JP2015084775A - 高親和性ｄｎａアプタマーを生成するための磁気アシスト迅速アプタマー選択方法 - Google Patents

高親和性ｄｎａアプタマーを生成するための磁気アシスト迅速アプタマー選択方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＤＮＡアプタマーをスクリーニングするための磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）プロトコルが提案される。
【解決手段】ＭＡＲＡＳプロトコルは高い親和性および特異性を有するアプタマーを効率的に生成することができる。標的に対する所望の親和性および特異性を有するＤＮＡアプタマーを選択するため、回転磁場または交流磁場が、標的結合磁性マイクロ粒子またはナノ粒子と組み合わせて用いられた。
【選択図】図２

Description

本発明は選択方法に関する。とくに、本発明は磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）方法に関する。
指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）は、ランダム配列の大きなコンビナトリアルライブラリ（ナイーブライブラリ）からのＤＮＡ／ＲＮＡ配列の単離のためのインビトロ選択方法であり、単離された配列は、分子に匹敵する三次元形状に折り畳まれるＤＮＡ／ＲＮＡの能力に基づき、分子に結合する。成功したＳＥＬＥＸの産物は「アプタマー」と称され、その構造は微小分子（例えば有機分子、イオン、ペプチド、タンパク質、核酸）、巨大分子から全細胞、ウイルス、寄生虫または組織まで多様な、さまざまな分子標的に高い特異性および親和性で結合し得る結合ポケットからなる。アプタマーの配列が分子標的について同定されると、化学合成によりアプタマー全体を生成することができる。さらに、官能基で修飾されたアプタマーはさまざまな生物学的用途においてそれらの安定性を増加することができるが、核酸にとっては有害である。従来の抗体産物と比較して、アプタマーの１つの利点はハイブリドーマおよび動物の屠殺が必要ないことにある。アプタマーは、病原性および悪性細胞または組織を標的化する優れた手段であり、抗体を代替する可能性を有するだけでなく、精製、診断、バイオセンサーおよび抗感染薬に適用することもできる。しかしながら、市販の抗体とは異なり、さらなる用途に適したアプタマーを得るのは困難である。
ＳＥＬＥＸは複数回交互で行うインキュベーション、分離、溶出、増幅および精製ステップを含み、これらのステップは：（１）ナイーブＤＮＡライブラリを標的分子と混合するステップ；（２）標的分子に結合したＤＮＡを結合していないＤＮＡから分離するステップ；（３）結合ＤＮＡを標的分子から溶出するステップ；（４）溶出ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、アプタマー濃縮ＤＮＡライブラリを生成するステップ；および（５）一本鎖オリゴヌクレオチドをＰＣＲ産物から精製するステップとしてまとめられ得る。この手順は、前の回で得られた濃縮ライブラリから出発し、数回繰り返される。一般的には、機能性核酸種のさらなる濃縮が検出されなくなるまで、少なくとも５〜１５回のＳＥＬＥＸ選択が行われる。十分な特異性および結合親和性（例えば、ナノモルの解離定数、Ｋｄ）を有するアプタマーを単離するには複数回の選択が必要である。一般的には、ＳＥＬＥＸは時間がかかる長いプロトコルである。アプタマーの選択が数日で完了し得る自動化ＳＥＬＥＸ手順でも、依然として大量の製剤および高い操作コストを必要とする。また、キャピラリー電気泳動ＳＥＬＥＸ（ＣＥ−ＳＥＬＥＸ）およびマイクロ流体ＳＥＬＥＸ（Ｍ−ＳＥＬＥＸ）を含む、この長い手順を簡略化するいくつかの機能戦略が提案された。しかしながら、ＣＥ−ＳＥＬＥＸは小分子と結合するアプタマーをスクリーニングするにはあまり効果的でなく、Ｍ−ＳＥＬＥＸは高価なマイクロ流体装置を必要とする。
アプタマーは多くの面で有望であるので、それらの用途に適した高い親和性および特異性を有するアプタマーを迅速にスクリーニングするのに十分に簡単な、効率的なスクリーニングプロトコルを開発することが望ましい。
ＳＥＬＥＸは時間のかかる長いプロトコルである。アプタマーの選択が数日で完了し得る自動化ＳＥＬＥＸ手順でも、依然として大量の製剤および高い操作コストを必要とする。また、キャピラリー電気泳動ＳＥＬＥＸ（ＣＥ−ＳＥＬＥＸ）およびマイクロ流体ＳＥＬＥＸ（Ｍ−ＳＥＬＥＸ）を含む、この長い手順を簡略化するいくつかの機能戦略が提案された。しかしながら、ＣＥ−ＳＥＬＥＸは小分子と結合するアプタマーをスクリーニングするにはあまり効果的でなく、Ｍ−ＳＥＬＥＸは高価なマイクロ流体装置を必要とする。
アプタマーは多くの面で有望であるので、それらの用途に適した高い親和性および特異性を有するアプタマーを迅速にスクリーニングするのに十分に簡単な、効率的なスクリーニングプロトコルを開発することが望ましい。
