JP2015164949A - ポリペプチド及びグラム陽性ポリペプチドを含有する免疫化組成物並びにこれらの使用方法 - Google Patents
ポリペプチド及びグラム陽性ポリペプチドを含有する免疫化組成物並びにこれらの使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2009年3月23日に出願された米国仮出願第61/210,772号の優先権を主張する。
農産業において、多数の重大な疾患がグラム陽性生物によって生じる。グラム陽性菌感染症によって生じる臨床症状の例は、乳腺炎、敗血症、肺炎、骨髄炎、髄膜脳炎、リンパ管炎、皮膚炎、生殖器感染症、子宮炎、周産期疾患、下垂体膿瘍、関節炎、滑液包炎、精巣炎、膀胱炎及び腎盂腎炎、リンパ節炎、結核、潰瘍性リンパ管炎、丹毒、蹄葉炎、チザー病、破傷風、ボツリヌス症、腸炎、悪性水腫、ブラクシー病(braxy)、桿菌性ヘモグロビン尿症、腸毒血症が含まれる。ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)は、特に農業動物の多くの異なる種に感染することができ、膨大な経済的損失を生じ得る。例えば、米国酪農業において、乳腺炎、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)によって度々生じる疾患に起因して、毎年乳牛1頭当たり約$185を損出すると見積もられている。米国では9.500万頭の乳牛が飼育されているので、乳腺炎の年間コストは約$18億である。これは、農家の牛乳販売の総売上げの約10%であり、この損失の約3分の2は、準臨床的に(無症状に)感染した乳牛における牛乳の生産の減少に起因する。他の損失は、異常乳の廃棄及び抗生物質で治療された乳牛由来の乳の保留、発症した乳牛の早期差し替えコスト、選別された乳牛の売却価額の低下、薬及び獣医サービスのコスト及び人件費の増加に起因する。ウシ酪農業内のこの蔓延に加えて、グラム陽性球菌によって生じる乳腺炎はまた、ヤギ及びヒツジの間で共通する。黄色ブドウ球菌(S. aureus)によって生じるさらなる動物疾患には、ウマにおけるボトリオミセス症、家禽における化膿性滑膜炎及び骨髄炎、ウサギにおけるスナッフル、ブタにおける流産、及び子ヒツジにおけるダニ性膿血が含まれる。ブドウ球菌の他の種は、イヌ及びブタの主たる皮膚病原体である{イヌ:(ストレプトコッカス・インターメディウス(S. intermedius)}{ブタ:スタフィロコッカス・ヒカス(S. hycius)}。家禽種において、ブドウ球菌病原体は心膜炎及び敗血症を生じる。
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)はまた、多種多様な感染症を生じるヒト病原体である。ヒト粘膜及び皮膚の共通の生着菌である、種黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、様々なヒト感染症を生じうる日和見病原体である。例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)は、膿痂疹、せつ腫症、蜂窩織炎、及び熱傷様皮膚症候群、並びに潜在的に致命的な手術後の創傷感染症を含む一部の皮膚感染症の原因病原体である。加えて、病院内(hospital settings)での易感染性個人の黄色ブドウ球菌(S. aureus)への曝露は、結果、器官感染症、例えば肺炎、尿路感染症、骨髄炎、関節炎、菌血、及び心内膜炎を生じている。黄色ブドウ球菌(S. aureus)はまた、中毒症、最も顕著な毒素性ショック症候群及び食中毒の原因病原体である。ブドウ球菌エンテロトキシンBによって生じる食中毒は、食物由来の疾病、特にサルモネラ症、カンピロバクター症及びリステリア症の最も一般的な原因である。ブドウ球菌の他の種はまた、ヒト疾患を生じ;表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリティカス(S. haemolyticus)及びスタフィロコッカス・ホミニス(S. hominis)は通常埋め込み医療機器に感染し、並びに腐生ブドウ球菌(S. saprophyticus)は、女性における尿路感染症と関連がある。
ブドウ球菌は、種々の宿主組織に感染し、宿主環境に関連する制限的な資源及び活発な防御の中で生存するためにデザインされた数種類のタイプの分泌タンパク質、細胞表面発現病原性因子の産生及び代謝系を介して、免疫系を回避する。コロニー形成は、感染の確立における必須の第一段階であり;莢膜、リポテイコ酸、及びテイコ酸を含む多数の因子は、コロニー形成に寄与する共通の構成成分である。加えて、表面タンパク質、例えばブドウ球菌フィブロネクチン結合タンパク質及び骨シアロタンパク質結合タンパク質は、特異的に宿主組織構成成分に結合する。毒素は、通常ブドウ球菌病原体間で産生され、非常にダメージを与え;食中毒、毒素性ショック症候群及び剥離性皮膚状態を含む一部のヒト疾患は、細胞外分泌毒素タンパク質の直接的な結果である。単一の単離株は、20〜30種の異なる分泌毒素に関する遺伝子をコードする。分泌タンパク質生成物の一部は、抗原提示細胞のMHCクラスII分子、同時に、T細胞のT細胞受容体に非特異的に結合することができるスーパー抗原である。結合は、T細胞シグナル伝達を誘発し、高レベルの炎症誘発性因子の放出につながり、最終的に極度の免疫応答に起因する宿主のダメージを誘発する。表面上に発現される病原性因子の他のクラスは、宿主免疫系から細菌を隠す。例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)細胞表面発現タンパク質Aは、宿主抗体のFc構成成分の結合によってオプソニン作用及び食作用を抑制する。多数のプロテアーゼ、溶血素(アルファ, ベータ, ガンマ及びデルタ)、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びコラゲナーゼもまた、細菌を周囲細胞からの栄養分の抽出及び宿主防御からの保護において補助する。
CDCの推定によれば、米国において毎年ほぼ200万人が院内感染症に罹患し、毎年90,000人が死亡している。これらの致命的な感染症のうち、70%は抗生物質耐性細菌によって生じる。微生物種間の抗生物質耐性の増加は、皮膚及び粘膜生着菌、例えば黄色ブドウ球菌(S. aureus)において特に明白である。例えば、病院内から単離される大多数の黄色ブドウ球菌(S. aureus)はペニシリンに耐性を示し、50%はまた半合成ペニシリン、例えばメチシリン、ナフシリン、及びオキサシリンに耐性を示す。MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(S. aureus))と呼ばれるこれらの単離株は、1970代に初めて観察され、今日病院内において深く根付いてしまっている。近年、感染した個人は病院又は医療従事者への以前の曝露がないコミュニティーにおけるMRSA感染症のケースが存在する。この驚くべき傾向は、MRSAを治療するために使用されるグリコペプチドであるバンコマイシンへの感受性がより低いMRSA単離株の単離によって増強される。バンコマイシン耐性のCDCの定義によれば、本当にバンコマイシンに耐性を示すことが示されている株はほとんどないが、一部のMRSA株は、バンコマイシンに対する感受性が低下した亜集団、又はVISA(バンコマイシン低感受性黄色ブドウ球菌(S. aureus))から構成されると特徴付けられる。バンコマイシン耐性及びバンコマイシン低感受性株の単離は、相対的に新たに発展したものなので、病院及び/又はコミュニティー内におけるこれらの蔓延に関するデータがほとんどない。時折、バンコマイシンに対する完全な耐性を有し且つ恐らくエンテロコッカス菌属(Enterococcus spp.)から得られる耐性プラスミドを運搬するVRSA(バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(S. aureus))もまた、ヒトから回収されている。
複数の抗生物質に耐性を示す多数のグラム陽性病原体の出現によって、疾患から保護するための予防ワクチンの開発を目的とする研究努力が活発化されてきた。ワクチンは、免疫系からの長期記憶応答を誘発するために患者に投与されるようデザインされ、これにより将来病原体に遭遇した場合に、免疫系はより迅速且つ効率的に病原体を除去することができる。今日まで、グラム陽性病原体と関連がある多数の重度のヒト疾患、特にブドウ球菌感染症と関連がある疾患に対する広範の予防ワクチンは、利用できていない。ブドウ球菌感染症からの予防のためのワクチン開発のアプローチは、接着マトリックス分子[MSCRAMMS(Nilsson et al. 1998. J Clin Invest 101 :2640-9; Menzies et al. 2002. J Infect Dis 185:937-43; Fattom et al. 2004. Vaccine 22:880-7)]、表面ポリサッカライド(McKenney et al. 2000; McKenney et al. 1999. Science 284:1523-7; Maira-Litran et al. 2002. Infect Immun 70:4433-40; Maira-Litran et al. 2004. Vaccine 22:872-9; Maira-Litran et al. 2005. Infect Immun 73 : 6752-62)及び変異細胞外タンパク質(exoprotein)(Lowell et al. 1996. Infect Immun 64 :4686-93 ; Stiles et al. 2001. Infect Immun 69:2031-6; Gampfer et al. 2002. Vaccine 20:3675-84)を、サブユニットワクチン組成物、並びに1種の生弱毒性株(Reinoso et al. 2002. Can J Vet Res 66:285-8)及び一部のDNAワクチンアプローチ(Ohwada et al. 1999. J Antimicrob Chemother 44:767-74;Brouillette et al. 2002. Vaccine 20:2348-57; Senna et al. 2003. Vaccine 21:2661-6)における抗原として認識している微生物表面の構成成分の使用を報告するものを含む。多くこれらの組成物はある程度の防御を示すにもかかわらず、様々なスタフィロコッカス・ヒカス株に対する交差防御をほとんど達成しておらず、さらに易感染性患者、院内感染に関してリスクの高い集団において実質的に免疫応答を誘発することができていない。
本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドを含む組成物を供する。本明細書で用いられる、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸のポリマーを意味する。従って、例えば、用語、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。当該用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。用語ポリペプチドは、特異的な長さのアミノ酸のポリマーを含まない。ポリペプチドは、自然のソースから直接的に単離可能、又は組換え、酵素、又は化学技術を用いて調製することが可能である。自然由来のポリペプチドの場合、このようなポリペプチドは典型的には単離により得られる。
