の事象の1つがミトコンドリア機能の低下であるため、MSCは、心筋その他の組織への虚血性傷害を、一部においては、救出できるかもしれない。
ここでのデータは、ヒトのDNAとmRNAについての定量分析を用いて得られたデータを示し、静脈注入(IV)されたヒト多能性間質細胞(hMSC)が、有意な移植なしに組織修復を促進できるといったパラドックスを検討するために使用した。2×106h
MSCをマウスにIV注入した後、殆どの細胞が、塞栓として肺に捕獲された。肺の細胞は、約24時間の半減期で消失したが、1000未満の細胞が6つの別な組織に出現した。肺のhMSCは、多数の遺伝子の発現を上方調節し、抗炎症性タンパク質TSG−6が大きく増加した。心筋梗塞の後、IVのhMSCは(TSG−6のsiRNAを形質移入されたhMSCではない)、炎症反応を低下させ、梗塞サイズを減少させ、心臓機能を改善した。組換え型TSG−6のIV投与もまた炎症反応を低下させ、梗塞サイズを減少させた。この結果は、MSCのIV注入後の動物モデルと患者における改善が、少なくとも部分的に、TSG−6を分泌するMSCの活性化によって説明されることを示唆する。
ら、2006年;ウイスニースキーとヴィルチェック、2004年)。即ち、(a)主としてインターα阻害剤の阻害活性を高めることにより、プロテアーゼの炎症性ネットワークを阻害する、(b)ヒアルロナンの断片に結合し、それによって炎症反応促進効果を鈍らせる、(c)炎症箇所への好中球浸潤を阻害する。遺伝子組換えマウスにおいて、遺伝子の不活化が炎症反応を高め(スザントら、2004年)、遺伝子の過剰発現が炎症反応を低下させた(ミンドレスキューら、2002年)。また、組換え型タンパク質の投与が、いくつかのネズミ科モデルにおいて、関節炎を改善した(バルドスら、2001年;ミンドレスキューら、2000年)。TSG−6は、最初は、TNF−αとともにインキュベートされた線維芽細胞からcDNAをスクリーニングすることによって発見されたが、ここでの結果は、hMSCが、TNF−αに応えて、皮膚線維芽細胞よりもはるかに多くのTSG−6を生成することを実証した。
1つの態様において、本発明は、高いレベルのTSG−6タンパク質を発現する条件下で、炎症促進性ケモカイン、炎症促進性サイトカイン(例、TNF−α、IL1)、及びLPSからなる群より選択された1つ又は複数のリガンドと接触した、間葉系幹細胞(MSC)の精製集団を提供する。特定の態様において、間葉系幹細胞(MSC)の精製集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞(RS−MSC)を含む。これらの細胞集団の各々は、心筋細胞壊死及び/又は組織の無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させるための下記の方法に有用である。
胞(RS−MSC)は、本明細書に記載の方法を用い、骨髄細胞及び/又は間葉系幹細胞(MSC)の精製集団から精製することができる(例、PODXLに特異的に結合する抗体、及び/又はCD49fに特異的に結合する抗体の1つ又は複数に結合)。
さらなる態様において、本発明は、(a)TSG−6タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ(b)TSG−6タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞(MSC)の集団を提供する。特定の態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞(MSC)の集団が精製される。さらなる態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞(MSC)の集団は、(a)TSG−6タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ(b)TSG−6タンパク質を発現する、遺伝子組換え迅速自己更新性の間葉系幹細胞(RS−MSC)を含む。これらの細胞集団の各々は、心筋細胞壊死及び/又は組織の無菌性炎症の1つ又は複数の症状を低減させる下記の方法に有用である。
一方、「下方制御」又は「抑制」とは、産生を減少させる制御を指称する。上方制御又は下方制御に関与する分子(即ち、転写因子)は、それぞれ「活性化因子」又は「抑制因子」と称されることが多い。
本発明は、さらに、精製MSC、及び/又は精製RS−MSC、及び/又はTSG−6を発現する遺伝子組換えMSC、及び/又はTSG−6を発現する遺伝子組換えRS−MSC、及び/又は精製TSG−6を提供する。
本発明は、(a)RS−MSCを含む細胞の第1集団を提供し、(b)細胞の集団を(i)PODXLに特異的に結合する抗体、及び(ii)CD49fに特異的に結合する抗体、の一方又は双方に接触させ、及び(c)前記抗体の一方又は双方に結合する細胞を分離し、それによって精製RS−MSCの集団を産生することを含む、迅速自己更新性の間葉系幹細胞(RS−MSC)の精製方法を提供する。
、ヒツジ、等)から得られる任意の免疫グロブリン(例、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、等)を包含する。この定義には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びキメラ抗体が含まれる。モノクローナル抗体の製造方法が公知である(例、「Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、「Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)」