本発明は、ＤＮＡライブラリから標的結合オリゴヌクレオチドをスクリーニングするのにバイオ機能化磁性粒子を用いるアプタマー選択プロトコルを提供する。こうしたプロトコル、磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）は、高親和性アプタマーを得るための効率的なプロトコルである。さらに、こうしたアプタマー選択プロトコルは、他のアプタマー選択プロトコルにも必要な材料調製およびポスト分析を除き、１時間以内に完了され得、高いスループットで自動化され得る。
本発明はアプタマー選択プロトコルを提供する。まず、複数のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのランダム配列ライブラリおよびその上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む試料が提供される。複数のオリゴヌクレオチド配列の一部分は、その上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合される。振動磁場を試料に印加することにより磁気アシストスクリーニングが行われ、その上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチド配列の部分を単離する。次に、その上に標的分子が結合していない複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチド配列の単離部分に陰性選択が行われる。次に磁気スタンドを用いることにより磁気分離が行われ、標的分子に特異的なアプタマーが単離される。
本発明はまたアプタマー選択プロトコルを提供する。まず、複数のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのランダム配列ライブラリおよびその上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む試料が提供される。標的分子は、複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に付着した第１成分および標的分子に付着した第２成分によって、複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合される。振動磁場を印加することにより磁気アシストスクリーニングが行われ、競合機構が提供される。その上に第１成分が付着した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を用いて試料に陰性選択が行われ、その上に第１成分が付着した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合していない複数のオリゴヌクレオチド配列の一部分が単離される。次に磁気スタンドを用いることにより磁気分離が行われ、その上に第１成分が付着した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合していない複数のオリゴヌクレオチド配列の部分が単離され、標的分子に特異的なアプタマーが選択される。
本発明の実施形態によると、振動磁場は回転磁場である。
本発明の実施形態によると、磁気アシストスクリーニングを行うプロセスは、固定磁場強度およびさまざまな磁場周波数の回転磁場を印加することにより複数回行われる磁気アシストスクリーニングをさらに含み、磁気アシストスクリーニングの各回に用いられる磁場周波数は他の回の磁気アシストスクリーニングのそれとは異なる。
本発明の実施形態によると、１４ガウスおよび２Ｈｚ〜２７ＫＨｚで変動する磁場周波数の回転磁場が印加される。
本発明の実施形態によると、振動磁場は交流磁場である。
本発明の実施形態によると、磁気アシストスクリーニングを行うプロセスは、固定磁場強度およびさまざまな磁場周波数の交流磁場を印加することにより複数回行われる磁気アシストスクリーニングをさらに含み、磁気アシストスクリーニングの各回に用いられる磁場周波数は他の回の磁気アシストスクリーニングのそれとは異なる。
本発明の実施形態によると、２５ガウスおよび２Ｈｚ〜２００ＫＨｚで変動する磁場周波数の交流磁場が印加される。
本発明の実施形態によると、磁気アシストスクリーニングを行うプロセスは、固定磁場周波数およびさまざまな磁場強度の交流磁場を印加することにより複数回行われる磁気アシストスクリーニングをさらに含み、磁気アシストスクリーニングの各回に用いられる磁場強度は他の回の磁気アシストスクリーニングのそれとは異なる。
本発明の実施形態によると、１００ＫＨｚおよび１２．５ガウス〜４００ガウスで変動する磁場強度の交流磁場が印加される。
本発明の実施形態によると、標的はＣ反応性タンパク質であり、第１成分はストレプトアビジンであり、第２成分はビオチンである。
本開示の前述および他の特徴および利点を理解できるようにするため、いくつかの例となる実施形態を添付の図面とともに以下で詳細に記載する。
