JP2015181347A - 神経細胞の培養方法及び移植用モジュール - Google Patents

Abstract

【課題】神経細胞を所定の方向に成長させる神経細胞の培養方法を提供すること。
【解決手段】培養基材上に、神経細胞と、前記神経細胞の神経突起の伸長方向をガイドするガイド部材とを配置する工程と、配置された前記神経細胞を培養する培養工程と、を有する、神経細胞の培養方法。
【選択図】図２

Description

本発明は、神経細胞の培養方法及び移植用モジュールに関する。

近年、再生医療等の医療分野において、細胞培養の培養及び成長に関する研究開発が進められている。特に、神経細胞については、パーキンソン病、アルツハイマー病等の治療を目的とした、損傷した神経の治療や、神経の自己組織性を利用した神経回路の形成等の研究開発が広く進められている（例えば、特許文献１）。

神経細胞は、細胞体と、この細胞体から他の神経細胞へと伸びる神経突起を含む。また、神経突起は、樹状突起及び軸索を含み、樹状突起は、外部からの刺激を受けて、軸索を介して、他の細胞に神経伝達物質を放出する。

特開２００６−２２３１９７号公報

神経細胞が損傷して断絶した場合、上述の機能が失われるため、障害を引き起こす可能性がある。そのため、神経細胞を所定の方向に成長させて、損傷箇所を回復させることが必要となる。

損傷箇所の回復には、神経細胞移植による接続が行われるが、各々の神経細胞の成長は不規則であるため、神経細胞を所定の方向に成長させる技術の開発が求められている。

上記課題に対して、神経細胞を所定の方向に成長させる神経細胞の培養方法を提供する。

培養基材上に、神経細胞と、前記神経細胞の神経突起の伸長方向をガイドするガイド部材とを配置する工程と、
配置された前記神経細胞を培養する培養工程と、
を有する、
神経細胞の培養方法。

神経細胞を所定の方向に成長させる神経細胞の培養方法を提供できる。

本実施形態に係る神経細胞の培養方法のフロー図の一例である。 第１の実施形態に係る神経細胞の培養方法の一例を説明するための概略図である。 本実施形態に係る培養方法によって培養された神経細胞を、神経細胞損傷箇所に適用する方法の一例を説明するための概略図を示す。 第２の実施形態に係る神経細胞の培養方法の一例を説明するための概略図である。 第２の実施形態に係る神経細胞の培養方法の他の例を説明するための概略図である。 第３の実施形態に係る神経細胞の培養方法の一例を説明するための概略図である。 本実施形態に係る培養方法によって培養された神経細胞を、神経細胞損傷箇所に適用する方法の他の例を説明するための概略図である。 本実施形態に係る神経細胞の位相差顕微鏡写真の一例である。 本実施形態に係る神経細胞の位相差顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真の他の例である。 本実施形態に係る神経細胞の位相差顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真の他の例である。

以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、本明細書において、同一の構成要素には、同一の参照符号を付し、重複する説明は省略することがある。また、同一図面における各々の構成要素は、説明のために、異なる縮尺を使用していることがある。

（神経細胞）
先ず、本実施形態において培養可能な神経細胞について、説明する。本実施形態において、培養対象の神経細胞は、シャーレ等の神経細胞培養基材上で培養できるものであれば、特に限定されるものではなく、公知の神経細胞を選択することができる。

例えば、ヒトを対象とした医療分野に適用する場合には、主にヒト由来の神経細胞を培養対象の神経細胞として選択することができ、より具体的には、神経損傷の患者の患部に適応する組織由来の神経細胞を選択することができ、例えばヒトの口腔粘膜細胞を好ましく使用することができる。しかしながら、各種ニューロデバイス等の、ヒトを対象としない用途に使用する場合には、種々の動物種及び組織由来の神経細胞を選択しても良い。

また、神経細胞は、生体組織から単離したものを使用しても良いし、幹細胞から神経細胞に分化誘導したものであっても良いし、これらを継代培養したものを使用しても良い。

（神経細胞の培養条件）
次に、本実施形態の神経細胞の培養条件について、説明する。本実施形態において、神経細胞の培養条件は、使用する神経細胞に対応する公知の培養条件の中から、当業者が適宜適切な条件を選択することができる。