、PCT/US90/02545、「Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)」、「Cole et al.,
in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)」、参照)。2つの異なる抗体の部分、典型的には2つの異なる種類を含む「キメラ抗体」もまた当該技術で標準的である(例、キャビリーらの米国特許第4816567号、シューマーカーらの米国特許第4978745号、ビーバーらの米国特許第4975369号、及びボスらの米国特許第4816397号、参照)。
特定の態様において、本発明は、(a)(i)心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び(ii)高いレベルのTSG−6タンパク質を発
現する条件下でTNF−α、IL1、及びLPSの1つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞(MSC)の集団を提供し、(b)前記哺乳類被検者に前記精製間葉系幹細胞(MSC)の集団の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。特定の態様において、精製間葉系幹細胞(MSC)の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞(RS−MSC)を含む。
リアを投与する方法(ベリンガーらの米国特許第6964856号)、アンチセンスを投与する方法(デラモンテらの米国特許第7291454号、スミスらのWO90/09180、スキントらのWO93/00909)、オリゴヌクレオチドを投与する方法(イノウエらの米国特許第5272065号)もまた挙げられる。ポリペプチド、核酸配列、及び/又は細胞は、予防的に(即ち、疾病の症状が観られる前)及び/又は治療的に(即ち、疾病の症状が観られた後)に投与することができる。また、投与は、1つ又は複数の疾病の症状の徴候に合わせることもできる(即ち、同時に又はその間)。また、本発明の組成物は、別な種類の薬物の投与又は治療手段(例、外科的)の前、同時、及び/又は後に投与することができる。本発明の組成物の投与方法には、限定されるものではないが、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所(例、直腸、膣)、及び舌下における投与が挙げられる。非経口の投与ルートには、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、及び輸液のルートが挙げられる。
本発明は、(a)(i)心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び(ii)(イ)TSG−6タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ(ロ)TSG−6タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞(MSC)の集団、を提供し、(b)前記哺乳類被検者に遺伝子組換え間葉系幹細胞(MSC)の集団の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
また、本発明は、(a)(i)心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び(ii)精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む組成物を提供し、(b)前記哺乳類被検者に前記組成物の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の1つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
胞(子宮内膜)、ATCC#crl−1622;T98G細胞(グリア芽腫)、ATCC#crl−1690;CCF−STTGl細胞(星状細胞腫)、ATCC#crl−1718;HUV−EC−C細胞(血管内皮)、ATCC#CRL−1730;UM−UC−3細胞(膀胱)、ATCC#crl−1749;CCD841−CoN細胞(結腸、ATCC#crl−1790;SNU−423細胞(肝細胞癌)、ATCC#crl−2238;WI38細胞(肺、正常)、ATCC#crl−75;ラジ細胞(リンパ芽球様)、ATCC#ccl−86;BeWo細胞(胎盤、絨毛腫)、ATCC#ccl−98;HT1080細胞(線維肉腫)、ATCC#ccl−121;MIAPaCa2細胞(膵臓)、ATCC#crl−1420;CCD−25SK細胞(皮膚線維芽細胞)、ATCC#crl−1474;ZR75−30細胞(乳腺)、ATCC#crl−1504;HOS細胞(骨肉腫)、ATCC#crl−1543;293−SF細胞(腎臓)、ATCC#crl−1573;LL47(MaDo)細胞(正常リンパ芽球)、ATCC#ccl−135;andヒーラ細胞(子宮頸癌)、ATCC#ccl−2。
また、本発明は、限定されるものではないが、哺乳類被検者における無菌性炎症などの炎症の1つ又は複数の症状を減少させる方法を提供するものであり、(a)(i)組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び(ii)高いレベルのTSG−6タンパク質を発現する条件下でTNF−α、IL1、及びLPSの1つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞(MSC)の集団を提供し、(b)前記哺乳類被検者に前記精製間葉系幹細胞(MSC)の集団の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させることを含む。1つの態様において、精製間葉系幹細胞(MSC)の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞(RS−MSC)を含む。もう1つの態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。炎症は、自己免疫反応によるものであってもよい。