本発明は、ＤＮＡライブラリから標的結合オリゴヌクレオチドをスクリーニングするのにバイオ機能化磁性粒子を用いるアプタマー選択プロトコルを提供する。こうしたプロトコル、磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）は、高親和性アプタマーを得るための効率的なプロトコルである。さらに、こうしたアプタマー選択プロトコルは、他のアプタマー選択プロトコルにも必要な材料調製およびポスト分析を除き、１時間以内に完了され得、高いスループットで自動化され得る。
添付図面は本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、本出願の一部に組み込まれ、これを構成する。図面は本発明の実施形態を例示し、明細書とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
本発明の１つの実施形態による回転磁場磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＲＯ−ＭＡＲＡＳ）プロトコルの実験装置の概略図である（図１Ａ）。本発明の１つの実施形態による交流磁場磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＡＣ−ＭＡＲＡＳ）プロトコルの実験装置の概略図である（図１Ｂ）。 本発明の１つの実施形態によるＲＯ−ＭＡＲＡＳの周波数依存性の分析のプロセスフローを概略的に示す。 本発明の１つの実施形態によるＲＯ−ＭＡＲＡＳにおいて印加された磁場周波数およびＲＯ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）の関係を示す。 本発明の１つの実施形態によるＡＣ−ＭＡＲＡＳにおいて印加された磁場周波数およびＡＣ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）の関係を示す。 本発明の１つの実施形態によるＡＣ−ＭＡＲＡＳにおいて用いられた磁場強度およびＡＣ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）の関係を示す。
ここで本発明の実施形態について詳細に参照し、その例を添付図面に示す。可能な場合は必ず、同じまたは同様の部分を指すのに図面および明細書で同じ参照番号を用いる。
本発明は、ＤＮＡライブラリから標的結合オリゴヌクレオチドをスクリーニングするのにバイオ機能化磁性粒子を用いるアプタマー選択プロトコルに関する。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は炎症、心臓発作、脳卒中および心血管疾患の一般的な指標であるので、ＣＲＰは下記の実験において標的として用いられ、バイオ機能化磁性粒子は実験目的のためＣＲＰで被覆される。ここでは、ＣＲＰ被覆バイオ機能化磁性ナノ粒子（ＣＲＰ−ＭＮＰ）およびＣＲＰ被覆バイオ機能化磁性マイクロ粒子（ＣＲＰ−ＭＭＰ）は、外部から印加される振動磁場により発生する磁気トルクにより駆動された。本発明のアプタマー選択プロトコルは磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）プロトコルである。
ＭＡＲＡＳプロトコルを行う前に材料を調製する必要がある。材料調製は、ランダム配列ライブラリの調製、標的の調製、および標的のランダム配列ライブラリとのインキュベーションを含む。これらの調製ステップを下記のセクションにまとめる。
（オリゴヌクレオチドライブラリおよびプライマー）
３タイプのランダム化オリゴヌクレオチド配列６０Ｎ、４０Ｎおよび２０Ｎがランダム配列ライブラリとして用いられた。ランダム化オリゴヌクレオチド配列は５’−ＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ−Ｘｎ−ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡ−３’と記載され、ランダム化（Ｎ）マー中央部Ｘｎを有し、ｎは１０〜１００の範囲のいずれかの整数を表し、Ｘｎはｎマーヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味する。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド配列６０Ｎ、４０Ｎまたは２０Ｎはランダム化Ｘ６０、Ｘ４０またはＸ２０中央部を有する核酸配列であってもよく、ランダム化Ｘ６０、Ｘ４０またはＸ２０中央部はそれぞれランダム化６０マー配列（６０ヌクレオチドの配列）、ランダム化４０マー配列またはランダム化２０マー配列を表す。ランダム化オリゴヌクレオチド配列は１ｍＭスケールで合成され、ＰＡＧＥ精製される（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ニューヨーク州グランドアイランドから購入される）。Ｌａｂ−順方向５’−ＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）およびＬａｂ−逆方向５’−ＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を含む、１セットのプライマーが用いられ、ＰＣＲ増幅中にライブラリの５’および３’縮重領域がアニールされた。上述した同じ配列を有する５’ビオチン標識プライマー：Ｌａｂ−ビオチン−Ｒが用いられ、二本鎖ＰＣＲ産物から順方向一本鎖が単離された。なお、逆方向一本鎖アプタマーが好まれる場合、一本鎖精製にＬａｂ−ビオチン−Ｆプライマーを用い、Ｌａｂ−ビオチンーＲを代替することができる。ユニバーサルＴ７プライマー（Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ-３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３））が用いられ、選択されたアプタマーのヌクレオチドが配列決定された。