2つのポリペプチドの構造上類似性は、2つのポリペプチド(例えば、明細書中に記載される候補ポリペプチド及び任意の適当な参照ポリペプチド)の残基を、これらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数が最大になるように整列させることによって決定することができ;各配列におけるアミノ酸は適切な順序を維持しなければならないが、どちらか一方又は両方の配列におけるギャップは、同一のアミノ酸の数を最大になるようにするための整列化において容認される。参照ポリペプチドは、明細書中で記載されるポリペプチド又は適当なものとして既知の任意の金属制御ポリペプチドとしてよい。候補ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較されているポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えば微生物から単離することができる、又は組換え技術を使用して生成する、或いは化学的又は酵素的に合成することができる。
候補ポリペプチドは、参照微生物によって発現され、且つ分子量によって上記で言及されるポリペプチドの1つと同様の候補ポリペプチドがマスフィンガープリントを有するかを決定するために、質量分光分析によって評価されてよい。典型的には、候補ポリペプチドは、例えばゲル電気泳動によって候補ポリペプチドを分解すること及び候補ポリペプチドを含むゲル部分を切り取ることによって単離されてよい。異なる特徴に基づいてポリペプチドを分離する任意のゲル電気泳動方法を使用することができ、例えば、疎水性、pI、又はサイズに基づく1次元又は2次元ゲル電気泳動、及び液体クロマトグラフィー分離を含む。候補ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼでの分解によって断片化することができる。好適には、リジン又はアルギニンに続くアミノ酸がプロリンである場合を除いて、プロテアーゼは、アミノ酸リジン及びアミノ酸アルギニンのカルボキシ末端側上でペプチド結合を切断することができる。このようなプロテアーゼの例は、トリプシンである。ポリペプチドのトリプシンでの分解のための方法は、通常且つ当技術分野で周知の方法である。このような方法の例は、実施例13において開示される。
本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードする用語ポリヌクレオチドで特定されてよい。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする、又はスタンダードハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこのようなポリヌクレオチド配列の補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む。
2.ポリペプチド断片のm/z値は、m/z値から1を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス300ppm、或いはプラス又はマイナス1Daの範囲を含む。
2.ポリペプチド断片のm/z値は、m/z値から1を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス300ppm、或いはプラス又はマイナス1Daの範囲を含む。
2.ポリペプチド断片のm/z値は、m/z値から1を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス400ppm、或いはプラス又はマイナス1Daの範囲を含む。
2.ポリペプチド断片のm/z値は、m/z値から1を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス430ppm、或いはプラス又はマイナス1Daの範囲を含む。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、通常ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(PflB)として周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号430に示される。変異実施形態は、配列番号431、配列番号432、配列番号433、配列番号434、配列番号435、配列番号436、配列番号437、配列番号438、配列番号439、及び配列番号440に示される。
本発明の組成物は、明細書中で記載される少なくとも1つの単離ポリペプチド、又は1以上の(例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4個の)多数のポリペプチドを含んでよい。例えば、組成物は、配列番号408のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び/又は配列番号397のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含むことができる。配列類似性及び/又は同一性の特定のレベル(例えば、少なくとも80%の配列類似性, 少なくとも90%の配列同一性等)を明細書中に明確に示さない限り、特定の配列番号のアミノ酸配列への言及は、「ポリペプチド配列類似性及びポリペプチド配列同一性」との見出しのセクションにおいて記載される配列類似性のレベル及び/又は配列同一性のレベルを有する変異体を含む。
「X」は、特定の組成物に含まれるポリペプチドを特定する。
本発明はまた、明細書中で記載されるポリペプチドを得るための方法を供する。本発明のポリペプチド及び全細胞は、ミクロコッカス科(Micrococcaceae)、好適にはブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)、より好適には黄色ブドウ球菌属(Staphylococcus aureus)のメンバーから単離可能であってよい。
本発明の態様は、本発明の組成物の使用方法を目的とする。当該方法は、動物へ本発明の組成物の有効量を投与することを含む。動物は、例えば、鳥類(例えば、ニワトリ又は七面鳥等)、ウシ属(例えば、蓄牛等)、ヤギ属(例えば, 蓄山羊等)、ヒツジ属(例えば, 蓄羊等)、ブタ(例えば, 蓄豚等)、バイソン(例えば, 野牛等)、ウマ科(例えば, ウマ等)、伴侶動物(例えば, イヌ又はネコ等)、シカ科ノメンバー(例えば, シカ, エルク, ムース, カリブー及びトナカイ等)、又はヒトであってよい。
IgG3>IgGl>IgG2>IgG4。
鉄制御タンパク質の製剤
実験室規模
鉄制限及び/又は他の程度の金属イオンキレート化の元で発現された新規タンパク質を含む、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の異種株に由来する組成物を、マウスにおける弱毒性攻撃に対する有効性に関して評価した。組成物の有効性を、次のパラメータ(1)マウスにおいて生病原性攻撃に対して相同種及び異種性防御を供する各組成物の有効性、(2)壊死性皮膚病変を低減する各組成物の有効性、及び(3)豊富及び欠乏した鉄条件中で成長させたブドウ球菌に由来する、防御を供する組成物の有効性、に関するデータを収集することによって評価した。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に由来する免疫化組成物の製剤
実施例1に記載されるように鉄欠乏条件において成長させ調製したヒト分離株ATCC19636及びウシ分離株1477由来のタンパク質を、2つのワクチン組成物を製剤するために使用した。ATCC分離株由来のタンパク質は、87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、及び33.0kDaの分子量を有し、一方ウシ分離株は、87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa、及び31.83の分子量を有するタンパク質を発現した。各組成物はまた、金属制御されていない次のタンパク質を含有した:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、及び40kDa。アジュバント濃度22.5%体積/体積の0.1mlの注射可能な量中に総タンパク質50μgの最終用量を示すように、IKA Ultra Turrax T−50 ホモジナイジング容器(IKA, Cincinnati, OH)を使用して、各水性タンパク質懸濁液(総タンパク質500μg/ml)を商業的アジュバント(EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston, Nebraska)中に乳化することによって、ストックワクチンを2つの株から調製した。実施例1に記載されるように、鉄豊富条件(300μM塩化第二鉄を追加したTSB)下で成長させたウシ分離株1477から、対照ワクチン接種として、タンパク質組成物を調製した。上記プロトコール中で水性タンパク質懸濁液の代わりに生理食塩水を使用することによってプラセボワクチンを調製した。
マウスへのワクチン接種
Harlan Breeding Laboratories(Indianapolis, IN)から入手した、体重16〜22グラムの70匹(N=70)のメスCF−1マウスを、等しく7個のグループに分配した(10匹のマウス/グループ)。マウスをポリカーボネートマウスケージ(Ancore Corporation, Bellmore, NY)中で飼育した。各処理グループに関して1つのケージを使用し、餌及び水を全マウスに自由に供給した。全マウスに、次のように14日の間隔をあけて2回、0.1mlの適当な組成物を腹腔内にワクチン接種した:
グループ1:プラセボワクチン接種
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種
グループ3:プラセボワクチン接種
グループ4:鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種
グループ5:鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種
グループ6:鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種
グループ7:ウシ1477FeCl3のワクチン接種、ここで「ウシ1477FeCl3」は300μMの塩化第二鉄を追加したTSB中で成長させたウシ1477から得られたタンパク質を意味する。
攻撃生物の調製
前記黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株ATCC19636及び株1477を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、(前記の)凍結ストック由来の分離株を血液寒天プレート上に画線し、37℃で18時間インキュベートした。1600μMの2,2−ジピリジル含有の50mlのトリプチックソイブロス(Difco)中で、各分離株の単独のコロニーを継代した。200rpmで回転させながら培養物を37℃で6時間インキュベートし、続いて細菌をペレット化するために、10,000×g、4℃で10分間遠心分離した。細菌ペレットを、4℃のTBS中で遠心分離によって2度洗浄した。最終ペレットを、約25mlのTBSの量で562nmで42%透過率(T)の光学濃度までTBS中で再懸濁し、攻撃のために使用した。攻撃の直前に、1mlのこれらの細菌懸濁液を段階希釈し、そして寒天上に蒔きマウス用量当たりのコロニー形成ユニット(CFU)の数を数えた。
攻撃
2回目のワクチン接種の14日後に、全グループ(1〜7)中のマウスに背面頸部の皮下に0.1mlの適当な生物を攻撃した。次の通り、マウスの7つのグループを攻撃した:
グループ1(プラセボワクチン接種):ATCC19636での攻撃
グループ2(鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種):ATCC19636での攻撃