これは、組織に対する有害な刺激を除去すると同時に治癒プロセスを開始するための生命体による保護的企てである。
また、本発明は、(a)(i)組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び(ii)(イ)TSG−6タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ(ロ)TSG−6タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞(MSC)の集団を提供し、(b)前記哺乳類被検者に前記遺伝子組換え間
葉系幹細胞(MSC)の集団の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
さらに、本発明は、(a)(i)組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び(ii)精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む組成物を提供し、(b)前記哺乳類被検者に前記組成物の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
さらに、本発明は、(a)組織における無菌性炎症の1つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者を提供し、(b)プラスミン活性、マクロファージ誘導タンパク質−1(MCP−1)、マクロファージ炎症性タンパク質−1α(MIP−1α)、βトロンボグロブリン、可溶性ST2受容体、C反応性タンパク質(CRP)、及びナトリウム利尿ペプチドの1つ又は複数(2、3、4、5、6、7など)の血清レベルの増加を、組織における無菌性炎症を有しない対照標準の哺乳類被検者に比較して検出することを含む、哺乳類被検者の組織における無菌性炎症を検出する方法を提供する。1つの態様において、組織は心筋組織を含む。
PODXLとCD49fのエピトープ発現を用いるRS−MSCの分離
最近、本発明者は、MSCの培養物中の早期前駆体を特定する表面タンパク質に対する抗体について探索した(図1A、1B)。最初のストラテジーとして、本発明者は、低密度で蒔かれたhMSCと培養物が広がるときの、表面タンパク質の転写物における変化についてのマイクロアレイのデータに疑問を抱いた。その結果は、10転写物にわたって安定状態レベルが減少し(2倍超)、殆ど同数が減少したことを示した(図2D)。最大の減少の2つの転写物は、細胞運動性と腫瘍進行に関連することが先に示されているタンパク質をコードしたもので、POXDL(ファーネスとマクナグニー、2006年)とα6インテグリン(CD49f)(リプスコムとメルクリオ、2005年)であった。
、コロニー形成単位(CFU−F)をアッセイした。PODXLhi/CD49fhi細胞は、クローン形成能がより高く、PODXLlo/CD49floの48%±5SDに対して90%±0.6SDのCFU−F値であった(n=4、p<0.1)。また、PODXLhi/CD49fhi細胞は、鉱化細胞と含脂肪細胞により効率的に分化し、即ち、骨形成培地中のインキュベーション後の抽出アリザリンレッドSにおける吸光度は0.65OD単位±0.029SDに対して0.16OD単位±0.05SDであり(n=4、p<0.01)、脂質形成培地中のインキュベーション後の抽出オイルレッドOにおける吸光度は0.06OD単位±0.012SDに対して0.70OD単位±0.14SDであった(n=4、p<0.01)。
MI後のマウス心臓にRS−MSCのより効率的な生着
本発明者は、MIマウスへのRS−MSC(PODXLhi/CD49fhi)の生着を比較するためにヒトAluについての改良PCRアッセイ(下記参照)を採用した。図4に示すように、RS−MSCは、MI心臓により効率的に生着した。また、細胞は、腎臓により効率的に生着し、血清クレアチニン値濃度の増加に反映されるように、腎臓に対する二次的損傷の結果と思われる(1.08±0.14SDに対して0.53mg/dcl±0.08SD、n=4)。
注入hMSC、癌細胞、及びヒトWBCの組織分布
マウスへのIV注入後、5分間以内に血液からhMSCを除去した(図5、左上)。先の報告の確認において(ババシュら、2003年;ガオら、2001b;シュレップファーら、2007年)、注入細胞の殆どは肺に捕獲された(図5、左下)。ヒト乳癌細胞株(MDA−MB−231)とヒトWBCについて同様な観察を行い、但し、一部のヒトWBCは、肺への捕獲を逃れ、肝臓で回収された。心臓の左心室に注入したhMSC(IC注入)もまた5分間以内に血液から除去したが(図5、右上)、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、及び骨髄に現れる多数のhMSCのIV注入と比較した(図5、右下)。
hMSCが肺に捕獲された後のマウス肺細胞とhMSCの双方の変化のトランスクリプトーム