（ＣＲＰ被覆バイオ機能化磁性粒子）
この研究に用いられるストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子（ＳＡ−ＭＮＰ）を含有する試薬は、Ｍａｇｑｕ（Ｍａｇｑｕ、台湾台北）から購入された。試薬中のＳＡ−ＭＮＰの平均流体力学的直径は０．３ｅｍｕ／ｇの濃度で５０ｎｍだった。磁性ナノ粒子は、ストレプトアビジンでナノ粒子の最外表面を被覆することによりバイオ機能化され、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中に分散された。ストレプトアビジン被覆磁性マイクロ粒子（ＳＡ−ＭＭＰ）を含有する試薬もＭａｇｑｕから購入され、ＳＡ−ＭＭＰの平均流体力学的直径は８ｍｇ／ｍｌの濃度で約３μｍだった。デキストラン、単もしくは多抗体、またはアミノ基のような他の代替物を用い、磁性粒子をバイオ機能化してもよい。この研究において用いられるヒトＣＲＰの純度は９９％より大きかった（ＭＹＢＩＯＳＯＵＲＣＥ、米国サンディエゴから購入）。ビオチン化キット（ビオチン標識キット−ＮＨ２）はＡｂｎｏｖａ（Ａｂｎｏｖａ、台湾台北）から購入された。この研究では、６００μｇの純粋ＣＲＰタンパク質が用いられ、ビオチン化ＣＲＰタンパク質は製造業者の指示に従って調製された。その後、合計２５０μｇのビオチン化ＣＲＰタンパク質が５０μｌのＳＡ−ＭＮＰ試薬またはＳＡ−ＭＭＰ試薬と混合され、一晩４℃でインキュベートされた。ストレプトアビジンとビオチンとの間の高親和性結合は、磁性粒子とビオチン化ＣＲＰタンパク質との間の結合を確保した。ここでは、標的ＣＲＰはストレプトアビジン−ビオチンの結合によって磁性粒子（ＭＮＰまたはＭＭＰ）に付着され、ストレプトアビジン−ビオチンは結合対とみなしてもよい。次にインキュベートされた溶液に磁気分離が行われ、磁気スタンド（Ｍａｇｑｕ）を用いることにより非結合ビオチン化ＣＲＰが除去された。ＣＲＰ−ＭＮＰおよびＣＲＰ−ＭＭＰは５０μｌのＰＢＳ−Ｔ（５０ｎＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に再懸濁され、それぞれＣＲＰ標識磁性ナノ粒子試薬（ＣＲＰ−ＭＮＰ試薬）およびＣＲＰ標識磁性マイクロ粒子試薬（ＣＲＰ−ＭＭＰ試薬）を形成し、４℃で保存された。ＣＲＰ−ＭＮＰ試薬中のビオチン化ＣＲＰの最終濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）により決定され、１８８．４７±１．３０ｎｇ／μｌであり、ＣＲＰ−ＭＭＰ試薬中では１４３．９５±４．２９ｎｇ／μｌである。使用前、ＣＲＰ−ＭＮＰ試薬およびＣＲＰ−ＭＭＰ試薬の両方は結合バッファ（ＢＤバッファ：５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄された。各洗浄ステップ中、磁気スタンドが用いられ、ＣＲＰ−ＭＮＰおよびＣＲＰ−ＭＭＰが回収された。同様に、ＳＡ−ＭＮＰおよびＳＡ−ＭＭＰが必要な場合、ストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子試薬（ＳＡ−ＭＮＰ試薬）およびストレプトアビジン被覆磁性マイクロ粒子試薬（ＳＡ−ＭＭＰ試薬）が結合バッファで３回洗浄され、ＳＡ−ＭＮＰおよびＳＡ−ＭＭＰが磁気スタンドを用いて回収された。
（ＭＡＲＡＳの実験装置）
ＭＡＲＡＳプロトコルを行うための実験装置を以下に記載した。実験装置は、振動磁場を発生させるための少なくとも２セットのコイル１００、電力増幅器２００、信号発生器３００を備え、ＬＡＢＶＩＥＷコンピュータプログラムで操作される。ＭＡＲＡＳにおいて用いられる振動磁場は、回転磁場ＭＡＲＡＳ（ＲＯ−ＭＡＲＡＳ）の場合は回転磁場または交流磁場ＭＡＲＡＳ（ＡＣ−ＭＡＲＡＳ）の場合は交流磁場であってもよい。ＲＯ−ＭＡＲＡＳについて、回転磁場は直交に配置された２セットのヘルムホルツコイルにより発生した。ＬＡＢＶＩＥＷプログラムが用いられ、２つの信号、ｃｏｓ（ωｔ）およびｓｉｎ（ωｔ）がＮＩ ＢＮＣ−２１１０キャプチャボックスを通して２チャンネル電力増幅器（ＨＣＡ３０３０Ｄ）に送信された。これらの２つの信号は次に同様に増幅され、これは２セットのコイルを同時に駆動し、回転磁場を生成した。実験装置は図１Ａに概略的に示される。図において、試料は２セットのヘルムホルツコイルの中心線の交点に配置された。しかしながら、回転磁場を発生させるのに他の代替装置を用いてもよい。ＡＣ−ＭＡＲＡＳについて、磁場は、試料がソレノイド内に配置された図１Ｂにおいて概略的に示されるように、電流発生器ユニットにより駆動された単一の励磁ソレノイドにより発生した。なお、図１Ａの装置は、コンピュータプログラムが１つの信号のみを１セットのヘルムホルツコイルに送信する場合、ＡＣ−ＭＡＲＡＳに用い、ＡＣ磁場を発生させることもできる。さらに、交流磁場を発生させるのに他の代替装置を用いてもよい。また、信号発生器（３００）からのサインおよびコサイン信号に電力増幅器（２００）の異なる増幅因子を用いることにより発生させることができる楕円磁場のような、他のタイプの振動磁場も印加可能であり得る。
