JP2011504734A - 工業用の新しいマロン酸脱炭酸酵素 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
1 好ましい実施形態
本発明の第1の態様は、式I:
HOOC-C(R1)(R2)-COOH (I)
[式中、残基R1は単環もしくは二環の、任意に1重、2重または3重に置換された環であって、例えば、任意に置換された、特に単環の芳香族もしくはヘテロ芳香族の環;または非芳香族の、特に任意に1つもしくは2つの炭素-炭素二重結合をその環内に保持する単環もしくは二環の環である前記環を表し;そして
残基R2はH、OH、SH、NH2、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル-低級アルキル、特にOH、SHまたは低級アルキルを表す]のα置換されたマロン酸化合物またはその塩形を脱炭酸する生体触媒による方法であって;
a)少なくとも式Iの化合物を、任意の立体異性体混合物の形でもしくは光学的に純粋な形で、
(i)マロン酸脱炭酸酵素活性、特にアリールマロン酸脱炭酸酵素活性を有し、かつ配列番号2(残基1〜240)(Blastデータベース登録番号BAA02419.1)のBordetella bronchiseptica菌タンパク質と100%以下または、特に、99%未満、例えば98、97、96または95%未満で、しかし少なくとも25%、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90%配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、または
(ii)マロン酸脱炭酸酵素活性、特にアリールマロン酸脱炭酸酵素活性を有し、かつ
配列番号12(残基1〜254)(Blastデータベース登録番号AAF25672)のAquifex pyrophilus菌タンパク質と100%以下または、特に、99%未満、例えば98、97、96または95%未満で、しかし少なくとも25%、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90%配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質と接触させるステップ、および
b)任意に式Iの化合物の少なくとも1つの脱炭酸生成物、好ましくは反応生成物の1つの特定の立体異性体を単離するステップを含むものである前記方法に関する。
残基R2はH、OH、SH、NH2、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル低級アルキル、特に、OH、SHまたは低級アルキルを表す]の化合物、またはその塩を脱炭酸するための上記タイプの方法を提供する。
HC(R1)(R2)-COOH (II)
[式中、残基R1およびR2は先に定義した通りである]の光学的に純粋な置換された生成物またはその塩形が得られる。
[式中、R3はH、CH3であり、R4はH、CH3CH2であり、MeはCH3であり;ここで、α-二置換されたマロン酸IIIは生体触媒によりモノ脱炭酸されて、高いエナンチオ選択性で、対応するモノカルボン酸IVを形成する]により表すことができる。
a)システインを含有する触媒部位(CS)(システイン残基は基質と相互作用して、特にプロトンを基質に伝達することによりエノラート中間体を形成することができる)、
b)オキシアニオンホール(OAH:oxy-anion hole)(切り離されないように基質のカルボン酸基と相互作用する複数の極性アミノ酸側鎖を含む)、
を含む。
c)環状、好ましくは芳香族またはヘテロ芳香族の、残基R1と相互作用する大結合ポケット(LBP)および
d)残基R2と相互作用する小結合ポケット(SBP)
を含むものである。
OAH1:Thr75、Gly189
OAH2:Ser76、Tyr126
を含む)により形成されることが観察された。
LBP1:Pro14、Pro15、Gly189、Gly190、Met104
LBP2:Val13、Met73、Pro21、Ser212
により特徴付けることができる。
SBP1:Lys40、Val43、Tyr48、Leu77、Val156、Pro14、Gly74
SBP2:Val156、Met159、Val43
により特徴付けることができる。
Pro14、Thr75、Ser76、Tyr126、Cys188
またはこれらの残基の3つまたは4つの組合わせ、例えば:
Thr75、Ser76、Tyr126、Cys188
Pro14、Thr75、Ser76、Cys188
を含む。
a)システインを含有する触媒部位配列「CSS」、すなわち、次の配列パターン:
「CSS」 (S/L)C(G/T)(G/N) (配列番号13)
を示す配列番号1の残基186〜191に対応する配列により形成される配列
および
b)オキシアニオンホールを形成する配列「OAH1S」および「OAH2S」、すなわち、次の2つの配列パターン:
「OAH1S」 (M/G)(G/C)TS(L/G) (配列番号14)
「OAH2S」 T(A/P)Y(I/R)(D/Q) (配列番号15)
(ここでOAH2Sにおける最初のおよび/または最後のアミノ酸残基は無くてもよい)を示す配列番号1の残基73〜77および124〜128にそれぞれ対応する配列。
OAH1S-OAH2S-CSS
で配置し、ここで、前記構造エレメントを、お互いに独立して1以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を介して連結する。
OAHS1-sp1-OAHS2-sp2-CS
で配置してもよく、ここでsp1とsp2は次の近似的配列長さ:
sp1 43〜47アミノ酸
sp2 55〜57アミノ酸
で連結するアミノ酸配列である。
c) 大結合ポケット配列「LBPS」、すなわち、配列番号1の残基12〜17に対応する配列領域により形成され、次の配列パターン:
「LBPS」 IVP(P/S/A)(A/T/S/P)(A/N/G) (配列番号16)
を示す配列と記述することができる。
LBPS-sp3-OAHS1-sp1-OAHS2-sp2-CS
で配置することができ、ここでsp1、sp2およびsp3はアミノ酸配列は次の近似的配列長さ:
sp1 43〜47アミノ酸
sp2 55〜57アミノ酸
sp3 57〜62アミノ酸
で連結するアミノ酸配列である。
a)配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCI(Blastデータベース登録番号EAN08019.1)に由来するタンパク質;
b)配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3(Blastデータベース登録番号BAA30082.1)に由来するタンパク質;
c)配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50(Blast データベース登録番号NP_888076.1)に由来するタンパク質;
d)配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAlkaliphilus metalliredigenes QYMF(Blastデータベース登録番号ZP_00801202.1)に由来するタンパク質;ならびに
e)アリールマロン酸またはマロン酸脱炭酸酵素活性を有しかつa)、b)、c)またはd)の配列の1つと100%未満の配列同一性を有するタンパク質
からなる群より選択される。
a)配列番号4のアミノ酸残基1〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質;
b)配列番号6 のアミノ酸残基1〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3に由来するタンパク質;
c)配列番号8のアミノ酸残基1〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50に由来するタンパク質;
d)配列番号10のアミノ酸残基1〜246を含みかつAklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質;および
e)配列番号12のアミノ酸残基1〜256を含みかつAquifex pyrophilusに由来するタンパク質;
から選択される本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質、ならびに本明細書に定義した脱炭酸酵素活性を有するその突然変異体であって、対応する親タンパク質と、99%未満、例えば98、97、96または95%未満、しかし少なくとも25%の配列同一性、例えば少なくとも30、35、40、45、50、60、70、80または90%の配列同一性、例えば25〜98、30〜97、30〜95、30〜90または30〜80または30〜70%の配列同一性を有する前記突然変異体に関する。
13および14、
13および15、
14および15、
13、14および15、
14、15および189、
14、15および190、
14、15、189および190、
13、14、15および189、
13、14、15および190、
13、14、15、189および190
13、14および191、
13、15および191;
14、15および191、
13、14、15および191、
14、15、189および191
14、15、190および191、
14、15、189、190および191、
13、14、15、189および191、
13、14、15、190および191、
13、14、15、189、190および191など
より得られる突然変異の組合わせを含む複数の突然変異を含むものである。
Val13AlaまたはGly;
Pro14Val、AlaまたはGly;
Pro15His、またはGly;
Gly189AlaまたはDel;
Gly190Ala、SerまたはDel;
Leu191Del
である。
a)Mesorhizobium sp. BNCIに由来する配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含むタンパク質;
b)Pyrcoccus horikoshii OT3に由来する配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含むタンパク質;
c)Bordetella bronchiseptica RB50に由来する配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含むタンパク質;
および
d)Aklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来する配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含むタンパク質;
を定義することができるであろう。
本発明はまた、少なくとも1つの上に定義した発現ベクターを保持する組換え微生物に関する。
「AMDase」(EC 4.1.1.76)はアリールマロン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を意味し、α-アリール-α-メチルマロン酸のようなα-アリールマロン酸のエナンチオ選択的モノ脱炭酸を触媒して光学的に純粋なアリールプロピオン酸を与える。この酵素はビオチンまたはいずれの他の補因子も活性のために必要としない。さらに、脱炭酸はマロニルチオエステル-酵素中間体の形成に関わらない。
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100
[式中、XAおよびXBはそれぞれ、エナンチオマーAまたはBのモル分率を意味する]によって計算される。
「塩形」はアンモニウム塩またはアルカリもしくはアルカリ土類金属塩、例えばNa+、K+またはCa2+塩を意味する。
3.1 本発明によるタンパク質
本発明は具体的に開示した「AMDase活性をもつタンパク質」、または「MDase活性をもつタンパク質」に限定されるものでなく、それらの機能的等価体も包含する。
元来の残基 置換の例
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln;His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn;Gln
