JP2015130861A - 工業用の新しいマロン酸脱炭酸酵素 - Google Patents

Abstract

【課題】α置換されたマロン酸（プロパン二酸）誘導体を酵素により脱炭酸する方法の提供。
【解決手段】Bordetella属の微生物から単離したアリールマロン酸脱炭酸酵素（AMDase）と構造的及び／又は機能的に関係する新規の酵素、その突然変異体、対応するコード配列及び発現系、該新規酵素を調製する方法、並び該脱炭酸酵素活性も有するさらなる好適な酵素を得るためのスクリーニング方法。該新規酵素はマロン酸（プロパン二酸）誘導体に対する有用な脱炭酸酵素活性を示す。
【選択図】なし

Description

本発明はα置換されたマロン酸（プロパン二酸）誘導体を酵素により脱炭酸する方法であって、ボルデテラ属（genus Bordetella）微生物、特にBordetella bronchiseptica（気管支敗血症菌）から単離したアリールマロン酸脱炭酸酵素（AMDase）と構造的および／または機能的に関係のある酵素が触媒する前記方法に関する。本発明はまた、請求の範囲に記載した方法を実施するために有用な脱炭酸酵素活性をもつ新規酵素、その突然変異体、対応するコード配列および発現系、前記新規酵素を調製する方法、およびまた前記脱炭酸酵素活性も有するさらなる好適な酵素を得るためのスクリーニング方法に関する。

マロニル基質の脱炭酸はいくつもの主要生物学的経路で起こる共通の酵素による変換である。例えば、数多くの好気性および嫌気性細菌は、マロネートまたはマロニル-CoAをアセテートへ変換するマロン酸脱炭酸酵素系を持っているので、マロネートを唯一の炭素源として成長することができる¹。これらの原型的なマロン酸脱炭酸酵素のほとんどは、異常な補欠分子族をもつアシル担体タンパク質（ACP）に関わる多酵素系ならびにビオチン依存性脱炭酸酵素である²。マロニルユニットの脱炭酸はまた、β-ケトアシルACPシンターゼ（KAS）酵素および脂肪酸内ドメインおよびポリケチドシンターゼが触媒するクライゼン縮合反応中に起こる。

アリールマロン酸脱炭酸酵素（AMDase）はグラム陰性細菌、Alcaligenes bronchisepticus（Bordetella bronchiseptica）から単離され^3,4、α-アリール-α-メチルマロン酸のエナンチオ選択的脱炭酸を触媒して光学的に純粋なα-アリールプロピオン酸を与える。この酵素の生物学的役割は確立されてないものの、フェニルマロン酸(1)；2-メチル-2-フェニルマロン酸(2)；2-メチル-2-ナフチルマロン酸(3)および2-チエニルマロン酸(4)（図1(a)を参照）を含む一連の基質を脱炭酸する強固な触媒であることがわかっている⁵。AMDaseはマロン酸脱炭酸酵素の中でも異常であり⁶、活性のためにビオチンまたは他の補因子を必要としない。さらに、脱炭酸は、いくつかのマロン酸脱炭酸酵素に対する共通の推進力^1,2であるマロニルチオエステル-酵素中間体⁷の形成に関与しない。この酵素の機構は従って非常に興味深い。AMDaseのキラルカルボン酸生成物はまた、工業用、特に医薬品合成の前駆体として潜在的に魅力がある。

B. bronchiseptica（配列番号2）由来のAMDaseはいくつものラセマーゼおよびイソメラーゼと配列類似性を示す^7,8。さらに、推定触媒性システインは配列アラインメントが示すように全酵素において保存されている。しかし、これらの酵素についてAMDase活性は報じられず、B. bronchiseptica（配列番号2）由来のAMDaseがα-アリールマロネートのα-アリールプロピオネートへの脱炭酸を触媒することができる唯一の酵素として残った。

グルタミン酸およびアスパラギン酸ラセマーゼの場合、2つのシステイン残基は活性部位のアミノ酸基質のどちら側にも位置する。実際、一般的な酸-塩基触媒において、2つのシステイン残基が機能して基質からα-プロトンを引き抜いて平面エノラートを生成し、これが反対の面から再プロトン化してラセミ体に導くことが考察された^9,10。AMDaseの場合、単一活性部位Cys残基（Cys188）が酵素触媒において重要な役割を果たすことが示されている。これから、AMDaseのこの機構はラセマーゼと類似しているという提案が行われた。例えば、基質2-メチル-2-フェニルマロン酸の脱炭酸はエノラートアニオンを生じることが示唆されていて、これがsi-面上でCys188によりプロトン化されてR-立体配置のα-フェニルプロピオン酸生成物を形成する⁸。ラセマーゼファミリーとの機構的類似性を支持するために、配列アラインメントの手引きによって第2のシステインを導入すると⁸、AMDase一点突然変異体（G74C）を生じ、これはたとえ非常に低い触媒効率ではあっても、ホモキラルなα-アリールプロピオネートをラセミ化することができた⁷。さらに、主要活性部位Cysをエノラート中間体の反対面上に再配置すると予測される二重突然変異G74C/C188Sは、反対のエナンチオ選択性をもつ酵素に導いた。この場合にも再び、この突然変異体の触媒効率は野生型AMDaseより数オーダーの量、低いものであった¹¹。

WO 2005/078111は、B. bronchiseptica KU1201から単離したAMDase酵素の突然変異体（2つの突然変異アミノ酸残基を運ぶ）の具体的な例を提供している。次の改変された酵素活性をもつ突然変異体：A84G、F85A、A87G、R94A、T103A、I127A、（F85A、R173A）、（F85A、E176A）および（F85A、A178G）を示唆している。次の改善された熱安定性をもつ突然変異体：P15A、P32A、G74A、T75A、D128A、D163A、A165GおよびC171Aを示唆している。一般的に、位置17、19、22、24、25、32、41、42、46、47、53、60、61、63、68、74、83、84、85、87、94、103、105、112、116、119、121、139、142、155、168、171、173、178、199、201、202、203、204、205、210、221、222、224、225、226、227、228、229、230、235、238、239および240の少なくとも1つにおける突然変異を記述している。しかし前記文書は、親AMDaseの前記突然変異体の結晶構造またはかかる酵素の触媒部位の構造組織を開示していないし、また、AMDase活性が異なる起源のタンパク質に関係しうることを教示または示唆していない。前記文書は、開示した酵素突然変異体を経由して進入しうるさらなる「生成物構造」を推測している。しかし、限られた数の突然変異体の酵素活性を単にフェニルマロン酸およびα-ヒドロキシ-(4-メチルフェニル)マロン酸について報じただけである。ヒドロカルビル置換された、特にアルケニル置換されたマロン酸誘導体を提案していないしまたは試験すらされていない。

AMDase活性をもつさらなる酵素はこれまで当技術分野で記載されてない。

それ故に、代わりの、場合によっては改善されたAMDase活性をもつ酵素であって、好ましくは光学的に純粋な、例えばα-アリールプロピオン酸のようなマロン酸誘導体の脱炭酸生成物を製造する工業プロセスに潜在的に応用可能であり、かつ脱炭酸酵素活性に対してビオチンまたは他の補因子を要求しない前記酵素が必要とされている。

また、拡張されたまたは改変／修飾された基質特異性をもつ新規のマロン酸脱炭酸酵素、すなわち、α-アリールマロン酸とは異なるマロン酸誘導体を脱炭酸する酵素であって、対応するマロン酸基質から好ましくは光学的に純粋なα置換されたモノカルボン酸を製造する工業プロセスに潜在的に応用可能である前記酵素を同定することが必要とされている。

また、かかるAMDase活性をもつ酵素または拡張されたまたは改変／修飾された基質特異性をもつ酵素から誘導された機能的突然変異体であって、マロン酸基質から好ましくは光学的に純粋なモノカルボン酸を製造する工業プロセスに潜在的に応用可能である前記機能的突然変異体が必要とされている。前記機能的突然変異体をアリールマロン酸とは異なるマロン酸基質、例えば、非芳香族のα置換マロン酸誘導体、例えばアルケニル置換マロン酸の好ましい独占的な脱炭酸に適合させることができる。

それ故に、本発明の目的は、かかる代わりのまたは場合によっては改善された、上記のマロン酸脱炭酸酵素活性（MDase活性）を持つ酵素を提供することである。

WO 2005/078111

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上記の問題は、驚いたことに、これまでAMDase活性またはMDase活性が記載されてない酵素をさらに同定することにより解決することができた。

特に、本発明者らはB. bronchiseptica（配列番号2）由来のAMDaseの結晶構造を同定し、そしてこの興味深い脱炭酸酵素の詳しい分子機構を実証できる¹⁸O標識化研究を実施した。この研究に基づいて、本発明者らは工業上好適なAMDase酵素をさらに同定することができた。例えば、Mesorhizobium sp. BNC1由来の酵素（配列番号4）を同定し、この酵素がB. bronchiseptica由来のAMDaseと類似した構造、立体化学、機構および触媒効率を有することを示した。本発明者らはまた、かかる酵素について、さらにα置換されたマロン酸誘導体の生体触媒転化を可能にする、拡張されたまたは修飾された基質特異性および／または酵素活性（親酵素と比較して）を観察した。前記研究に基づいて、本発明者らはまた、機能的遺伝子操作で作製した前記酵素の突然変異体を提供することができた。

(a)AMDaseが触媒する脱炭酸反応；(b)本発明で提示したB. bronchiseptica由来のAMDaseが触媒する脱炭酸反応の機構である。 (a)AMDaseが触媒する脱炭酸反応；(b)本発明で提示したB. bronchiseptica由来のAMDaseが触媒する脱炭酸反応の機構である。 ESI-MS分析後に確認した、C-末端His₆-タグをもつ精製酵素の配列である。 (a)B. bronchiseptica由来のAMDase（上の行）と色々な微生物：すなわち、Mesorhizobium sp. BNCI、Bordetella bronchiseptica RB50、Pyrcoccus horikoshii OT3およびAlkaliphilus metalliredigenes QYMF由来の構造的および機能的に関係のある酵素の例の配列アラインメントである。(b)B. bronchiseptica由来のAMDase（上の行）と色々な微生物由来の構造的および機能的に関係のある酵素の例の、機能的に関係する配列領域のアラインメントである。 (a)B. bronchiseptica由来のAMDase（上の行）と色々な微生物：すなわち、Mesorhizobium sp. BNCI、Bordetella bronchiseptica RB50、Pyrcoccus horikoshii OT3およびAlkaliphilus metalliredigenes QYMF由来の構造的および機能的に関係のある酵素の例の配列アラインメントである。(b)B. bronchiseptica由来のAMDase（上の行）と色々な微生物由来の構造的および機能的に関係のある酵素の例の、機能的に関係する配列領域のアラインメントである。 (a)リン酸およびCys188を強調したAMDase結晶構造のイラストによる表現である。(b)AMDase活性部位であって、結合したリン酸ならびにリン酸のO₁、O₂およびO₃に対する水素結合パターンが観察される。 (a)リン酸およびCys188を強調したAMDase結晶構造のイラストによる表現である。(b)AMDase活性部位であって、結合したリン酸ならびにリン酸のO₁、O₂およびO₃に対する水素結合パターンが観察される。 AMDaseの活性部位であって、結合して小結合ポケットを構築する残基Leu40、Val43、Tyr48、Val156、Pro14、Met159（明色）は、オキシアニオンホール残基Ser76、Thre75、Gly189（暗色）と結合しかつ触媒部位Cys188の近位にある中間体エノラートのメチル基を囲む。 (a)溶媒アクセシブル表面をもつB. bronchiseptica AMDase活性部位の断面であり、結合ポケット中に位置した2-メチル-2-フェニルマロン酸のモデルを示す。オキシ-アニオンホールを構築する残基は暗色であり、疎水性ポケットを構築する残基は明色である。(b)Mesorhizobium sp. BNCI AMDaseの活性部位である。 (a)溶媒アクセシブル表面をもつB. bronchiseptica AMDase活性部位の断面であり、結合ポケット中に位置した2-メチル-2-フェニルマロン酸のモデルを示す。オキシ-アニオンホールを構築する残基は暗色であり、疎水性ポケットを構築する残基は明色である。(b)Mesorhizobium sp. BNCI AMDaseの活性部位である。 AMDaseの活性部位における2-メチル-2-フェニルマロン酸（左）とエノラート（右）の配向である。 ¹⁸O標識した水を用いるAMDase立体化学の決定である。 2-メチル-2-フェニルマロン酸を基質として用いるAMDase活性のin vivoアッセイであり、左の写真はAMDaseの遺伝子なしのpET30bベクターを含有する大腸菌のコロニーを、右の写真は前記遺伝子を伴うpET30bベクターを含有する大腸菌のコロニーを示す。 2-メチル-2-フェニルマロン酸を基質として用いるAMDase活性のin vivoアッセイであり、上側のプレートはpET30bを含有するBL21（DE3）、下側のプレートはAMDase遺伝子を伴うpET30bを含有するBL21（DE3）を示す。

発明の詳細な説明
1 好ましい実施形態
本発明の第1の態様は、式I：
HOOC-C(R¹)(R²)-COOH （I）
［式中、残基R¹は単環もしくは二環の、任意に1重、2重または3重に置換された環であって、例えば、任意に置換された、特に単環の芳香族もしくはヘテロ芳香族の環；または非芳香族の、特に任意に1つもしくは2つの炭素-炭素二重結合をその環内に保持する単環もしくは二環の環である前記環を表し；そして
残基R²はH、OH、SH、NH₂、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル-低級アルキル、特にOH、SHまたは低級アルキルを表す］のα置換されたマロン酸化合物またはその塩形を脱炭酸する生体触媒による方法であって；
a)少なくとも式Iの化合物を、任意の立体異性体混合物の形でもしくは光学的に純粋な形で、
(i)マロン酸脱炭酸酵素活性、特にアリールマロン酸脱炭酸酵素活性を有し、かつ配列番号2（残基1〜240）（Blastデータベース登録番号BAA02419.1）のBordetella bronchiseptica菌タンパク質と100％以下または、特に、99％未満、例えば98、97、96または95％未満で、しかし少なくとも25％、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90％配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、または
(ii)マロン酸脱炭酸酵素活性、特にアリールマロン酸脱炭酸酵素活性を有し、かつ
配列番号12（残基1〜254）（Blastデータベース登録番号AAF25672）のAquifex pyrophilus菌タンパク質と100％以下または、特に、99％未満、例えば98、97、96または95％未満で、しかし少なくとも25％、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90％配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質と接触させるステップ、および
b)任意に式Iの化合物の少なくとも1つの脱炭酸生成物、好ましくは反応生成物の1つの特定の立体異性体を単離するステップを含むものである前記方法に関する。

他の代わりの実施形態において、本発明は式I［式中、残基R¹は、任意に1以上の環状置換基を保持する直鎖または分枝鎖のモノまたはポリ不飽和低級アルケニル基を表し；例えば1以上の、好ましくは1つの、単環もしくは二環の、任意に置換された芳香族または非芳香族環により置換されるか；または低級アルケニル基の2つの、例えば末端の置換基が一緒に炭素または複素環の、飽和または不飽和の、芳香族または特に例えば本明細書に定義したシクロアルキリデン残基のような非芳香族環を形成し；そして
残基R²はH、OH、SH、NH₂、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル低級アルキル、特に、OH、SHまたは低級アルキルを表す］の化合物、またはその塩を脱炭酸するための上記タイプの方法を提供する。

前記代わりの実施形態によれば、応用する酵素活性は、本明細書に定義したMDase活性である。

式Iの化合物、またはその塩の特定のグループにおいて、残基R¹は、単環もしくは二環の任意に置換された環により、任意に置換された直鎖または分枝鎖のモノ不飽和低級アルケニル基を表し、そして残基R²は低級アルキル基である。

特に、R¹が単環もしくは二環の、任意に置換された環により任意に置換された直鎖のC₁〜C₆-アルケン-1-イル基を表しかつ残基R²がC₁〜C₆-アルキル基である化合物を記載しなければならない。