グループ3(プラセボワクチン接種):ウシ1477での攻撃
グループ4(鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種):ウシ1477での攻撃
グループ5(鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種):ATCC19636での攻撃
グループ6(鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種):ウシ1477での攻撃
グループ7(ウシ1477FeCl3のワクチン接種):ウシ1477での攻撃
*グループ2(鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種/ATCC19636での攻撃)
*グループ3(プラセボワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ4(鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ5(鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種/ATCC19636での攻撃)
*グループ6(鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質ワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ7(ウシ1477FeCl3ワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ2(鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種/ATCC19636での攻撃)
*グループ3(プラセボワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ4(鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ5(鉄制限下で発現されたウシ1477タンパク質のワクチン接種/ATCC19636での攻撃)
*グループ6(鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
*グループ7(ウシ1477FeCl3ワクチン接種/ウシ1477での攻撃)
哺乳類において、組織損傷又は細菌感染症への応答が急性炎症反応をもたらすことが示されている。この応答は、炎症;膨潤、熱、疼痛及び発赤として認識される臨床徴候を生じることになる毛細血管透過性及び食作用性浸潤を増加し;放置されたままであると、死に至るかもしれない。体液性因子の活性化及びサイトカインの放出は、まとめると、生理及び生化学イベントのカスケードをもたらす急性期タンパク質応答として周知の全身性イベントを媒介する。この応答の持続時間は、全身性感染症の損傷の重症度及び規模に直接的に関係する。細菌敗血症、主な外科手術、熱傷及び他の身体上の外傷中において、血清中の多数の金属、例えば、鉄、銅、及び亜鉛のイオン濃度変化が生じることが十分に実証されている。例えば、感染症の急性期中、鉄及び亜鉛の血漿レベルの低下及び銅の血漿レベルの増加が生じる。血清中のこららのトレース金属イオンの変化は、任意の細菌感染症の重症度又は進行に直接的に影響を及ぼすかもしれない。
本発明の組成物は、大規模な商業的条件下でも生成され得る。
発酵
実施例1に記載されるような作用用種の低温貯蔵バイアル(2ml, 109CFU/rnl)を使用して、ブドウ糖(Difco)を含まず、0.125g/1の2,2−ジピリジル(Sigma)、2.7グラムのBiTek酵母抽出物(Difco)及びグリセロール(3% 体積/体積)を含有する、37℃まで予熱した500mlのトリプチックソイブロス(TSB)中に播種した。200rpmで攪拌しながら培養物を37℃で12時間インキュベートし、これを使用して2リットルの上記の培地に播種し、37℃でさらに4時間成長させた。この培養物を使用し、13リットルの上記の培地を充填した20リットルのVERTIS卓上発酵槽(Virtis, Gardiner, NY)に播種した。50%NaOH及び10%HCLでの自動滴定によって、pHを6.9〜7.1で一定に保持した。攪拌速度を400回転/分に調整し、培養物を37℃で11リットルエアー/分で通気した。11mlの消泡剤(Mazu DF 204 Chem/Serv, Minneapolis, MN)の添加によって、自動的に起泡を制御した。これらの条件下で4時間培養物を連続して成長させ、無菌状態で150リットルの発酵槽(W. B. Moore, Easton, PA)中に注ぎ込んだ。発酵槽を、ブドウ糖非含有の120リットルのトリプチックソイブロス(3,600.0 グラム)、BiTek酵母抽出物(600 グラム)、グリセロール(3,600ml)、2,2−ジピリジル(3.0グラム)及びMazu DF204消泡剤(60ml)で充填した。発酵のパラメータは、次の通りであった:60リットルのエアー/分及び平方インチ当り10ポンド(psi)の背圧で分散させ撹拌を220回転/分まで増加することによって、溶存酸素(DO)を30%+/−10%に維持した。50%NaOH及び10%HCLでの自動滴定によって6.9〜7.1にpHを一定に維持し、温度を37℃に維持した。発酵の4.5時間後に(OD540 8-9)、ブドウ糖非含有の1200リットルのトリプチックソイブロス(36,000グラム)、BiTek酵母抽出物(6,000グラム)、グリセロール(36,000ml)、2,2−ジピリジル(30.0グラム)及びMazu DF 204消泡剤(600ml)を充填した1,500リットルのNew Brunswick Scientific発酵槽IF−15000に培養物を移送した。発酵のパラメータは、次の通りであった:300〜1100リットルのエアー/分及び平方インチ当り5ポンド(psi)の背圧で分散させ撹拌を300回転/分まで増加することによって酸素補給し、60%+/−10%に溶存酸素(DO)を維持した。発酵の進行に伴い、溶存酸素の制御において補助するために0〜90リットル/分の酸素補給を行った。50%NaOH及び10%HCLで自動滴定することによってpHを6.9〜7.4に一定に保持し、温度を37℃に維持した。
Waukesha Model U−60供給ポンプ(Waukesha Cherry-Burrell, Delevan, WI)に接続された、カタログ番号AS300C5(Pall Filtron)の、3つの30ft2アルファ300−K オープンチャネルフィルターを備えた、Pall Filtron 接線流 Maxiset−25(Pall Filtron Corporation, Northboro, MA)を使用して細菌発酵物を濃縮し洗浄した。1250リットルの元々の培養物体積を、30psiのフィルター入口圧及び5〜6psiの残余圧力(retentate pressure)を使用して(2.5リットル/分)50リットルまで減少した。いずれの混入している外来性のタンパク質も、例えば分泌毒素及びプロテアーゼを含むことになる細胞外タンパク質も除去するために、トリス緩衝生理食塩水pH8.5を使用して細菌残余物(retentate)を調整して150リットルまで戻し、続いて50リットルに再濃縮した。トリス緩衝生理食塩水の上昇したpHは、全細胞懸濁液の保存中に生じ得る多くのタンパク質分解を防止するのに役立つ。プロテアーゼ阻害剤は、上昇されたpHに代えて、又は加えて使用してよい。200リットルタンク中の底部に装着した磁気駆動のミキサーを使用して、残余物を十分に混合した。残余物を無菌の4リットルのNalgene容器No.2122中に無菌で分注し(3.5リットル)、保存のために製造中の限界点(breaking point)として−20℃の冷凍室の中に入れる、又はさらに処理してよい。発酵させた培養物及び最終回収物の30mlの試料を遠心分離することによって、ペレット質量を算出した。簡潔に言うと、予め重さを測定した50mlのNalgene conicalチューブを、JA−21ローター(Beckman Instruments, Palo Alto CA)を使用してBeckman J2−21遠心分離機中で39,000×gで90分間遠心分離した。運転終了後、上清を捨て、再度チューブの重さを測定した。ペレット質量を各ステージに関して計測した。発酵工程によって、ウェットペレットの質量約60キログラムが得られた。
トリス緩衝生理食塩水pH8.5中の80キログラムの細菌細胞スラリーを、900リットルのTBSpH8.5を含有する、上方にミキサー(Eastern, Model TME-1/2, EMI Incorporated, Clinton, CT)を装着した定置蒸気滅菌の1000リットルのjacketed プロセスタンク(Lee, Model 259LU)中に無菌で移送した。200rpm、18時間の連続的な混合によりバルクの細菌懸濁液を4℃まで冷却した後、ホモジナイズにより破砕した。簡潔に言うと、細菌懸濁液を含有する1000リットルタンクはモデルC−500−B AVESTIN ホモジナイザー(Avestin Inc, Ottawa Canda)に接続していた。第二の1000リットルのjacketed プロセスタンク(空)をホモジナイザーに接続し、プロセスタンク中の液体はホモジナイザーを通して空のタンク中に再度移すことができ、クローズドシステムを維持しながらホモジナイズの通過を複数回可能にした。ホモジナイズ中の温度を4℃に維持した。最初の通過の開始時に、ホモジナイザー圧を30,000psiまで調整して、ホモジナイザーを通してWaukeshaモデル10DOポンプ(Waukesha)を介して液体を70psiで循環させた(500ガロン/時)。最初の通過前に、2つのホモジナイズ前の試料をホモジナイザーから回収し、破砕程度を決定しpHをモニターするためにベースラインを設定した。透過率(1:100希釈での540nmにおける%T)で破砕程度をモニターし、ホモジナイズしていない試料と比較した。ホモジナイザーの通過数を最終透過パーセントが1:100希釈で78〜91%T、好適には86〜91%を示すように標準化した。ホモジナイズ後、タンクをホモジナイザーから取り除き、4℃のチラーループ(chiller loop)上に置き、240rpmで混合した。
図1に説明される鉄制御タンパク質を含有する破砕した細菌懸濁液を、T−1Sharples(Alfa Laval Seperations, Warminster, PA)を使用して遠心分離によって回収した。簡潔に言うと、破砕した細菌ホモジネートを含有する1000リットルのjacketedプロセスタンクを、遠心力60,000×g、17psiで供給速度250ml/分によって、12台のSharpies中に注いだ。流出液を第二の1000リットルのjacketedプロセスタンク中にクローズド無菌ループを介して回収し、クローズドシステムを維持しながら遠心機を介して複数回通過できるようにした。遠心分離中の温度を4℃に維持した。ホモジネートを遠心機を介して8回通過させた。タンパク質の約50%を2回目の通過後に回収し、その後ホモジネート液体を元の体積の1/3まで濃縮し、その後の6回の通過に関しては工程時間を短縮した。ホモジネートタンクを遠心機から無菌で切断し、濃縮用のWaukeshaモデルU30供給ポンプに接続された25ft2 screen−channel series アルファ30K Centrasetteフィルター(Pall Filtron)を備えたMillipore Pellicon 接線流フィルター アセンブリー(Millipore Corporation, Bedford, MA)に接続した。濃縮後、工程が完了するまで遠心分離を継続した。各通過後にタンパク質を回収した。タンパク質を回収し、再懸濁し、防腐剤として0.15%のformulin(Sigma)を含有する50リットルのトリス緩衝生理食塩水pH8.5中に分注した。