ＤＮＡアプタマーは特定の標的分子に結合するオリゴ核酸配列であり、アプタマーは通常大きなランダム配列プールから選択することにより得られる。ＭＡＲＡＳプロトコルの後、ＭＡＲＡＳプロトコルによりスクリーニングされた選択されたアプタマーにクローニング、ＰＣＲ増幅および（解離定数に関する）結合親和性計算のようなポスト分析を行ってもよい。
（ＭＡＲＡＳプロトコル）
ＭＡＲＡＳプロトコルは下記のプロセス：複数のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのランダム配列ライブラリおよびその上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む試料を提供するステップ；振動磁場を試料に印加することにより磁気アシストスクリーニングを行うステップ；磁気分離を行い、その上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合したオリゴヌクレオチド配列からなる結合混合物を回収するステップ；結合混合物を結合バッファ中に分散させるステップ；溶液を加熱し、その上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から複数のオリゴヌクレオチド配列を溶出するステップ；磁気スタンドを用いることにより磁気分離を行い、上澄みを回収し、その上に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を除去するステップ；回収された上澄みを９５℃まで５分間加熱し、４℃で急冷するステップ；陰性選択を行い、その上に標的分子が結合していない複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合したアプタマーを除去し、標的分子に特異的なアプタマーを選択するステップ；ならびに磁気分離を行い、標的分子に特異的な複数のオリゴヌクレオチド配列を有する上澄みを回収するステップとしてまとめられ得る。
（選択されたアプタマーのクローニングおよび配列決定分析）
各ＭＡＲＡＳ実験ステップから回収された上澄みは、その後のＰＣＲ増幅のため、１ｍｌの１００％冷アルコールで沈殿され、１００μｌのｄｄＨ２Ｏにより希釈された。回収された上澄みはその後ＰＣＲによりＬａｂ−ＦおよびＬａｂ−Ｒプライマーで増幅された。１．２５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｎＭのプライマーを含有するＰＣＲ反応は、下記の条件下で行われた：９５℃で５分；９５℃で４０秒の３５サイクル、６０℃で４０秒、７２℃で４０秒；および７２℃で１０分。ＰＣＲ産物はＤＮＡ抽出ミニプレップシステム（Ｖｉｏｇｅｎｅ、台湾台北）を用いることにより精製された。精製産物はｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）にサブクローニングされた。クローニング手順は製造業者の指示に従って行われた。選択されたコロニーのプラスミドは高速プラスミドミニキット（Ｇｅｎｅａｉｄ、台湾台北）を用いることにより精製された。プラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰＲＩＳＭ３７３０ＤＮＡ自動配列決定装置およびＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル配列決定キット（米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いることにより配列決定された。
（リアルタイム定量ＰＣＲによるアプタマー結合親和性の評価）
アプタマーの標的ＣＲＰに対する親和性は、リアルタイムＰＣＲにより測定された、平衡解離定数（Ｋｄ）により表された。クローニング実験から選択された各プラスミドについて、１０ｎｇのアプタマークローンプラスミドがＰＣＲテンプレートとして用いられ、Ｌａｂ−ビオチン−ＲおよびＬａｂ−Ｆプライマーで二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が生成された。ＰＣＲ条件および手順は上述したとおりだった。ＰＣＲ増幅の完了後、ＰＣＲ産物は、５μｌのＳＡ−ＭＮＰ試薬の洗浄から得られた、ＳＡ−ＭＮＰと混合された。順方向一本鎖アプタマー（非ビオチン化鎖）は、０．１５Ｎの新鮮なＮａＯＨと５分間インキュベートされることにより、固定化相補的鎖から分離された。