例えば、残基R¹は、エテニル、プロペン-1-イルまたはブテン-1-イルのような直鎖のC₁〜C₆-アルケン-1-イル基を表し、かつ残基R²はC₁〜C₆-アルキル基である。任意に前記残基R¹はさらに、単環もしくは二環の、特に、単環の、芳香族または非芳香族環により置換されていてもよい。好ましくは芳香族であってもよく、および以下に定義した基であってもよい前記環基は、さらに、以下に定義した1、2または3つの任意の置換基により置換されていてもよい。任意に前記残基R¹はまた、末端が置換されていてもよい。

他の実施形態においては、R¹が任意に順に置換されたシクロアルキリデン環により末端が置換された、直鎖のC₁〜C₆-アルケン-1-イル基を表し、かつ残基R²はC₁〜C₆-アルキル基である化合物を記述しなければならない。

限定されない式Iの化合物の例としては、2-フェニル-マロン酸、2-エテニル-マロン酸、2-プロペン-1イル-マロン酸、2-ブテン-1イル-マロン酸、2-（シクロヘキシリデンメチル）マロン酸、2-シクロヘキセン-1-イル-マロン酸；および対応するメチルマロン酸化合物が挙げられる。

好ましくは、前記方法は、立体選択的モノ脱炭酸である脱炭酸反応を含むものである。

好ましくは、式II：
HC(R¹)(R²)-COOH （II）
［式中、残基R¹およびR²は先に定義した通りである］の光学的に純粋な置換された生成物またはその塩形が得られる。

本発明の方法の限定されない例は、次のスキーム：

［式中、R³はH、CH₃であり、R⁴はH、CH₃CH₂であり、MeはCH₃であり；ここで、α-二置換されたマロン酸IIIは生体触媒によりモノ脱炭酸されて、高いエナンチオ選択性で、対応するモノカルボン酸IVを形成する］により表すことができる。

好適な方法のさらなる限定されない例は、α位置のMe（すなわちメチル）置換基がSH、または、特に、OHにより置換えられた式IIIの化合物を脱炭酸して式IVの化合物を形成する方法である。

当業者は、本発明が本明細書に記載した好ましい脱炭酸反応に限定されないことを理解しうる。酵素反応は原則として可逆反応であるので、本発明はまた、対応する逆反応、すなわち式IIの化合物を基質としかつ式Iのマロン酸を生成物とするカルボキシル化反応も包含する。

好ましい実施形態においては、AMDaseまたはMDase活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と100％以下のまたは、特に、99％未満のアミノ酸配列同一性を示すタンパク質は、式Iの基質分子を保持する能力を有する基質ポケットを形成し、この基質ポケットは機能的配置で次の構造エレメント：
a)システインを含有する触媒部位（CS）（システイン残基は基質と相互作用して、特にプロトンを基質に伝達することによりエノラート中間体を形成することができる）、
b)オキシアニオンホール（OAH：oxy-anion hole）（切り離されないように基質のカルボン酸基と相互作用する複数の極性アミノ酸側鎖を含む）、
を含む。

加えて、前記基質ポケットはさらに、
c)環状、好ましくは芳香族またはヘテロ芳香族の、残基R¹と相互作用する大結合ポケット（LBP）および
d)残基R²と相互作用する小結合ポケット（SBP）
を含むものである。

添付図によりさらに図解したように、B. bronchiseptica（配列番号2）のAMDase酵素の結晶構造分析は、酵素の反応中心の形成に関わる個々のアミノ酸残基またはアミノ酸配列部分の同定を可能にし、その結果、AMDaseまたはMDase活性をもつ好適なさらなる酵素に対するモデル系または参照酵素およびそれから誘導される機能的突然変異体を確立することができた。

特に、前記特異的参照酵素については、ある特定の「主要アミノ酸残基」を同定することができ、このアミノ酸残基は基質ポケットの機能的に明確な部分の形成に関わると予想される。前記機能的に明確な部分は、触媒部位（CS）、オキシアニオンホール（OAH）小結合ポケット（SBP）および大結合ポケット（LBP）と呼ばれる。

第1の機能的部分はCSであり、主要アミノ酸残基はCys188である。さらに、一級アミノ酸配列でお互いに隣接していない配列部分が、それにも関わらず、結合ポケットの同じ機能的部分に寄与することにより、機能的に関係していることが見出された。従って、機能的部分OAHは少なくとも2つの明確な配列部分（OAH1およびOAH2と呼ばれ、以下に記載した主要アミノ酸残基
OAH1：Thr75、Gly189
OAH2：Ser76、Tyr126
を含む）により形成されることが観察された。

また、前記参照酵素は結合ポケット領域SBPおよびLBPを形成し、これらと関連するアミノ酸残基は、酵素に結合した式Iの基質についてのその優先的配向に従ってさらにサブ分割されうることも観察された。

LBPはLBP1およびLBP2にサブ分割されて、次の主要残基：
LBP1：Pro14、Pro15、Gly189、Gly190、Met104
LBP2：Val13、Met73、Pro21、Ser212
により特徴付けることができる。

LBP1残基は基質の環状基（R¹）の周りに位置する一方、LBP2残基は大結合ポケットの構築の残りの部分である。

SBPはSBP1およびSBP2にサブ分割されて、次の主要残基：
SBP1：Lys40、Val43、Tyr48、Leu77、Val156、Pro14、Gly74
SBP2：Val156、Met159、Val43
により特徴付けることができる。

SBP1残基は基質の切り離されるカルボキシル基の周りの小結合ポケットの大きい部分を形成する一方、SBP2残基は基質の嵩の低いバルキーな残基（R²）周りの前記結合ポケットの小さい部分を構築する。

この分析に基づいて、高度に特徴のある配列パターンを開発することができ、この手法により、所望の酵素活性をもつさらなるタンパク質の候補を探すことができ、そして実際に本発明者らは見出すことができた。新しく認識したAMDaseまたはMDase酵素、およびそのアミノ酸配列の対応する部分でありかつ前記特徴のある配列パターンも示す部分の例を図3(b)のアラインメントに示す。主要アミノ酸残基（すなわち前記主要アミノ酸のサブグループ）の特徴的配列パターンを前記アラインメントから誘導することができる。前記サブグループは特に：
Pro14、Thr75、Ser76、Tyr126、Cys188
またはこれらの残基の3つまたは4つの組合わせ、例えば：
Thr75、Ser76、Tyr126、Cys188
Pro14、Thr75、Ser76、Cys188
を含む。

前記配列パターンを適用することによるさらなる候補酵素および／または突然変異体の検索も本発明に包含されうる。当業者は、上記の配列パターンが前記パターンの2つの隣接アミノ酸残基の間の正確な距離によって限定されないことを理解するであろう。上記のパターン中の2つの隣接するアミノ酸残基の間の距離は、所望の酵素の活性に影響を与えることなく、例えば、お互いに独立して、±10、±5、±3、±2または±1のアミノ酸位置まで変わってもよい。

近くの空間近位という視点では、個々の主要アミノ酸残基を前記上述の配列部分（例えば、位置14、43、74、75、189のアミノ酸を参照されたい）の1以上に割り当てることができる。

本発明によって得た結晶学的データに基づく個々のアミノ酸残基の前記機能性および空間分析に沿って、本発明のアリールマロン酸またはマロン酸の脱炭酸酵素活性をもつ潜在的に有用な酵素の特徴であるユニークな部分的アミノ酸配列を同定することができる。

さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の酵素の好ましい部分アミノ酸配列は、次の通り記述することができる：
a)システインを含有する触媒部位配列「CSS」、すなわち、次の配列パターン：
「CSS」 (S/L)C(G/T)(G/N) （配列番号13）
を示す配列番号1の残基186〜191に対応する配列により形成される配列
および
b)オキシアニオンホールを形成する配列「OAH1S」および「OAH2S」、すなわち、次の2つの配列パターン：
「OAH1S」 (M/G)(G/C)TS(L/G) (配列番号14）
「OAH2S」 T(A/P)Y(I/R)(D/Q) （配列番号15）
（ここでOAH2Sにおける最初のおよび／または最後のアミノ酸残基は無くてもよい）を示す配列番号1の残基73〜77および124〜128にそれぞれ対応する配列。

好適な部分配列CSS、OAH1SおよびOAH2Sの具体的な例は図3(b)から誘導することができる。

さらなる実施形態によれば、前記構造エレメントCSS、OAH1SおよびOAH2Sをアミノ酸鎖において次の順（N→C）：
OAH1S-OAH2S-CSS
で配置し、ここで、前記構造エレメントを、お互いに独立して1以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を介して連結する。

特に、前記構造エレメントCSS、OAH1SおよびOAH2Sをアミノ酸鎖において次の順（N→C）：
OAHS1-sp1-OAHS2-sp2-CS
で配置してもよく、ここでsp1とsp2は次の近似的配列長さ：
sp1 43〜47アミノ酸
sp2 55〜57アミノ酸
で連結するアミノ酸配列である。

さらなる好ましい部分アミノ酸配列は、
c） 大結合ポケット配列「LBPS」、すなわち、配列番号1の残基12〜17に対応する配列領域により形成され、次の配列パターン：
「LBPS」 IVP(P/S/A)(A/T/S/P)(A/N/G) （配列番号16）
を示す配列と記述することができる。

好適な部分配列LBPSの具体的な例は図3(b)から誘導することができる。

特に、前記構造エレメントCSS、OAH1S、OAH2SおよびLBPSをアミノ酸鎖において次の順（N→C）：
LBPS-sp3-OAHS1-sp1-OAHS2-sp2-CS
で配置することができ、ここでsp1、sp2およびsp3はアミノ酸配列は次の近似的配列長さ：
sp1 43〜47アミノ酸
sp2 55〜57アミノ酸
sp3 57〜62アミノ酸
で連結するアミノ酸配列である。

当業者は、本明細書に開示した具体的な脱炭酸酵素の突然変異体を遺伝子操作し、ある特定の基質（親酵素と比較して）に対するそれらの基質スペクトル（基質特異性）を改変するかまたはそれらの酵素活性を改善できることを理解するであろう。前記突然変異（アミノ酸置換、付加、欠失、挿入、逆位）はまた、本明細書で以上に定義した構造エレメント内で実施することができる。特定の突然変異体は、1以上の前記構造エレメントにおいて1〜10、特に1、2、3、4または5の同時突然変異を含みうる。好適な突然変異の限定されない例を以下に記載する。

当業者はまた、さらなる単一のまたは複数の突然変異を、前記構造エレメントに関係しない、かつ、従って、酵素の基質ポケットもしくは触媒部位に影響を与えない、かつ、従って、酵素活性もしくは基質特異性に与える影響の少ない、本明細書に開示した脱炭酸酵素のアミノ酸配列の領域において実施できることを理解するであろう。本発明の技術的教示（例えば、本明細書に提示した配列アラインメントのような）の手引きにより、当業者はさらに広汎な改変を行うことができるかかる領域を容易に同定しうる。例えば、当業者は、酵素活性および／または基質特異性に否定的な影響を与える予測できないリスクを冒すことなく、1〜30、2〜20または5〜10の同時突然変異をかかる領域で実施することができる。

当業者はまた、さらなる単一のまたは複数の突然変異を、基質ポケットまたは活性部位を構築しないが、前記領域の形状に影響を与え、従って、酵素活性および／または基質特異性に影響を与えうる、本明細書に開示した脱炭酸酵素のアミノ酸配列の領域において実施しうることを理解するであろう。本発明の技術的教示（例えば、本明細書に提示した配列アラインメントのような）の手引きにより、当業者はかかる領域を容易に同定しうる。例えば、当業者は、かかる領域において、1〜30、2〜20または5〜10の同時の突然変異をかかる領域で実施することが可能になりうる。配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質のかかるアミノ酸残基の限定されない例としてはLeu191があり、この残基を改変する（いずれかの他のアミノ酸残基により置換える）かまたは除去して、酵素の活性部位および／または結合ポケットの形状に影響を与えることができる。

本発明の方法のさらなる実施形態によれば、AMDaseまたはMDase活性を有するタンパク質は、
a)配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCI（Blastデータベース登録番号EAN08019.1）に由来するタンパク質；
b)配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3（Blastデータベース登録番号BAA30082.1）に由来するタンパク質；
c)配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50（Blast データベース登録番号NP_888076.1）に由来するタンパク質；
d)配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAlkaliphilus metalliredigenes QYMF（Blastデータベース登録番号ZP_00801202.1）に由来するタンパク質；ならびに
e)アリールマロン酸またはマロン酸脱炭酸酵素活性を有しかつa)、b)、c)またはd)の配列の1つと100％未満の配列同一性を有するタンパク質
からなる群より選択される。

AquifexおよびPyrococus由来のアリールマロン酸脱炭酸酵素活性を有する新規タンパク質を同定することは非常に有望である、何故なら、これらの生物は好熱性であり、従ってその酵素も熱安定性があると期待されるからである。従って、本発明はまた、アリールマロン酸またはマロン酸脱炭酸酵素活性を有する新規の熱安定性のあるタンパク質ならびに対応する安定なタンパク質突然変異体および誘導体も提供する。

さらなる好ましい実施形態によれば、単離したまたは精製した、任意に、本明細書に記載の固定した脱炭酸酵素を用いて、または前記脱炭酸酵素活性を発現する微生物を式Iの化合物の存在のもとで培養することにより、脱炭酸反応を実施する。

本発明はまた、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質であって、配列番号2のアミノ酸残基1〜240を含むBordetella bronchisepticaタンパク質と、99％未満、例えば98、97、96または95％未満、しかし少なくとも25％の配列同一性、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90％の配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70％の配列同一性を示す前記タンパク質に関する。

本発明はまた、
a）配列番号4のアミノ酸残基1〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質；
b）配列番号6 のアミノ酸残基1〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3に由来するタンパク質；
c）配列番号8のアミノ酸残基1〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50に由来するタンパク質；
d）配列番号10のアミノ酸残基1〜246を含みかつAklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質；および
e）配列番号12のアミノ酸残基1〜256を含みかつAquifex pyrophilusに由来するタンパク質；
から選択される本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質、ならびに本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するその突然変異体であって、対応する親タンパク質と、99％未満、例えば98、97、96または95％未満、しかし少なくとも25％の配列同一性、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90％の配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70％の配列同一性を有する前記突然変異体に関する。

例えば、先に定義したMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質およびBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質からなる群より選択される所望の脱炭酸酵素活性を有するタンパク質を用いて、先に同定したタイプの化合物（ここで、残基R¹は先に定義した単環もしくは二環の、任意に置換された環により任意に置換された直鎖または分枝鎖のモノまたはポリ不飽和低級アルケニル基を表し、残基R²はH、OH、SH、NH₂、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル低級アルキル、特に低級アルキルを表す）を脱炭酸することができる。

特に、配列番号2、4、6、8および10のタンパク質の前記突然変異体はなお、先に定義した主要アミノ酸残基および／または構造エレメントCSS、OAH1S、OAH2SおよびLBPSの一部または全てを含んでいる。

さらなる応用可能な突然変異の限定されない例は、例えばWO2005/078111、配列番号2のタンパク質に対する図2に開示されており、この文書の開示は本明細書に参照により組み入れられる。前記配列を、構造的に関係のある新しくスクリーニングした本発明のAMDase活性をもつタンパク質（例えば、図3(a)を参照）とアラインすることにより、当業者は好適な突然変異体形、AMDase活性も持つ新しく得られる酵素を推論することを可能にしうる。こうして推論した突然変異体は実質的に対応する非突然変異の親酵素と同じ酵素特性、例えば酵素の活性、基質特異性、立体特異性、安定性、溶解度を有するか、または、改変された酵素特性、例えば改変された、すなわち増加したまたは減少した酵素の活性、触媒効率、安定性、溶解度、立体特異性、および／または改変された、すなわちより広いまたはより狭い基質特異性を有しうる。