タンパク質懸濁液を、いずれの外来性タンパク質(プロテアーゼ, 毒素, 細胞質及び代謝酵素等)も除去するためにダイアフィルトレーションによって4℃で洗浄した。簡潔に言うと、50リットルのタンパク質を、Daytonミキサー、Model 2Z846(Dayton Electric, Chicago, IL)を装着した底部を備えた、150リットルの無菌トリス緩衝生理食塩水、pH8.5を含有する200リットルのプロセスタンク中に、125回転/分で回転しながら無菌で移送した。プロセスタンクを、Waukesha Model U30供給ポンプに接続された25ft2 screen−channel series アルファ30K Centrasetteフィルター(Pall Filtron)を備えたMillipore Pellicon 接線流 フィルターアセンブリー(Millipore Corporation)に無菌で接続した。200リットルのタンパク質溶液を濾過によって目的の体積リットルまで濃縮し、その後150リットルの無菌生理食塩水を添加した。続いて、タンパク質懸濁液を約50リットルまで濃縮した。タンパク質濃縮物を上部に装着したミキサーを備えた50リットルのjacketedプロセスタンク中で保存し4℃で保存した。
マウスの過剰免疫化及びポリクローナル抗体製剤
鉄制限条件下で成長させた黄色ブドウ球菌(S. aureus)株ATCC19636に由来するタンパク質を接種したマウスワクチンから単離された精製抗体による受動免疫は、相同種及び異種の黄色ブドウ球菌(S. aureus)での攻撃に対して防御的であった。15匹の成体CD1マウスに実施例3に記載の通り、実施例1及び2に記載されるように鉄欠乏条件下で成長させた黄色ブドウ球菌(S. aureus)株ATCC19636に由来するタンパク質組成物をワクチン接種した。7日の間隔をあけて3回、各ワクチン接種において50μgのタンパク質組成物を、マウスに腹腔内にワクチン接種した。3回目の免疫化の7日後、マウスから心穿刺によって完全に採血した。血清をプールし、標準的な硫酸アンモニウム沈殿法を使用して抗体を精製した。0.5倍量の飽和硫酸アンモニウムpH7.2を添加することによって、外来性の血清タンパク質を抗体沈殿より前に最初に除去した。
受動免疫及び攻撃
鉄制限中に発現された黄色ブドウ球菌(S. aureus)タンパク質に対して産生された注入抗体の防御効果を評価するために、200μlの注入において精製抗体製剤(グループ1)又は生理生理食塩水(グループ2)のいずれかを15匹のマウスの2つのグループそれぞれに腹腔内に注入した。さらなる15匹のマウスの2つのグループそれぞれに精製抗体製剤(グループ3)又は生理食塩水(グループ4)いずれかを皮下に注入した。60分後、腹腔内に注入した15匹のマウスの2グループに、1.3×108cfuの黄色ブドウ球菌(S. aureus)株19636で腹腔内攻撃した。同様に、皮下注入した15匹のマウスの2グループに、異種黄色ブドウ球菌(S. aureus)株による攻撃に対する交差防御を試験するために、1.3×108cfuの黄色ブドウ球菌(S. aureus)株1477で皮下攻撃した。死亡率及び/又は病変サイズを5日間記録し、全マウスの肝臓を屠殺後取り除き、ホモジナイズし、全身性感染症の尺度として存在する黄色ブドウ球菌(S. aureus)の数を測定するためにプレートに蒔いた。カプラン・マイヤー生存曲線(図5及び6)は、鉄制限中に発現された黄色ブドウ球菌(S. aureus)タンパク質をワクチン接種したマウス由来の抗体の注入によって提供される防御効果を示す。ATCC19636攻撃グループに関して注入グループと対照グループとの間に有意な差は存在しないが(p=0.076, ログランク検定)、1日目に死亡した抗体注入したグループ内の1匹のマウスの肝臓を血液寒天上で培養し、攻撃生物(黄色ブドウ球菌(S. aureus))の非存在及び/又は存在を決定した。当該マウスに由来する培養物は、ブドウ球菌に関して陰性であり、血液寒プレート又は培養物培地上で成長を示さなかった。対照的に、プラセボグループ内で死亡したマウスの肝臓は、ブドウ球菌の存在に関して全て陽性であり、実際にこれらのマウスの肝臓に由来する各血液寒天プレート上で純粋培養物を得た。肝臓のデータは抗体注入したグループ内の死亡したマウスが黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染症で死亡した可能性を排除できないが、感染症はプラセボグループ内のように全身性でなかく、マウスは他の原因で死亡していたであろう。この抗体注入したマウスの死亡を除外すると、抗体注入及びプラセボ治療間で有意な差異が得られた(p = 0.015, ログランク検定)。ATCC19636由来のタンパク質でのワクチン接種及び黄色ブドウ球菌(S. aureus)株1477による攻撃後に生成された抗体をマウスに注入した交差攻撃に関するデータは、防御的傾向もまた示した。攻撃後7〜14日に、注入及び非注入グループにおける全マウスは、壊死性皮膚病変を進行し始めた。しかしながら、マウスの肉眼検査は、グループ間において観察可能な病変の形成及び病変の重症度に明白な遅れを明らかに示した。注入したマウスは、より早い病変の進行を示し重症度の高い非注入対照マウスと比較して病変をゆっくりと進行した。注入マウスは、非注入マウスより早く治癒した。これは、攻撃後21〜35日に明確である。攻撃後35日におけるマウスの肉眼検査は、非注入マウスは外観が著しく酷く、より大きい瘢痕を呈することを示した。実際、非注入マウスにおいて広範囲な瘢痕組織及び/又は進行した湾曲した外観によって説明される外観の悪化(disfigurement)を、ほとんど進行させなかった注入マウスと対照的に、これらの多くの非注入マウスは正常な姿勢を保てず、外見上湾曲して見えた。全体的に、これらのデータは、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の鉄誘発タンパク質に対して産生される抗体の腹腔内の注入が、黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染症から防御し重症度を制限することができることを示す。
慢性的に感染した乳牛グループにおける黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に由来するワクチン組成物の評価
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に起因する慢性的に多い体細胞数の病歴を有する商業的な乳牛グループを、実施例1に記載されるようにワクチン組成物の評価のために選択した。本実験的試験のワクチン有効性を判定するための基準は、1)ワクチン接種していない対照と比較した、ワクチン接種グループにおける黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)によって生じる臨床乳腺炎の低下した発症率、2)対照と比較したワクチン接種グループの体細胞数における改善(すなわち, 減少)、及び3)ワクチン接種グループの非ワクチン接種対照に対する、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の培養物の陽性単離株の比率の低下、であった。ワクチン接種日(0日目)に血液を採取し、最初の免疫化から3週及び6週間後に再度血液を採取する。試験中、ワクチン接種後の注射部位反応又は全身性反応をモニターした。加えて、バルクのタンクの牛乳試料を培養し、ワクチン接種に培養した黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のCFUの数が減少しているかを決定するために定量的に数えた。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(TTX101)のワクチン製剤
分離株TTX101を使用して、実施例1に記載されるように組成物を調製した。組成物は、鉄欠乏条件下で発現された、87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa、及び31.83kDaの分子量を有するタンパク質、並びに150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、及び40kDaの分子量を有する非金属制御タンパク質を含んだ。アジュバント濃度が22.5%体積/体積である2.0mlの注射可能な体積中の最終用量が800μgの総タンパク質を示すように、IKA Ultra Turrax T−50 ホモジナイズ容器(IKA, Cincinnati, OH)を使用して商業的アジュバント(EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston NE)中に、抽出されたタンパク質懸濁液を乳化することによって実験用ワクチンを調製するために(1ミリリットル当り400μgの総タンパク質)、株TTX101に由来する免疫化組成物を使用した。ワクチンを21日の間隔をあけて2回皮下に投与した。
実験デザイン及び集団ワクチン接種
最初のワクチン接種の18日前に、試験に登録した泌乳している乳牛全て(N=80)を黄色ブドウ球菌(S. aureus)に関して、各泌乳の乳牛に由来する個々の牛乳試料を培養することによる、標準化された好気性細菌学的培養方法によって試験した。さらに、標準方法を使用して牛群改良協会(Dairy Herd Improvement Association)によって体細胞数(SCC)を数えた。80頭の乳牛中14頭が臨床的に乳腺炎と診断され、黄色ブドウ球菌(S. aureus)に関して培養物陽性であった。残りの乳牛(N=66)は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)に関して陰性と判定された。80頭の乳牛を、ワクチン接種したグループ1(N=40)及び非ワクチン接種グループ2(N=40)とデザインした2つのグループに平等に分けた。ブドウ球菌陽性と臨床的に診断された14頭の乳牛を両方のグループに等しく分配し、各試験グループは臨床的乳腺炎に罹患する7頭の乳牛を含んだ。最初のワクチン接種前のグループ間の平均SCCは、ワクチン接種されていない対照において203,219であったのに対し、ワクチン接種グループでは240,443であった(統計的差異無し, p = 0.7)。
異種黄色ブドウ球菌(S. aureus)株間のタンパク質の分子量は同様であることが証明されており、マウス攻撃試験において異種の防御が観察されたので、図1の分子量と共通するタンパク質が同様のタンパク質であるかを決定しようと試みた。タンパク質を特徴付けるために選択した技術は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI-MS)であった。実施例1に記載されるSDS−PAGEを使用して組成物の一部を分離し、タンパク質を可視化するためにゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
切除及び洗浄。ゲルを10分間水で2度洗浄した。試料中に存在するゲルの量を低減するために、可能な限りタンパク質バンド付近でカットすることによって、目的の各タンパク質バンドを切除した。
このサーチ結果は、組成物中に存在する各タンパク質のマスフィンガープリントであり、表2、3、4、及び5に示す。
低鉄条件下で成長させた黄色ブドウ球菌(S. aureus)のマイクロアレイに基づく遺伝子発現分析を使用した鉄制御タンパク質ファミリーの同定
マイクロアレイ分析に関して、個々のストック溶液から作製した化学的限定培地(CDM)(表10)中で細菌を培養した。