肺に捕獲されるhMSCの作用を調べるため、MSCをIV注入して10時間後にマウス肺からRNAを抽出し、マウス特異的マイクロアレイとヒト特異的マイクロアレイの双方についてRNAアッセイをした。予想通り、マウスのトランスクリプトームに大きな変化があり、755遺伝子が上方制御され、347遺伝子が2倍以上に下方制御された(図示せず)。また、hMSCのトランスクリプトームに大きな変化があり、451遺伝子が上方制御され、1001遺伝子が2倍以上に下方制御された。したがって、この結果は、hMSCがhMSCの塞栓を含むマウス肺とのクロストークに応答したことを示す。
hMSCを活性化して高いレベルのTSG−6を発現可能
hMSCによるTSG−6の合成を検討するため、hMSCを炎症誘発性サイトカインTNF−αとともにインキュベートした。hMSCは活性化し、60倍〜120倍のレベルのTSG−6転写物を発現した(図8左上)。未刺激のhMSCは、測定可能な量のタンパク質を分泌しなかったが、TNF−αによって活性化されたhMSCは大量に分泌した(図8中央)。siRNAを用いた遺伝子のノックダウンは、転写物レベルとタンパク質分泌の双方を低下させた(図8下側)。驚くことに、TNF−αとともにインキュベートした線維芽細胞においてTSG−6が最初に発見されたにもかかわらず(ウイスニースキーとヴィルチェック、2004年)、TNF−αに対するhMSCの反応は、ヒト線維芽細胞の反応を大きく超えた。
IVのMSCと組換え型TSG−6の双方が、MIマウスにおける血清と心臓の炎症促進性プロテアーゼを減少させる
永久的MIを免疫不全マウスに生成させた後、本発明者が先に左心室駆出率を改善すると観察した条件下で(イソら、2007年)、尾静脈にhMSCを注入した。血清アッセイは、MIマウスでプラスミン活性が増加すること、及び1時間後のhMSCのIV投与が活性を低下させることを実証した(図9A)。また、ヒト組換え型TSG−6の1回のIV注入によって、hMSCの作用を再現した。心臓アッセイは、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、ウロキナーゼ(uPA)、プロマトリックスメタロプロテアーゼ9(pro−MMP9)、及び活性MMP9のレベルがMIマウスで増加することを実証した(図9B、図9C)。
ンら、2005年;パオロッチら、2006年;カルバリョら、2006年)、この結果は特に興味深い。
補足的方法
以下の方法を用いて得られたデータを下記に示す。
hMSCは、成体幹細胞の調製・分配センターから入手した。細胞は、培養物中で一貫して3系列に分化され、造血性マーカー(CD34、CD36、CD117、及びCD45)に対して陰性であり、CD29(95%)、CD44(>93%)、CD49c(99%)、CD49f(>70%)、CD59(>99%)、CD90(>99%)、CD105(>99%)、及びCD166(>99%)に対して陽性であった。約100万細胞のバイアルを解凍し(継代1又は2)、25mlの完全培養培地(CCM)中の174cm2の皿(Nunc)に蒔き、5%CO2の37℃でインキュベートした。CCMは、17%FBS(hMSCの迅速成長のためにロット選択、アトランタ・バイオロジカルス社、ローレンスビル、GA)、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、及び2mMLのグルタミン(GIBCO/BRL)を含むα−MEM(GIBCO/BRL)とした。1日後、培地を置き換え、培養物をPBSで洗浄して非付着性細胞を除去した後、0.25%トリプシン/1mMのEDTA(GIBCO/BRL)を用いて37℃で5分間インキュベートし、生存細胞を回収した。細胞を800Gの10分間の遠心分離によって濃縮し、CCMに懸濁させ、174cm2の皿に100細胞/cm2で再度蒔き、70%集密まで6〜7日間にわたってインキュベートし、その結果、約50%の細胞が、抗細胞接着タンパク質PODOXL(リーら、2009年)に対して陽性であった。骨髄からのマウス(C57/B16)MSCもまた前記センターから入手し、記載のようにして(ペイスタ−ら、2004年)、継代5まで拡大した。
IV注入から15分後にマウス血液中のhMSCを検出するため、50μlの血液をCCM中の10cmの皿の上に蒔いた。1日後、細胞をPBSで洗浄し、10mlのCCMで被覆し、3〜4日ごとに培養液を交換しながら、14日間にわたってインキュベートした。コロニー(図10)を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、抗ヒト核抗原(1:200、クローン235−1、ケミコン社)と抗ヒトβ2ミクログロブリン(1:200、ロッシェ社)で標識化し、DAPIで封入した(VECTASHIELD(商標)、DAPIを用いる封入剤、ベクター・ラボラトリイズ社)。
hMSC、マウスMSC、及び線維芽細胞を、6ウェルプレートのCCMに50000細胞/ウェルで蒔き、18時間にわたってインキュベートした。一部のFBSを細胞上に
保有させるために洗浄せずに培地を除去し、10ng/mlの組換え型ヒトTNF−α(R&Dシステムズ社)を含んで血清を含まないCCMに置き換えた。0〜48時間のインキュベーションの後、RT−PCRアッセイのために全体のRNAを抽出し(RNeasyミニキット、QIAGEN)、培地をELISAのために回収した。
ネズミトロポニンIのELISAキット(ライフダイアグノースティック社)を用い、メーカーの指示書にしたがって、LAD連結から2日後のマウスの血清で、心臓トロポニンIの濃度を測定した。
200万の継代2のMSCを、MIから1時間後のマウスにIV注入し、48時間後に血清と心臓を回収した。50mMのトリスのpH7.4で0.9%のNaCl中の発色基質としてクロモジムPL(ロシュ・アプライド・サイエンス社)を用い、マウス血清からプラスミン活性をアッセイした。反応混合物を37℃でインキュベートし、30分間にわたって2分ごとに405nmで分光光度法によってアッセイした。値を「吸光度/分」の平均変化として表わした。