配列番号2のBordetella bronchiseptica タンパク質についての、主要アミノ酸置換の限定されない例を以下に掲げる。

¹⁾Del＝アミノ酸残基の欠失

限定されない突然変異体の例は、13、14、15、189、190および191から選択される位置における少なくとも1つの突然変異；またはこれらの位置のいずれかの順列、例えば：
13および14、
13および15、
14および15、
13、14および15、
14、15および189、
14、15および190、
14、15、189および190、
13、14、15および189、
13、14、15および190、
13、14、15、189および190
13、14および191、
13、15および191；
14、15および191、
13、14、15および191、
14、15、189および191
14、15、190および191、
14、15、189、190および191、
13、14、15、189および191、
13、14、15、190および191、
13、14、15、189、190および191など
より得られる突然変異の組合わせを含む複数の突然変異を含むものである。

これらの位置における突然変異の実施は、例えばアルケニル置換基を保持する式(I)の非芳香族、非環状マロン酸に対する酵素の結合アフィニティの改善を可能にする。

この文脈におけるアミノ酸突然変異の具体的な例は、
Val13AlaまたはGly；
Pro14Val、AlaまたはGly；
Pro15His、またはGly；
Gly189AlaまたはDel；
Gly190Ala、SerまたはDel；
Leu191Del
である。

突然変異Pro14ValおよびPro15Hisは、小さい不飽和脂肪族基質の結合をより良いものにすることができる。かかる突然変異体にGly190Alaを加えるとさらに良い結果を得ることができる。Gly189Alaなどの第4の突然変異の後、酵素は不飽和脂肪族基質だけを受容し、芳香族基質を受容することはできない。Val13およびPro14のより小さいアミノ酸、例えばGly/Alaへの突然変異および残基Gly189または190の1つの欠失は、酵素が分枝鎖基質をより受容するように仕向けるに違いない。上記説明は限定すると考えてはならない。

類推で、当業者は構造的に関係する酵素に対する好適な突然変異体、すなわち、
a）Mesorhizobium sp. BNCIに由来する配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含むタンパク質；
b）Pyrcoccus horikoshii OT3に由来する配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含むタンパク質；
c）Bordetella bronchiseptica RB50に由来する配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含むタンパク質；
および
d）Aklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来する配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含むタンパク質；
を定義することができるであろう。

本発明はまた、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸に関する。

本発明はまた、少なくとも1つの調節核酸配列と機能しうる形で連結された、上に定義した核酸を含む発現カセットに関する。

本発明はまた、少なくとも1つの上に定義した発現カセットまたは核酸を含む組換え発現ベクターに関する。
本発明はまた、少なくとも1つの上に定義した発現ベクターを保持する組換え微生物に関する。

本発明はまた、上に定義した脱炭酸酵素活性を有する少なくとも1つのタンパク質または上に定義した組換え微生物を、任意に固定した形で含むバイオリアクターに関する。

本発明はまた、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性をもつ酵素を調製する方法であって、上に定義した組換え微生物を培養するステップおよび任意に前記脱炭酸酵素を培養から単離するステップを含むものである前記方法に関する。

本発明はまた、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の結晶形、特に、アリールマロン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の上に定義した結晶形に関する。

好ましい結晶形は配列番号2（Blastデータベース登録番号BAA02419.1）のBordetella bronchisepticaタンパク質から得られ、その結晶は格子定数a＝38.7、b＝65.6、c＝42.2Å（オングストローム）、およびβ＝110.8°を有する単位セルをもつP2₁空間群に属する。

本発明はまた、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の結晶形を調製する方法であって、前記タンパク質を含有する溶液（約1〜50または5〜20mg/mlの濃度）に、8.3〜8.7の範囲のpH、例えば8.5を有する、好ましくはTrisバッファーで緩衝化した結晶化剤、およびポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、特にPEG 4000〜8000、例えばPEG 6000を加えるステップを含むものである前記方法に関する。

本発明はまた、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有する候補酵素をスクリーニングする方法であって、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性をもつ酵素に特徴的な配列モチーフ（パターン）を同定するステップ、および公知のアミノ酸配列、例えばアミノ酸配列データベースを、前記配列モチーフと部分的または全面的にマッチする配列についてスクリーニングするステップを含むものである前記方法に関する。好ましくは前記配列モチーフは、配列番号2、4、6、8、9、10または12により定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の結晶形の結晶構造から誘導される。

本発明はまた、上に定義した方法によりスクリーニングした、本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有する候補酵素を調製する方法であって、候補酵素をコードするヌクレオチド配列を得るステップ、組換え微生物において前記配列を発現するステップ、および前記発現産物を単離するステップを含むものである前記方法に関する。最後に、本発明はまた、先に定義した式Iの化合物を脱炭酸する脱炭酸反応における、前記方法により調製した発現産物の使用に関する。

2 特定の用語の説明
「AMDase」（EC 4.1.1.76）はアリールマロン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を意味し、α-アリール-α-メチルマロン酸のようなα-アリールマロン酸のエナンチオ選択的モノ脱炭酸を触媒して光学的に純粋なアリールプロピオン酸を与える。この酵素はビオチンまたはいずれの他の補因子も活性のために必要としない。さらに、脱炭酸はマロニルチオエステル-酵素中間体の形成に関わらない。

「アリールマロン酸デカルボキシラーゼ（AMDase）活性を有する酵素」は、本明細書に定義した一般式Iの少なくとも1つの基質、特にマロン酸のα位置に少なくとも1つの芳香族置換基を保持する式Iの基質の、モノ脱炭酸、すなわちカルボキシル基の水素による置換を触媒する。

本明細書に開示した脱炭酸酵素または突然変異体はまた、広汎な基質特異性（本明細書に記載した非突然変異の参照酵素と比較して）を示し、それによって環状またはアリール基を含有するマロン酸だけでなく、非芳香族、非環状基を含有するマロン酸も脱炭酸しうるか、またはかかる非環状、非芳香族基を含有するマロン酸を基質として優先しうるので、本明細書で使用する用語「MDase」または「MDase活性を有する酵素」はさらに一般的に広汎な基質特異性をもつ脱炭酸酵素および／または改変もしくは修飾された基質優先性または基質特異性をもつ脱炭酸酵素を意味する。前記MDaseは、本明細書に定義した一般式Iの少なくとも1つの基質、特にマロン酸のα位置に環状または芳香族置換基を保持しない式Iの基質を併せて、もしくは排他的に、モノ脱炭酸、すなわち、少なくとも1つのカルボキシル基の水素による置換を触媒する。このMDase酵素はビオチンまたはいずれの他の補因子も活性のために必要としない。さらに、脱炭酸はマロニルチオエステル-酵素中間体の形成に関わらない。

「広汎な基質特異性」は、参照酵素と比較すれば、さらなる構造的に異なる基質を転化することを意味する。

「改変／修飾された基質特異性」は、参照酵素と比較すれば、部分的にまたは完全に異なる基質分子のセットを転化することを意味する。従って、用語「改変された基質特異性」は、例えば、突然変異の影響を受けて、脱炭酸酵素が、参照酵素（例えば非突然変異酵素のような）より、特定の基質分子の脱炭酸に対してよりうまく適合する状況を記載しうる。例えば、より高い優先性または特異性は、酵素変異体が形成した結合ポケットのより高い基質アフィニティによって生じうる。

「改変／修飾された酵素活性」は、参照酵素と比較すれば、少なくとも1つの共通の基質分子に対してより速やかなまたはより遅い転化反応速度を示す酵素を意味する。

本明細書で使用する用語「脱炭酸酵素」または「脱炭酸酵素活性を有する酵素」は、特に断りがなければ、一般的に本明細書に定義したAMDaseおよび／またはMDase酵素を意味する。

酵素反応は可逆反応であるので、本発明はまた、本明細書に記載の生体触媒脱炭酸反応の、対応する逆反応（すなわちモノ炭酸化）にも関する。

用語「生体触媒による方法」は、本明細書に定義した脱炭酸酵素（AMDaseまたはMDase）の触媒活性の存在のもとで、すなわち、単離された純粋なまたは粗製の酵素またはかかる酵素活性を含有するまたは発現する全微生物細胞の存在のもとで実施するいずれかの方法を意味する。

用語「立体特異的」は、いくつかのエナンチオマーの1つがその酵素により、少なくとも90％ee、好ましくは少なくとも95％ee、特に少なくとも98％ee、または少なくとも99％eeの高いエナンチオマー過剰または純度で作られることを意味し、そのee％値は次式：
ee％＝[X_A-X_B]/[X_A+X_B]*100
［式中、X_AおよびX_Bはそれぞれ、エナンチオマーAまたはBのモル分率を意味する］によって計算される。

本明細書に定義したAMDase、MDaseまたは脱炭酸酵素の「基質ポケット」またはその「反応性中心」は、触媒する反応の間、式Iの基質分子を抱いて、その基質分子を式IIの生成物に転化する。前記基質ポケットはある特定の「構造エレメント」すなわち異なる機能をもつ前記基質ポケットの部分から構成される。前記構造エレメントはお互いに「機能的配置」で存在する、すなわちこれらは触媒する反応の間、協同する。

「配列モチーフ」または「パターン」は、複数のアミノ酸残基の特徴的な配置または「フィンガープリント」を表し、特定のアミノ酸配列内でお互いに隣接しているかまたはお互いから定義された方式で、すなわち、特徴的な長さの中間体スペーサー配列により分離されている。

式Iの基質および式IIの生成物については、次の意味が好ましい：
「塩形」はアンモニウム塩またはアルカリもしくはアルカリ土類金属塩、例えばNa⁺、K⁺またはCa²⁺塩を意味する。

「低級アルキル」は、1〜8個、好ましくは1、2、3または4個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の基であるC₁〜C₈アルキル基を意味する。それらの例は、C₁〜C₄-アルキル基、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、2-ブチル、イソブチルまたはtert-ブチル；およびさらに4個以上の炭素原子をもつ残基、例えばペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピル、ヘプチル、オクチルおよびその構造異性体、例えば2-エチルヘキシルである。

「低級アルコキシ」は好ましくは、上記低級アルキル基のC₁〜C₈-アルコキシ類似体を意味する。

「低級アルキルチオ」は好ましくは、上記低級アルキル基のC₁〜C₈-アルキルチオ類似体を意味する。例は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、sec-ブチルチオ、イソブチルチオおよびtert-ブチルチオである。

「低級アルケニル」は、2〜8個、好ましくは2〜4個の炭素原子を有するモノ不飽和の直鎖または分枝鎖の炭化水素基であるC₂〜C₈-アルケニル基、例えばエテニル、1-または2-プロペニル、1-、2-および3-ブテニル、2-メチルプロペン-3-イル、2-メチルプロペン-1-イル、1-、2-、3-および4-ペンテニル、1-、2-、3-、4-および5-ヘキセニル、1-、2-、3-、4-、5-および6-ヘプテニル1-、2-、3-、4-、5-、6-および7-オクテニルおよびまたそれらの構造異性体を含む。

「低級アルキニル」は上記「低級アルケニル」基のアルキニル相同体を含む。

用語「ヒドロキシ低級アルキル」は、1〜8個、特に1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基であって、少なくとも1個の水素原子、例えば1または2個の水素原子がヒドロキシル基により置換されているC₁〜C₈-ヒドロキシアルキルを意味する。それらの例は、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシ-1-エチル、2-および3-ヒドロキシ-1-プロピル、2-、3-および4-ヒドロキシ-1-ブチル、2-、3-、4-および5-ヒドロキシ-1-ペンチル、2-、3-、4-、5-および6-ヒドロキシ-1-ヘキシル、2-、3-、4-、5-、6-および7-ヒドロキシ-1-ヘプチル、2-、3-、4-、5-、6-、7-および8-ヒドロキシ-1-オクチル、2,3-ジヒドロキシ-1-プロピルおよびそれらの構造異性体である。

用語「シクロアルキリデン」は、二重結合を介して分子の残りの構造と連結された4〜7個の環炭素原子を含む環構造を表す。例としては、シクロペンチリデン、シクロヘキシリデンおよびシクロヘプチリデンが挙げられる。

「単環もしくは二環の環」残基の例としては、3〜12個の環炭素原子および任意に1〜4個のN、SおよびOのようなヘテロ原子を有する、炭素環または複素環の、任意に環縮合した、非芳香族または好ましくは芳香族または複素芳香族の環が挙げられる。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ならびにそれらのモノまたはポリ不飽和相同体、例えばシクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル、ならびにナフチルおよびフェニル；ならびにO、NおよびSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜7員の飽和またはモノまたはポリ不飽和複素環基（ここで、この複素環はさらに他の複素環または炭素環と環縮合していてもよい）が挙げられる。複素環の残基の例は、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、モルホリン、ピロール、フラン、チオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピラン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、クマロン、インドールおよびキノリンから誘導される複素環である。「単環の」環はまた、上記シクロアルキリデン構造も含む。

「任意の置換基」としては、NH₂、OH、SH、ハロゲン、例えばF、Cl、Br、I；先に定義した低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル-低級アルキルが挙げられる。「任意の置換基」はまた、かかる置換基の2つにより形成されたとみなしうる上記シクロアルキリデン残基を含む。

3 発明の他の実施形態
3.1 本発明によるタンパク質
本発明は具体的に開示した「AMDase活性をもつタンパク質」、または「MDase活性をもつタンパク質」に限定されるものでなく、それらの機能的等価体も包含する。

具体的に開示した酵素の「機能的等価体」または類似体は本発明の範囲に包含され、それは、さらに所望の生物学的機能または活性、例えば酵素活性を持つ様々なポリペプチドである。

例えば、「機能的等価体」は、酵素活性に使われる試験において、本明細書に定義した酵素の少なくとも1〜10％、または少なくとも20％、または少なくとも50％、または少なくとも75％、または少なくとも90％高いかまたは低い活性を示す酵素を意味する。

本発明による「機能的等価体」はまた、特に、上述のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置において、具体的に記述したのと異なる1つのアミノ酸を有するが、それにも関わらず上記の生物活性の1つを有する突然変異体を意味する。「機能的等価体」は従って、1以上のアミノ酸付加、置換、挿入、欠失および／または逆位により得られ、前記の変化が本発明による特性のプロファイルをもつ突然変異体に導くことを条件としていずれの配列位置で起こってもよい突然変異体を含む。機能的等価性は特にまた、反応性パターンが突然変異体と未変のポリペプチドの間で定性的に一致すれば、（すなわち、例えば同じ基質が異なる速度で転化されても）与えられる。好適なアミノ酸置換の例を次表に示す：
元来の残基 置換の例
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln；His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn；Gln
Ile Leu；Val
Leu Ile；Val
Lys Arg；Gln；Glu
Met Leu；Ile
Phe Met；Leu；Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp；Phe
Val Ile；Leu
以上の意味での「機能的等価体」はまた、記載したポリペプチドの「前駆体」、ならびにそのポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」である。

「前駆体」はこの場合、所望の生物活性を持つかまたは持たない天然または合成のポリペプチドの前駆体である。

表現「塩」は、本発明によるタンパク質分子のカルボキシル基の塩ならびにアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は公知の方法で作ることができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩、ならびに有機塩基、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどのアミン類の塩を含む。酸付加塩、例えば塩酸または硫酸などの無機酸の塩、および酢酸および蓚酸などの有機酸の塩も本発明に包含される。

本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、官能基のアミノ酸側鎖でまたはそれらのN-末端またはC-末端において公知の技法を用いて作製することができる。かかる誘導体は、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、一級または二級アミンとの反応により得ることができるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応により作られる遊離アミノ基のN-アシル誘導体；またはアシル基との反応により作られる遊離ヒドロキシ基のO-アシル誘導体を含む。

「機能的等価体」は天然でまた、他生物から得られるポリペプチド、ならびに天然の変異体を含む。例えば、相同性配列域の領域は、配列比較により確立することができ、そして等価酵素は本発明の具体的なパラメーターに基づいて決定することができる。

「機能的等価体」はまた、例えば所望の生物学的機能を示す、本発明によるポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含む。

「機能的等価体」はさらに融合タンパク質であって、上記ポリペプチド配列の1つまたはそれから誘導された機能的等価体および少なくとも1つのさらなる、機能的に異なる異種配列を官能基のN-末端またはC-末端結合に（すなわち、実質的に融合タンパク質部分の相互機能障害なしに）有する前記融合タンパク質である。これらの異種配列の限定されない例は、例えば、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。