Ile Leu;Val
Leu Ile;Val
Lys Arg;Gln;Glu
Met Leu;Ile
Phe Met;Leu;Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp;Phe
Val Ile;Leu
以上の意味での「機能的等価体」はまた、記載したポリペプチドの「前駆体」、ならびにそのポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」である。
本発明はまた、本明細書に定義した酵素をコードする核酸配列に関する。
マルチプルアラインメントパラメーター:
ギャップ・オープニング・ペナルティ 10
ギャップ・エキステンション・ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アラインメント遅れに対する%同一性 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション重み付け 0
ペワイズアラインメントパラメーター:
FASTアルゴリズム オン
K-tupleサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウインドウサイズ 5
最良対角数 5
によって計算することができる。
DNAギャップ・オープニング・ペナルティ 15.0
DNAギャップ・エキステンション・ペナルティ 6.66
DNAマトリックス Identity
タンパク質ギャップ・オープニング・ペナルティ 10.0
タンパク質ギャップ・エキステンション・ペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
によって決定することができる。
本発明はまた、調節核酸配列の遺伝子制御のもとで、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現構築物、ならびにこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むものであるベクターに関する。
状況に応じて、用語「微生物」は出発微生物(野生型)または本発明によって遺伝的に改変した組換え微生物またはそれらの両方を意味する。
本発明はまた、前記タンパク質を発現する微生物を培養しそして所望の産物を培養物から単離することにより、本発明によるタンパク質を生産する方法に関する。
1 一般情報
a)計器と材料
全ての化学品は(特に断らない限り)Sigma-Aldrichから購入した。XhoIおよびNdeI制限酵素はRocheから、T4リガーゼはNew England Biolabsから購入した。1H NMR分析はBruker 200または400 MHz分光計で実施した。ESI-MS分析はポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化源運転を備えたBruker Esquire 3000+イオントラップMSで実施した。ESI-MS分析用のタンパク質サンプルはddH2O中で4時間の透析により脱塩した。
新しいマロン酸脱炭酸酵素を見出すために、Bordetella bronchiseptica由来のAMDaseのタンパク質配列を公的データベースからの公知のタンパク質配列とBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を用いてアラインした。検索の間、次のパラメーターを用いた:データベース-重複のない(nonredundant)タンパク質配列、アルゴリズム-blastp(タンパク質-タンパク質BLAST)。
タンパク質 EAN08019.1(Mesorhizobium sp. BNC1から)、
タンパク質 BAA30082.1(Pyrococcus horikoshii OT3から)、
タンパク質 NP_888076.1(Bordetella bronchiseptica RB50から)および
タンパク質 ZP_00801202.1(Alkaliphilus metalliredigenes QYMFから)。
次の酵素:
Bordetella bronchiseptica由来のAMDase、
タンパク質 EAN08019.1(Mesorhizobium sp. BNC1から)、
タンパク質 BAA30082.1(Pyrococcus horikoshii OT3から)、
タンパク質 NP_888076.1(Bordetella bronchiseptica RB50から)および
タンパク質 ZP_00801202.1(Alkaliphilus metalliredigenes QYMFから)および
グルタミン酸 ラセマーゼ (AAF25672)(Aquifex pyrophilusから)
をコードする遺伝子を、大腸菌における発現について最適化し、合成し、そしてアンピシリン耐性遺伝子を含有するpGA4ベクター(GENEART AG., Germany)中にクローニングした。これらの遺伝子を次いでカナマイシン耐性遺伝子を含有するpET30bベクター(Novagen, Cat.No. 69910-3, EMD Chemicals, Inc., San Diogo, USA)中にXhoIおよびNdeI制限酵素切断部位を利用してサブクローニングした。ライゲーション産物をBL21(DE3)エレクトロコンピテント大腸菌細胞中に形質転換し、これをKan50-LB-寒天プレート上にまいた。プラスミドを次いで細胞から単離し、サブクローニングの成功を配列決定により確認した。このサブクローニングは、大腸菌における標的化酵素の容易な発現と精製(タンパク質は6xHis-タグ付けされた)を可能にした。pET30bベクター中へのサブクローニングの後、全酵素の配列はC末端において次のアミノ酸:Leu-Glu-His-His-His-His-His-Hisだけ延長された。