使用する培地としては、特に限定されず、神経細胞の培養に使用される公知の培養用培地を使用することができる。また、培地は、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、新生仔ウシ血清、ウマ血清等の血清を含んでいても良い。

細胞の培養における、インキュベータとしては、培地中の二酸化炭素（ＣＯ_２）濃度を所定の値に維持するために、神経細胞における一般的な細胞培養に使用するものと同様のＣＯ_２インキュベータを使用することができる。一般的には、ＣＯ_２濃度が５％〜１０％、温度が２８℃〜３７℃、相対湿度８０％程度の培養条件で培養される。また、培地中の酸素（Ｏ_２）濃度を所定の値に維持するために、Ｏ_２インキュベータを使用しても良い。

また、神経細胞の培養において、神経細胞から分泌される神経成長因子（以下、Ｎｅｕｒｏ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦと呼ぶことがある）を培地中に添加することが好ましい。

神経細胞は、神経細胞培養基材上に播種され、ＣＯ_２インキュベータ内で所定期間静置されることで培養される。神経細胞の定着後は、所定の期間毎に培地を交換しても良い。交換培地としては、血清培地でも良いし、無血清培地でも良いし、サイトカイン等を添加した添加培地でも良い。

培養基材としては、特に制限はなく、例えばシャーレ等のプラスチックの培養器皿又は時計皿等の従来の培養基材を使用することができる。

（神経細胞の培養方法）
図１に、本実施形態に係る神経細胞の培養方法のフロー図の一例を示す。

図１に示されるように、本実施形態に係る神経細胞の培養方法は、
培養基材上に神経細胞と、前記神経細胞の伸長方向をガイドするガイド部材とを配置する工程（Ｓ１０００）と、
配置された前記神経細胞を培養する培養工程（Ｓ２０００）と、
を有する。

ガイド部材の種々の実施形態について、下記に詳細に説明する。

［第１の実施形態］
図２に、第１の実施形態に係る神経細胞の培養方法の一例を説明するための概略図を示す。

図２に示されるように、本実施形態においては、培養基材１００上に、ナノファイバ１０２と、このナノファイバ１０２の近傍に神経細胞１０４とが配置される。この状態で、神経細胞１０４を培養することで、神経細胞１０４の神経突起１０６は、ナノファイバ１０２の伸長方向（軸方向）に沿って成長する。即ち、ナノファイバ１０２の伸長方向を制御することにより、神経細胞１０４を所望の方向に伸長させることができる。この際、ナノファイバ１０２は、神経突起１０６の成長をガイドするガイド部材としての役割を果たす。

ナノファイバ１０２は、図２では１つだけ示されているが、本発明はこの点において限定されず、一般的には、２以上のナノファイバ１０２が配置される。また、本明細書における図面において、神経細胞は概略的に示されており、本発明はこの点において限定されない。

ナノファイバ１０２の材料としては、生体親和性を有していれば、特に制限はなく、無機材料、有機材料及び／又は無機有機複合材料のナノファイバを使用することができる。無機材料としては、例えば、カーボンナノファイバ等の材料を使用することができる。また、有機材料としては、例えば、セルロース系又は合成高分子系のナノファイバを使用することができる。

ナノファイバ１０２の径としては、特に制限はなく、通常の市販のナノファイバを使用することができる。

第１の実施形態に係る神経細胞の培養方法では、上述した培養条件において、約３ｍｍ／日のオーダで神経細胞１０４がナノファイバ１０２の伸長方向に沿って成長することが確認されている。

ナノファイバ１０２及び神経細胞１０４は、神経細胞損傷箇所に適用して損傷箇所を修復する移植用モジュール１１２ａとして使用することができる。

図３に、本実施形態に係る培養方法によって培養された神経細胞を、神経細胞損傷箇所に適用する方法の一例を説明するための概略図を示す。

本実施形態においては、例えば、損傷箇所１０８を有する脊髄１１０に、移植用モジュール１１２ａを適用する実施形態について説明するが、本発明はこの点において限定されない。

損傷箇所１０８は、神経細胞が損傷して断絶した領域、箇所を意味する。この損傷箇所１０８に、好ましくは複数整列されたナノファイバ１０２及び培養した神経細胞１０４を含む移植用モジュール１１２ａを、移植する。神経細胞１０４は、損傷箇所１０８の損傷長さＬに応じて、前述した培養方法によって所定の長さに培養したものを使用することが好ましい。なお、ナノファイバ１０２は、生体親和性を有する材料で形成されている。そのため、ナノファイバ１０２及び神経細胞１０４を含む移植用モジュール１１２ａを、直接、損傷箇所１０８に移植することが可能である。