防御タンパク質の候補の免疫活性のスクリーニング
MALDI−TOF分析(実施例13)及び/又はマイクロアレイ及びゲノム分析(実施例14)から特定されるタンパク質の抗体反応を評価するために、2パートスクリーンを使用して個々に発現されたブドウ球菌タンパク質を評価した。急速な第一スクリーンでは、細胞を含まない大腸菌溶解物を使用して発現された少量の候補タンパク質に結合した抗体を調査するために転写活性PCR断片を使用した。第一スクリーン由来のポジティブ候補を確認するために、第二スクリーンは、商業的ベクター(pQE30Xa, Qiagen, Valencia CA)を使用した大腸菌中のタンパク質の、標準的なPCRに基づくクローニング、発現及び精製を使用した。第二スクリーンはまた、ワクチン接種及び実験法のための十分なタンパク質の産生及び精製のための各免疫反応性タンパク質の候補に対応する発現ベクターを含有する大腸菌宿主細胞のマスター種のストックを生成した。
組換えで生成されたポリペプチド由来の免疫化組成物製剤
ワクチンを製剤するための組換え黄色ブドウ球菌(S. aureus)ポリペプチドを分離するために、実施例14に記載される大腸菌クローンを37℃(225rpm)で対数期の中間部(OD600= 0.4-0.6)まで1Lのトリプチックソイブロス中で成長させ、続いて1mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)で4時間誘導した。培養物をSorvallの遠心分離機(4000×g)中で4℃で10分間ペレット化し、精製手順の実行前に−80℃で凍結した。続いて、過剰発現された黄色ブドウ球菌(S. aureus)のポリペプチドの溶解性に応じて、2つの異なる方法によって細菌ペレットを処理した。
10μgの各ポリペプチドを混合し、体積をPBSで100μlに調整し、免疫化組成物を形成した。
マウスのワクチン接種
IV攻撃(試験A)
Harlan Breeding Laboratories(Indianapolis, IN)から入手した体重16〜22グラムの50匹(N=50)のメスのBALB/Cマウスを3つのグループ(10〜20マウス/グループ)に分配した。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育した(ケージ当り、N=5マウス)。全マウスに餌及び水を自由に供給した。全ワクチンを50%IFAでアジュバントとして製剤した。次の通り14日の間隔をあけて0.1mlの適当な組成物を2回マウスの皮下にワクチン接種した:
グループ1:オボアルブミン(70μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ(プラセボ, 20匹のマウス)。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(70μg/100μl)をワクチン接種したもの(SIRP抽出物, 20匹のマウス)。
グループ3:組換えポリペプチドMntC(10μg/100μl)をワクチン接種したもの(rMntC, 10匹のマウス)。
Harlan Breeding Laboratories(Indianapolis, IN)から入手した体重16〜22グラムの40匹(N=40)のメスのBALB/Cマウスを、4グループに等しく分配した(10匹マウス/グループ)。ポリカーボネートマウスケージ中でマウスを飼育した(ケージ当り、N=5マウス)。餌及び水を全マウスに自由に供給した。全ワクチンをアジュバントとして50%IFAで製剤した。次の通り、2つのワクチン接種(グループ1〜3)又は3つのワクチン接種(グループ4)を使用して、マウスの皮下に0.1mlの適当な組成物を14日の間隔をあけてワクチン接種した:
グループ1:オボアルブミン(70μg/100μl)(プラセボ)を2回ワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(70μg/100μl)(SIRP抽出物)を2回ワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドPflB、Opp1A、SirA、SYN2、FhuD、SYN1、及びMntC(各10μg/100μl, 総タンパク質70μg/100μl)を2回ワクチン接種したもの(rSIRP7(2x))。
グループ4:組換えポリペプチドPflB、Opp1A、SirA、SYN2、FhuD、SYN1、及びMntC(各10μg/100μl, 総タンパク質70μg/100μl)を3回ワクチン接種したもの(rSIRP7(3x))。
Harlan Breeding Laboratories(Indianapolis, IN)から入手した体重16〜22グラムの30匹(N=30)のメスのBALB/Cマウスを、3グループ(10マウス/グループ)に等しく分配した。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育した(ケージ当り、N=5マウス)。餌及び水を全マウスに自由に供給した。次の通り、0.1mlの適当な組成物を14日の間隔をあけて2回マウスの皮下にワクチン接種した:
グループ1:オボアルブミン(70μg/100μl)(プラセボ)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(70μg/100μl)をワクチン接種したもの(SBRP抽出物)。
グループ3:組換えポリペプチドPflB、Opp1A、SirA、SYN2、FhuD、SYN1、及びMntC(各10μg/100μl, 総タンパク質70μg/100μl)をワクチン接種したもの(rSIRP7)。
攻撃生物の製剤
IV攻撃(試験A)
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株ATCC25904を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、標準的なTSB(鉄非制限)中で成長させた凍結グリセロールストック由来のlμlのループを使用してTSBの20mlの培養物を播種し、37℃で18時間インキュベートした。2.5mlのこの培養物を500mlのフレッシュなTSB中に継代培養した。0.4(吸光度)の光学濃度(OD600)が達成されるまで(対数期の中間部)、培養物を250rpmで回転しながら37℃で約2時間インキュベートし、続いて細胞を10,000×g、4℃で10分間遠心分離し、細菌をペレット化した。細菌ペレットを遠心分離によってPBS中で4℃で洗浄した。最終ペレットを20mlのPBS中で再懸濁した。最終攻撃用量を一定分量のこの濃縮細菌培養物のPBSへの添加によって調製し、4.0がOD600である溶液を生じ(A)、これは約6.67×108CFU/mlに相当する。攻撃の直前に、1mlのこれらの細菌懸濁液を段階希釈し、寒天上に蒔き、マウス用量当りのコロニー形成ユニット(CFU)の数を数えた。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株ATCC25904を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、標準的なTSB(鉄非制限)で成長させた凍結グリセロールストック由来の細菌の1μlのループを使用し、TSBの20mlの培養物を播種し37℃で18時間インキュベートした。2.5mlのこの培養物を500mlのフレッシュなTSB中に継代培養した。0.4(吸光度)の光学濃度(OD600)が達成されるまで(対数期の中間部)、培養物を250rpmで回転しながら37℃で約2時間インキュベートし、続いて細胞を10,000×g、4℃で10分間遠心分離し、細菌をペレット化した。細菌ペレットを遠心分離によってPBS中で4℃で洗浄した。最終ペレットを20mlのPBS中で再懸濁した。最終攻撃用量を一定分量のこの濃縮細菌培養物のPBSへの添加によって調製し、6.0がOD600である溶液を生じ(A)、これは約3.33×109CFU/mlに相当する。攻撃の直前に、1mlのこれらの細菌懸濁液を段階希釈し、寒天上に蒔き、マウス用量当りのコロニー形成ユニット(CFU)の数を数えた。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株ATCC25904を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、標準的なTSB(鉄非制限)中で成長させた凍結グリセロールストック由来の細菌の1μlのループを使用し、TSBの20mlの培養物を播種し37℃で18時間インキュベートした。2.5mlのこの培養物を500mlのフレッシュなTSB中に継代培養した。0.4(吸光度)の光学濃度(OD600)が達成されるまで(対数期の中間部)、250rpmで回転しながら培養物を37℃で約2時間インキュベートし、続いて細胞を10,000×g、4℃で10分間遠心分離し、細菌をペレット化した。細菌ペレットを遠心分離によってPBS中で4℃で洗浄した。最終ペレットを20mlのPBS中で再懸濁した。最終攻撃用量を一定分量のこの濃縮細菌培養物をPBSへ添加することによって調製し、4.0がOD600である溶液を生じ(A)、これは約6.67×108CFU/mlに相当する。攻撃の直前に、1mlのこれらの細菌懸濁液を階希釈し、寒天上に蒔き、マウス用量当りのコロニー形成ユニット(CFU)の数を数えた。
攻撃
IV攻撃(試験A)
二回目のワクチン接種の14日後に、全グループ(1〜3)中のマウスの外側尾(lateral tail)静脈中に0.3mlの適当な生物で静脈内攻撃した。マウス当り2×108CFUの黄色ブドウ球菌(S. aureus)株ATCC25904で3つのグループのマウスに同様に攻撃した。攻撃後10日間死亡率を毎日記録した。ATCC25904分離株で攻撃したマウスを比較する場合、80%のプラセボワクチン接種したグループ1のマウスは攻撃の10日以内に死亡した(表14)。これは、株ATCC25904が投与した用量レベルでマウスにおいて高い死亡率を生じたことを証明した。グループ1のマウスとは対照的に、(鉄欠乏条件での成長後に、株ATCC25904から抽出されたタンパク質, SIRP抽出物をワクチン接種した)グループ2のわずか25%のマウスが攻撃後の10日以内に死亡した。これらの結果は、鉄欠乏ATCC25904に由来するタンパク質組成物のワクチン接種によって、株ATCC25904で攻撃したマウスを有意に防御することを説明した(p=0.0006, 死亡率に関するログランク検定)。加えて、(組換えMntCポリペプチド, rMntCをワクチン接種した)グループ3のわずか50%のマウスが、攻撃の10日以内に死亡し、これは、組換えタンパク質によってATCC25904株での攻撃に対する防御が提供されたことを示している(p =0.100, 死亡率に関するログランク検定)。
二回目のワクチン接種の14日後、全グループ(1〜4)中のマウスに、0.5mlの適当な生物で腹腔内攻撃した。マウスの3つのグループに、マウス当り1×109CFUの黄色ブドウ球菌(S. aureus)株ATCC25904で同様に攻撃した。攻撃後10日間、死亡率を毎日記録した。
2回目のワクチン接種の14日後、全グループ(1〜3)のマウスの外側尾静脈に、0.3mlの適当な生物で静脈内攻撃した。マウスの3グループに、2×108CFUの黄色ブドウ球菌(S. aureus)株ATCC25904で同様に攻撃した。死亡率を攻撃後10日間毎日記録した。
表14.黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC分離株25904での攻撃後の、ワクチン接種したマウス及びワクチン接種していないマウスの死亡率。
組換えで調製したポリペプチドを使用した受動免疫