T7 RNAポリメラーゼプロモーターとカナマイシン耐性遺伝子を含有するAMDaseをコードするプラスミドを、エレクトロコンピテント大腸菌菌株BL21(DE3)中に形質転換した。細菌を最初に培養培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、0.4%グルコース、0.20 x M9バッファー(1リットルについて:KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NaCl 5g、MgSO4(1M) 1ml、1リットルまでのdH2O)、50mg/mLカナマイシン)でほぼ4時間37℃の温度でインキュベートしてOD600=1を達成した。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(1mM、最終濃度)を加えるとタンパク質発現を誘導した。一晩30℃でのインキュベーション後に、細胞をペレット化(4500rpm、15分間、4℃)し、25mM NaCl、2mM EDTA、0.2mM DTTおよびプロテアーゼインヒビター-フェニルメタンスルホニルフルオリド(10μg/mL)を含有する50mM TRISバッファー(pH8)中の卵白リゾチーム(0.1mg/1mLバッファー)を加えた後、室温にて溶解した。溶解後、2%ストレプトマイシン-硫酸塩を加えることにより核酸を沈降させ、次いで遠心分離した(4500rpm、20分間、4℃)。粗AMDaseを含有する上清を一晩、25mM NaClを含有する25mM TRISバッファー(pH 8)に対して透析し(Spectra/Por 2、MWCO:12-14 000)、His6 融合タンパク質を得て、これをFPLCによりGE Healthcare Bio-Science HiTrap Chelating 5mLカラム上で容易に精製した。タンパク質の溶出は、リン酸ナトリウムバッファー(0.02M、pH7.4)、NaCl(0.5M)およびイミダゾール(25、60および250mM)のステップ勾配を用いて達成した。標的タンパク質をイミダゾール濃度250mMで溶出した。この手順で培養250ml当たり15mgまでのタンパク質を得て、典型的な純度はSDS-PAGEにより95%であった。最終タンパク質濃度をBradfordアッセイまたはOD280における分光計読取り値を用いることにより計算した。
部位特異的突然変異誘発を、Pfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)を用いて、Stratagene QuikChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット用の製造業者取扱説明書に従って実施した。PCR機械の条件は次の通りであった:1セグメントサイクル:95℃で2分間;2セグメントサイクル(繰り返し30回):95℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で5.5分間;3セグメントサイクル:4℃で10分間。PCR後、Dpn I制限酵素を加えて非変異プラスミドを消化した。変異DNAを大腸菌BL21(DE3)中に移し、タンパク質を、野生型について先に記載した手順に従い発現させた。本発明の他の脱炭酸酵素の突然変異誘発を類似の方法で実施した。
試験ペトリ皿を次の培地:1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、1%寒天、0.025%ブロモチモールブルー(BTB)を用いて調製した。pHを6.5に調節し、培地をオートクレーブ処理した。培地温度が50〜60℃に達すると、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(1mM、最終濃度)、カナマイシン(40mg/mL、最終濃度)およびフェニルマロン酸(0.36%、最終濃度)を加えた。AMDaseを含有する細菌培養液100μlを試験ペトリ皿にまいた。37℃における2〜3日のインキュベーション後、コロニーおよび周辺領域は緑色〜青色に変色してAMDase活性を示した。
この方法は、脱炭酸反応中に生成する[OH-]の濃度増加に伴う、pH指示薬BTBの黄色から緑色/青色への変化を分光計により620nmで測定することに関わる。色の増加がpHの増加と直線関係にあることを保証するために、pH指示薬のpKa(BTBのpKa=7.3)付近で行わなければならない17。本発明者らは5mM(および/または10mM)MOPSバッファーpH7.2が好適であることを見出した。濃度の高い方のバッファー(10mM)は、バッファー能力が高いため色の変化が遅いので、高濃度の酵素または迅速な反応で優れた結果をもたらす。
反応速度=dA/dt*Q*反応体積
[式中、Q=CMOPS Buffer/CBTB indicator*1/(Δε620nm*l)であり、Δε616nm=15703.79M-1 cm-1であり17,18;CMOPS BufferはMOPSバッファー濃度を、CBTB indicatorはBTB指示薬濃度をそれぞれ表す]
を用いて計算した。
400μlの0.1M TRISバッファーpH8へ100μlの2-メチル-2-フェニルマロン酸の0.5M水溶液(pH8に調節した後)を加えた。次いで、20μlのAMDase溶液(10mg/mL)を加え、反応液を30℃にて8時間攪拌した。生成物を1M HClで酸性化した後、ジエチルエーテルで抽出し、TMS-ジアゾメタンを用いてメチル化した。反応液をGCにより分析し(95%まで転化)、2-フェニルプロパン酸形成をGC-MS、1H NMRにより確認した。両方の酵素の(メチル化後)反応生成物は同じ立体配置(キラルカラムによるGCで同じピーク、ee>99%)を有した。従って、文献7によれば、この生成物の絶対的立体配置はRであった。
フェニルマロネート(1)はSigma-Aldrichから購入した。2-エチル-2-フェニルマロネートはBASF SEから好意的に贈られた。ジエチル 2-メチル-2-フェニルマロネート(2a)はジエチル フェニルマロネートからヨードメタンとの反応で合成した。10g(42.3mmol)のジエチル フェニルマロネートを、1.6g(69.5mmol)金属ナトリウムを60mLの絶対エタノールに溶解して調製したナトリウムエタノラート溶液中で1時間還流下にて攪拌した。次いで6mL(96.4mmol)のMeIを加え、得られる混合物を還流下にてさらに1時間攪拌した。反応後、溶媒を真空化で除去し、残留物をジエチルエーテルに溶解し、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。ジエチルエーテルを蒸発させ、最終生成物(蒼白色の油)を98%収率およびNMR分析により99%純度で得た。