結合ＳＡ−ＭＮＰは磁気スタンドにより除去された。当量の０．１５ＮのＨＣｌが回収された上澄みに添加され、最終ｐＨが７．０に調節され、その後順方向ｓｓＤＮＡが１ｍｌの１００％氷冷アルコールで沈殿された。なお、逆方向一本鎖アプタマーは、結合混合物を９４℃で溶出した後、磁気分離を行うことにより生成することもできる。また、順方向および逆方向一本鎖アプタマーは、ＰＣＲ増幅中にＬａｂ−ビオチン−ＦおよびＬａｂ−Ｒプライマーを用いることにより単離することもできる。一本鎖アプタマーの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国デラウェア州ウィルミントン）で決定された。２０μｌのＢＤバッファ中の一連の漸次希釈アプタマー（２００ｎＭ〜１．５６２５ｎＭ）は、二次構造の形成のため、９５℃まで５分間加熱され、４℃で冷却された。部分希釈アプタマーはインプット対照（インプット）として保持された。５μｌのＣＲＰ−ＭＮＰ試薬の洗浄から得られたＣＲＰ−ＭＮＰは、希釈アプタマーを含有する各マイクロチューブ中に添加され、３０分間室温でインキュベートされた。結合ＣＲＰ−ＭＮＰは１００μｌのＢＤバッファで２回洗浄された。結合アプタマーは、最終体積２０μｌのｄｄＨ２Ｏ中で９４℃で１０分間加熱することにより、ＣＲＰ−ＭＮＰから溶出された。溶液中のＣＲＰ−ＭＮＰが磁気スタンドで除去され、上澄みが回収された。インプット対照および溶出アプタマーの両方は１ｍｌの１００％氷冷アルコールで沈殿された。インプット対照および溶出アプタマーは１００μｌのｄｄＨ２Ｏを充填した試験チューブ中で別々に溶解された。インプット対照チューブおよび溶出アプタマーチューブを含む、各試験チューブ中のアプタマーの量はリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）により計算された。ｑ−ＰＣＲはＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェル反応プレートで行われ、閾値サイクル（ｃｔ）値はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムソフトウェア、バージョン２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で最大相関係数アプローチを用いて自動的に計算された。各ｑ−ＰＣＲランのための混合物は、２．５μｌのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに０．５ｎＭのプライマーＬａｂ順方向およびＬａｂ逆方向を含有する１０μｌだった。反応条件は下記のとおりだった：９５℃で３分間；９４℃で３０秒間の４０サイクル、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間。インプット対照および溶出アプタマー中のアプタマーの濃度は、最大結合の指標として２００ｎＭのアプタマーを用いて計算された。選択されたアプタマーのＫｄ値は次に、曲線適合プログラム、（ｃｕｒｖｅｅｘｐｅｒｔ．ｗｅｂｈｏｐ．ｎｅｔからの）ＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ１．３によって実験データに基づき飽和結合曲線を適合することにより決定された。
（ＭＡＲＡＳ手順のパラメータ依存性）
１ナノモルの２０Ｎランダム化オリゴヌクレオチドライブラリは、マイクロチューブ中でＢＤバッファで１０μｌまで希釈され、９５℃まで５分間加熱され、４℃で急冷された。５μｌのＣＲＰ−ＭＮＰ試薬の洗浄から得られたＣＲＰ−ＭＮＰはマイクロチューブ中に添加され、３０分間室温でインキュベートされた。ＣＲＰ−ＭＮＰに結合したオリゴヌクレオチド配列は磁気スタンドに誘引されるので、非結合オリゴヌクレオチド配列は除去され、結合混合物は１ｍｌのＢＤバッファで３回洗浄された。１００μｌのＢＤバッファが添加され、試料としてマイクロチューブ中で結合混合物が再懸濁された。印加された磁場は回転磁場（ＲＯ−ＭＡＲＡＳ）または交流磁場（ＡＣ−ＭＡＲＡＳ）のいずれかだった。磁場の強度は試料位置でガウスメータにより測定された。
ＲＯ−ＭＡＲＡＳの周波数依存性の研究について、結合混合物（試料）に、磁気アシストスクリーニングのため、一定の磁場強度（１４ガウス）および変動する磁場周波数（例えば：２Ｈｚ、２０Ｈｚ、２００Ｈｚ、２０００Ｈｚ、２０ＫＨｚおよび２７ＫＨｚ）を有する回転磁場が印加された。複数回の磁気アシストスクリーニングが行われ、標的分子に対して異なる結合親和性を有するアプタマーが単離（選択）される。図２は本発明の１つの実施形態によるＲＯ−ＭＡＲＡＳの周波数依存性の分析のプロセスフローを概略的に示す。この例では、用いられる電力増幅器のため、達することができるもっとも高い周波数はＲＯ−ＭＡＲＡＳについて１４ガウスの磁場強度で２７ＫＨｚである。まず、試料に２Ｈｚの磁場が１０分間印加された後、磁性ナノ粒子に対する磁場の作用による凝集を回避するため、ピペティングにより２．５分毎に撹拌された。振動磁場を試料に印加する目的は、オリゴヌクレオチド配列およびＣＲＰ−ＭＮＰ間の結合上に競合機構を生成することである。