この際、移植用モジュール１１２ａを損傷箇所１０８に支持する、支持部材１１０を配置しても良い。支持部材１１０としては、生体親和性を有すると共に、ナノファイバ１０２及び神経細胞１０４を損傷箇所１０８に保持することができれば、特に限定されない。

ナノファイバ１０２によって、移植される神経細胞１０４は、所定の方向に成長しやすい状態となっている又は所定の方向に成長している。この移植用モジュール１１２ａを移植することにより、脊髄１１０における、損傷箇所１０８を介して対向する２つの端面１１０ａ、１１０ｂに位置される図示しない神経細胞同士が、移植された神経細胞１０４を介して接続される可能性を高くすることができる。即ち、損傷箇所１０８の修復を、容易に実現することができる。

移植用モジュール１１２ａは、１又は２つ以上の電極を有することが好ましい。電極を移植箇所、即ち損傷箇所１０８に、好ましくは複数の電極を損傷箇所１０８の中心に対して放射状に配置する。そして、神経活動電位の変化を測定することにより、神経細胞がどのように細胞活動しているかを調べることができる。さらにこの場合、損傷箇所１０８に対応する筋肉表面に、皮下埋め込み型電極を配置することが好ましい。損傷個所１０８に配置した電極の生体電位と、損傷個所１０８に対応する筋肉表面に配置した皮下埋め込み型電極の生体電位との比較から、神経伝達信号の伝達具合、つまりは損傷箇所１０８の修復度合いを推定することができる。また、これらの電極に、例えば矩形波電流等の電気刺激を入力しても良い。

また、電極に、例えば矩形波電流等の電気刺激を入力しても良い。外部からの電気刺激に対して反射した活動電位を計測することにより、神経細胞の細胞活動を更に詳細にモニタすることができる。さらに、モニタリングした活動電位と細胞活動との関係から、電気刺激の刺激頻度を制御することにより、神経細胞の伸長の指向性を制御することも可能である。

例えば、矩形波電流によって電気刺激を入力する場合の電流強度、パルス持続時間及び波形の傾きは、神経線維を興奮させることができれば、特に限定されない。また、通電方式は、単極通電法であっても、双極通電法であっても良い。

移植用モジュール１１２ａを移植した後は、パイプ等の流路を介して、移植用モジュール１１２ａに、ＮＧＦ、Ｏ_２又はＣＯ_２等を含む培地を、ポンプ等を用いて供給することが好ましい。これにより、移植用モジュール１１２ａは、前述した培養条件と同様の、細胞が生物体の中で生存可能な環境と近い条件で培養される。そのため、神経細胞１０４の成長が更に促進されるため、より高い確率で損傷箇所１０８を修復することができる。

移植用モジュール１１２ａ及び後述する移植用モジュール１１２ｂ、１１２ｃは、冷凍保存によるストックが可能である。この場合、必要な時に移植用モジュールを解凍して使用することができる。

以上、第１の実施形態に係る神経細胞の培養方法では、神経細胞１０４のガイド部材として、ナノファイバ１０２を使用する。神経細胞１０４はナノファイバ１０２の伸長方向に沿って成長するため、所望の伸長方向にナノファイバ１０２を配置することで、所望の方向に神経細胞１０４を成長させることができる。

［第２の実施形態］
図４に、第２の実施形態に係る神経細胞の培養方法の一例を説明するための概略図を示す。

図４に示されるように、第２の実施形態においては、培養基材１００上に、中空ナノファイバ１１４と、神経細胞１０４とが配置される。この際、神経細胞１０４は、中空ナノファイバ１１４の入口付近又は内部に配置される。この状態で、神経細胞１０４を培養することで、神経細胞１０４の神経突起１０６は、中空ナノファイバ１１４の伸長方向に沿って成長する。即ち、中空ナノファイバ１１４の伸長方向を制御することにより、神経細胞１０４を所望の方向に伸長させることができる。この際、中空ナノファイバ１１４は、神経突起１０６の成長をガイドするガイド部材としての役割を果たす。

