JP2015128385A - いもち病抵抗性を付与する真性抵抗性遺伝子Pita−2及びその対立遺伝子Pi19の利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】真性抵抗性遺伝子Pi19及びPita-2をコードする塩基配列を同定し、単離したことに基づき、これらの遺伝子を植物へ遺伝子導入することにより本課題が解決する。
【選択図】図4
Description
[1] 植物において、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNAであって、
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(2)配列番号1の配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(3)配列番号1の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(4)配列番号2の塩基配列からなるDNA;
(5)配列番号2の塩基配列に相補する配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;
(6)配列番号2の塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する塩基配列からなるDNA;
(1’)配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(2’)配列番号3において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(3’)配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(4’)配列番号4の塩基配列からなるDNA;
(5’)配列番号4の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;及び
(6’)配列番号4の塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する塩基配列からなるDNA
からなる群から選ばれる、前記DNA。
[2] 前記DNAが、cDNAである、項目1に記載のDNA。
[3] 項目1又は2に記載のDNAを含むベクター。
[4] 項目1の(1)〜(6)からなる群から選ばれるDNAと、項目1の(1’)〜(6’)からなる群から選ばれるDNAとを含む、項目3に記載のベクター。
[5] 項目3に記載のベクターにより遺伝子導入され、Pita-2遺伝子をコードするDNA又はPi19遺伝子をコードするDNAを含む、形質転換細胞。
[6] 項目4に記載のベクターにより遺伝子導入され、Pita-2遺伝子をコードするDNA及びPi19遺伝子をコードするDNAを含む、形質転換細胞。
[7] 項目5又は6の形質転換細胞を含む、形質転換イネ科植物体。
[8] 項目7に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換イネ科植物体。
[9] 前記形質転換イネ科植物体が、イネである、項目7又は8に記載の形質転換植物体。
[10] 項目7〜9のいずれか1項に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
[11] 項目1の(1)〜(6)からなる群から選ばれるDNAからなる、Pita-2遺伝子、又は項目1の(1’)〜(6’)からなる群から選ばれるDNAからなる、Pi19遺伝子。
[12] 項目11に記載のPita-2遺伝子をホモ接合型で含み、かつ項目11に記載のPi19遺伝子をホモ接合で含む、イネ。
[13] 項目7又は8に記載の形質転換イネ科植物体の製造方法であって、項目3又は4に記載のベクターを、イネ科植物の細胞に導入する工程、及び当該植物細胞から植物体を再生させる工程、を含む前記製造方法。
[14] 前記形質転換イネ科植物体がイネである、項目13に記載の方法。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からPi19遺伝子又はPita-2遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNA断片を検出する工程
いもち病菌は、次に挙げる菌株については農業生物資源研究所ジーンバンクより取り寄せた:Kyu77-07A(MAFF242858、Pishに非親和性、Pi19、Pita-2に親和性、同レース102.0)、Kyu89-246(MAFF101506、Pita-2、Pibに非親和性、Pi19に親和性、同レース003.0)、GFOS8-1-1(MAFF101527、Pita-2、Pi19に親和性、同レース303.0)、CHNOS58-3-1(MAFF101267、Pi19に非親和性、同レース000.0)。H06-47-1菌株 (Pi19、Pita-2に非親和性、日本の判別品種によるレース000.0)は、以下に説明する交雑法により作出した。