本発明に包含される「機能的等価体」はまた、具体的に開示したタンパク質の相同体である。これらは上記のパーセント同一性値を有する。前記パーセント同一性値は、具体的に開示したアミノ酸配列との同一性を意味し、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988、2444-2448のアルゴリズムに従って計算することができる。

パーセント同一性値はまた、BLASTアラインメント、アルゴリズムblastp（タンパク質-タンパク質BLAST）からまたは以下に記載のクラスタル設定を応用して計算することができる。

本発明による相同的ポリペプチドのパーセント同一性は特に、本明細書に具体的に記載したアミノ酸配列の1つの合計長さに対する相対的なアミノ酸残基のパーセント同一性を意味する。

タンパク質グリコシル化の場合であれば、本発明による「機能的等価体」は、脱グリコシルしたまたはグリコシル化した形ならびにグリコシル化パターンを改変することにより修飾された型を含む。

本発明によるかかるタンパク質またはポリペプチドの機能的等価体または相同体は、突然変異誘発、例えばタンパク質の点突然変異、延長または短縮により作製することができる。

本発明によるタンパク質のかかる機能的等価体または相同体は、突然変異体のコンビナトリアルデータベースを、例えば、短縮突然変異体についてスクリーニングすることにより同定できる。例えば、タンパク質変異体の多様なデータベースを核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素ライゲーションにより作製することができる。潜在相同体のデータベースを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するのに用いることができる方法は非常に多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成機で行い、次いで合成遺伝子を好適な発現ベクターにおいてライゲートすることができる。縮重ゲノムを利用すると、所望の潜在タンパク質配列のセットをコードする全ての配列を混合物で供給することができる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者にとって公知である（例えば Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura ら, (1984) Science 198:1056; Ike et al (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。

従来の技術分野において、点突然変異または短縮により作製したコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択した特性をもつ遺伝子産物のcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法は公知である。これらの技法を、本発明による相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により作製した遺伝子バンクを迅速にスクリーニングするように適応することができる。ハイスループット分析に基づく大きい遺伝子バンクをスクリーニングするために最も頻繁に用いられる技法は、遺伝子バンクを複製可能な発現ベクターにクローニングするステップ、得られるベクターデータベースによって好適な細胞を形質転換するステップ、および所望の活性の検出により検出した産物の遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件のもとでコンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを含むものである。データベース中の機能的突然変異体の頻度を増加する技法である再帰アンサンブル突然変異誘発（REM）を、スクリーニング試験と組合わせて利用し、相同体を同定することができる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。

3.2 コード核酸配列
本発明はまた、本明細書に定義した酵素をコードする核酸配列に関する。

本発明はまた、本明細書に具体的に開示した配列とある特定の度合いの「同一性」をもつ核酸に関する。2つの核酸の間の「同一性」は、それぞれの場合における核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味する。

例えば同一性は、Informax（USA）社のVector NTI Suite 7.1 プログラムの方法により、クラスタル法（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1）を用いて、次の設定：
マルチプルアラインメントパラメーター：
ギャップ・オープニング・ペナルティ 10
ギャップ・エキステンション・ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アラインメント遅れに対する％同一性 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション重み付け 0
ペワイズアラインメントパラメーター：
FASTアルゴリズム オン
K-tupleサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウインドウサイズ 5
最良対角数 5
によって計算することができる。

あるいは、同一性は、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs (2003) Nucleic Acids Res 31 (13)：3497-500, the web page: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# と、次の設定：
DNAギャップ・オープニング・ペナルティ 15.0
DNAギャップ・エキステンション・ペナルティ 6.66
DNAマトリックス Identity
タンパク質ギャップ・オープニング・ペナルティ 10.0
タンパク質ギャップ・エキステンション・ペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
によって決定することができる。

本明細書に記載した全ての核酸配列（1本鎖および2本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA）は公知の方法でヌクレオチド・ビルディングブロックから化学合成により、例えば、二重へリックスの個々のオーバーラップする、相補的な核酸ビルディングブロックの断片縮合により作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、公知の方法で、ホスホアミダイト法により行うことができる（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press, New York, pages 896-897）。合成オリゴヌクレオチドの蓄積およびDNAポリメラーゼのクレノウ断片の方法によるギャップの充填およびライゲーション反応ならびに一般的クローニング技法は、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている（以下参照）。

本発明はまた、上記ポリペプチドおよびそれらの機能的等価体のいずれかをコードする核酸配列（1本鎖および2本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA）にも関するものであり、これらの核酸配列は、例えば、人工のヌクレオチド類似体を用いて得ることができる。

本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば、本発明のコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸断片との両方に関する。

本発明による核酸分子はさらにコード遺伝子領域の3'および／または5'末端から得られる非翻訳配列を含んでもよい。

本発明はさらに、具体的に記載したヌクレオチド配列またはそのセグメントに相補的である核酸分子に関する。

本発明のヌクレオチド配列によって、他の細胞タイプおよび生物に含まれる相同配列を同定および／またはクローニングするために有用なプローブおよびプライマーを作製することが可能となる。かかるプローブおよびプライマーは通常、「ストリンジェントな」条件（下記参照）下で、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12個、好ましくは、少なくとも約25個、例えば、約40、50または75個の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。

「単離された」核酸分子は、その核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、それが組換え法により産生されたのであれば、他の細胞性物質や培地を実質的に含まず、また、それが化学合成されたのであれば、化学的前駆物質や他の化学薬品を実質的に含まないものでありうる。

本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学の手法および本発明により提供される配列情報を用いることにより単離することができる。例えば、cDNAは好適なcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーションプローブとして具体的に開示した完全な配列またはそのセグメントの1つと標準的なハイブリダイゼーション技法とを用いて単離することができる（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989に記載のように行う）。さらに、開示した配列またはそのセグメントの1つを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより単離することができる。このようにして増幅した核酸を好適なベクターにクローニングして、DNA配列解析により特徴づけることができる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、標準的な合成方法により、例えば自動DNA合成機を使って、作製することもできる。

本発明による核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体または部分は、例えば、通常のハイブリダイゼーション技法またはPCR技法により他の細菌から、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーを介して単離することができる。これらのDNA配列は標準条件で本発明による配列とハイブリダイズする。

「ハイブリダイズする」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがほとんど相補的な配列と標準条件で結合できるが、非特異的結合が非相補的なパートナーの間ではこの条件で起こらないことを意味する。このためには、配列が90〜100％相補的でありうる。特異的にお互いに結合できる相補的配列の特性は、例えばノーザンブロットもしくはサザンブロットに、またはPCRもしくはRT-PCRのプライマー結合に利用される。

短い保存領域のオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション用に使うと有利である。しかし、本発明による核酸の、より長い断片または完全な配列をハイブリダイゼーション用に使うことも可能である。これらの標準条件は使用する核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片または完全な配列）に応じてまたはハイブリダイゼーションに使用する核酸の型（DNAもしくはRNA）に応じて変化する。例えば、DNA：DNAハイブリッドに対する融点は、同じ長さのDNA：RNA ハイブリッドの融点よりほぼ10℃低い。

例えば、特定の核酸に応じて、標準条件は42〜58℃の温度、0.1〜5×SSC（1×SSC＝0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH 7.2）の濃度のバッファ水溶液中、またはさらに50％ホルムアミドが存在する条件を意味し、例えば42℃、5×SSC、50％ホルムアミド中である。有利なDNA：DNAハイブリッドに対するハイブリダイゼーション条件は0.1×SSCおよび約20℃〜45℃の温度、好ましくは約30℃〜45℃の温度である。DNA：RNAハイブリッドに対する有利なハイブリダイゼーション条件は0.1×SSCおよび約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃の温度である。ハイブリダイゼーション用のこれらの記載温度は、長さほぼ100ヌクレオチドおよびG+C含量50％の核酸に対してホルムアミドの非存在のもとで計算した融点値の例である。DNAハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学教科書、例えば、Sambrook et al., 1989に記載されており、当業者に公知である式を用いて、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの型またはG+C含量に応じて計算することができる。当業者はハイブリダイゼーションについてのさらなる情報を次の教科書から得ることができる：Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York；Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。

「ハイブリダイゼーション」は特にストリンジェントな条件のもとで行うことができる。かかるハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。

「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、特に：42℃にて一晩、50％ホルムアミド、5×SSC（750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×Denhardt溶液、10％デキストラン硫酸塩および20g/ml変性剪断サケ精子DNAからなる溶液中のインキュベーションと、次いで0.1×SSCによる65℃におけるフィルターの洗浄を意味する。

本発明はまた、具体的に開示したまたは誘導可能な核酸配列の誘導体に関する。

従って、本発明によるさらなる核酸配列を、本明細書に具体的に開示した配列から誘導することができ、この核酸配列は単一のまたは複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により元のものとは異なるが、なお所望の特性のプロファイルをもつポリペプチドをコードすることができる。

本発明はまた、いわゆるサイレントな突然変異を含むかまたは具体的に記載した配列と比較して、特別な元来のまたは宿主生物、ならびに天然の変異体、例えばそのスプライシング変異体または対立遺伝子変異体のコドン利用によって改変されている核酸配列を包含する。

本発明はまた、保存ヌクレオチド置換により（すなわち、問題のアミノ酸を同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸により置換して）得ることができる配列に関する。

本発明はまた、具体的に開示した核酸から配列多形により誘導された分子に関する。これらの遺伝子多形は、自然変異によって集団内の個体間に存在しうる。これらの自然変異は通常遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5％のばらつきを生じる。

本発明による核酸配列の誘導体は、例えば、全配列領域にわたって、誘導されたアミノ酸のレベルで少なくとも60％相同性、好ましくは少なくとも80％相同性、非常に特に好ましくは少なくとも90％相同性を有する対立遺伝子変異体を意味する（アミノ酸レベルの相同性については、先にポリペプチドについて記載した詳細な説明を参照されたい）。相同性が配列の部分領域全体にわたって高いほど有利でありうる。

さらに、誘導体はまた、本発明による核酸配列の相同体、例えば、動物、植物、真菌または細菌の相同体、短縮配列、コードおよび非コードDNA配列の1本鎖DNAもしくはRNAであると解釈すべきである。例えば、相同体は、DNAレベルで、本明細書に具体的に開示した配列に与えられた全DNA領域にわたって、少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、とりわけ好ましくは少なくとも70％特にとりわけ好ましくは少なくとも80％の相同性を有する。

さらに、誘導体は、例えばプロモーターとの融合体と解釈すべきである。記載したヌクレオチド配列に加えるプロモーターを、プロモーターの機能または効力を損なうことなく、少なくとも1つのヌクレオチド交換、少なくとも1つの挿入、逆位および／または欠失により改変することができる。さらに、プロモーターの効力を、その配列を改変することにより増加することもまたは異なる属の生物のより効果的なプロモーターで完全に交換することすらできる。

3.3 本発明による構築物
本発明はまた、調節核酸配列の遺伝子制御のもとで、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現構築物、ならびにこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むものであるベクターに関する。

「発現ユニット」は、本発明によれば、本明細書に規定したプロモーターを含むものであって、発現すべき核酸もしくは遺伝子との機能的連結に従って、この核酸もしくはこの遺伝子の発現、転写および翻訳を調節する、発現活性をもつ核酸を意味する。従って、この意味で「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターだけでなく、他の調節配列、例えばエンハンサーが存在してもよい。

「発現カセット」または「発現構築物」は、本発明によれば、発現すべき核酸または発現すべき遺伝子と機能しうる形で結び付けた発現ユニットを意味する。発現ユニットとは対照的に、発現カセットは従って、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果、タンパク質として発現すべき核酸配列も含むものである。

用語「発現」または「過剰発現」は、本発明の関係では、対応するDNAによりコードされた微生物中の1以上の酵素の細胞内活性の産生または増加を記載する。これについては、例えば、生物に遺伝子を挿入し、存在する遺伝子を他の遺伝子と置き換え、遺伝子のコピー数を増加し、強いプロモーターを使用し、または高活性をもつ対応する酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、また任意にこれらの対策を組合わせることもできる。

好ましくは、本発明によるかかる構築物はそれぞれのコード配列の5'上流にプロモーター配列、および3'下流にターミネーター配列、ならびに任意にさらなる通常の調節配列を含むものであり、それぞれの調節配列はコード配列と機能しうる形で連結されている。

「プロモーター」、「プロモーター活性をもつ核酸」または「プロモーター配列」は、本発明によれば、転写すべき核酸と機能しうる形で連結されて、この核酸の転写を調節する核酸を意味する。

「機能的」または「機能しうる」連結は、この文脈では、例えば、プロモーター活性をもつ核酸の1つ、および転写すべき核酸配列、および任意にさらなる調節配列（例えば、核酸の転写を可能にする核酸配列）、および例えばターミネーターを、それぞれの調節配列が核酸配列の転写中にその機能を遂行できる方式で連続配置することを意味する。これは必ずしも化学的な意味での直接連結を必要としない。エンハンサー配列などの遺伝子調節配列はまた、より離れた位置からまたは他のDNA分子からですら、標的配列に作用することができる。転写すべき核酸配列をプロモーター配列の下流（すなわち3'末端）に置いて、2つの配列がお互いに共有結合している配置が好ましい。プロモーター配列と遺伝子組換えで発現される核酸配列の間の距離は200塩基対未満、または100塩基対未満、または50塩基対未満でありうる。

プロモーターおよびターミネーターとは別に、挙げることができる他の調節配列の例は標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。

本発明による核酸構築物は特に、本明細書に具体的に記載した配列またはその誘導体および相同体、ならびに本明細書に具体的に記載したアミノ酸配列から誘導できる核酸配列から選択される配列を含むものであり、例えば遺伝子発現を制御する、例えば増加するための、1以上の制御シグナルと機能しうる形でまたは機能的に結合されていることが有利である。

これらの調節配列だけでなく、これらの配列の自然調節がさらに実際の構造遺伝子の前に存在しうるのであって、場合によっては、自然調節をスイッチオフするように遺伝子的を改変して、遺伝子の発現を増加してもよい。核酸構築物はまた、もっと簡単な設計、すなわち、さらなる調節シグナルをコード配列の前に挿入せずかつ調節を伴う自然プロモーターを除去しない設計であってもよい。代りに、自然調節配列をサイレンシングして調節が起こらず、遺伝子発現を増加するようにしてもよい。

好ましい核酸構築物はまた、有利な方法として、核酸配列の発現の増加を可能にするプロモーターと機能しうる形で連結された前記エンハンサー配列を1つ以上含む。他の調節配列またはターミネーターなどのさらなる有利な配列をまた、DNA配列の3'末端に挿入することもできる。本発明による核酸の1以上のコピーが構築物に含まれてもよい。構築物はまた、任意に構築物を選択するために、抗生物質耐性または栄養要求性を補完しうる遺伝子などの他のマーカーを含んでもよい。

プロモーターに含まれる好適な調節配列の例は、グラム陰性菌で有利に使われるcos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP（rhaP_BAD）SP6、λ-P_Rまたはλ-P_Lプロモーターである。他の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性菌プロモーターのace、amyおよびSPO2、酵母または真菌プロモーターのADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHである。人工プロモーターも調節に用いることができる。

発現については、核酸構築物を宿主生物に、有利な方法としては、宿主での遺伝子の最適な発現を可能にするベクター、例えばプラスミドまたはファージ中に挿入する。ベクターは、プラスミドおよびファージだけでなく、当業者に公知の全ての他のベクター、すなわち、例えばウイルス（SV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなど）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および直鎖または環状DNAも意味すると解釈すべきである。これらのベクターは宿主生物中で自律的に複製できるかまたは染色体を介して複製できる。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を示す。

好適なプラスミドは例えば、大腸菌にpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11またはpBdCIがあり；ノカルジオ状放線菌類にpJAM2があり；ストレプトマイセス菌にpIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361があり；バシラス菌にpUB110、pC194またはpBD214があり；コリネバクテリウムにpSA77またはpAJ667があり；真菌にpALS1、pIL2またはpBB116があり；酵母に2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMBLYe23があり；あるいは植物にpLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004またはpDH51がある。以上記載したプラスミドは可能性のあるプラスミドから選択したわずかなものである。その他のプラスミドが当業者に周知であり、例えば、単行本のCloning Vectors（Eds. Pouwels P.H. et al Elsevier、Amsterdam-New York-Oxford、1985、ISBN 0 444 904018）に見出しうる。