溶解緩衝液(1%のトリトンX−100、0.1%のSDS、pH7.2のIXPBS中の0.1%アジ化ナトリウム)中の氷上で心臓組織をホモジナイズし、4℃で1時間にわたって回転しながらインキュベートした。溶解物を4℃で10分間の12000Gで除去した。プレキャストのゼラチンゲル(10%ザイモグラムのゼラチンゲル、インビトロゲン/ノベックス)を用いたザイモグラムにより、心臓抽出物の5μlのアリコートを分析した。一定の軽い撹拌をしながら、室温で30分間にわたってゲルを再生し、37℃で一晩展開し、コロイダルブルー(Novex技術告示IM−6025)で着色し、広範囲に洗浄し(20時間超)、均一なバックグラウンド信号を生成した。着色したウェットゲルのデジタル像を、スキャナーを用いて捕えた。
対照標準マウスの肺、約200万のhMSCのIV注入から10時間後のマウスの肺、及び均質化の直前に100万のhMSCを添加した肺から、RNAを分離した。マウス(MG−4302.0)又はヒト(HG−Ul33Plus2.0)のマイクロアレイ(アフィメトリクス社)でのアッセイに、約8μgの合計RNAを使用した。マイクロアレイSuite5.0(MASS5.0、アフィメトリクス社)とdChip1.3+プログラム(シャートら、2001年)を用いてデータを解析した。それらの値は、対照標準マウスの肺、均質化前にhMSCを添加した対照標準マウスの肺、又はhMSCのIV注入後のマウスの肺における信号強度に対する変化の倍数で表わした。データは、クロスハイブリッド形成(CV>0.5とコール>33%)についてフィルタ処理し、マイクロアレイSuite5.0プログラムで解析し、先に記載のように(オータキら、2008年)、値1と変動3SD(+3、赤;3、青)に標準化した。
IV注入後に肺において上方制御されたhMSCの上方制御と下方制御の転写物
補足的方法
以下の方法を用いて得られたデータを図13〜18に示す。
骨髄からのhMSCとマウスMSCを、成体幹細胞の調製・分配センターから入手した。このセンターは、国立衛生研究所と国立研究資源センターの助成金(P40RR17447−06)の援助下で、250以上の研究施設に、初期前駆細胞の濃縮されたMSCの標準調製物を供給している。hMSCを継代3と70%密集度に増殖させ、マウスMSC培養物も実施例7〜10に示すように調製した。ヒト乳癌細胞と線維芽細胞の培養物の源と条件もまた実施例7〜10に示している。
マウスに麻酔をかけ、28ゲージ針を用い、尾静脈を通して又は胸壁を通して左心室に、約1又は2×106hMSCのサスペンジョンの約150μlを注入した。成功したIV注入について、その箇所で血管外漏出がないか、及び注入から1時間以内の肺におけるAlu配列の約80%の回復(図13C)をモニターした。注入前に細胞を4℃に維持し、ピペットを用いて軽く再懸濁させ、注入前に凝集していないことを確保した。
50μlの血液サンプルを、心臓の左心室から針と注射器を用いて抜き出し、2mMの
EDTAに調節した。次いで、20mlのPBSを左心室を通して、5mlのPBSを右心室を通して、マウスに灌流した。切開によって、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓の組織、及び骨髄を分離し、−80℃で保存した。DNAを抽出するため、サンプルを解凍し、5mlの緩衝液(10mMのトリスHCl、(pH8.0)、20μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)、0.1mMのEDTA(pH8.0)、0.5%SDS、及び20μg/mlのRNA分解酵素Aを含む)を各サンプルに添加した。サンプルを均質化し(パワーゲン125型ホモジナイザー、フィシャー・サイエンティフィック社)、200rpmの振盪機中で、50℃にて一晩インキュベートした。0.5mlのサンプルに0.5mlのフェノール/クロロホルム溶液(pH6.7)を添加し、2mlのフェーズロックゲルチューブ(フェーズロックゲル、エッペンドルフ/ブリンクマン社)の中で15300Gで5分間わたって遠心分離することによって、DNAを抽出した。半体積の2.5Mの酢酸アンモニウムと同体積の100%エタノールを添加し、40℃で終夜にわたってDNAを沈殿させた。沈殿物を氷冷の75%エタノールで洗浄し、無菌水中に再度懸濁させた。トリゾール(インビトロゲン社)を用いて同じマウス組織と細胞培養物からRNAを分離し、RNeasyミニキット(Qiagen社)で洗浄した。
いくつかの組織からのDNA抽出物のUV吸光度によるアッセイが、PCRアッセイについて十分に正確な値を与えなかったため、ジフェニルアミン反応(バートン、1956年)によってDNA濃度を測定した。5μlのデオキシリボヌクレアーゼ緩衝剤と2μlの無菌水中の3μlのデオキシリボヌクレアーゼI(フィシャー・サイエンティフィック社)を用い、40μlのサンプルを37℃で1時間にわたって消化した。各サンプルを50μlの無菌水で希釈し、ジフェニルアミン試薬の原液200μlを添加した(100mlの氷酢酸(フィシャー・サイエンティフィック社)と2.75mlのH2SO4(シグマ社)中の1gのジフェニルアミン(フィシャー・サイエンティフィック社))。サンプルを100℃で21分間インキュベートし、吸光度を595nmで測定した。0.039〜1.25mg/mlの仔ウシ胸腺DNA(シグマ社)を用いて検量線を作成した。