実施例16に記載されるように調製した組換えポリペプチドの組成物をマウスにワクチン接種したことを除いて、実施例8に記載されるように、ポリクローナル抗体組成物を調製した。
組換え生成されたポリペプチドの大規模発酵及び単離
実施例14の組換え大腸菌のマスター種のストックを、2000mlの無菌RM培地(1リットル当り20gのカザミノ酸, 60g Na2HPO4, 30g KH2PO4, 5g NaCl 10g NH4Cl 及び100ug/ml アンピシリン)中で37℃で8時間生物を成長させることによって調製することができる。10,000×g、30分間の遠心分離によって、細菌を回収することができる。培養物を遠心分離(10,000xg)によって2回洗浄することができ、20%無菌グリセロールを含有する500mlの無菌RM培地中で最終細菌ペレットを再懸濁する。1ミリリットルの培養物を2mlのcryovialに移送し、−85℃で保存する。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたSirA、SYN2、FhuD、及びMntCポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(40μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質をワクチン接種したもの(40μg/100μl)。
グループ3:組換えポリペプチドSirA、SYN2、FhuD、及びMntC(各10μg/100μl, 総タンパク質40μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたPflBポリペプチドを調製し、単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドPflB(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたOpp1Aポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドOpp1A(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたSirAポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)ワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドSirA(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたSYN2ポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドSYN2(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたFhuDポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドFhuD(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたSYN1ポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドSYN1(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたMntCポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドMntC(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたSstDポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ。
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドSstD(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
マウスのワクチン接種
実施例16に記載されるように、組換えで生成されたFhuD2ポリペプチドを調製し単離する。
グループ1:オボアルブミン(10μg/100μl)をワクチン接種したプラセボ
グループ2:鉄制限下で発現されたATCC25904タンパク質(10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
グループ3:組換えポリペプチドFhuD2(各10μg/100μl)をワクチン接種したもの。
組換えポリペプチドは、黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染で生じる血清によって特異的に結合される。
組換えで生成されたポリペプチド及び黄色ブドウ球菌(S. aureus)細胞から直接的に抽出された鉄制御膜ポリペプチドに対する抗体は交差反応する。
組換え黄色ブドウ球菌(S. aureus)タンパク質のウエスタンブロット分析
実施例16に記載されるように、組換え黄色ブドウ球菌(S. aureus)タンパク質を調製し、続いてドデシル硫酸ナトリウムの10%のポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜(BioRad, Hercules, CA)に移送した。個々のブロットを、(ブドウ球菌感染症が報告されていない)健康なヒトドナー又は回復期(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(S. aureus))のヒトドナー由来の血清と反応させた。
金属制御ポリペプチドの黄色ブドウ球菌(S. aureus)DU5875表面発現
黄色ブドウ球菌(S. aureus)株DU5875(cap-, spa-)を、鉄豊富条件(TSB+0.3mM 塩化第二鉄)又は鉄欠乏条件(TSB+lmM ジピリジル)で約0.6のOD600まで成長させた。
ルミネックスアッセイを使用し、組換えSIRP構成成分PflB(配列番号353)、Opp1A(配列番号364)、SirA(配列番号375)、SYN2(配列番号386)、FhuD(配列番号397)、SYN1(配列番号408)、及びMntC(配列番号419)の組合せ(rSIRP7)又はプラセボで免疫化したマウス由来の脾細胞によってサイトカイン発現を評価し、続いてSIRPE抽出物(SIRPE)又はrSIRP7で再刺激した。数個のサイトカインを再刺激上で上方制御し、そしてSIRPE及びrSIRP7再刺激によって誘発されたサイトカインプロファイルは同様であった。rSIRP7又はSIRPE再刺激への応答における全体的なサイトカインプロファイルは、Thl/Thl7型免疫応答から期待されるものと似ており、組換えSIRP構成成分のワクチン接種は、サイトカイン発現に基づいて測定することができる細胞の免疫応答を誘発することを証明する。
実施例1に記載される方法を使用して、複数の株(Newman, Reynolds)由来の黄色ブドウ球菌(S. aureus)抽出物を調製した。黄色ブドウ球菌(S. aureus)細胞を1000μmの2,2−ジリジルを含有する鉄制限培地(Sigma-Aldrich St. Louis, MO)又は300μMのFeC13を含有する鉄豊富培地(Sigma-Aldrich St. Louis, MO)中で成長させた。
好中球による活性酸素種の産生、炎症応答の兆候を測定するために、酸化バーストアッセイを使用することができる。鮮血から好中球を得るために、フレッシュなヒト血液由来の赤血球を1:10希釈の溶解緩衝液(150mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 1mM ニナトリウム EDTA, pH7.4)の添加によって溶解し、室温で10分間インキュベートし、10分間430×gで遠心分離する。チューブインバージョンによって上清を取り除き、ペレット化し、PBSで2回洗浄し、続いて5mlのRPMI−ヘペス5%FCS+グルタミン(完全RPMI)中で再懸濁し、そしてISOTON中の1/500希釈の細胞懸濁(10ml ISOTON中に20μlの細胞, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA)後にMULTISIZER(Beckman Coulter, Inc., Brea, CA)を使用して数える。
オプソニン作用アッセイ
オプソニン作用アッセイ(OPA)を展開し、血清の補体依存性オプソニン活性を測定することによって、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に関する血清の機能食作用活性を推定した。OPAの概要を表17に記載する。黄色ブドウ球菌(S. aureus)の2つの株をアッセイにおいて使用する。莢膜又はタンパク質Aを産生しない株DU5875を、アッセイを最も良く制御するために使用する。莢膜及びタンパク質Aを発現する株LST4 Lowensteinを、野生型株としてアッセイ中で使用する。アッセイ中で使用する細菌の数は、エフェクター白血球のソース次第であり、濃度が1×105cfu/ml〜5×107cfu/mlの範囲である。健康なヒトボランティア又はヒト前骨髄球性白血病株細胞、HL60由来の白血球を食作用エフェクター細胞として使用する。表17が示すように、アッセイ中で使用したエフェクター細胞の数は、細胞のソースに依存的である。幼齢ウサギの血清を補体のソースとして使用し、ウサギ血清の機能補体活性を最大にし、一方毒性を最小にするために、血清のロットに応じて1%〜10%に希釈する。免疫前又は後のオプソニン活性に関して試験を行う血清を、56℃で30分間非働化し、希釈1:20〜1 :2,000,000でアッセイ中で試験する。食作用を黄色ブドウ球菌(S. aureus)の生菌数(cfu)によって測定する。免疫前の血清と比較して、活性化補体との組合せでのcfuの有意な減少を証明する試験血清は、オプソニンだと考えられる。アッセイデータを、不等分散の片側分布を使用したスチューデントt検定によって分析する(Kim 2010; Stranger- Jones 2006; Dryla 2005)。
(生体内(in vivo)での)免疫機構実験
他の実施例において、ワクチンタンパク質がマウスへ防御を与える免疫機構を評価する。これらの実験は、次の2つのタイプを含むことができる:(1)ワクチン攻撃実験において、特異的な免疫成分が防御に必要であるかを決定するために、遺伝子ノックアウトマウスを使用すること;及び(2)移送した成分が防御を与えるために十分であるかを試験するために、免疫化したドナーマウス由来の免疫細胞を細菌攻撃前に未処理のレシピエント中に移送する養子移植実験。
鉄取り込みアッセイの抑制
SIRP成分に対して産生された抗体が鉄取り込みによって細胞成長を抑制するかを評価するために、抗SIRP抗血清でプレインキュベートした細菌細胞を使用して、鉄取り込み/移送アッセイのブロックを行うことができる。任意の株由来の黄色ブドウ球菌(S. aureus)細胞をキレート化した又は鉄リッチな培地中でオーバーナイトで成長させる。細胞を同一培地中で継代培養し、対数期の中間部〜後半部まで成長させ、ペレット化しPBS中で抗SIRP抗血清又は対照抗血清で最大1時間インキュベートする。0.45μMのフィルターを使用した濾過によって細胞を回収し、続いて環境鉄を排除するためにChelex−100処理最少培地中で再懸濁した。簡潔に言うと、細胞を振盪する。一方で、ニトリロ三酢酸で放射標識した55FeCl2(又は他の放射標識した鉄分子)と鉄ソース(例えば, フェリクローム)を混合し、数分間インキュベートする。
高収率タンパク質精製プロトコール