いもち病菌株H06-47-1は、以下の手順により作製した。独立行政法人農業生物資源研究所耐病性作物研究開発ユニットの管理する、いもち病菌株3986-R-22とCHNOS58-3-1を、公知の技術(「植物病原性微生物研究法」脇本哲監修、ソフトサイエンス社、平成5年4月2日発行)により交配した。その後代を単胞子分離して系統を確立した。それぞれのいもち病菌系統を、国際判別イネ品種群(国際稲研究所(IRRI)から入手可能)に、文献(JIRCAS Working Report No.63、17-33)に記載の方法で接種して、罹病性か否かを病徴の有無により判別することで各いもち病菌の遺伝子型を特定し、AvrPi19のみを持ついもち病菌系統を選抜した。
いもち病菌の感染は、文献(JIRCAS Working Report No.63、17-33)に記載の方法で概ね行った。具体的には、100,000個/mlの胞子懸濁液(0.01% tween20を含む)をイネの葉に噴霧接種した後、暗所、温度25℃、湿度100%の接種箱内で20時間静置し、その後温室内で生育させた。
イネのいもち病菌に対する抵抗性は、温室で生育させた播種後2〜4週間のイネに上記の方法でいもち病菌を感染させ、接種後7〜14日目に葉に現れたいもち病斑のサイズおよび形態を観察し評価した。
いもち病に対する抵抗性の定量的測定は下記の方法で行った。いもち病菌接種から7日後に、感染させたイネの葉身からゲノムDNA(イネおよびいもち病菌由来のDNAを含む)を回収し、リアルタイムPCR(TaKaRa Thermal Cycler Dice Real Time System TP800)を用いて、いもち病菌のもつ28S rDNAを特異的に増幅し、イネのゲノム量に対する相対値を算出した。いもち病菌の28S rDNAを特異的に増幅するプライマーとして、AOL617 とAOL618を使用し、イネのゲノム量を定量するためにイネゲノム上の特異的な配列を増幅するプライマーとしてAOL21とAOL23を用いた。PCR条件は95℃(30秒)を1サイクル、95℃(5秒)、60℃(30秒)を40サイクルで行った:
AOL617 5’-TACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTA-3’(配列番号8)
AOL618 5’-TCAGCAGATCGTAACGATAAAGCTACTC-3’(配列番号9)
AOL21 5’-GAGCGATGCATATCGCACAGCTG-3’(配列番号10)
AOL23 5’-GGTCTGGCTGCTTACTAGAGTC-3’(配列番号11)
真性抵抗性の誘導に必須なR遺伝子、および関連因子の同定を目的として、いもち病R遺伝子Pi19をもつイネ品種「日本晴」を背景とする変異体集団をスクリーニングに供した。本変異体集団は、イネゲノムリソースセンター(Rice Genome Resource Center(RGRC))のホームページ(http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/index.html)内のTos17ミュータントパネルデータベースより取得した。1次スクリーニングでは、1系統につき20個体、2次スクリーニングでは40個体播種し、いもち病菌(H06-47-1株)に対する抵抗性を指標に選抜を行った。相補試験のコントロールとしては、いもち病真性抵抗性遺伝子座Pi19、Pita-2のいずれも持たないことが知られているイネ品種「US1」を用いた。このスクリーニングにより、イネいもち病に対する真性抵抗性に変化を生じたttm (tissue-culture triggered mutation)変異体の選抜を行い、2系統の変異体(ttm12、ttm17)を単離同定することに成功した(図1A)。ttm12変異体とttm17変異体は、それぞれコシヒカリ、日本晴、又は日本晴の第12染色体の短腕部を含む領域をカサラスの染色体領域に置換した日本晴/カサラス染色体置換系統であるCSSL−52と交配し、F2及びF3を取得した。このF2またはF3でその変異表現型が1:3に分離したことから、ttm12変異体とttm17変異体は、ともに劣性の1遺伝子変異をもつことが明らかとなった(表1)。なお、CSSL−52はイネゲノムリソースセンター(Rice Genome Resource Center(RGRC))のホームページ(http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/index.html)から入手した。