さらなるベクターの実施形態においては、本発明による核酸構築物または本発明による核酸を含有するベクターを微生物に直鎖DNAの形で挿入し、異種もしくは相同組換えを介して宿主生物のゲノム中に組み込むことが有利である。この直鎖DNAは直線化ベクター、例えばプラスミド、またはただ本発明による核酸構築物もしくは核酸であってもよい。

生物において異種遺伝子を最適に発現させるためには、その生物で使われる特定のコドン使用頻度に従って核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度は、問題の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター評価に基づいて容易に決定することができる。

本発明による発現カセットの作製は、好適なプロモーターと好適なコードヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルとの融合に基づく。このために使われる通常の組換えおよびクローニング技法は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、ならびにT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、およびAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されている。

組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、有利な方法として、好適な宿主生物における発現用の宿主特異的ベクターに挿入し、これにより遺伝子が宿主中で最適に発現されることを可能にする。ベクターは当業者に周知であり、例えば、"Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Publ. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出すことができる。

3.4 本発明によって用いることができる宿主
状況に応じて、用語「微生物」は出発微生物（野生型）または本発明によって遺伝的に改変した組換え微生物またはそれらの両方を意味する。

「野生型」は、本発明によれば、対応する出発微生物を意味し、必ずしも天然の生物に対応する必要はない。

本発明によるベクターを用いることにより、例えば、少なくとも1つの本発明によるベクターにより形質転換された組換え微生物を作製することができ、そして本発明によるポリペプチドの産生に利用することができる。有利な方法として、以上記載した本発明による組換え構築物を好適な宿主系に挿入して発現させる。好ましくは、特別な発現系における記載した核酸の発現を確保するために、当業者は手慣れた通常のクローニングおよびトランスフェクション法、例えば共沈降、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルスのトランスフェクションなどを用いる。好適な系は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Publ. Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。

原則として、全ての原核生物は本発明による核酸または核酸構築物のための組換え宿主生物とみなすことができる。細菌を宿主生物として用いることは有利である。好ましくは、これらをPHA-、TAG-またはWE型の封入体を産生する能力を有する生来のまたは組換え体の細菌から選択し、これらとしては、特にTAG-を産生するノカルジオ状の放線菌類、特にロドコッカス属、ミコバクテリウム属、ノカルジア属、ゴルドニア属、スケルマニア属およびツカムレラ属；ならびにTAGを産生するストレプトミセス属；WEを産生するアシネトバクター属およびアルカニボラキシ属（Alcanivorax）；ならびにエシェリキア属、とりわけE. Coli（大腸菌）、コリネバクテリウム属、とりわけC. glutamicum（グルタミン酸生産菌）、およびバシラス属、とりわけB. subtilis（枯草菌）の組換え菌株が挙げられる。

従って本発明による宿主生物は、好ましくは、上記定義による酵素活性をコードする本明細書に記載の核酸配列、核酸構築物またはベクターの少なくとも1つを含有する。

本発明の方法に利用する生物を、当業者の手慣れた方法で、宿主生物に応じて、生育または増殖する。通常、微生物を、一般に糖類の形態の炭素源、一般に窒素の有機源（酵母エキスなど）または塩（硫酸アンモニウムなど）の形態の窒素源、微量元素（鉄、マンガンおよびマグネシウム塩）ならびに、適宜、ビタミンを含む液培地中で、0℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃の温度で酸素曝気して増殖する。栄養液体培地のpHは増殖の間、固定した値、すなわち調節したまたは調節しない値に維持してもよい。増殖は回分式、半回分式または連続的に行ってもよい。栄養分は発酵の開始時に補給してもまたは、その後、半連続的または連続的に補給してもよい。

3.5 脱炭酸酵素活性をもつタンパク質の組換え生産
本発明はまた、前記タンパク質を発現する微生物を培養しそして所望の産物を培養物から単離することにより、本発明によるタンパク質を生産する方法に関する。

本発明によって用いる微生物は回分式プロセスまたは供給回分式または繰返し供給回分式プロセスで、連続的にまたは非連続的に培養することができる。

公知の培養方法の総括は、Chmiel (Bioprocesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag、Stuttgart、1991))による教科書またはStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、1994))による教科書に見出しうる。

用いる培地は具体的な菌株の要件を適当な方式で満たさなければならない。

様々な微生物に対する培地は、米国細菌学会のハンドブック"Manual of Methods for General Bacteriology"（the American Society for Bacteriology, Washington D. C.、USA、1981）に記載されている。

本発明により用いることができるこれらの培地は、一般に1種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。

好ましい炭素源は糖類、例えば単糖類、二糖類または多糖類である。非常に優れた炭素源は例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖類はまた、複雑な化合物、例えば糖蜜または糖精製から得られる他の副産物を介して培地に加えることもできる。様々な炭素源の混合物を加えることも有利でありうる。他の可能性のある炭素源は油類および脂肪類（ダイズ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびヤシ油など）、脂肪酸類（パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸など）、アルコール類（グリセロール、メタノールまたはエタノールなど）および有機酸類（酢酸または乳酸など）である。

窒素源は通常、有機または無機窒素化合物またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例としては、アンモニアガスまたはアンモニウム塩（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム、硝酸塩など）、尿素、アミノ酸類または複雑な窒素源（トウモロコシ浸漬液、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母エキス、肉エキスなど）などが挙げられる。窒素源は別々にまたは混合物として使用することができる。

培地に存在してもよい無機塩化合物にはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が含まれる。

無機硫黄を含有する化合物（硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオニット、テトラチオナート、チオ硫酸塩、硫化物など）だけでなく、有機硫黄化合物（メルカプタンおよびチオールなど）を硫黄源として使用することができる。

リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩をリン源として使用することができる。

溶液中の金属イオンを保持するためにキレート剤を培地に加えてもよい。とりわけ好適なキレート剤にはジヒドロフェノール（カテコールまたはプロトカテキュ酸など）、または有機酸（クエン酸など）が含まれる。

本発明による発酵培地はまた、他の成長因子（ビタミンなど）または成長促進物質（例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンなど）を含有してもよい。成長因子と塩はしばしば培地の複雑な成分（酵母エキス、糖蜜、トウモロコシ浸漬液など）に由来する。さらに好適な前駆体を培地に加えることができる。培地中の化合物の正確な組成は特定の実験に強く依存するものであり、それぞれの具体的な事例に対して個々に決定しなければならない。培地最適化に関する情報は、教科書"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach"（Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）に見出しうる。増殖培地はまた、商業的供給者（例えば、Standard 1（Merck）またはBHI（脳心臓注入液、DIFCO）など）から得ることもできる。

全ての培地成分を、加熱（20分間、1.5bar、121℃にて）によりまたは滅菌濾過により無菌化する。成分を一緒にまたは、必要であれば、別々に無菌化してもよい。培地の全ての成分は増殖の出発時に存在してもよいし、または、任意に連続的にもしくはバッチ式供給により加えてもよい。

培養の温度は通常、15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃であり、実験中、一定に保持してもよいしまたは変化させてもよい。培地のpHは5〜8.5の範囲、好ましくはほぼ7.0にすべきである。増殖のためのpHは増殖中に、塩基化合物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水など）または酸化合物（リン酸または硫酸など）を加えることにより制御することができる。消泡剤、脂肪酸ポリグリコールエステルを発泡を制御するために使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために、選択作用をもつ好適な物質、例えば抗生物質を培地に加えてもよい。酸素または酸素含有気体混合物、例えば大気を培地に供給して好気性条件を維持する。培養温度は通常20℃〜45℃である。培養は、所望の産物の最大量が得られるまで続ける。これは通常、10時間〜160時間以内に達成される。

細胞を、任意に、高周波超音波により、高圧により（例えば、フレンチプレス細胞破砕機で）、浸透圧溶解により、界面活性剤、溶解性酵素もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーを用いて、または掲げた方法のいくつかを組合わせて破壊することができる。

次の例は、単に、本発明の説明を果たすものである。当業者には明らかである数多くの可能な変法も本発明の範囲に包含される。

実験の部
1 一般情報
a)計器と材料
全ての化学品は（特に断らない限り）Sigma-Aldrichから購入した。XhoIおよびNdeI制限酵素はRocheから、T4リガーゼはNew England Biolabsから購入した。¹H NMR分析はBruker 200または400 MHz分光計で実施した。ESI-MS分析はポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化源運転を備えたBruker Esquire 3000⁺イオントラップMSで実施した。ESI-MS分析用のタンパク質サンプルはddH₂O中で4時間の透析により脱塩した。

b)配列類似性検索と新しいAMDaseの同定
新しいマロン酸脱炭酸酵素を見出すために、Bordetella bronchiseptica由来のAMDaseのタンパク質配列を公的データベースからの公知のタンパク質配列とBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）を用いてアラインした。検索の間、次のパラメーターを用いた：データベース-重複のない（nonredundant）タンパク質配列、アルゴリズム-blastp（タンパク質-タンパク質BLAST）。

B. bronchiseptica由来のAMDaseと最も類似したタンパク質のヒットのリストから、次の細菌酵素を選択した：
タンパク質 EAN08019.1（Mesorhizobium sp. BNC1から）、
タンパク質 BAA30082.1（Pyrococcus horikoshii OT3から）、
タンパク質 NP_888076.1（Bordetella bronchiseptica RB50から）および
タンパク質 ZP_00801202.1（Alkaliphilus metalliredigenes QYMFから）。

c)AMDasesおよび他の酵素のサブクローニング
次の酵素：
Bordetella bronchiseptica由来のAMDase、
タンパク質 EAN08019.1（Mesorhizobium sp. BNC1から）、
タンパク質 BAA30082.1（Pyrococcus horikoshii OT3から）、
タンパク質 NP_888076.1（Bordetella bronchiseptica RB50から）および
タンパク質 ZP_00801202.1（Alkaliphilus metalliredigenes QYMFから）および
グルタミン酸 ラセマーゼ （AAF25672）（Aquifex pyrophilusから）
をコードする遺伝子を、大腸菌における発現について最適化し、合成し、そしてアンピシリン耐性遺伝子を含有するpGA4ベクター（GENEART AG., Germany）中にクローニングした。これらの遺伝子を次いでカナマイシン耐性遺伝子を含有するpET30bベクター（Novagen, Cat.No. 69910-3, EMD Chemicals, Inc., San Diogo, USA）中にXhoIおよびNdeI制限酵素切断部位を利用してサブクローニングした。ライゲーション産物をBL21（DE3）エレクトロコンピテント大腸菌細胞中に形質転換し、これをKan50-LB-寒天プレート上にまいた。プラスミドを次いで細胞から単離し、サブクローニングの成功を配列決定により確認した。このサブクローニングは、大腸菌における標的化酵素の容易な発現と精製（タンパク質は6xHis-タグ付けされた）を可能にした。pET30bベクター中へのサブクローニングの後、全酵素の配列はC末端において次のアミノ酸：Leu-Glu-His-His-His-His-His-Hisだけ延長された。

配列番号1、3、5、7、9、および11によるヌクレオチド配列は、これらのhisタグ付け酵素をコードする最適化配列を表す。

d)His ₆ -融合タンパク質の発現と精製
T7 RNAポリメラーゼプロモーターとカナマイシン耐性遺伝子を含有するAMDaseをコードするプラスミドを、エレクトロコンピテント大腸菌菌株BL21（DE3）中に形質転換した。細菌を最初に培養培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％塩化ナトリウム、0.4％グルコース、0.20 x M9バッファー（1リットルについて：KH₂PO₄ 3g、Na₂HPO₄ 6g、NaCl 5g、MgSO₄（1M） 1ml、1リットルまでのdH₂O）、50mg/mLカナマイシン）でほぼ4時間37℃の温度でインキュベートしてOD₆₀₀＝1を達成した。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（1mM、最終濃度）を加えるとタンパク質発現を誘導した。一晩30℃でのインキュベーション後に、細胞をペレット化（4500rpm、15分間、4℃）し、25mM NaCl、2mM EDTA、0.2mM DTTおよびプロテアーゼインヒビター-フェニルメタンスルホニルフルオリド（10μg/mL）を含有する50mM TRISバッファー（pH8）中の卵白リゾチーム（0.1mg/1mLバッファー）を加えた後、室温にて溶解した。溶解後、2％ストレプトマイシン-硫酸塩を加えることにより核酸を沈降させ、次いで遠心分離した（4500rpm、20分間、4℃）。粗AMDaseを含有する上清を一晩、25mM NaClを含有する25mM TRISバッファー（pH 8）に対して透析し（Spectra/Por 2、MWCO：12-14 000）、His₆ 融合タンパク質を得て、これをFPLCによりGE Healthcare Bio-Science HiTrap Chelating 5mLカラム上で容易に精製した。タンパク質の溶出は、リン酸ナトリウムバッファー（0.02M、pH7.4）、NaCl（0.5M）およびイミダゾール（25、60および250mM）のステップ勾配を用いて達成した。標的タンパク質をイミダゾール濃度250mMで溶出した。この手順で培養250ml当たり15mgまでのタンパク質を得て、典型的な純度はSDS-PAGEにより95％であった。最終タンパク質濃度をBradfordアッセイまたはOD₂₈₀における分光計読取り値を用いることにより計算した。

e)Bordetella bronchiseptica由来のAMDaseの部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Pfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、Stratagene QuikChange（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット用の製造業者取扱説明書に従って実施した。PCR機械の条件は次の通りであった：1セグメントサイクル：95℃で2分間；2セグメントサイクル（繰り返し30回）：95℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で5.5分間；3セグメントサイクル：4℃で10分間。PCR後、Dpn I制限酵素を加えて非変異プラスミドを消化した。変異DNAを大腸菌BL21（DE3）中に移し、タンパク質を、野生型について先に記載した手順に従い発現させた。本発明の他の脱炭酸酵素の突然変異誘発を類似の方法で実施した。

f) AMDase活性を決定するためのin vivoプレートアッセイ
試験ペトリ皿を次の培地：1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％塩化ナトリウム、1％寒天、0.025％ブロモチモールブルー（BTB）を用いて調製した。pHを6.5に調節し、培地をオートクレーブ処理した。培地温度が50〜60℃に達すると、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（1mM、最終濃度）、カナマイシン（40mg/mL、最終濃度）およびフェニルマロン酸（0.36％、最終濃度）を加えた。AMDaseを含有する細菌培養液100μlを試験ペトリ皿にまいた。37℃における2〜3日のインキュベーション後、コロニーおよび周辺領域は緑色〜青色に変色してAMDase活性を示した。

g) 反応速度定数の決定
この方法は、脱炭酸反応中に生成する[OH^-]の濃度増加に伴う、pH指示薬BTBの黄色から緑色／青色への変化を分光計により620nmで測定することに関わる。色の増加がpHの増加と直線関係にあることを保証するために、pH指示薬のpKa（BTBのpKa＝7.3）付近で行わなければならない¹⁷。本発明者らは5mM（および／または10mM）MOPSバッファーpH7.2が好適であることを見出した。濃度の高い方のバッファー（10mM）は、バッファー能力が高いため色の変化が遅いので、高濃度の酵素または迅速な反応で優れた結果をもたらす。