ステップI:10μl(40μmol)のジエチル 2-メチル-2-フェニルマロネート(5)を10μlのDMSOと混合し、5mgのブタ肝臓エステラーゼ(15単位/mg凍結乾燥粉末、Sigma-Aldrich)を含有する500μlのリン酸塩バッファーpH 7(H2 18O実験用:0.5mLバッファーを蒸発乾固し、残留する粉末を0.5mLのH2 18Oに再溶解し、「標識した」バッファーを反応に用いた)中に懸濁化した。次いで反応液を4℃へ冷却し、1M HClでpH 1へ酸性化し、生成物をジエチルエーテルを用いて抽出した。モノエチル 2-メチル-2-フェニルマロネートを1HNMRにより、およびTMS-ジアゾメタンによるメチル化後、GC-MS(同位体分析で)により同定した。モノエチル 2-メチル-2-フェニルマロネートのエナンチオ選択性を、キラルカラムChiracel-OD上のHPLC-分析により確認した。エナンチオマーピークの分離は、0.25mL/minの流量で260nmにて、ヘキサン-イソ-プロパノール-トリフルオロ酢酸(93:7:1.5)の混合物を用いることにより達成した。形成した生成物は文献データによると立体配置Rを有した14。
大腸菌における発現についてコドン最適化した、B. bronchiseptica AMDaseをコードする合成遺伝子をpET30bベクター中にサブクローニングした。大腸菌BL21(DE3)菌株におけるIPTGによる誘導後の発現により、AMDaseをC-末端His6-融合タンパク質として得た。酵素を次いでNi-アフィニティクロマトグラフィにより、95%を超える純度(SDS-PAGEにより確認)に精製し、その分子量をESI-MSにより確認した(m/z測定値=25,799、計算分子量=25,800 Da)。
b)Aquifex pyrophilus由来のグルタミン酸ラセマーゼ(ラセマーゼ活性に対する反応速度定数)10
シッティングドロップ(Sitting Drop)技法によるAMDase結晶化
実施例1によって得たB. bronchisepticus AMDaseを10mg/mLに濃縮し、Tris(0.1M、pH8.5)およびPEG 6000(30%)からなる母液の2μLと混合した2μLを用いてシッティングドロップを調製した。トレイを21℃でインキュベートすると、小結晶が1週間後に現れた。結晶は単位セルa=38.7、b=65.6、c=42.2Å、β=110.8°のP21空間群に属し、溶媒含量はほぼ34%であった。1.5Åに対する完全なデータセットを、10% PEG 200を寒冷保護剤として添加後に100Kへフラッシュ冷却した単結晶について採取することができた(表2参照)。回折像を分析し、データをCrystal Clearを用いて求めた。
AMDase構造を、異常分散を考慮した多重同形置換法(MIRAS)を用いて2つのリード塩化物誘導体について、1.45Åの名目分解能へ分解した。構造は、触媒機能における見掛けの相違にも関わらず、Asp/Glu ラセマーゼ10,12の結晶構造については全体的類似性を示す。結晶は比較的小さいが、溶媒含量(ほぼ22%)が異常に低いので回折は非常に強かった。構造は明らかにぴったりと折り畳まれた単量体であり、驚くべきことに、βシート末端間の溶媒が進入しうるチャネルの中心において、活性部位Cys188近くに結合した単一リン酸分子を保持した(図4(a))。このリン酸は古典的オキシアニオンホール(oxy-anion hole)配置が結合した4個のうちの2個の酸素をもつ提示したエノラート中間体のカルボン酸基をおそらく模倣する(図4(b))。単一の単離されたオキシアニオンホールは多くのタンパク質構造に記載されている(Robertus, J. D., Kraut, J., Alden, R. A. & Birktoft, J. J. Subtilisin; a stereochemical mechanism involving transition-state stabilization. Biochemistry 11, 4293-4303 (1972))。しかし、高エネルギーのエン二酸(enediolate)型中間体を安定化すると予測されるジオキシアニオンホールの形でのこれらの2つのホールの存在は、今迄記載されていない。
活性部位にドッキングした提示エノラート中間体について結晶構造をさらに分析すると、アミノ酸残基Leu40、Val43、Val156、Tyr48およびMet159(失われるカルボン酸の反対側に位置する)がメチル置換基と適応しうる小さい疎水性結合ポケットを作ることを明らかにした(図5)。
L40A_R GTAACGCTACCCGCGCCCAGGCCGCTC (配列番号18)
V43A_F CCTGGGTAGCGCAACCCCGGAAGGC (配列番号19)
V43A_R GCCTTCCGGGGTTGCGCTACCCAGG (配列番号20)
V156A_F GCATTACCGGCGCGGAAGCGATGGC (配列番号21)
V156A_R GCCATCGCTTCCGCGCCGGTAATGC (配列番号22)
本発明の突然変異体の調製を、1つの特定のAMDase(BAA02419.1)の前記3つの特定の単一突然変異体について例示したが、当業者はアミノ酸配列の任意の位置で同一方法の突然変異を導入して、本発明の酵素の活性プロファイルを修飾することができる。
Pro14Ala_F CATTGGCATGATTGTGGCGCCGGCAGCGGGTC (配列番号23)
Pro14Ala_R GACCCGCTGCCGGCGCCACAATCATGCCAATG (配列番号24)
P14G_F CATTGGCATGATTGTGGGTCCGGCAGCGGGTCTG (配列番号25)
P14G_R CAGACCCGCTGCCGGACCCACAATCATGCCAATG (配列番号26)
G189A_F CTGCTGTCTTGCGCGGGTCTGCTGACC (配列番号27)
G189A_R GGTCAGCAGACCCGCGCAAGACAGCAG (配列番号28)