R遺伝子について解析が行われており、Pi19遺伝子座を持つことによりいもち病菌株H06-47-1に対し抵抗性を示すことが明らかであるコシヒカリを交配親に選び、ttm12変異体と交配した。これらのF2集団から変異型を示す10個体を選抜し、これらを用いて、日本晴/コシヒカリ間のSNPをタイピングアレイにより網羅的に解析し、領域の絞り込みを進めた。その結果、ttm12変異体の推定原因遺伝子座は、第12番染色体短腕上の、マーカーNag08J35512とNag08J35562の約1.8Mb間に存在すると予測した(図3A)。次に詳細にマッピングするため、第12染色体の短腕部を含む領域をカサラスに置換した日本晴/カサラス染色体置換系統(CSSL52) (NK-SL54-20030430)とttm12を交配し、得られたF2、F3個体を解析に用いた。日本晴/カサラス染色体置換系統はイネゲノムリソースセンター(Rice Genome Resource Center(RGRC))のホームページ(http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/index.html)から取得した。このF2、F3集団を用いて、詳細なマッピングを行った結果、第12染色体上の2つのSNPマーカー間(snps_48303とsnps_48309)、約34kbの間に、Pi19遺伝子の候補領域が絞り込まれた(図3B)。RAPデータベース(Rice Annotation Project Database(RAP-DB)、http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)より、この領域には1遺伝子(Os12g0285100;仮説上の遺伝子)が存在することが予測された(図3C)。なお、日本晴とカサラスのSNPマーカーであるsnps_48303(C/T)を検出するため、下記のプライマーAOL1120とAOL1121を使用し、またsnps_48309(A/G)を検出するプライマーとして、AOL1122とAOL1123を使用した:
AOL1120 5’-AACACACGAAGCATGAGCTG-3’(配列番号12)
AOL1121 5’-CTGTCTCCACATGCATGACC-3’(配列番号13)
AOL1122 5’-GGACAAAGGGGAGGAAGAAG-3’(配列番号14)
AOL1123 5’-CACGACGATGACAACGAGAG-3’(配列番号15)
Pi19遺伝子がttm12変異体及びttm17変異体の原因遺伝子であることを確かめるため、相補性実験を行った。相補性試験に供するゲノムDNAを取得するため、農業生物資源研究所イネゲノム育種研究ユニットが管理する日本晴ゲノムDNA由来のPACライブラリーから、Pi19遺伝子領域を含むPACをPCRにより選抜した。用いたプライマーセットはAOL1193とAOL1198、AOL1135とAOL1205、AOL1136とAOL1137、AOL1142とAOL1143、並びにAOL1144とAOL1145であり、5組全てで増幅がみられたPACとしてPAC19を得た。PAC19を制限酵素SalI(東洋紡(TOYOBO))で消化し、Pi19遺伝子領域を含む約15kbの断片(図5)をバイナリーベクターpPZP2H-lac(参考文献Fuse et al. 2001 Plant Biotech. 18 219-222)に組み込み、ベクターを作製した。そのベクター又は遺伝子断片を含まない空のベクター(Empty Vector(EV))をttm17変異体にアグロバクテリウム法によって導入し、それぞれ形質転換体を得た。これらの形質転換体に対して、AvrPi19を持ついもち病菌(H06-47-1)に対する抵抗性と、AvrPi19を持たないいもち病菌(Kyu89-246)に対する抵抗性を調べた(図6)。その結果、PAC−19を導入したttm17変異体では、AvrPi19を持ついもち病菌H06-47-1に対して抵抗性を示すが(図6A)、AvrPi19を持たないいもち病菌Kyu89-246に対しては抵抗性を示さなかった(図6B)。AvrPi19を持ついもち病菌H06-47-1に対する抵抗性を回復させたことから、ttm17変異体の原因遺伝子が、Pi19遺伝子であることが示され、その配列が配列番号3のアミノ酸配列をコードすることが証明された。一方、AvrPi19を持たないいもち病菌Kyu89-246に対する抵抗性は見られなかった。このことから、Pi19遺伝子産物が非特異的な抵抗性を付与しないことが示された。AOL1143及びAOL1167のプライマーを用いてPCRを行うことにより、ttm17形質転換体に対して、PAC−19が導入されていること確認した(図6A、B下段:黒矢頭が形質転換により導入されたPi19遺伝子断片を示す):
AOL1135: 5’-GATTTGGTATGGGAGGAGCA-3’(配列番号16)
AOL1136: 5’-TAAACCTGGCCCAAGACAAG-3’(配列番号17)
AOL1137: 5’-TTGCTTGCCTCAGTAGACGA-3’(配列番号18)
AOL1138: 5’-TGCTTCTTGAAAAGGGGAGA-3’(配列番号19)
AOL1139: 5’-AACCGACTCCCTCTTGGAAT-3’(配列番号20)
AOL1140: 5’-ATTTGTCGGCCACATCTTTC-3’(配列番号21)
AOL1141: 5’-GTCCGCTGTTCCTGCTCTAC-3’(配列番号22)