試料に振動磁場が印加される際、試料の結合混合物には、溶液中の磁性粒子の回転または振動運動を誘発する、試料の磁性粒子の磁気双極子および外部から印加された磁場の相互作用により生成された駆動トルク、ならびに水溶液中の磁性粒子の運動による散逸トルクが印加される。これらの２つのカウンタートルクは結合オリゴヌクレオチド配列およびＣＲＰ−ＭＮＰ間の結合上に伸縮力を発生させる。ＣＲＰ−ＭＮＰに結合した配列は、伸縮力がＣＲＰ−ＭＮＰへの配列の結合強度を相殺するまで解離しないだろう。競合機構の向上は、振動磁場の周波数および強度ならびに磁性粒子のサイズを増加する手段により、これらの２つのトルクを増加することにより達成することができる。この例では、振動磁場の周波数が増加すると、磁性粒子の双極子モーメントと磁場方向との間の位相遅れが増加し、磁性粒子の双極子モーメントおよび印加された磁場のベクター産物である駆動トルクの増加をもたらす。一方、駆動磁場の周波数が増加すると増加する磁性粒子のより高い角速度のため、散逸トルクも増加する。よって伸縮力は外部から印加された振動磁場の周波数を増加することにより向上させることができる。第１回目の磁気スクリーニングは２Ｈｚの磁場周波数で行われ、上澄み中の解離（非結合）ヌクレオチド配列は磁気スタンドを用いることにより回収された。１４ガウスの磁場強度ならびに２Ｈｚ、２０Ｈｚ、２００Ｈｚ、２０００Ｈｚ、２０ＫＨｚおよび２７ＫＨｚの磁場周波数の回転磁場（ＲＯ）下の２０Ｎランダム化ヌクレオチド配列ライブラリに基づき、これらの回収された非結合ヌクレオチド配列は、（表１に挙げられるように）個別の参照番号を有し、それぞれ２０Ｎ ＲＯ Ｆ２、Ｆ２０、Ｆ２００、Ｆ２Ｋ、Ｆ２０Ｋ、Ｆ２７Ｋ配列と称された。その後、１００μｌのＢＤバッファが添加され、保持された結合混合物が再懸濁され、混合物に図２に示されるように次の周波数２０Ｈｚを有する磁場が印加された。前述のプロセスは最終周波数（２７ＫＨｚ）を有する磁場が印加されるまで繰り返された。最終周波数の磁場の印加後、磁気分離の最終回が行われ、上澄みが分離され、結合混合物が保持された。最後に、１００μｌのＢＤバッファが保持された結合混合物に添加され、９５℃まで５分間加熱され、アプタマーがＣＲＰ−ＭＮＰから溶出され、上澄み中の溶出アプタマーが磁気スタンドを用いることにより回収された。次に回収された上澄みに後述する陰性選択が行われた。陰性選択後、最終上澄みは＞２７Ｋと示された。振動磁場を印加することによる上記磁気スクリーニングは陽性選択と称される。陽性選択中に標的ストレプトアビジン磁性ナノ粒子が用いられたので、得られたアプタマーは場合によっては標的の代わりにＳＡ−ＭＮＰに結合したものから選択され得る。従って、各回収された上澄みに陰性選択が行われ、これはＳＡ−ＭＮＰを用いることにより行われ、ＳＡ−ＭＮＰに結合し得るいずれのアプタマーも除去された。陰性選択は陽性選択前または後に行ってもよい。陰性選択について、５μｌのＳＡ−ＭＮＰ試薬の洗浄から得られたＳＡ−ＭＮＰが回収された上澄みに添加され、３０分間室温でインキュベートされた。次に回収された上澄みに、磁気スタンドを用いることにより磁気分離が行われ、アプタマー−ストレプトアビジン−磁性ナノ粒子が除去され、上澄みが回収された。なお、ＳＡ−ＭＭＰは陰性選択に用いることもできる。異なる磁場周波数でのさまざまな回数の磁気アシストスクリーニングからの陰性選択後に得られた上澄みは対応する周波数で称された。回収された上澄みは、クローニング、ＰＣＲ増幅および配列決定のようなさらなる分析のため、１ｍｌの１００％冷アルコールで沈殿された。
（磁性ナノ粒子でＲＯ−ＭＡＲＡＳを用いることにより選択されたアプタマーの特徴付け）
さまざまな回転磁場周波数の磁気アシストスクリーニング（陽性選択および陰性選択）から得られたアプタマーは２０Ｎ ＲＯ Ｆ２（−１、−２）、２０Ｎ ＲＯ Ｆ２０（−４、−５）、２０Ｎ ＲＯ Ｆ２００（−１、−３）、２０Ｎ ＲＯ Ｆ２Ｋ（−１、−４）、２０Ｎ ＲＯ Ｆ２０Ｋ（−１、−２）、２０Ｎ ＲＯ Ｆ２７Ｋ（−４、−６）および２０Ｎ ＲＯ ＞Ｆ２７Ｋ（−１、−５）と称され、選択された２０Ｎアプタマーの配列決定結果は表１に挙げた。
解離定数（Ｋｄ）はｑ−ＰＣＲおよび非線形適合曲線により計算された。図３は、本発明の１つの実施形態によるＲＯ−ＭＡＲＡＳにおいて用いられた磁場周波数およびＲＯ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）の関係を示す。図３の結果は、ＲＯ−ＭＡＲＡＳの磁場周波数が増加すると、ＲＯ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）が減少することを示す。ＲＯ−ＭＡＲＡＳにより１４ガウスの一定の磁場強度および一連の周波数でスクリーニングされた２０Ｎアプタマーのもっとも低いＫｄ値は、２０Ｎ ＲＯ ＞２７Ｋ−１アプタマーの６．２６ｎＭだった。換言すると、より高い結合親和性を有するアプタマーは、ＲＯ−ＭＡＲＡＳの磁場周波数を増加することによりスクリーニングすることができる。