G190A_F CTGCTGTCTTGCGGCGCGCTGCTGACCCTGGATG (配列番号29)
G190A_R CATCCAGGGTCAGCAGCGCGCCGCAAGACAGCAG (配列番号30)
G189A+G190A_F CATTCTGCTGTCTTGCGCGGCGCTGCTGACCCTGGATG (配列番号31)
G189A+G190A_R CATCCAGGGTCAGCAGCGCCGCGCAAGACAGCAGAATG (配列番号32)
選択した部位特異的飽和突然変異誘発 プライマー:
VAL13+PRO14(SAT)_F CCCCGACCATTGGCATGATTNDTNDTCCGGCAGCGGGTCTGGTTC (配列番号33)
VAL13+PRO14(SAT)_R GAACCAGACCCGCTGCCGGAHNAHNAATCATGCCAATGGTCGGGG (配列番号34)
PRO14+PRO15(SAT)_F CGACCATTGGCATGATTGTGNDTNDTGCAGCGGGTCTGGTTCCGG (配列番号35)
PRO14+PRO15(SAT)_R CCGGAACCAGACCCGCTGCAHNAHNCACAATCATGCCAATGGTCG (配列番号36)
突然変異体の調製を上記の通り実施した。
疎水性相互作用が脱炭酸で重要である可能性をさらに探求するために、活性部位における基質のありそうな配向を確立する必要があった。これを行うために、18O標識実験を行って反応の立体化学的コースを確立し、そして2-メチル-2-フェニルマロネート2基質の2つのプロキラルカルボキシレート基のどちらが脱炭酸中に失われるか、およびどちらの1つがオキシアニオンホールと結合するかを同定した(図8)。従って、ブタ肝臓エステラーゼ(PLE)を用いて2-メチル-2-フェニルマロネートジエチルエステルのエナンチオ選択的加水分解を触媒し、(R)-モノエステル6を98% e.e.で得て、これは文献と一致した14。これを次いでH2 18O中のNa18OHで加水分解し、プロ-Rカルボキシレート7中に18O標識をもつ2-メチル-2-フェニルマロン酸を得た。同様に、ジエステル5を最初に98%H2 18OのPLEで加水分解して8を得て、次いで無標識NaOHで鹸化し、プロ-Sカルボキシレート9中に18O標識をもつ2-メチル-2-フェニルマロン酸に導いた。キラル18O標識したマロネート7および9を別々にAMDaseとインキュベートした。脱炭酸の生成物を次いでTMS-ジアゾメタンを用いてメチル化し、GC-MSにより分析した。これから、(R)-マロネート7(経路A)から得られる生成物(2-フェニルプロパン酸塩メチルエステル)は18O標識(m/z164)を失う一方、(S)-マロネート9(経路B)からの生成物は18O標識(m/z166)を保持することが明らかになった。これは、脱炭酸が立体配置の全逆位でプロ-Rカルボキシレートを失うことを介して起こることを立証する15。
AMDaseの生体触媒における応用は非常に有望であるにも関わらず、今までかかる酵素の1つだけが単離され特徴づけられただけである。しかし、タンパク質データベースを検索すると、B. bronchiseptica AMDaseと配列類似性を共有する多数のタンパク質が存在し、そのほとんどは機能が未知であることを示す。AMDaseと中〜高度の類似性を示し(図3(a)、(b))かつシステインをB. bronchiseptica 酵素のCys188と同じ相対位置に含有する4つのタンパク質配列を選択して研究した(表3)。
新しい酵素のプールから、Mesorhizobium sp. BNC1由来の脱炭酸酵素だけが2-メチル-2-フェニルマロネート2の脱炭酸に長けている。この場合、2-メチル-2-フェニルマロネート脱炭酸後に得られる2-フェニルプロピオネート生成物はBordetella bronchiseptica由来のAMDaseから得た脱炭酸生成物と同じR立体配置(ee>99%)を持つことを示した。さらに(R)-および(S)-マロネート7および9による18O標識研究も、Mesorhizobium sp. BNC1 AMDaseがB. bronchiseptica酵素と同じ立体化学で作用し、立体配置の全逆位のプロ-Rカルボキシレートを失うことを示す。B. bronchiseptica AMDaseに対する見掛けの機構的および配列類似性が得られたので、基質2-メチル-2-フェニルマロネート2と結合したMesorhizobium sp. BNC1 AMDase活性部位のモデルを作製することが可能である(図6(b))。このモデルは、プロ-Sカルボキシレート基と適合するオキシアニオンホールおよびプロ-Rカルボキシレートの不安定化を果たす保存された疎水性ポケットをもつ非常に類似した活性部位構造を示す。さらに溶媒進入可能なポケットが存在し、基質のフェニル基と理想的に適合しうる。総合すると、これは、この酵素がB. bronchiseptica AMDaseと類似した機構および構造を持つことを立証する。新しい脱炭酸酵素の設計のための価値ある情報を提供するだけでなく、これらの観察は、これらの全く異なる生物が一次または二次代謝において明らかな機能をもたない類似の酵素を何故持つのかといういくつかの興味深い疑問を提起する。明らかにこのクラスの酵素が自然においてどういう生理学的役割を果たしうるかは、今後解明されるべき課題として残る。
BTB活性アッセイを先に記載した通り実施した。式I[式中、R2はメチルであり、R1はフェニル、エテニル、プロペン-1-イル、ブテン-1-イルまたは2-メチル-プロペン-1-イルである]の化合物を基質として試験した。結果を次表4に総括した。
色々な非芳香族基質をBordetella bronchiseptica KU1201およびMesorhizobium sp. BNC1由来のAMDasesにより、次のスキーム:
に示した通り脱炭酸した。
メチル 2-メチルブタ-3-エノアート:12.286分(エナンチオマー(R))および12.350分(S);
メチル (E)-2-メチルペンタ-3-エノアート:24.984分(S)および27.823分(R);
メチル (E)-2-メチルヘキサ-3-エノアート:34.324分(S)および34.885分(R);
メチル 2,4-ジメチルペンタ-3-エノアート:33.679分(R)および34.254分(S)。