全ての反応速度アッセイはAnthos Zenyth 3100 96-ウエルマイクロプレートリーダーで実施した。10μlの20〜500mMフェニルマロン酸またはメチル-フェニルマロン酸溶液（pH7.2に調節）を0.0186mMブロモチモールブルーを含有する180μlの5〜10mM MOPSバッファーpH7.2に加えた。反応は10μlの脱炭酸酵素溶液（0.002〜0.02mM、最終濃度）を加えることにより開始した。反応の感度はバッファー濃度に依存し、低い濃度ほど感度は高い。K_Mとk_catの値は、得られる青色溶液の620nmにおける分光計測定値から、Lineweaver-Burkプロットおよび次式：
反応速度＝dA/dt*Q*反応体積
［式中、Q＝C_{MOPS Buffer}/C_{BTB indicator}*1/(Δε_620nm*l)であり、Δε_616nm＝15703.79M^-1 cm^-1であり^17,18；C_{MOPS Buffer}はMOPSバッファー濃度を、C_{BTB indicator}はBTB指示薬濃度をそれぞれ表す］
を用いて計算した。

h) Bordetella bronchiseptica由来のAMDaseおよびMesorhizobium sp. BNC1由来のAsp/Gluラセマーゼによる2-メチル-2-フェニルマロン酸の2-フェニルプロパン酸へのin vitro脱炭酸
400μlの0.1M TRISバッファーpH8へ100μlの2-メチル-2-フェニルマロン酸の0.5M水溶液（pH8に調節した後）を加えた。次いで、20μlのAMDase溶液（10mg/mL）を加え、反応液を30℃にて8時間攪拌した。生成物を1M HClで酸性化した後、ジエチルエーテルで抽出し、TMS-ジアゾメタンを用いてメチル化した。反応液をGCにより分析し（95％まで転化）、2-フェニルプロパン酸形成をGC-MS、¹H NMRにより確認した。両方の酵素の（メチル化後）反応生成物は同じ立体配置（キラルカラムによるGCで同じピーク、ee＞99％）を有した。従って、文献⁷によれば、この生成物の絶対的立体配置はRであった。

i)酵素反応用の基質
フェニルマロネート(1)はSigma-Aldrichから購入した。2-エチル-2-フェニルマロネートはBASF SEから好意的に贈られた。ジエチル 2-メチル-2-フェニルマロネート(2a)はジエチル フェニルマロネートからヨードメタンとの反応で合成した。10g（42.3mmol）のジエチル フェニルマロネートを、1.6g（69.5mmol）金属ナトリウムを60mLの絶対エタノールに溶解して調製したナトリウムエタノラート溶液中で1時間還流下にて攪拌した。次いで6mL（96.4mmol）のMeIを加え、得られる混合物を還流下にてさらに1時間攪拌した。反応後、溶媒を真空化で除去し、残留物をジエチルエーテルに溶解し、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。ジエチルエーテルを蒸発させ、最終生成物（蒼白色の油）を98％収率およびNMR分析により99％純度で得た。

2-メチル-2-フェニルマロン酸（2）をジエチル 2-メチル-2-フェニルマロネート（2a）から水酸化ナトリウムで加水分解により合成した。4g（16mmol）のジエチル 2-メチル-2-フェニルマロネートを100mLのエタノールに溶解し、そして50mLの水酸化ナトリウムの3.25M水性溶液を加えた。反応液を一晩室温で攪拌した。エタノールを次いで真空下で蒸発させ、得られる白色粉末を10mLの水に溶解し、氷上で冷却し、そして5M HClを用いてpH 1へ酸性化した。生成物を2x100mLのジエチルエーテルを用いて抽出しそして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。エーテルを蒸発させ、最終生成物（白色粉末）を97％収率および99％純度（NMR分析により）で得た。

ジエチル 2-プロピリデンマロネート（4a）、ジエチル 2-ブチリデンマロネート（5a）およびジエチル 2-（2-メチルプロピリデン）マロネート（6a）を、ジエチルマロネートのプロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびイソブチルアルデヒドとの反応によりそれぞれ調製した。16g（0.1mol）のジエチルマロネートを、0.4mlのピペリジンおよび1.2mlの氷酢酸と一緒に50mlのトルエン中で20分間攪拌した。次いで0.12molの適当なアルデヒドを加え、反応液をDean-Stark条件下で4時間還流した。塩酸で酸性化した水100mlを反応混合物に加え、生成物をジエチルエーテルで抽出した。有機層をブライン溶液で数回洗浄しそして硫酸マグネシウム上で乾燥した。全ての生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製した。生成物は80％までの収率で無色の油として得た。

ジエチル 2-エチリデンマロネート（3a）はSigma-Aldrichから購入した。

ジエチル 2-メチル-2-ビニルマロネート（3b）、ジエチル 2-メチル-2-((E)-プロパ-1-エニル)マロネート（4b）、ジエチル 2-メチル-2-((E)-ブタ-1-エニル)マロネート（5b）およびジエチル 2-メチル-2-(2-メチルプロパ-1-エニル)マロネート（6b）を、ジエチル 2-メチル-2-ビニルマロネート（3b）合成において示したのと同じやり方で得た。15mlの無水THF中の2.4mlのジイソプロピルアミンを-78℃に冷却し、10.5mlのヘキサン中のBuLi（2.5M）を滴状で加えた。20分後、7.5mlのDMPUおよび2.8g（0.014mol）のジエチル 2-エチリデンマロネート（3a）を加えた。反応液を-78℃にて45分間攪拌し、次いで3.8gのヨードメタンを加えた。反応液を攪拌放置すると1時間内に室温に到達し、次いで30分間還流した。70mlの塩酸酸性化した水を反応混合物に加え、生成物をジエチルエーテルを用いて抽出した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製した。最終エステルを無色の油として30％収率で得た。2-メチル-2-ビニルマロン酸（3）、ジエチル2-メチル-2-((E)-プロパ-1-エニル)マロン酸（4）、ジエチル2-メチル-2-((E)-ブタ-1-エニル)マロン酸（5）およびジエチル2-メチル-2-(2-メチルプロパ-1-エニル)マロン酸（6）を、先に記載した2-メチル-2-フェニルマロン酸（2）に対するのと同じ方法により、エステルから合成した。

k） ¹⁸ O標識化実験
ステップI：10μl（40μmol）のジエチル 2-メチル-2-フェニルマロネート（5）を10μlのDMSOと混合し、5mgのブタ肝臓エステラーゼ（15単位/mg凍結乾燥粉末、Sigma-Aldrich）を含有する500μlのリン酸塩バッファーpH 7（H₂ ¹⁸O実験用：0.5mLバッファーを蒸発乾固し、残留する粉末を0.5mLのH₂ ¹⁸Oに再溶解し、「標識した」バッファーを反応に用いた）中に懸濁化した。次いで反応液を4℃へ冷却し、1M HClでpH 1へ酸性化し、生成物をジエチルエーテルを用いて抽出した。モノエチル 2-メチル-2-フェニルマロネートを¹HNMRにより、およびTMS-ジアゾメタンによるメチル化後、GC-MS（同位体分析で）により同定した。モノエチル 2-メチル-2-フェニルマロネートのエナンチオ選択性を、キラルカラムChiracel-OD上のHPLC-分析により確認した。エナンチオマーピークの分離は、0.25mL/minの流量で260nmにて、ヘキサン-イソ-プロパノール-トリフルオロ酢酸（93：7：1.5）の混合物を用いることにより達成した。形成した生成物は文献データによると立体配置Rを有した¹⁴。

ステップII：ステップIからの生成物を150μlの乾燥エタノールに溶解し、55μlの8.75M NaOHを加えた（H₂ ¹⁸O実験用：100mgの金属ナトリウムを55μlのH₂ ¹⁸Oに溶解し、得たNa¹⁸OHを反応に用いた）。反応液を2.5時間30℃にて攪拌した。反応液を蒸発乾固し、冷（4℃）0.1M TRISバッファーpH 8（400μl）に溶解し、pHを1M HClを用いて8に調節した。その混合物の1/3を1M HClを用いてpH 1に酸性化し、生成物をジエチルエーテルを用いて抽出した。2-メチル-2-フェニルマロン酸を¹HNMRにより、およびTMS-ジアゾメタンによるメチル化後、GC-MS（同位体分析で）により同定した。

ステップIII：ステップIIからの残りの溶液に20μlのAMDase溶液（10mg/mL）を加え、その反応混合物を4.5時間（Mesorhisobium sp.由来のAMDaseについては一晩）30℃にて攪拌した。この後、混合物を4℃まで冷却し、1M HClを用いてpH 1に酸性化し、最終生成物をジエチルエーテルを用いて抽出した。2-フェニルプロパン酸を¹HNMRにより、およびTMS-ジアゾメタンによるメチル化後、GC-MS（同位体分析で）により同定した。生成物（メチル化後）のエナンチオ選択性（ee＞99％）をキラルカラムを備えたGCにより確認した。

実施例１：B. bronchiseptica AMDaseの過剰生産と活性
大腸菌における発現についてコドン最適化した、B. bronchiseptica AMDaseをコードする合成遺伝子をpET30bベクター中にサブクローニングした。大腸菌BL21（DE3）菌株におけるIPTGによる誘導後の発現により、AMDaseをC-末端His₆-融合タンパク質として得た。酵素を次いでNi-アフィニティクロマトグラフィにより、95％を超える純度（SDS-PAGEにより確認）に精製し、その分子量をESI-MSにより確認した（m/z測定値＝25,799、計算分子量＝25,800 Da）。

アリールマロン酸脱炭酸酵素活性を、最初、AMDase発現ベクターを保持する無傷の大腸菌細胞により、文献⁴に報じられた手順を改変した方法（すなわち、pH指示薬としてブロモチモールブルーおよび基質としてフェニルマロネート1を使う）を用いて試験した。IPTGの存在のもとで、AMDaseによる基質の脱炭酸は黄色から青色への色変化により明らかであった。類似の色変化は基質として2-メチル-2-フェニルマロネート2を用いても認められた。脱炭酸酵素のin vitro反応速度パラメーターを、公知のUV分光計アッセイの改変法（脱炭酸後の水酸化物イオンの濃度増加⁴をBTBの620nmにおける吸収の変化に依って検出する）を用いて決定した。これから、見掛けの反応速度パラメーターを、フェニルマロネートおよび2-メチル-2-フェニルマロネート2を基質として測定した（表１）。全体の反応速度定数は、生来の酵素について測定した値と一致し、His₆-タグはAMDaseの活性に小さい影響しか与えないことを示唆した。しかし、2-メチル-2-フェニルマロネートのk_catは従来報じられた値⁶より高かった。

表1 基質としてフェニルマロネートおよび2-メチル-2-フェニルマロネートを用いて試験した、酵素の反応速度定数（BTB分光計の方法により決定した値）

^a）Bordetella bronchiseptica由来のAMDaseについての文献データ⁶、
^b）Aquifex pyrophilus由来のグルタミン酸ラセマーゼ（ラセマーゼ活性に対する反応速度定数）¹⁰

実施例２：B. bronchiseptica AMDaseの構造
シッティングドロップ（Sitting Drop）技法によるAMDase結晶化
実施例1によって得たB. bronchisepticus AMDaseを10mg/mLに濃縮し、Tris（0.1M、pH8.5）およびPEG 6000（30％）からなる母液の2μLと混合した2μLを用いてシッティングドロップを調製した。トレイを21℃でインキュベートすると、小結晶が1週間後に現れた。結晶は単位セルa＝38.7、b＝65.6、c＝42.2Å、β＝110.8°のP2₁空間群に属し、溶媒含量はほぼ34％であった。1.5Åに対する完全なデータセットを、10％ PEG 200を寒冷保護剤として添加後に100Kへフラッシュ冷却した単結晶について採取することができた（表2参照）。回折像を分析し、データをCrystal Clearを用いて求めた。

結晶構造分析により示されるように、AMDaseの活性部位に結合するリン酸アニオンは、リン酸バッファーを溶出バッファーとして用いたFPLC精製プロセスに由来する。

2つの同形リード塩化物誘導体に対する重原子部位の位置を、差パターソン関数の手作業解析により見出した。位置する部位を用いて解析し実験MIRASフェーズを作製し、次いでArp/Warpを用いて部分AMDaseモデルを自動構築した。得られるモデルを完成し、Coot および Refmac 5を用いて仕上げた。

表2：B. bronchisepticus由来のAMDaseの結晶学データ

b)AMDase構造の決定
AMDase構造を、異常分散を考慮した多重同形置換法（MIRAS）を用いて2つのリード塩化物誘導体について、1.45Åの名目分解能へ分解した。構造は、触媒機能における見掛けの相違にも関わらず、Asp/Glu ラセマーゼ^10,12の結晶構造については全体的類似性を示す。結晶は比較的小さいが、溶媒含量（ほぼ22％）が異常に低いので回折は非常に強かった。構造は明らかにぴったりと折り畳まれた単量体であり、驚くべきことに、βシート末端間の溶媒が進入しうるチャネルの中心において、活性部位Cys188近くに結合した単一リン酸分子を保持した（図4(a)）。このリン酸は古典的オキシアニオンホール（oxy-anion hole）配置が結合した4個のうちの2個の酸素をもつ提示したエノラート中間体のカルボン酸基をおそらく模倣する（図4(b)）。単一の単離されたオキシアニオンホールは多くのタンパク質構造に記載されている（Robertus, J. D., Kraut, J., Alden, R. A. & Birktoft, J. J. Subtilisin； a stereochemical mechanism involving transition-state stabilization. Biochemistry 11, 4293-4303 (1972)）。しかし、高エネルギーのエン二酸（enediolate）型中間体を安定化すると予測されるジオキシアニオンホールの形でのこれらの2つのホールの存在は、今迄記載されていない。

O₁はTyr126の側鎖、ならびにSer76のアミド骨格およびヒドロキシル側鎖の両方と結合し、他方、O₂はThr75のヒドロキシルおよびアミド骨格の両方に加えて、Gly189のアミド骨格と結合している。水素結合パターンだけからは、O原子のいずれかまたは両方が脱プロトンされているかどうかを確立することはできない。さらにリン酸O₃はCys188側鎖と水素結合している。しかし、非常に小さいさらなる直接接触がリン酸分子とAMDaseの残りの残基との間に作られている。

この酵素の真の生物学的基質は知られてないものの、プロキラルな2-メチル-2-フェニルマロネート2がモデル基質として広く使われている。最初に、それ故に、この基質の脱炭酸から誘導される提示したエノラート中間体をその構造の活性部位中にモデル化した（図5）。モデルは、エノラートのカルボン酸基をオキシアニオンホール中に配置するために、元来のリン酸基のO₁-P-O₂原子の配位結合を利用する。元来の構造においては、活性部位空洞体積は性質が主に疎水性でありかつO₁-P-O₂原子上に広がっている。O₁基上に直接利用できる比較的小さい空間が存在する一方、対照的に、溶媒中に広がる大きい空洞が直接O₂上で利用しうる。大きい空洞はまた、芳香族基と結合するのに理想的な形状であり、Gly189-Gly190アミド結合からほぼ8Å離れて位置するPro14側鎖をもち、その間に平滑な芳香族系の理想的なVDWスタッキングを可能にしている。利用しうる活性部位体積から考えて、この酵素は2-ナフチル置換基を含む比較的バルキーなオルト-、メタ-およびパラ基と適応することができると思われ、この酵素の従来確認されている基質特異性^6,13と一致する。O₁上に利用しうる小さい空間しか存在しないという事実は明らかにより小さいメチル置換基とうまく適応すると思われることを示す。この方式（図5）で結合される、提示した中間体のモデルは、Cys188チオールをエノラートのsi-面と近く接触して位置し、これは、R-立体配置の2-フェニルプロピオン酸生成物に導くその後のプロトン化ステップと一致している。

実施例３：活性部位修飾
活性部位にドッキングした提示エノラート中間体について結晶構造をさらに分析すると、アミノ酸残基Leu40、Val43、Val156、Tyr48およびMet159（失われるカルボン酸の反対側に位置する）がメチル置換基と適応しうる小さい疎水性結合ポケットを作ることを明らかにした（図5）。

従って、3つの単一突然変異体Leu40Ala、Val43AlaおよびVal156Alaを部位特異的突然変異誘発により作製した。

次のプライマー（フォワードおよびリバース）をそれぞれの部位特異的突然変異誘発に用いた（SigmaAldrichより入手）。

L40A_F GAGCGGCCTGGGCGCGGGTAGCGTTAC （配列番号17）
L40A_R GTAACGCTACCCGCGCCCAGGCCGCTC （配列番号18）
V43A_F CCTGGGTAGCGCAACCCCGGAAGGC （配列番号19）
V43A_R GCCTTCCGGGGTTGCGCTACCCAGG （配列番号20）
V156A_F GCATTACCGGCGCGGAAGCGATGGC （配列番号21）
V156A_R GCCATCGCTTCCGCGCCGGTAATGC （配列番号22）
本発明の突然変異体の調製を、1つの特定のAMDase（BAA02419.1）の前記3つの特定の単一突然変異体について例示したが、当業者はアミノ酸配列の任意の位置で同一方法の突然変異を導入して、本発明の酵素の活性プロファイルを修飾することができる。