均質化の直前に、マウス組織サンプルにhMSCを連続希釈で添加することによって検量線を作成した。約200ngの合計RNAを使用し、逆転写によって2本鎖cDNAを合成した(スーパースクリプトIII、インビトロゲン社)。タクマンユニバーサルPCRマスターミックス(アプライド・バイオシステムズ社)を用い、ヒト特異的GAPDHプライマーとプローブ(タクマン(商標)遺伝子発現アッセイID、Hs00266705_gl)を用いて、リアルタイムPCR(ABI7900配列検出器、アプライド・バ
イオシステムズ社)によってcDNAを分析した。サンプル中の合計cDNAについての最終値は、GAPHDについてヒトとマウスの遺伝子の双方を増幅するプライマーを用いた平行リアルタイムPCRアッセイによって修正した(実施例7〜10参照)。
マウスの肺からRNAを分離し、マウス(MG−4302.0)とヒト(HG−Ul33Plus2.0)のマイクロアレイ(アフィメトリクス社、サンタクララ、CA)の双方についてアッセイし、そのデータを実施例7〜10に記載のようにしてフィルタ処理した。
約200ngの合計RNAを使用し、逆転写によって2本鎖cDNAを合成した(スーパースクリプトIII、インビトロゲン社)。タクマンユニバーサルPCRマスターミックス(アプライド・バイオシステムズ社)を用い、リアルタイムPCRによってcDNAを分析した。アッセイのため、反応物を50℃で2分間、及び95℃で10分間にわたってインキュベートした後、95℃で15秒間と60℃で1分間を40サイクル行った。遺伝子発現の相対的計量のため、ヒト特異的GAPDHプライマーとプローブ(タクマン(商標)遺伝子発現アッセイID、Hs00266705_gl)を使用した。それ以外のPCRプライマーとプローブ配列は、実施例10に列挙した。
6ウェルのプレートのCCMに50000細胞/ウェルで蒔いた生存可能な継代1のhMSCを用い、形質移入用の標的hMSCを調製した。1日間のインキュベーションの後、市販のキット(Lipofectamine(商標)RNAiMAX試薬、インビトロゲン社)を用い、TSG−6(sc−39819、サンタクルス・バイオテクノロジー社、サンタクルス、CA)について10nMもしくは20nMのsiRNA、又はRNAi陰性対照標準(Stealth(商標)RNAi陰性対照標準、インビトロゲン社)を用いて、細胞を形質移入した。6時間後、3ml/ウェルの抗生物質を含まないCCMで培地を置き換え、16〜20時間にわたってhMSCをインキュベートした。
TNF−α処理MSCからの培地中のTSG−6タンパク質のレベルをELISAによって測定した。96ウェルのプレート(マキシソープ(商標)、ヌンク社)を、0.2M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.2)中のTSG−6(クローンA38.1.20、サンタクルス・バイオテクノロジー社)に特異的な10μg/mlのモノクローナル抗体の50μlで、40℃にて一晩被覆した。プレートを、PBSで洗浄し、PBS中の0.25%(wt/vol)BSAと0.05%(vol/vol)のTween−20で、室温にて30分間にわたってブロックした。プレートをPBSで再度洗浄した。ブロック緩衝液中の50μlのサンプル又は組換え型ヒトTSG−6タンパク質(R&Dシステムズ社)の対照標準を添加した。室温で2時間後、PBSと、さらに50μl/ウェルの0.5μg/mlのビオチニル化抗ヒトTSG−6(TSG−6ビオチニル化PAb検出抗体、R&Dシステムズ社)で洗浄した。2時間後、プレートをPBSで洗浄した。各ウェルに50μlのストレプトアビジン−HRP(R&Dシステムズ社)を添加した。プレートを被覆し、室温で20分間にわたってインキュベートした。100μlの基質溶液(R&Dシステムズ社)を添加し、サンプルを室温で10分間にわたってインキュベートした。吸光度を450nmで測定した(フロースターオプティマ、BMGラボテクノロジーズ社)。
生後7〜8週間のオスの免疫不全NOD/scidマウス(NOO.CB17−Prk
dcscid/J、ザジャクソン・ラボラトリィ)をイソフルオリンによる麻酔下で機械的に人口呼吸し、胸を開き、左冠動脈前下降枝を連結し、胸を閉じた。LADの有効性は、予備実験によって確立されており、外科措置から48時間後に7匹のマウスで血清の心臓トロポニンIのレベルが増加したことが実証されている(図16A)。
実施例7〜10に示したように、市販のキットを使用し、マウス血清中の心臓トロポニンI(ELISAキット、ライフ・ダイアグノスティクス社)、血清中のプラスミン活性(ロシュ・アプライド・サイエンス)、酵素電気泳動による心臓のMMP(10%ザイモグラムのゼラチンゲル、インビトロゲン/ノベックス)をアッセイした。
MI誘発マウスの5μmの凍結心臓片を抗−Ly−6GとLy−6C(RB6−8C5、BDバイオサイエンス社)で着色し、Ly−6GとLy−6Cの陽性細胞をソフトウエアプログラム(ImageJ、NIHイメージ社)でカウントした。
MIから21日後のパラフィン包埋心臓サンプルを、400以上の連続した5μmの片に切断し、マッソントリクロームで着色した。先に記載のように(タカガワら、2007年)、梗塞サイズについて定量的アッセイを行った。手短に言えば、梗塞領域に及ぶ第10番目の片ごとの像(1つの心臓につき合計で20片)を、×4対物レンズを用いたスピニングディスク顕微鏡(オリンパス社)によって調べ、ステレオ・インベスティゲータ・ソフトウエア(ステレオ・インベスティゲータ・バージョン7、MBFバイオサイエンス社)で把握した。立体的定量ソフトウエアを使用し、心臓の正中線の梗塞長さを測定した。
MIから21日後に心エコー検査を行った(アクソンセコイアC512心エコー検査システム、シーメンス・メディカル・ソリューションズUSA社)。
2つのグループ間の比較は、非対の両側スチューデントt−検定を用いて行った。P<0.05を有意とみなした。