一部の実施例において、組換えrSIRPを高収率方法を使用して精製した。ポリペプチドのより高い収率及び純度のために、この方法を最適化する。組換え生成されたポリペプチドを含有する細菌ペレットの再懸濁によって、20mM トリスpH9;リゾチーム(100μg/ml 最終)及びMgCl2(1mM 最終)で補完した300mM NaCl中で当該方法を実施する。続いて、穏やかなロッキングをしながら試料を4℃で15分間インキュベートする。15分後、1U/mlのbenzonaseを添加し、試料を1時間室温でインキュベートする。遠心分離(20,000xg, 20分, 4℃)後に得られた可溶性溶解物を0.45μmフィルターで濾過し、ニッケル−His結合樹脂がパックされた平衡化5mlの重力カラム(Novagen 69670-4, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)に添加する。製造者の説明書に従って、N−His6−タンパク質の精製を実施する。N−His6−タンパク質の精製を、HiLoad 26/60Superdex 75 prep grade size−exclusion カラム(GE Healthcare Bioscienes, Piscataway, NJ)を使用して終了させる。カラムを、BioCAD FPLC(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)を使用して20mM トリス pH9;300mM NaClで平衡化し、15mlのタンパク質試料を流速1.5ml/分でHiLoadカラム上にロードする。移動相として20mMトリスpH9;300mM NaClを使用した流速1.8ml/分でのランタイム3.5時間後に、試料を溶出する。
Claims (57)
- 配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも92%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において1又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該1又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号399のアミノ酸1〜26と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の欠失又は少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
- 配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも98%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において1又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該1又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号415のアミノ酸1〜5と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の欠失又は少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
- ATCC19636又はATCC25904から選択された黄色ブドウ球菌(S. aureus)での攻撃から動物を保護する、請求項1又は2に記載の組成物。
- 医薬として許容される担体をさらに含んでなる、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも92%の配列同一性有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項6に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項2に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項2に記載の組成物。
- 少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる請求項1又は2に記載の組成物であって、ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である組成物。
- 前記第二のポリペプチドが:配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号357、配列番号358、配列番号359、配列番号360、配列番号361、配列番号362、配列番号363、配列番号364、配列番号365、配列番号366、配列番号367、配列番号368、配列番号369、配列番号370、配列番号371、配列番号372、配列番号373、配列番号374、配列番号375、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号391、配列番号392、配列番号393、配列番号394、配列番号395、配列番号396、配列番号419、配列番号420、配列番号421、配列番号422、配列番号423、配列番号424、配列番号425、配列番号426、配列番号427、配列番号428、又は配列番号429のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項10に記載の組成物。
- 少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる請求項1に記載の組成物であって、ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが:配列番号408、配列番号409、配列番号410、配列番号411、配列番号412、配列番号413、配列番号414、配列番号415、配列番号416、配列番号417、又は配列番号418のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
- 前記第二のポリペプチドが:配列番号408、配列番号409、配列番号410、配列番号411、配列番号412、配列番号413、配列番号414、配列番号415、配列番号416、配列番号417、又は配列番号418のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項12に記載の組成物。
- 少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる請求項2に記載の組成物であって、ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが:配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、又は配列番号407のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
- 前記第二のポリペプチドが:配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、又は配列番号407のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項14に記載の組成物。
- 鉄キレート剤非含有の培地において成長させた場合に、黄色ブドウ球菌(S. aureus)から単離可能であり、且つ150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDaの分子量を有する単離ポリペプチド;又はこのような単離ポリペプチドの組合せをさらに含んでなる、請求項1又は2に記載の組成物。
- 対象における感染症を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 対象における症状を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 対象における感染症を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 対象における感染症を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 対象における症状を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 対象における感染症を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象へ組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 前記組成物が、少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である、請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第二のポリペプチドが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、又は33kDaの分子量を有する、請求項23に記載の方法。
- 前記組成物が:配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号357、配列番号358、配列番号359、配列番号360、配列番号361、配列番号362、配列番号363、配列番号364、配列番号365、配列番号366、配列番号367、配列番号368、配列番号369、配列番号370、配列番号371、配列番号372、配列番号373、配列番号374、配列番号375、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号391、配列番号392、配列番号393、配列番号394、配列番号395、配列番号396、配列番号419、配列番号420、配列番号421、配列番号422、配列番号423、配列番号424、配列番号425、配列番号426、配列番号427、配列番号428、又は配列番号429のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる、請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが:配列番号408、配列番号409、配列番号410、配列番号411、配列番号412、配列番号413、配列番号414、配列番号415、配列番号416、配列番号417、又は配列番号418のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第二のポリペプチドが:配列番号408、配列番号409、配列番号410、配列番号411、配列番号412、配列番号413、配列番号414、配列番号415、配列番号416、配列番号417、又は配列番号418のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項26に記載の方法。
- 前記組成物が、少なくとも1つの第二のポリペプチドをさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが:配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、又は配列番号407のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第二のポリペプチドが:配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、又は配列番号407のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項29に記載の方法。