AOL1142: 5’-GCTCTGCCATACAGGACCAT-3’(配列番号23)
AOL1143: 5’-GCAACTTACAGGCATGCAGA-3’(配列番号24)
AOL1144: 5’-TGCTGCGAATGTAGAGGTTG-3’(配列番号25)
AOL1145: 5’-TGCCACGATCATATTGAGGA-3’(配列番号26)
AOL1146: 5’-TCCTCGGTTTGCATTACTCC-3’(配列番号27)
AOL1167: 5’-TCTTCACCTGGCAGATTTCC-3’(配列番号28)
AOL1169: 5’-GCCACCAGCGAAAAACTCT-3’(配列番号29)
AOL1174: 5’-TCAAGAGATACAACACGCGTTG-3’(配列番号30)
AOL1179: 5’-AACGTGGGTGTATGTGTCACA-3’(配列番号31)
AOL1181: 5’-TGCCGCCATCATATTGAAGA-3’(配列番号32)
AOL1184: 5’-AAATGCTTGGCTGAACTGGT-3’(配列番号33)
AOL1185: 5’-CTTGTTTGAACGAGCGTGATC-3’(配列番号34)
AOL1193: 5’-CTCCCTCAATCCCTTCATCA-3’(配列番号35)
AOL1198: 5’-GATGGGTTTGCGAGGTAATG-3’(配列番号36)
AOL1205: 5’-GAACTGGTTGACGAGAACCAC-3’(配列番号37)
非特許文献3では、第12番染色体に座上するPi19遺伝子座がPita-2遺伝子と強く連鎖しているか、同じ遺伝子座の対立遺伝子である旨、言及されている。また、Pi19遺伝子座は同じ第12番染色体上の別のR遺伝子であるPita遺伝子座とも強く連鎖しているか、同じ遺伝子座の対立遺伝子である可能性がある旨も記載されている。
Pi19遺伝子のコード領域の塩基配列が特定されたことにより、Pi19遺伝子座が正確に特定された。この情報を元に公知のデータベースを確認したところ、RAPデータベース(Rice Annotation Project Database(RAP-DB)、http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)上の情報から、Pi19遺伝子座の近傍220kbの位置に、既に遺伝子が単離同定されているPita遺伝子座が存在していることがわかった。Pita-2遺伝子座は未同定であったことから、Pi19遺伝子がPita−2遺伝子と対立遺伝子の関係にある可能性が考えられた。そこで、Pi19遺伝子について複数の品種間での多型を調べることにした。Pi19遺伝子の塩基配列が判明していること及び多型が存在するため、品種により複数のプライマーセットを使い分けることで塩基配列を決定した。具体的には、日本晴、コシヒカリ、愛知旭、カサラス及びIRBL19-Aの各品種ではAOL1135とAOL1136、AOL1137とAOL1138、AOL1139とAOL1140、AOL1141とAOL1142、AOL1143とAOL1144、AOL1145とAOL1146を用いた。PiNo.4及びレイホウでは、AOL1135とAOL1136、AOL1137とAOL1138、AOL1139とAOL1140、AOL1141とAOL1142、AOL1143とAOL1144、AOL1145とAOL1174を用いた。コシヒカリBL3号、IRBL-ta2及びTadukanでは、AOL1135とAOL1136、AOL1137とAOL1138、AOL1139とAOL1140、AOL1141とAOL1142、AOL1143とAOL1144、AOL1145とAOL1179を用いた。LTHでは、AOL1139とAOL1140、AOL1141と1142、AOL1143とAOL1144、AOL1179とAOL1181を用いた。US1では、AOL1169とAOL1184、AOL1139とAOL1140、AOL1141とAOL1142、AOL1143とAOL1144、AOL1179とAOL1181を用いた。IR24ではAOL1193とAOL1185、AOL1139とAOL1140、AOL1141とAOL1142、AOL1143とAOL1144、AOL1179とAOL1181を用いた。それぞれのプライマーセットを用いてゲノミックDNAを鋳型としてPCR増幅を行い、塩基配列を決定した。その塩基配列から推定したアミノ酸配列をアライメントした(図7A、B、C)。Pi19遺伝子座を持つことがこれまでに知られている品種(日本晴、コシヒカリ、愛知旭、カサラス、IRBL19-A)では、カサラスに1アミノ酸の多型が見つかった以外はすべてアミノ酸配列が保存されていた(図7A)。一方、Pi19遺伝子座を持たずにPita-2遺伝子座をもつことが知られている品種(PiNo.4、レイホウ、コシヒカリBL3号、IRBL-ta2、Tadukan)では、Pi19遺伝子とは異なるもののこれらの品種間では完全に保存された共通のアミノ酸配列が見られ、Pi19遺伝子と比較するとC末端側に多型が集中していた(図7B)。Pi19遺伝子もPita-2遺伝子の両方をもたないことが知られている品種(LTH、US1、IR24)では、 Pi19遺伝子に比べ広範囲にわたって多数の多型が生じていた(図7C)。既知の各品種の遺伝子型と保存されたアミノ酸配列にほぼ完全な一致がみられたことから、Pi19遺伝子とPita-2遺伝子とが対立遺伝子の関係にあることが推測された。