Bordetella bronchiseptica由来の補因子非依存性アリールマロン酸脱炭酸酵素(AMDase)の最初のX線結晶構造を活性部位にリン酸が結合した姿で提示した。この結晶構造は、基質カルボキシレートの1つと結合しかつ推定エノラート中間体形成の安定化に必要であるオキシアニオンホールの存在を表す。さらに、溶媒進入可能な空洞は典型的な基質である大きいアリール置換基に適応できることが明らかである一方、ぴったりした疎水性ポケットはさらなる脂肪族マロネート置換基のサイズを制限する。18O標識研究を利用して、モデル基質2-メチル-2-フェニルマロネートの脱炭酸は立体化学の逆位およびプロ-Rカルボキシレートを失うことにより起こることを確立することができた。この結果は、活性部位と結合した基質のモデルの作製を可能にする。このモデルは、脱炭酸中に失われる基質のプロ-Rカルボキシレートは疎水性ポケットにぴったりと結合し、これがカルボキシレート上の負電荷を不安定化し、補因子またはアシル酵素中間体の非存在での脱炭酸に必要な推進力を提供すると推論される。この疎水性ポケットの構造的および機構的重要性を、ミスフォールディングまたは活性の完全な喪失をもたらす疎水性残基のAlaへの部位特異的変異誘発により例示した。脱炭酸の後、オキシアニオンホールにより安定化されたエノラートが得られ、これが、次いで活性部位Cys188残基によりsi-面からプロトン化されて(2R)-フェニルプロピオン酸を生じる。
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Claims (32)
- 式I:
HOOC-C(R1)(R2)-COOH (I)
[式中、残基R1は任意に1以上の環状置換基を保持する直鎖または分枝鎖のモノまたはポリ不飽和低級アルケニル基を表すか;または残基R1は単環もしくは二環の、任意に置換された、飽和またはモノまたはポリ不飽和の環を表し、そして
残基R2はH、OH、SH、NH2、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたはヒドロキシル低級アルキルを表わす]
の化合物またはその塩形を生体触媒により脱炭酸する方法であって、
a)式Iの少なくとも1つの化合物を
(i)脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2(残基1〜240)のBordetella bronchisepticaタンパク質と100%以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質または
(ii)脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号12(残基1〜254)のAquifex pyrophilusタンパク質と100%以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
と接触させるステップ;および
b)任意に式Iの化合物の少なくとも1つの脱炭酸生成物を単離するステップ
を含むものである前記方法。 - 脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と100%以下の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質は基質ポケットを有し、前記ポケットは式Iの基質分子を保持する能力を有しかつ機能的配置で次の構造エレメント:
a)システインを含有する触媒部位であって、そのシステイン残基は特に脱炭酸される基質のエノラート中間体へプロトンを伝達することにより基質と相互作用することができる前記触媒部位、および
b)基質の切り離すべきでないカルボン酸基と相互作用する複数の極性アミノ酸側鎖を含むオキシアニオンホール
を含むものである、請求項1に記載の方法。 - 酵素は次の構造エレメント:
a)次の配列パターン:
「CSS」 (S/L)C(G/T)(G/N) (配列番号13)
を示す配列領域により形成されるシステインを含有する触媒部位「CSS」、および
b)次の2つの配列パターン:
「OAH1S」 (M/G)(G/C)TS(L/G) (配列番号14)
「OAH2S」 T(A/P)Y(I/R)(D/Q) (配列番号15)
を示す2つの配列領域のアミノ酸残基で形成されるオキシアニオンホールを含む基質ポケットを有するか、
または、前記酵素はなお式(I)の少なくとも1つの基質を保持する能力を有する突然変異した基質ポケットを有する、請求項2に記載の方法。 - 前記構造エレメントが次の系列順(N→C):
OAH1S - OAH2S - CSS
でアミノ酸鎖に配置され、ここで前記構造エレメントは、お互いとは独立して1以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を介して、一緒に連結されている、請求項3に記載の方法。 - 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が
a)配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質;
b)配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshiiに由来するタンパク質;
c)配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質;
d)配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAlkaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質;ならびに
e)アリールマロン酸またはマロン酸脱炭酸酵素活性を有しかつa)、b)、c)またはd)の配列の1つと100%未満の配列同一性を有するタンパク質
からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 脱炭酸反応が立体選択的なモノ脱炭酸である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 式II:
HC(R1)(R2)-COOH (II)
[式中、残基R1およびR2は請求項1に定義した通りである]
の光学的に純粋な化合物またはその塩形を得る、請求項6に記載の方法。 - 脱炭酸反応を、式Iの化合物の存在のもとで、単離または精製した(任意に固定した)形の前記脱炭酸酵素を用いて、または前記脱炭酸酵素活性を発現する微生物を培養することによって実施する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 式Iの化合物[式中、残基R1は単環もしくは二環の任意に置換された環により、任意に置換された直鎖または分枝鎖のモノ不飽和低級アルケニル基を表しかつ残基R2は低級アルキル基である]またはその塩形を脱炭酸する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- R1は単環もしくは二環の、任意に置換された環により、任意に置換された直鎖C1〜C6-アルケン-1-イル基を表しかつ残基R2はC1〜C6-アルキル基である、請求項9に記載の方法。
- R1はエテニル、プロペン-1-イル、ブテン-1-イルを表す、請求項10に記載の方法。
- 脱炭酸酵素活性を有する前記タンパク質は先に定義したMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質およびBordetella bronchisepticaに由来するタンパク質からなる群より選択される、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 脱炭酸酵素活性を有しかつ配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質と99%未満の配列同一性を有するタンパク質。
- a)配列番号4のアミノ酸残基2〜241を含みかつMesorhizobium sp. BNCIに由来するタンパク質
b)配列番号6のアミノ酸残基2〜240を含みかつPyrcoccus horikoshii OT3に由来するタンパク質
c)配列番号8のアミノ酸残基2〜267を含みかつBordetella bronchiseptica RB50に由来するタンパク質
d)配列番号10のアミノ酸残基2〜246を含みかつAklaliphilus metalliredigenes QYMFに由来するタンパク質 および
e)配列番号12のアミノ酸残基2〜256を含みかつAquifex pyrophilusに由来するタンパク質
から選択される、脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。 - 請求項13または14に定義した脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の突然変異体であって、対応する親タンパク質と100%未満の配列同一性を有する突然変異体。
- 請求項2〜4のいずれか1項に定義した構造エレメントをなお含む、請求項15に記載の突然変異体。
- 請求項13〜16のいずれか1項の脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸。
- 少なくとも1つの調節核酸配列と機能しうる形で連結された、請求項17の核酸を含む発現カセット。
- 少なくとも1つの請求項18の発現カセットまたは請求項17の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 少なくとも1つの請求項19の発現ベクターを保持する組換え微生物。
- 請求項13〜16のいずれか1項に定義した脱炭酸酵素活性を有する少なくとも1つのタンパク質または請求項20の組換え微生物を任意に固定した形で含むものであるバイオリアクター。
- 脱炭酸酵素活性を有する酵素を調製する方法であって、請求項20に定義した組換え微生物を培養するステップおよび任意に脱炭酸酵素活性を有する前記酵素を培養から単離するステップを含むものである、上記方法。
- 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質の結晶形。
- 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が請求項13〜16のいずれか1項に定義したものである、請求項23に記載の結晶形。
- 脱炭酸酵素活性を有するタンパク質が配列番号2のBordetella bronchisepticaタンパク質(Blastデータベース登録番号BAA02419.1)である、請求項24に記載の結晶形。
- 定数a=38.7、b=65.6、c=42.2Å、およびβ=110.8°を有する単位セルをもつP21空間群に属する、請求項25に記載の結晶形。
- 前記タンパク質、8.3〜8.7のpHを有する結晶化剤およびポリエチレングリコールを含有する溶液を加えるステップを含むものである、請求項23〜26のいずれか1項に定義したタンパク質の結晶形を調製する方法。
- 請求項1に定義した脱炭酸酵素活性を有する候補酵素をスクリーニングする方法であって、請求項13〜16の1項に定義した酵素に特徴的な配列モチーフ(パターン)を同定するステップおよびアミノ酸配列データベースを前記モチーフと部分的または完全にマッチするデータベース登録配列についてスクリーニングするステップを含むものである、上記方法。
- 前記配列モチーフが請求項2〜4のいずれか1項に定義されている、請求項28に記載のスクリーニング方法。
- 配列モチーフが請求項23〜26のいずれか1項に定義したタンパク質の結晶の結晶構造から誘導される、請求項28または29に記載のスクリーニング方法。
- 候補酵素のコードヌクレオチド配列を得るステップ、組換え微生物において前記配列を発現させるステップおよび前記発現産物を単離するステップを含むものである、請求項28〜30のいずれか1項に記載の方法によりスクリーニングした脱炭酸酵素活性を有する候補酵素を調製する方法。
- 請求項25により調製した発現産物の、請求項1に定義した式Iの化合物を脱炭酸する脱炭酸反応における使用。
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