- 前記組成物が:鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に黄色ブドウ球菌(S. aureus)から単離可能であり、且つドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDaの分子量を有する単離ポリペプチド;又はこのような単離ポリペプチドの組合せをさらに含んでなる、請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が哺乳類である、請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項31に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)が黄色ブドウ球菌(S. aureus)である、請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 対象における感染症を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。 - 対象における症状を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号397から選択されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。 - 対象におけるコロニー形成を減少するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によってコロニー形成された対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 対象において感染症を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。 - 対象における症状を治療するための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。 - 対象におけるコロニー形成を減少するのための方法であって:
ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)によってコロニー形成された対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が:配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。 - 前記組成物が、少なくとも1つの第二のポリペプチドに特異的に結合する抗体をさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第二のポリペプチドが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、又は33kDaの分子量を有する、請求項40に記載の方法。
- 前記第二のポリペプチドが:配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号357、配列番号358、配列番号359、配列番号360、配列番号361、配列番号362、配列番号363、配列番号364、配列番号365、配列番号366、配列番号367、配列番号368、配列番号369、配列番号370、配列番号371、配列番号372、配列番号373、配列番号374、配列番号375、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号391、配列番号392、配列番号393、配列番号394、配列番号395、配列番号396、配列番号419、配列番号420、配列番号421、配列番号422、配列番号423、配列番号424、配列番号425、配列番号426、配列番号427、配列番号428、又は配列番号429のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項40に記載の方法。
- 前記組成物が少なくとも1つの第二のポリペプチドに特異的に結合する抗体をさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、そして該第二のポリペプチドが、配列番号408、配列番号409、配列番号410、配列番号411、配列番号412、配列番号413、配列番号414、配列番号415、配列番号416、配列番号417、又は配列番号418のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項34〜36のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第二のポリペプチドが:配列番号408、配列番号409、配列番号410、配列番号411、配列番号412、配列番号413、配列番号414、配列番号415、配列番号416、配列番号417、又は配列番号418のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項43に記載の方法。
- 前記組成物が、少なくとも1つの第二のポリペプチドに特異的に結合する抗体をさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり:該第二のポリペプチドが配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、又は配列番号407のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第二のポリペプチドが:配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、又は配列番号407のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項45に記載の方法。
- 前記組成物が:鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に黄色ブドウ球菌(S. aureus)から単離可能であり、且つドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、150kDa、292kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDaの分子量を有するポリペプチド;又はこのような単離ポリペプチドの組合せに特異的に結合する抗体をさらに含んでなる、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が哺乳類である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項48に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)が黄色ブドウ球菌(S. aureus)である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するためのキットであって、別々の容器中に:
配列番号408又は配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列類似性を有する単離ポリペプチド;及び、
ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出する試薬、
を含んでなるキット。 - 前記88kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される88kDaのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも80%類似であるマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり;
55kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される55kDaのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも80%類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり;
38kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される38kDaのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも80%類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり;
37kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される37kDaのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも80%類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり;
36kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される36kDaのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも80%類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり;
35kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される35kDaのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも80%類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり;
33kDaの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC株19636によって発現される33kDaのポリペプチドマスフィンガープリントと少なくとも80%類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である、請求項24又は41に記載の方法。 - 配列番号397のアミノ酸配列と少なくとも92%の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において1又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該1又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号399のアミノ酸1〜26と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の欠失又は少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
- 配列番号408のアミノ酸配列と少なくとも98%の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において1又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該1又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号415のアミノ酸1〜5と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の欠失又は少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
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