本実施形態の中空ナノファイバ１１４は、図４では１つだけ示されているが、本発明はこの点において限定されず、一般的には、２以上の中空ナノファイバ１１４が配置される。また、１つの中空ナノファイバ１１４には、１つの神経細胞１０４が配置されても良いし、２つ以上の神経細胞１０４が配置されていても良い。

中空ナノファイバ１１４の直径は、神経細胞１０４を内部に配置することができれば特に限定されないが、１０μｍ〜１００μｍとすることが好ましい。

中空ナノファイバ１1４の材料としては、第１のナノファイバ１０２の材料と同様に、生体親和性を有していれば、特に制限はなく、無機材料、有機材料及び／又は有機無機複合材料の中空ナノファイバを使用することができる。無機材料としては、例えば、カーボン製の中空ナノファイバを使用することができる。有機材料としては、例えば、セルロース系の中空ナノファイバ又は合成高分子系の中空ナノファイバを使用することができる。

図５に、第２の実施形態に係る神経細胞の培養方法の他の例を説明するための概略図を示す。

図５に示されるように、第２の実施形態の変形例においては、培養基材１００上に、外表面から内表面へと連通する微小なホール１１６を有する中空ナノファイバ１１４と、神経細胞１０４とが配置される。

この第２の実施形態の変形例では、中空ナノファイバ１１４は微小なホール１１６を有するため、成長の過程で中空ナノファイバ１１４の内表面に到達した神経突起１０６は、ホール１１６を介して中空ナノファイバ１１４の外表面へと出る。外表面１１４に出た神経突起１０６は、この外表面１１４に沿って、即ち、中空ナノファイバ１１４の伸長方向に沿って、更に成長する。

ホール１１６の径としては、神経突起１０６が通過することができれば、特に制限されない。

第２の実施形態及び第２の実施形態の変形例に係る神経細胞の培養方法では、上述した培養条件において、約３ｍｍ／日のオーダで神経細胞１０４が中空ナノファイバ１１４の伸長方向に沿って成長することが確認されている。

第２の実施形態及び第２の実施形態の変形例においても、中空ナノファイバ１１４及び神経細胞１０４は、移植用モジュール１１２ｂ、１１２ｂ'として、これを損傷箇所１０８に移植することで、容易に損傷箇所１０８の修復を実現することができる。

移植用モジュール１１２ｂ、１１２ｂ'は、移植用モジュール１１２ａと同様に、１又は２つ以上の電極を有することが好ましい。電極を移植箇所、即ち損傷箇所１０８に、好ましくは複数の電極を損傷箇所１０８の中心に対して放射状に配置する。そして、神経活動電位の変化を測定することにより、神経細胞がどのように細胞活動しているかを調べることができる。さらにこの場合においても、損傷箇所１０８に対応する筋肉表面に、皮下埋め込み型電極を配置することが好ましい。損傷個所１０８に配置した電極の生体電位と、損傷個所１０８に対応する筋肉表面に配置した皮下埋め込み型電極の生体電位との比較から、神経伝達信号の伝達具合、つまりは損傷箇所１０８の修復度合いを推定することができる。また、これらの電極に、例えば矩形波電流等の電気刺激を入力しても良い。

以上、第２の実施形態に係る神経細胞の培養方法では、神経細胞１０４のガイド部材として、中空ナノファイバ１１４を使用する。神経細胞１０４は中空ナノファイバ１１４の伸長方向に沿って成長するため、所望の伸長方向で中空ナノファイバ１１４を配置することで、所望の方向に神経細胞１０４を成長させることができる。

［第３の実施形態］
図６に、第３の実施形態に係る神経細胞の培養方法の一例を説明するための概略図を示す。

図６に示されるように、第３の実施形態においては、培養基材１００上に、雲状（クラウド状）に形成されたナノファイバ１１８と、神経細胞１０４とが配置される。本実施形態において、「クラウド状に形成されたナノファイバ」とは、１つ又は２つ以上のナノファイバが、規則的又は不規則的に伸長することによって形成されたナノファイバ又はナノファイバ群のことを指す。

クラウド状に形成されたナノファイバ１１８を利用することで、神経細胞１０４の神経突起１０６を、規則的又は不規則的に伸長するナノファイバ１１８の伸長方向に対応して成長させることができる。