AOL1174 5’-TCAAGAGATACAACACGCGTTG-3’(配列番号30)
AOL1352 5’-CATCTGTGTAGTCCCTACTCC-3’(配列番号40)
Claims (14)
- 植物において、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNAであって、
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(2)配列番号1の配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(3)配列番号1の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(4)配列番号2の塩基配列からなるDNA;
(5)配列番号2の塩基配列に相補する配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;及び
(6)配列番号2の塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する塩基配列からなるDNA
からなる群から選ばれる、前記DNA。 - 前記DNAが、cDNAである、請求項1に記載のDNA。
- 請求項1又は2に記載のDNAを含むベクター。
- 植物において、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNAであって、
(1)配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(2)配列番号3において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(3)配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(4)配列番号4の塩基配列からなるDNA;
(5)配列番号4の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;及び
(6)配列番号4の塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する塩基配列からなるDNA
からなる群から選ばれる、DNAをさらに含む、請求項3に記載のベクター。 - 請求項3に記載のベクターにより遺伝子導入され、Pita-2遺伝子をコードするDNAを含む、形質転換細胞。
- 請求項4に記載のベクターにより遺伝子導入され、Pita-2遺伝子をコードするDNA及びPi19遺伝子をコードするDNAを含む、形質転換細胞。
- 請求項5又は6の形質転換細胞を含む、形質転換イネ科植物体。
- 請求項7に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換イネ科植物体。
- 前記形質転換イネ科植物体が、イネである、請求項7又は8に記載の形質転換植物体。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 請求項1に記載のDNAからなる、Pita-2遺伝子。
- 請求項11に記載のPita-2遺伝子をホモ接合型で含み、かつ、以下の:
(1)配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA;
(2)配列番号3において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNA;
(3)配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNA;
(4)配列番号4の塩基配列からなるDNA;
(5)配列番号4の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNA;及び
(6)配列番号4の塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する塩基配列からなり、いもち病に対する真性抵抗性を付与するDNA
からなる群から選ばれるDNAからなるPi19遺伝子をホモ接合で含む、イネ。 - 請求項7又は8に記載の形質転換イネ科植物体の製造方法であって、請求項3又は4に記載のベクターを、イネ科植物の細胞に導入する工程、及び当該植物細胞から植物体を再生させる工程、を含む前記製造方法。
- 前記形質転換イネ科植物体がイネである、請求項13に記載の方法。
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