選択した部位特異的突然変異誘発プライマー：
Pro14Ala_F CATTGGCATGATTGTGGCGCCGGCAGCGGGTC (配列番号23)
Pro14Ala_R GACCCGCTGCCGGCGCCACAATCATGCCAATG (配列番号24)
P14G_F CATTGGCATGATTGTGGGTCCGGCAGCGGGTCTG (配列番号25)
P14G_R CAGACCCGCTGCCGGACCCACAATCATGCCAATG (配列番号26)
G189A_F CTGCTGTCTTGCGCGGGTCTGCTGACC (配列番号27)
G189A_R GGTCAGCAGACCCGCGCAAGACAGCAG (配列番号28)
G190A_F CTGCTGTCTTGCGGCGCGCTGCTGACCCTGGATG (配列番号29)
G190A_R CATCCAGGGTCAGCAGCGCGCCGCAAGACAGCAG (配列番号30)
G189A+G190A_F CATTCTGCTGTCTTGCGCGGCGCTGCTGACCCTGGATG (配列番号31)
G189A+G190A_R CATCCAGGGTCAGCAGCGCCGCGCAAGACAGCAGAATG (配列番号32)
選択した部位特異的飽和突然変異誘発 プライマー：
VAL13+PRO14(SAT)_F CCCCGACCATTGGCATGATTNDTNDTCCGGCAGCGGGTCTGGTTC (配列番号33)
VAL13+PRO14(SAT)_R GAACCAGACCCGCTGCCGGAHNAHNAATCATGCCAATGGTCGGGG (配列番号34)
PRO14+PRO15(SAT)_F CGACCATTGGCATGATTGTGNDTNDTGCAGCGGGTCTGGTTCCGG (配列番号35)
PRO14+PRO15(SAT)_R CCGGAACCAGACCCGCTGCAHNAHNCACAATCATGCCAATGGTCG (配列番号36)
突然変異体の調製を上記の通り実施した。

実施例４：基質配向と脱炭酸の機構
疎水性相互作用が脱炭酸で重要である可能性をさらに探求するために、活性部位における基質のありそうな配向を確立する必要があった。これを行うために、¹⁸O標識実験を行って反応の立体化学的コースを確立し、そして2-メチル-2-フェニルマロネート2基質の2つのプロキラルカルボキシレート基のどちらが脱炭酸中に失われるか、およびどちらの1つがオキシアニオンホールと結合するかを同定した（図8）。従って、ブタ肝臓エステラーゼ（PLE）を用いて2-メチル-2-フェニルマロネートジエチルエステルのエナンチオ選択的加水分解を触媒し、(R)-モノエステル6を98％ e.e.で得て、これは文献と一致した¹⁴。これを次いでH₂ ¹⁸O中のNa¹⁸OHで加水分解し、プロ-Rカルボキシレート7中に¹⁸O標識をもつ2-メチル-2-フェニルマロン酸を得た。同様に、ジエステル5を最初に98％H₂ ¹⁸OのPLEで加水分解して8を得て、次いで無標識NaOHで鹸化し、プロ-Sカルボキシレート9中に¹⁸O標識をもつ2-メチル-2-フェニルマロン酸に導いた。キラル¹⁸O標識したマロネート7および9を別々にAMDaseとインキュベートした。脱炭酸の生成物を次いでTMS-ジアゾメタンを用いてメチル化し、GC-MSにより分析した。これから、(R)-マロネート7（経路A）から得られる生成物（2-フェニルプロパン酸塩メチルエステル）は¹⁸O標識（m/z164）を失う一方、(S)-マロネート9（経路B）からの生成物は¹⁸O標識（m/z166）を保持することが明らかになった。これは、脱炭酸が立体配置の全逆位でプロ-Rカルボキシレートを失うことを介して起こることを立証する¹⁵。

確立された反応の立体化学コースによって、AMDase構造の活性部位に基質2-メチル-2-フェニルマロネートを配置することは可能である（図6）。オキシアニオンホールにより決定されるプロ-Sカルボキシレートおよび溶媒に曝されたポケットに配置されるフェニル置換基によって、プロ-SカルボキシレートはCys188残基に対する活性部位の反対の側を占めかつLeu40、Val43、Val156、Tyr48疎水性ポケットと実にぴったりと結合していることは明らかである（図7）。実際、このモデルからLeu40Alaの突然変異が、プロ-Rカルボキシレートと結合しかつ安定化して脱炭酸を遅らせるのに十分な空間を作る役割を果たしうると結論することが可能である。Leu40が脱炭酸酵素活性にとって必須である一方、Val43、Val156は明らかにタンパク質の正しいフォールディングに必要であるという事実は、酵素が正しい機能的コンフォメーションを採用するために果たすこれらの残基の重要性を示している。さらに、これらの知見は、マロネート基質のプロ-Rカルボキシレートの疎水性不安定化が脱炭酸の推進力であり、これがオキシアニオンホールにより安定化したエノラート中間体のプロ-Sカルボキシレート中に電子密度を非局在化させることを示唆する（図1(b)）。従って、酵素は、補因子なしにまたは電子吸引チオエステルのような活性化前に、単にマロネート基質を配向することによって1つのカルボキシル基を水素結合の広汎なネットワークにより安定化する一方、他のカルボキシレートからかかる安定化相互作用を取り除いて、効率的な脱炭酸を実施することができる。

実施例５：他のAMDase関係酵素の同定と触媒特性
AMDaseの生体触媒における応用は非常に有望であるにも関わらず、今までかかる酵素の1つだけが単離され特徴づけられただけである。しかし、タンパク質データベースを検索すると、B. bronchiseptica AMDaseと配列類似性を共有する多数のタンパク質が存在し、そのほとんどは機能が未知であることを示す。AMDaseと中〜高度の類似性を示し（図3(a)、(b)）かつシステインをB. bronchiseptica 酵素のCys188と同じ相対位置に含有する4つのタンパク質配列を選択して研究した（表3）。

表3 アリールマロン酸脱炭酸酵素活性を研究するために選択した酵素およびESI-MSにより決定したその分子量

従ってこれらのタンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌について最適化したコドンを用いて合成した。その合成遺伝子を大腸菌にクローニングして過剰発現させ、His₆-融合タンパク質を先に記載した通り精製した。SDS-PAGEはその全てのタンパク質が95％を超える純度であることを立証しかつ全てのタンパク質のESI質量分析は計算値と一致した（表3）。以上に加えて、公知のAquifex pyrophilus由来のグルタミン酸ラセマーゼを過剰産生させて精製した。このグルタミン酸ラセマーゼの配列はB. bronchiseptica由来のAMDaseの配列と少しの類似性しかなかった。しかし、その構造¹⁰、および2つのシステインによる中間体エノラートの形成に基づいて一般的な酸塩基触媒で果たす機構は十分確立されている^10,16。これらの事実から、この酵素を生来のラセマーゼが乱雑な脱炭酸酵素活性も示しうるかを確立するために研究すべき興味深い候補として選んだ。

新しい酵素群の活性を最初、BTBおよび基質としてのフェニルマロネートと共にプレート上にてin vivoで測定した（図9および10を参照）。驚くべきことに、全ての形質転換したコロニーはインキュベーションの期間を延長した後、青色になる一方、遺伝子を挿入してない形質転換体は色変化を生じなかった。これは、全ての酵素が脱炭酸反応をある程度触媒することができることを示唆する。次いで、精製した酵素の見掛けの反応速度定数を確立した（表１）。注目すべきことに、B. bronchiseptica AMDaseと最高の類似性を示すMesorhizobium sp. BNC1由来の酵素はフェニルマロネート1と2-メチル-2-フェニルマロネート2の両方で非常に効率的な脱炭酸酵素活性を示した。Bordetella bronchiseptica RB50由来の酵素はフェニルマロネートに中度の活性を示す一方、Pyrococcus horikoshii OT3およびAlkaliphilus metalliredigenes QYMF由来の酵素はフェニルマロネートに非常に低いレベルの活性しか示さず、これは、これらの酵素を持つ形質転換体では遅い発色しか示さなかったin vivoアッセイと一致する。興味深いことに、公知のAquifex pyrophilus由来のグルタミン酸ラセマーゼは、たとえ生来のグルタミン酸ラセマーゼ活性より196倍低い活性でも、フェニルマロネートの脱炭酸を触媒することができる。これらの結果はタンパク質配列アラインメントを通して理由づけることが可能である（図3(a)(b)）。全ての酵素はオキシアニオンホールを持つが、ただB. bronchisepticaとMesorhizobium sp.由来の酵素は推定疎水性カルボキシレート結合ポケットを有し、これは脱炭酸で失われるCO₂基を不安定化するために必要である。これから得られる結論は、1つのカルボキシレートのオキシアニオンホール中へのぴったりした結合は脱炭酸にとって十分であるが、効率的な脱炭酸のためには、失われるカルボン酸基を酵素活性部位との疎水性接触を介して不安定化しなければならないことである。これらの結果は、アリールマロン酸の脱炭酸がいくつもの異なる酵素により達成できることを示し、そしてこれは基質特異性および生体触媒活性の改善された新しい脱炭酸酵素を遺伝子操作で作るためのいくつもの可能な出発点を提供する。

実施例６：Mesorhizobium sp. BNC1由来のAMDaseの構造と機構
新しい酵素のプールから、Mesorhizobium sp. BNC1由来の脱炭酸酵素だけが2-メチル-2-フェニルマロネート2の脱炭酸に長けている。この場合、2-メチル-2-フェニルマロネート脱炭酸後に得られる2-フェニルプロピオネート生成物はBordetella bronchiseptica由来のAMDaseから得た脱炭酸生成物と同じR立体配置（ee＞99％）を持つことを示した。さらに(R)-および(S)-マロネート7および9による¹⁸O標識研究も、Mesorhizobium sp. BNC1 AMDaseがB. bronchiseptica酵素と同じ立体化学で作用し、立体配置の全逆位のプロ-Rカルボキシレートを失うことを示す。B. bronchiseptica AMDaseに対する見掛けの機構的および配列類似性が得られたので、基質2-メチル-2-フェニルマロネート2と結合したMesorhizobium sp. BNC1 AMDase活性部位のモデルを作製することが可能である（図6（b)）。このモデルは、プロ-Sカルボキシレート基と適合するオキシアニオンホールおよびプロ-Rカルボキシレートの不安定化を果たす保存された疎水性ポケットをもつ非常に類似した活性部位構造を示す。さらに溶媒進入可能なポケットが存在し、基質のフェニル基と理想的に適合しうる。総合すると、これは、この酵素がB. bronchiseptica AMDaseと類似した機構および構造を持つことを立証する。新しい脱炭酸酵素の設計のための価値ある情報を提供するだけでなく、これらの観察は、これらの全く異なる生物が一次または二次代謝において明らかな機能をもたない類似の酵素を何故持つのかといういくつかの興味深い疑問を提起する。明らかにこのクラスの酵素が自然においてどういう生理学的役割を果たしうるかは、今後解明されるべき課題として残る。

実施例７：色々なアルケニル置換された式Iの基質に対するB. bronchiseptica KU 1201およびMesorhizobium sp BNC1 AMDasesの活性
BTB活性アッセイを先に記載した通り実施した。式I［式中、R²はメチルであり、R¹はフェニル、エテニル、プロペン-1-イル、ブテン-1-イルまたは2-メチル-プロペン-1-イルである］の化合物を基質として試験した。結果を次表4に総括した。

表 4：30℃にてBTBアッセイにより測定した式Iの色々な化合物の反応速度定数

データは、試験したアルケニル置換された非芳香族化合物が前記2種の異なるAMDase酵素によりそれぞれ脱炭酸されることを示す。非芳香族残基R¹については最速の反応がR²＝エテニルについて観察された。

実施例８：色々なアルケニル置換された式Iの基質について、B. bronchiseptica KU 1201およびMesorhizobium sp BNC1 AMDaseにより形成された一酸の光学純度および絶対的立体配置の決定
色々な非芳香族基質をBordetella bronchiseptica KU1201およびMesorhizobium sp. BNC1由来のAMDasesにより、次のスキーム：

［式中、R³=H、CH₃；Me＝CH₃；R⁴＝H、CH₃CH₂］
に示した通り脱炭酸した。

前記酵素反応の条件は、アリールマロン酸について記載した条件（上記参照）と同じで反応時間がそれより長いだけである。通常、24時間後に全ての基質は転化された。

前記不飽和脂肪族マロネートの反応は完了まで進む（＞99％の転化）。その生成物は、酵素反応の終結後、酸性水層からジエチルエーテルで抽出することによって純粋な形で（NMRにより測定して）回収することができる。通常、さらなる精製ステップは必要でない。

反応を200mg規模で実施し、純粋な回収生成物の観察収率はほぼ90〜95％であった。

反応生成物を分析するために、得た一酸をジアゾメタンによって対応するメチルエステルに誘導体化した。次いで前記メチルエステルのee値を、ガスクロマトグラフィを用いてキラルカラムVarian Chirasil-Dex CB（25m x 250 μm x 0.26μm）に次の温度条件下で適用して定量した：50℃にて30分間保ち、次いで勾配10℃/minで200℃に到達し、次いで200℃にて5分間保つ。

保持時間は次の値であった：
メチル 2-メチルブタ-3-エノアート：12.286分（エナンチオマー(R)）および12.350分(S)；
メチル (E)-2-メチルペンタ-3-エノアート：24.984分(S)および27.823分(R)；
メチル (E)-2-メチルヘキサ-3-エノアート：34.324分(S)および34.885分(R)；
メチル 2,4-ジメチルペンタ-3-エノアート：33.679分(R)および34.254分(S)。

一酸を、Bordetella bronchiseptica KU1201 および Mesorhizobium sp. BNC1由来の2つのAMDase酵素のそれぞれからee＞99％で得た。

得られた一酸の絶対立体配置は(R)であり、アリールマロン酸と同じである。

絶対立体配置は測定した旋光能を対応する文献データと比較して決定した。

対応する非芳香族のHO-置換された基質（この場合、Meがヒドロキシにより置換されている）を脱炭酸しならびに比色スクリーニング法によりアッセイした（データは示してない）。

本発明の総括
Bordetella bronchiseptica由来の補因子非依存性アリールマロン酸脱炭酸酵素（AMDase）の最初のX線結晶構造を活性部位にリン酸が結合した姿で提示した。この結晶構造は、基質カルボキシレートの1つと結合しかつ推定エノラート中間体形成の安定化に必要であるオキシアニオンホールの存在を表す。さらに、溶媒進入可能な空洞は典型的な基質である大きいアリール置換基に適応できることが明らかである一方、ぴったりした疎水性ポケットはさらなる脂肪族マロネート置換基のサイズを制限する。¹⁸O標識研究を利用して、モデル基質2-メチル-2-フェニルマロネートの脱炭酸は立体化学の逆位およびプロ-Rカルボキシレートを失うことにより起こることを確立することができた。この結果は、活性部位と結合した基質のモデルの作製を可能にする。このモデルは、脱炭酸中に失われる基質のプロ-Rカルボキシレートは疎水性ポケットにぴったりと結合し、これがカルボキシレート上の負電荷を不安定化し、補因子またはアシル酵素中間体の非存在での脱炭酸に必要な推進力を提供すると推論される。この疎水性ポケットの構造的および機構的重要性を、ミスフォールディングまたは活性の完全な喪失をもたらす疎水性残基のAlaへの部位特異的変異誘発により例示した。脱炭酸の後、オキシアニオンホールにより安定化されたエノラートが得られ、これが、次いで活性部位Cys188残基によりsi-面からプロトン化されて(2R)-フェニルプロピオン酸を生じる。