全身注入hMSCの血液と捕獲からの浄化
マウスにIV注入したhMSCの結末を追跡するため、本発明者は、ヒト特異的Alu配列についてのリアルタイムPCRアッセイを用いた(マックブライドら、2003年)。2×106ヒトMSCのIV注入後、Aluアッセイは、細胞の99%±1.07SDが5分間以内に循環から浄化されることを示した(図13A)。約10分間の遅延期の後、2%〜3%の細胞(4〜6×104)が再度循環に現れ、肺から放出されたものと思われた。血液中に検出された少数のAlu配列がhMSCを反映することを立証するため、15分後に回収した50μlの末梢血を、hMSC培地のプラスチック培養皿の上に蒔き、14日間にわたってインキュベートした。培養物は、紡錘状hMSCの典型的なコロニーを発生し、ヒト核抗原とヒトβ2ミクログロブリンの両方に、抗体によって標識した(補足的な図13)。組織における細胞の分布を追跡するため、均質化直前の未処理マウスからの組織に対し、いろいろな数のhMSCを加えることによって、各々の組織について個々の検量線を作成した(図13B)。組織特異的検量線の使用は、抽出DNAの収率、臓器の細胞数、又はPCR反応の効率の相違によって生じる変動を最小限にする。アッセイの感度は、アッセイしたマウス臓器あたり約100のヒト細胞であった。アッセイを容易にするため、UV吸光度に代えて、抽出物中のDNAについて定量的比色分析を使用し(バートン、1956年)、PCR反応について適切なアリコートを選択した。予想通り(ガオら、2001年;シュレップファーら、2007年;リーら、2009年)、循環から浄化された細胞の殆どは肺に捕獲されていた。15分後に屠殺したマウスにおいて、ヒトDNAの83%±6.3SDが肺で回収され、僅かな痕跡量が別な組織で回収された(図13C)。一連の転移性乳癌細胞のIV注入による対照標準実験でも同様な結果が得られた(図13CのMDA−MB−231)。ヒト白血球のIV注入後、少ない割合で15分後に肺において回収され、多い割合で循環系に残って肝臓にも現れた(図13C)。肺に捕獲されるhMSCの割合は、同じ体積(150μl)の媒体中で注入MSCの数を10000まで少なくすること、インテグリン−α4又はインテグリン−α6に対する抗体で細胞を前処理すること(チェンら、2006年)、又はラット白血球とともに細胞を前インキュベートすること(チュート、2006年)によっては、有意には減少しなかった。動脈内注入の効果を検討するため、心臓の左心室に2×106hMSCを注入した。5分間で血液から殆どの細胞が同様に浄化されたが(補足的な図14A)、15〜60分間にわたって注入細胞の約1.72%±1.81SDのわずかな再循環がやはり存在した(補足的な図14A)。また、IV注入に比較して、注入から15分後に、脳、心臓、肺、肝臓、及び腎臓などの臓器で多数の細胞が回収された(補足的な図14B)。転移性乳癌細胞による対照実験は、同様なパターンの組織分布を生じた(補足的な図14B)。
肺に捕獲されたhMSCの動態学と再分配
肺からの細胞の経時な再分配を検討するため、2×106hMSCをIV注入し、マウスの7つの組織を4日以内にアッセイした(図13E)。Alu配列のアッセイは、肺に最初に捕獲された細胞が、約24時間の半減期で消失することを示した。同様な値が、GAPDHについてのヒトmRNAのレベルで、生存ヒト細胞についてのアッセイによって得られた(図13E)。肺の組織切片は、肺に捕獲されたヒトMSCが、輸入血管に塞栓を形成し(リーら、2009年)、多くの細胞がアポトーシスすることを実証した(図示せず)。肺から消失した細胞は、6つの他の組織に有意な数で現れず、注入したAlu配列の合計0.04%(約4000細胞に相当)が、48時間後に6つの組織で回収され、96時間後には0.01であった(図13E)。
梗塞心臓におけるhMSCの捕獲
多数のIV注入hMSCがMI後の心臓に現れるかどうかを調べるため、冠動脈前下行枝(LAD)の永久的連結によってMIを発生させてから1日後のNOD/SCIDマウスの尾静脈に、hMSCを注入した。Alu配列のアッセイは、注入細胞の0.04%±0.03SD(400細胞±300SD、n=5)が、注入から15分後の梗塞心臓で回収されたことを示した(図13F)。IV注入から1日後、心臓のAlu配列は約5倍の0.148%±0.053SDに増加し、約1480細胞±530SD(n=5)に相当した。同様な値が、注入から1日後のヒトGAPDHのmRNAのアッセイによって得られた(792細胞±140SD、n=5)。
塞栓によって生じるマウスとヒトのトランスクリプトームにおける変化
双方のトランスクリプトームをアッセイするため、約2×106hMSCをマウスの尾静脈に注入し、10時間後に肺からRNAを抽出した。その10時間後は、ヒトGAPDHのmRNAについてのアッセイが、アッセイに適当な量のヒトmRNAが存在することを示した時間である(図13E)。ヒトmRNAによるクロスハイブリダイゼーションについてのフィルタ処理後、このデータは、hMSCの塞栓が、755マウス転写物の発現を上方制御し、347マウス転写物の発現を2倍以上に下方制御することを示した(図14A)。また、このデータは、肺における塞栓後に、451ヒト転写物が上方制御され、1009転写物が下方制御されることを示した(図14B)。
インビトロMSCは活性化してTSG−6を分泌