即ち、第３の実施形態に係るクラウド状に形成されたナノファイバ１１８は、神経突起１０６の成長を、第１及び第２の実施形態と比較して、自由度を有して所定の方向性に成長させるガイド部材としての役割を果たす。

ナノファイバ１１８の材料としては、他の実施形態と同様に、生体親和性を有していれば、特に制限はなく、無機材料、有機材料及び／又は無機有機複合材料のナノファイバを使用することができる。無機材料としては、例えば、カーボンナノファイバ等の材料を使用することができる。また、有機材料としては、例えば、セルロース系又は合成高分子系のナノファイバを使用することができる。

第３の実施形態に係る神経細胞の培養方法においても、上述した培養条件において、約３ｍｍ／日のオーダで神経細胞１０４がナノファイバ１１８の伸長方向に沿って成長することが確認されている。

クラウド状に形成されたナノファイバ１１８及び神経細胞１０４は、第１及び第２の実施形態と同様に、神経細胞損傷箇所に適用して損傷箇所を修復する移植用モジュール１１２ｃとして使用することができる。

図７（ａ）に、本実施形態に係る培養方法によって培養された神経細胞を、神経細胞損傷箇所に適用する方法の他の例を説明するための概略図を示す。また、図７（ｂ）に、第３の実施形態に係るクラウド状に形成されたナノファイバを含む移植用モジュールの一例の光学顕微鏡写真を示す。

本実施形態においては、損傷箇所１２０を有する脳神経１２２に、培養された神経細胞を適用する実施形態について説明するが、本発明はこの点において限定されない。

本実施形態において、損傷箇所１２０は、図７に示されるように、脳梗塞等によって形成された脳神経内の穴の領域、箇所を意味する。この損傷箇所１２０に、クラウド状に形成されたナノファイバ１１８及び培養した神経細胞１０４を含む移植用モジュール１１２ｃを、移植する。なお、ナノファイバ１１８の大きさ、形状は、損傷箇所１２０の大きさ、形状等に合わせて予め設定しておく。また、第３の実施形態のナノファイバ１１８と神経細胞１０４とを有する移植用モジュール１１２ｃを使用する場合、神経細胞１０４の神経突起１０６が、例えば、移植用モジュール１１２ｃの略表面にまで成長したものを使用することが好ましい。

移植用モジュール１１２ｃを損傷箇所１２０に移植する場合、移植用モジュール１１２ｃを損傷箇所１０８に支持する図示しない支持部材を配置しても良い。

移植用モジュール１１２ｃにおける神経細胞１０４は、この移植用モジュール１１２ｃの略表面にまで成長している。この移植用モジュール１１２ｃを移植することにより、脳細胞１２２における、損傷箇所１２０に面する縁部１２４に位置する神経細胞と接続される可能性を高くすることができる。即ち、損傷箇所１２０の修復を、容易に実現することができる。

移植用モジュール１１２ｃを移植した後は、図示しないパイプ等を介して、移植用モジュール１１２ｃに、ＮＧＦ、Ｏ_２又はＣＯ_２等を含む培地を、供給することが好ましい。これにより、移植用モジュール１１２ｃは、前述した培養条件と同様の、細胞が生物体の中で生存可能な環境と近い条件で培養される。そのため、神経細胞１０４の成長が更に促進されるため、より高い確率で損傷箇所１２０を修復することができる。

移植用モジュール１１２ｃは、移植用モジュール１１２ａ及び１１２ｂと同様に、１又は２つ以上の電極を有することが好ましい。電極を移植箇所、即ち損傷箇所１２０に、好ましくは複数の電極を損傷箇所１２０の中心に対して放射状に配置する。そして、神経活動電位の変化を測定することにより、神経細胞がどのように細胞活動しているかを調べることができる。さらにこの場合においても、損傷箇所１０８に対応する筋肉表面に、皮下埋め込み型電極を配置することが好ましい。損傷個所１０８に配置した電極の生体電位と、損傷個所１０８に対応する筋肉表面に配置した皮下埋め込み型電極の生体電位との比較から、神経伝達信号の伝達具合、つまりは損傷箇所１０８の修復度合いを推定することができる。また、これらの電極に、例えば矩形波電流等の電気刺激を入力しても良い。