これに加えて、B. bronchiseptica AMDaseに対して類似性を示す4つの新しい酵素がアリールマロン酸基質の脱炭酸を触媒することが示された。Mesorhizobium sp. BNC1由来のこれらの酵素の1つは、元来のB. bronchiseptica AMDaseに類似した基質特異性、触媒効率および立体化学を持つことが見出された。さらに、2つの酵素の間の配列類似性からMesorhizobium由来のAMDaseの構造モデルの作製が可能になり、このモデルは2つのAMDaseは共通の機構を共有するという仮説を支持した。さらに、類似の触媒機構を持つと予測されているAquifex pyrophilus由来の公知のグルタミン酸ラセマーゼも、AMDaseと少ししか配列類似性を示さないにも関わらず、乱雑なアリールマロン酸脱炭酸酵素活性を持つことを示した。

これらを組合わせた結果は全体として、合理的な変異誘発または方向性をもつ進化のいずれかにより新しい脱炭酸酵素を遺伝子操作で作製するために必要な主要構造および機構の洞察を与える。前記技法は、例えば、次の文献に開示されている：
1） Roberto A Chica, Nicolas Doucet and Joelle N Pelletier , Semi-rational approaches to engineering enzyme activity: combining the benefits of directed evolution および rational design, Current Opinion in Biotechnology, 16, 4, 2005, 378-384、
2） Enzyme functionality: Design, engineering, and screening edited by Allan Svendsen, Marcel Dekker, Inc., New York、Basel 2003、
3） Paul A. Dalby Engineering Enzymes for Biocatalysis Recent Patents on Biotechnology 2007, 1, 1-9。

このことは重要な改善であって、AMDaseが与える高い立体選択性は安価に入手しうるマロン酸前駆体から高価なホモキラルカルボン酸の調製を可能にする。

本明細書に引用した文書は本明細書に参照により組み入れられる。

参照文献
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次の例は、単に、本発明の説明を果たすものである。当業者には明らかである数多くの可能な変法も本発明の範囲に包含される。
本発明の様々な態様を以下にまとめて示す。
１．式I：
HOOC-C(R¹)(R²)-COOH （I）
［式中、残基R¹は任意に1以上の環状置換基を保持する直鎖または分枝鎖のモノまたはポリ不飽和低級アルケニル基を表すか；または残基R¹は単環もしくは二環の、任意に置換された、飽和またはモノまたはポリ不飽和の環を表し、そして
残基R²はH、OH、SH、NH₂、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル低級アルキルを表わす］
の化合物またはその塩形を生体触媒により脱炭酸する方法であって、
a)式Iの少なくとも1つの化合物を
(i)脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2（残基1〜240）のBordetella bronchisepticaタンパク質と100％以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質または
(ii)脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号12（残基1〜254）のAquifex pyrophilusタンパク質と100％以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
と接触させるステップ；および
b)任意に式Iの化合物の少なくとも1つの脱炭酸生成物を単離するステップ
を含むものである前記方法。
２．脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と100％以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質は基質ポケットを有し、前記ポケットは式Iの基質分子を保持する能力を有しかつ機能的配置で次の構造エレメント：
a)システインを含有する触媒部位であって、そのシステイン残基は特に脱炭酸される基質のエノラート中間体へプロトンを伝達することにより基質と相互作用することができる前記触媒部位、および
b)基質の切り離すべきでないカルボン酸基と相互作用する複数の極性アミノ酸側鎖を含むオキシアニオンホール
を含むものである、上記１に記載の方法。
３．酵素は次の構造エレメント：
a)次の配列パターン：
「CSS」 (S/L)C(G/T)(G/N) （配列番号13）
を示す配列領域により形成されるシステインを含有する触媒部位「CSS」、および
b）次の2つの配列パターン：
「OAH1S」 (M/G)(G/C)TS(L/G) （配列番号14）
「OAH2S」 T(A/P)Y(I/R)(D/Q) （配列番号15）
を示す2つの配列領域のアミノ酸残基で形成されるオキシアニオンホールを含む基質ポケットを有するか、
または、前記酵素はなお式(I)の少なくとも1つの基質を保持する能力を有する突然変異した基質ポケットを有する、上記２に記載の方法。
４．前記構造エレメントが次の系列順（N→C）：
OAH1S - OAH2S - CSS
でアミノ酸鎖に配置され、ここで前記構造エレメントは、お互いとは独立して1以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を介して、一緒に連結されている、上記３に記載の方法。
５．脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が
a)配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質；
b)配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshiiに由来するタンパク質；
c)配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質；
d)配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAlkaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質；ならびに
e)アリールマロン酸またはマロン酸脱炭酸酵素活性を有しかつa)、b)、c)またはd)の配列の1つと100％未満の配列同一性を有するタンパク質
からなる群より選択される、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６．脱炭酸反応が立体選択的なモノ脱炭酸である、上記１〜５のいずれかに記載の方法。
７．式II：
HC(R¹)(R²)-COOH （II）
［式中、残基R¹およびR²は上記１に定義した通りである］
の光学的に純粋な化合物またはその塩形を得る、上記６に記載の方法。
８．脱炭酸反応を、式Iの化合物の存在のもとで、単離または精製した（任意に固定した）形の前記脱炭酸酵素を用いて、または前記脱炭酸酵素活性を発現する微生物を培養することによって実施する、上記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．式Iの化合物［式中、残基R¹は単環もしくは二環の任意に置換された環により、任意に置換された直鎖または分枝鎖のモノ不飽和低級アルケニル基を表しかつ残基R²は低級アルキル基である］またはその塩形を脱炭酸する、上記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．R¹は単環もしくは二環の、任意に置換された環により、任意に置換された直鎖C₁〜C₆-アルケン-1-イル基を表しかつ残基R²はC₁〜C₆-アルキル基である、上記９に記載の方法。
１１．R¹はエテニル、プロペン-1-イル、ブテン-1-イルを表す、上記１０に記載の方法。
１２．脱炭酸酵素活性を有する前記タンパク質は先に定義したMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質およびBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質からなる群より選択される、上記９〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と99％未満の配列同一性を有するタンパク質。
１４．a）配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質
b）配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3に由来するタンパク質
c）配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50に由来するタンパク質
d）配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質 および
e）配列番号12のアミノ酸残基2〜256を含みかつAquifex pyrophilusに由来するタンパク質
から選択される、脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
１５．上記１３または１４に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の突然変異体であって、対応する親タンパク質と100％未満の配列同一性を有する突然変異体。
１６．上記２〜４のいずれかに定義した構造エレメントをなお含む、上記１５に記載の突然変異体。
１７．上記１３〜１６のいずれかの脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸。
１８．少なくとも1つの調節核酸配列と機能しうる形で連結された、上記１７の核酸を含む発現カセット。
１９．少なくとも1つの上記１８の発現カセットまたは上記１７の核酸を含む組換え発現ベクター。
２０．少なくとも1つの上記１９の発現ベクターを保持する組換え微生物。
２１．上記１３〜１６のいずれかに定義した脱炭酸酵素活性を有する少なくとも1つのタンパク質または上記２０の組換え微生物を任意に固定した形で含むものであるバイオリアクター。
２２．脱炭酸酵素活性を有する酵素を調製する方法であって、上記２０に定義した組換え微生物を培養するステップおよび任意に脱炭酸酵素活性を有する前記酵素を培養から単離するステップを含むものである、上記方法。
２３．脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の結晶形。
２４．脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が上記１３〜１６のいずれかに定義したものである、上記２３に記載の結晶形。
２５．脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質（Blastデータベース登録番号BAA02419.1）である、上記２４に記載の結晶形。
２６．定数a＝38.7、b＝65.6、c＝42.2Å、およびβ＝110.8°を有する単位セルをもつP2₁空間群に属する、上記２５に記載の結晶形。
２７．前記タンパク質、8.3〜8.7のpHを有する結晶化剤およびポリエチレングリコールを含有する溶液を加えるステップを含むものである、上記２３〜２６のいずれかに定義したタンパク質の結晶形を調製する方法。
２８．上記１に定義した脱炭酸酵素活性を有する候補酵素をスクリーニングする方法であって、上記１３〜１６の1項に定義した酵素に特徴的な配列モチーフ（パターン）を同定するステップおよびアミノ酸配列データベースを前記モチーフと部分的または完全にマッチするデータベース登録配列についてスクリーニングするステップを含むものである、上記方法。
２９．前記配列モチーフが上記２〜４のいずれかに定義されている、上記２８に記載のスクリーニング方法。
３０．配列モチーフが上記２３〜２６のいずれかに定義したタンパク質の結晶の結晶構造から誘導される、上記２８または２９に記載のスクリーニング方法。
３１．候補酵素のコードヌクレオチド配列を得るステップ、組換え微生物において前記配列を発現させるステップおよび前記発現産物を単離するステップを含むものである、上記２８〜３０のいずれかに記載の方法によりスクリーニングした脱炭酸酵素活性を有する候補酵素を調製する方法。
３２．上記２５により調製した発現産物の、上記１に定義した式Iの化合物を脱炭酸する脱炭酸反応における使用。

Claims (32)

1. 式I：
   HOOC-C(R¹)(R²)-COOH （I）
   ［式中、残基R¹は任意に1以上の環状置換基を保持する直鎖または分枝鎖のモノまたはポリ不飽和低級アルケニル基を表すか；または残基R¹は単環もしくは二環の、任意に置換された、飽和またはモノまたはポリ不飽和の環を表し、そして
   残基R²はH、OH、SH、NH₂、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル低級アルキルを表わす］
   の化合物またはその塩形を生体触媒により脱炭酸する方法であって、
   a)式Iの少なくとも1つの化合物を
   (i)脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2（残基1〜240）のBordetella bronchisepticaタンパク質と100％以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質または
   (ii)脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号12（残基1〜254）のAquifex pyrophilusタンパク質と100％以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
   と接触させるステップ；および
   b)任意に式Iの化合物の少なくとも1つの脱炭酸生成物を単離するステップ
   を含むものである前記方法。
2. 脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と100％以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質は基質ポケットを有し、前記ポケットは式Iの基質分子を保持する能力を有しかつ機能的配置で次の構造エレメント：
   a)システインを含有する触媒部位であって、そのシステイン残基は特に脱炭酸される基質のエノラート中間体へプロトンを伝達することにより基質と相互作用することができる前記触媒部位、および
   b)基質の切り離すべきでないカルボン酸基と相互作用する複数の極性アミノ酸側鎖を含むオキシアニオンホール
   を含むものである、請求項１に記載の方法。
3. 酵素は次の構造エレメント：
   a)次の配列パターン：
   「CSS」 (S/L)C(G/T)(G/N) （配列番号13）
   を示す配列領域により形成されるシステインを含有する触媒部位「CSS」、および
   b）次の2つの配列パターン：
   「OAH1S」 (M/G)(G/C)TS(L/G) （配列番号14）
   「OAH2S」 T(A/P)Y(I/R)(D/Q) （配列番号15）
   を示す2つの配列領域のアミノ酸残基で形成されるオキシアニオンホールを含む基質ポケットを有するか、
   または、前記酵素はなお式(I)の少なくとも1つの基質を保持する能力を有する突然変異した基質ポケットを有する、請求項２に記載の方法。
4. 前記構造エレメントが次の系列順（N→C）：
   OAH1S - OAH2S - CSS
   でアミノ酸鎖に配置され、ここで前記構造エレメントは、お互いとは独立して1以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を介して、一緒に連結されている、請求項３に記載の方法。
5. 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が
   a)配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質；
   b)配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshiiに由来するタンパク質；
   c)配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質；
   d)配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAlkaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質；ならびに
   e)アリールマロン酸またはマロン酸脱炭酸酵素活性を有しかつa)、b)、c)またはd)の配列の1つと100％未満の配列同一性を有するタンパク質
   からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 脱炭酸反応が立体選択的なモノ脱炭酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 式II：
   HC(R¹)(R²)-COOH （II）
   ［式中、残基R¹およびR²は請求項１に定義した通りである］
   の光学的に純粋な化合物またはその塩形を得る、請求項６に記載の方法。
8. 脱炭酸反応を、式Iの化合物の存在のもとで、単離または精製した（任意に固定した）形の前記脱炭酸酵素を用いて、または前記脱炭酸酵素活性を発現する微生物を培養することによって実施する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 式Iの化合物［式中、残基R¹は単環もしくは二環の任意に置換された環により、任意に置換された直鎖または分枝鎖のモノ不飽和低級アルケニル基を表しかつ残基R²は低級アルキル基である］またはその塩形を脱炭酸する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. R¹は単環もしくは二環の、任意に置換された環により、任意に置換された直鎖C₁〜C₆-アルケン-1-イル基を表しかつ残基R²はC₁〜C₆-アルキル基である、請求項９に記載の方法。
11. R¹はエテニル、プロペン-1-イル、ブテン-1-イルを表す、請求項１０に記載の方法。
12. 脱炭酸酵素活性を有する前記タンパク質は先に定義したMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質およびBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質からなる群より選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と99％未満の配列同一性を有するタンパク質。
14. a）配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質
    b）配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3に由来するタンパク質
    c）配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50に由来するタンパク質
    d）配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質 および
    e）配列番号12のアミノ酸残基2〜256を含みかつAquifex pyrophilusに由来するタンパク質
    から選択される、脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
15. 請求項１３または１４に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の突然変異体であって、対応する親タンパク質と100％未満の配列同一性を有する突然変異体。
16. 請求項２〜４のいずれか1項に定義した構造エレメントをなお含む、請求項１５に記載の突然変異体。
17. 請求項１３〜１６のいずれか1項の脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸。
18. 少なくとも1つの調節核酸配列と機能しうる形で連結された、請求項１７の核酸を含む発現カセット。
19. 少なくとも1つの請求項１８の発現カセットまたは請求項１７の核酸を含む組換え発現ベクター。
20. 少なくとも1つの請求項１９の発現ベクターを保持する組換え微生物。
21. 請求項１３〜１６のいずれか1項に定義した脱炭酸酵素活性を有する少なくとも1つのタンパク質または請求項２０の組換え微生物を任意に固定した形で含むものであるバイオリアクター。
22. 脱炭酸酵素活性を有する酵素を調製する方法であって、請求項２０に定義した組換え微生物を培養するステップおよび任意に脱炭酸酵素活性を有する前記酵素を培養から単離するステップを含むものである、上記方法。
23. 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の結晶形。
24. 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が請求項１３〜１６のいずれか1項に定義したものである、請求項２３に記載の結晶形。
25. 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質（Blastデータベース登録番号BAA02419.1）である、請求項２４に記載の結晶形。
26. 定数a＝38.7、b＝65.6、c＝42.2Å、およびβ＝110.8°を有する単位セルをもつP2₁空間群に属する、請求項２５に記載の結晶形。
27. 前記タンパク質、8.3〜8.7のpHを有する結晶化剤およびポリエチレングリコールを含有する溶液を加えるステップを含むものである、請求項２３〜２６のいずれか1項に定義したタンパク質の結晶形を調製する方法。
28. 請求項１に定義した脱炭酸酵素活性を有する候補酵素をスクリーニングする方法であって、請求項１３〜１６の1項に定義した酵素に特徴的な配列モチーフ（パターン）を同定するステップおよびアミノ酸配列データベースを前記モチーフと部分的または完全にマッチするデータベース登録配列についてスクリーニングするステップを含むものである、上記方法。
29. 前記配列モチーフが請求項２〜４のいずれか１項に定義されている、請求項２８に記載のスクリーニング方法。
30. 配列モチーフが請求項２３〜２６のいずれか1項に定義したタンパク質の結晶の結晶構造から誘導される、請求項２８または２９に記載のスクリーニング方法。
31. 候補酵素のコードヌクレオチド配列を得るステップ、組換え微生物において前記配列を発現させるステップおよび前記発現産物を単離するステップを含むものである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法によりスクリーニングした脱炭酸酵素活性を有する候補酵素を調製する方法。
32. 請求項２５により調製した発現産物の、請求項１に定義した式Iの化合物を脱炭酸する脱炭酸反応における使用。

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