TSG−6の増加は、そのタンパク質が先に有力な抗炎症因子であると示されていたため、特に興味が深い(フォルテーザら、2007年;ゲッティングら、2002年;ウィスニースキーとビルセク、2004年;ミルナーら、2006年)。リアルタイムRT−PCRアッセイは、肺におけるヒトTSG−6mRNAが、hMSCのIV注入から10時間後に増加し、24時間後にさらに増加することを示した(図15B)。未処理マウスとMIマウスの肺において、TSG−6の発現に相違はない(図15B)。TSG−6は、TNF−αとともにインキュベートされたヒト線維芽細胞からのcDNAクローンの分析によって発見された(リーら、1992年)。したがって、同じドナーからのhMSCと線維芽細胞をTNF−αとともにインキュベートし、リアルタイムRT−PCRによってmRNAをアッセイした。hMSCにおけるTSG−6の転写物は、48時間にわたる10ng/mlのTNF−αを用いたインキュベート後に約120倍増加し、hMSCの次の継代では約80倍に増加した(図15C)。ELISAは、48時間にわたるTNF−αを用いたインキュベーションが、TSG−6タンパク質の分泌を、検出不能レベルから2000pg/ml/105細胞/48時間を超えるレベルまで増加させることを示した(図15D)。驚くことに、TNF−αに対するhMSCの反応は、ヒト線維芽細胞の反応をはるかに超えた。並列実験において、同じ条件下でTNF−αとともにインキュベートしたマウスMSCは、TSG−6についての転写物の発現を3.94倍(±0.49SD、n=4)に上方制御した。
IVのMSCとrhTSG−6はいずれもMIマウスの炎症促進性プロテアーゼを減少
急性MIは急性炎症反応を発生し、湿潤性好中球が心筋を劣化させるMMPを生成する(ファングら、2007年;リンジーら、2001年)。永久的LADは、心臓トロポニンI(図16A)、心筋障害のバイオマーカー(チャペル、1998年;パルベイズ、1997年)、プラスミン活性(図16B)、及び炎症反応のマーカー(ハイマンスら、1999年;グリフィンら、2005年)の血清レベルを増加させる。プラスミン活性は、rhTSG−6の2回の注入で減少し、その既知の抑制効果(バルドスら、2001年;ミルナーら、2006年)と矛盾のない観察であった。また、プラスミン活性は、hMSC、又はhMSCとスクランブルsiRNAのIV注入によって減少したが、TSG−6のsiRNAを形質移入されたhMSCでは減少しなかった。
MIにおける梗塞サイズと心臓機能に及ぼすTSG−6の効果
先に報告されたように(イソら、2007年)、hMSCのIV注入は、MIから3週間後の梗塞サイズを低下させた(図17A、17B、17F、及び図12)。TSG−6遺伝子のsiRNAノックダウンをともなうhMSCは、梗塞サイズに効果を有しなかった(図17D、17F)。スクランブルsiRNAで形質導入したhMSCは、梗塞サイズに中間的効果を生じ(図17D、17F)、スクランブルsiRNAが、TSG−6の分泌に部分的な効果を有するためと思われた(図15E、15F)。また、外科処置の直後と24時間後の100μgのrhTSG−6のIV注入は、梗塞サイズを減少させた(図17E、17F、図12)。しかしながら、rhTSG−6の効果は、hMSC(p<0.05)の投与後の梗塞サイズの減少よりも若干小さかった。
以下の参考文献は、本願明細書に示した記載に対して例示的手順又は他の補足的事項を与える範囲で、本願でも具体的に参考にして取り入れられる。
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- 哺乳類被検者における心筋梗塞のサイズを低下させる方法に使用される腫瘍壊死因子刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む医薬組成物であって、前記方法は、前記心筋梗塞の発生後に前記TSG−6タンパク質を前記哺乳類被検者に投与することを含み、前記TSG−6タンパク質が0.001mg/kg/日から1000mg/kg/日までの量で投与される医薬組成物。
- 前記TSG−6タンパク質が0.01mg/kg/日から100mg/kg/日までの量で投与される請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記TSG−6タンパク質が0.1mg/kg/日から10mg/kg/日までの量で投与される請求項2に記載の医薬組成物。
- 哺乳類被検者における心筋梗塞のサイズを低下させる方法に使用される腫瘍壊死因子刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む医薬組成物であって、前記方法は、前記心筋梗塞の発生後の24時間以内に前記TSG−6タンパク質を前記哺乳類被検者に投与することを含み、前記TSG−6タンパク質が前記哺乳類被検者における心筋梗塞のサイズを低下させるのに有効な量で投与される医薬組成物。
- 前記哺乳類被検者がヒトである請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記TSG−6タンパク質が静脈内に投与される請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記TSG−6タンパク質が心筋に直接注射される請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記TSG−6タンパク質が0.001mg/kg/日から1000mg/kg/日までの量で投与される請求項4に記載の医薬組成物。
- 哺乳類被検者における心筋梗塞のサイズを低下させる方法に使用される腫瘍壊死因子刺激遺伝子6(TSG−6)タンパク質を含む医薬組成物であって、前記方法は、前記心筋梗塞の発生後の24時間以内に前記TSG−6タンパク質を前記哺乳類被検者に投与することを含み、前記TSG−6タンパク質が0.001mg/kg/日から1000mg/kg/日までの量で投与される医薬組成物。
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