以上、第３の実施形態に係る神経細胞の培養方法では、神経細胞１０４のガイド部材として、クラウド状に形成されたナノファイバ１１８を使用する。神経細胞１０４はクラウド状に形成されたナノファイバ１１８の伸長方向に対応して成長するため、所定の方向性を有しながらも、高い自由度を有して、神経細胞１０４を成長させることができる。

（実施例）
次に、神経細胞を、ガイド部材によって、所定の方向に伸長させることが可能であることを実証した実施例について、説明する。

本実施形態では、モデル細胞として、ＰＣ−１２細胞を使用した。ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫から樹立された細胞株であるＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦを作用させることにより、神経突起を伸長して、交感神経細胞様に分化することが知られている。

ＰＣ−１２細胞を、ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘペプチドハイドロゲル（株式会社スリー・ディー・マトリックス製）に接着し、全培養条件で突起を伸長させた。なお、細胞密度は、８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、ＮＧＦを添加後、８日間全培養条件で培養した。

図８に、本実施形態に係る神経細胞の位相差顕微鏡写真の一例を示す。図８に示されるように、ＰＣ−１２細胞は、主として、
パターン１（Ｐ１）：ゲルの端部に向かって又はゲルの端部に沿って伸長する：
パターン２（Ｐ２）：ゲルの凹凸に並行に伸長する：
パターン３（Ｐ３）：他の細胞に向かって伸長する：及び
パターン４（Ｐ４）：放射状に伸長する：
４つのパターンで神経突起が伸長していることがわかる。

この４つのパターンをより詳細に説明するために、図９（ａ）に、本実施形態に係る神経細胞の位相差顕微鏡写真と、図９（ｂ）に、蛍光顕微鏡写真の他の例を示す。また、図１０（ａ）に、本実施形態に係る神経細胞の位相差顕微鏡写真と、図１０（ｂ）に、蛍光顕微鏡写真の他の例を示す。

図９（ａ）及び図９（ｂ）の写真からも、ＰＣ−１２細胞は、放射状に、かつ、他の細胞に向かって伸長していることが観察される。また、図１０（ａ）及び図１０（ｂ）の写真から、ゲルの端部に向かって又はゲルの端部に沿って、ゲルの凹凸に並行に伸長していることが観察される。

以上の結果から、ＰＣ−１２細胞の伸長方向は、配置された足場や、ゲルの凹凸、細胞の凝集等に影響されることがわかった。即ち、規則的又は不規則的な所定の方向性を有するガイド部材を使用することで、神経細胞の伸長方向を、所定の方向に制御できることがわかった。

以上、本実施形態に係る神経細胞の培養方法は、神経細胞を所望の方向性を有して伸長させることができる。また、この神経細胞及びガイド部材を有する移植用モジュールは、所望の方向性に神経細胞を伸長させることができるため、神経細胞の損傷を有する箇所に、汎用的に適用することができる。

１００ 培養基材
１０２ ナノファイバ
１０４ 神経細胞
１０６ 神経突起
１０８ 損傷箇所
１１０ 脊髄
１１２ 移植用モジュール
１１４ 中空ナノファイバ
１１６ ホール
１１８ クラウド状に形成されたナノファイバ
１２０ 損傷箇所
１２２ 脳神経
１２４ 縁部

Claims (8)

1. 培養基材上に、神経細胞と、前記神経細胞の神経突起の伸長方向をガイドするガイド部材とを配置する工程と、
   配置された前記神経細胞を培養する培養工程と、
   を有する、
   神経細胞の培養方法。
2. 前記ガイド部材は、ナノファイバを含む、
   請求項１に記載の神経細胞の培養方法。
3. 前記ナノファイバは、クラウド状に形成されている、
   請求項２に記載の神経細胞の培養方法。
4. 前記ガイド部材は、中空ナノファイバを含む、
   請求項１乃至３のいずれか一項に記載の神経細胞の培養方法。
5. 前記中空ナノファイバは、外表面から内表面へと連通する穴部を有する、
   請求項４に記載の神経細胞の培養方法。
6. 神経細胞と前記神経細胞の神経突起の伸長方向をガイドするガイド部材と、
   を有する、移植用モジュール。
7. 前記移植用モジュールは更に、電極を有する、
   請求項６に記載の移植用モジュール。
8. 前記移植用モジュールは更に、前記神経細胞に外部から酸素、二酸化炭素及び／又はＮＧＦを供給するための流路を有する、
   請求項６又は７に記載の移植用モジュール。