これは競合機構を確認し、選択されたアプタマーの標的に対する親和性は駆動磁場の周波数を増加することにより向上させることができることを示す。これはＲＯ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされたアプタマ−の標的分子に対する親和性が印加された回転磁場周波数に依存することも示す。より高い磁場周波数および磁場強度でのＭＡＲＡＳの選択パラメータを最適化するため、磁場強度および周波数を含む、印加された交流磁場（ＡＣ−ＭＡＲＡＳ）の選択されたアプタマ−の親和性に対する効果が研究された。２０Ｎランダム化オリゴヌクレオチド配列ライブラリのＣＲＰ−ＭＮＰとの結合混合物の調製は上述したとおりだった。磁場周波数依存性の分析では、一定の磁場強度（２５ガウス）および変動する磁場周波数（例えば：２Ｈｚ、２０Ｈｚ、２００Ｈｚ、２ＫＨｚ、２０ＫＨｚおよび２００ＫＨｚ）を有するＡＣ磁場が図１Ｂの装置によって印加された。まず、結合混合物に２５ガウスおよび２ＨｚのＡＣ磁場が１０分間印加された。磁場の印加中、混合物はピペティングにより２．５分毎に撹拌された。１回の磁気アシストスクリーニング後、磁気分離が行われ、上澄みが回収され、結合混合物が１００μｌのＢＤバッファ中に再懸濁された。混合物により高い周波数（例えば２０Ｈｚ）を有する別のＡＣ磁場が連続して印加された。上記手順は最終周波数（２００ＫＨｚ）を有するＡＣ磁場が印加されるまで繰り返された。
最終周波数の磁場の印加後、磁気分離が行われ、上澄みが分離され、結合混合物が保持された。最後に、１００μｌのＢＤバッファが添加され、保持された結合混合物が再懸濁され、次に溶出のため９５℃まで５分間加熱された。上澄み中の溶出アプタマーは磁気スタンドにより分離され、回収された上澄みに上述したように陰性選択が行われた。ＳＡ−ＭＮＰに結合し得るいずれのアプタマーも除去する陰性選択が行われる最終上澄みは＞２００Ｋと示された。また、陰性選択が異なる周波数を有するＡＣ磁場の印加から得られたそれぞれの回収された上澄みについて行われ、アプタマー−ストレプトアビジン−磁性ナノ粒子が除去され、上澄みが回収された。陰性選択はＡＣ−ＭＡＲＡＳにおいて陽性選択前または後に行われてもよい。陰性選択後、異なる磁場周波数でのさまざまな回数の磁気アシストスクリーニングから得られた上澄みは、対応する周波数として称された。すべての回収された上澄みは、ＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定のような、さらなる分析のため１ｍｌの１００％冷アルコールで沈殿された。
（磁性ナノ粒子でＡＣ−ＭＡＲＡＳを用いることにより選択されたアプタマーの特徴付け）
２Ｈｚ、２０Ｈｚ、２００Ｈｚ、２０００Ｈｚ、２０ＫＨｚおよび２００ＫＨｚの磁場周波数の交流磁場（ＡＣ）下の２０Ｎランダム化ヌクレオチド配列ライブラリに基づき、これらの回収された非結合ヌクレオチド配列は、（表２に挙げられるように）個別の参照番号を有する２０Ｎ ＡＣ Ｆ２（−２、−４）、Ｆ２０（−２、−４）、Ｆ２００（−１、−２）、Ｆ２Ｋ（−１、−４）、Ｆ２０Ｋ（−１、−３）、Ｆ２００Ｋ（−１、−２）、＞２００Ｋ（−１、−２）と示された。
図４は、本発明の１つの実施形態によるＡＣ−ＭＡＲＡＳにおいて用いられた磁場周波数およびＡＣ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）の関係を示す。図４の結果は、ＡＣ−ＭＡＲＡＳの磁場周波数が増加すると、ＡＣ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）が減少することを示す。ＡＣ−ＭＡＲＡＳにより２５ガウスでスクリーニングされた２０Ｎアプタマーのもっとも低いＫｄ値は、２０Ｎ ＡＣ ＞２００Ｋ−２アプタマーの８．３５ｎＭだった。ＡＣ−ＭＡＲＡＳまたはＲＯ−ＭＡＲＡＳによって得られた対応するＫｄ値およびＫｄ値対磁場周波数の曲線は同様である。図３または４の結果に基づき、選択されたアプタマーのＫｄはＲＯ−ＭＡＲＡＳまたはＡＣ−ＭＡＲＡＳのいずれについても周波数依存的である。
上記結果によると、（ＡＣ−ＭＡＲＡＳおよびＲＯ−ＭＡＲＡＳを含む）ＭＡＲＡＳにより選択されたアプタマーの結合親和性は、ＭＡＲＡＳの印加された磁場周波数に高度に依存する。ＭＡＲＡＳの磁場条件を最適化するため、その後の実験ではより高い磁場強度が用いられた。
磁場強度依存性の分析について、固定周波数（１００ＫＨｚ）および変動する磁場強度（例えば：１２．５ガウス、２５ガウス、５０ガウス、１００ガウス、２００ガウスおよび４００ガウス）のＡＣ磁場を用いるＡＣ−ＭＡＲＡＳは図１Ｂの装置で行われた。実験手順は周波数依存性の分析の手順と同様だった。また、回収された上澄みは上述したものと同様の指定スキームを用いて示された。陰性選択後、一連の上澄みは回収され、すべての回収された上澄みはさらなるＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定のため１ｍｌの１００％冷アルコールで沈殿された。
（高磁場強度ＭＡＲＡＳ（ＨＡＣ−ＭＡＲＡＳ）から選択されたアプタマーの特徴付け）
１００ＫＨｚの固定磁場周波数ならびに１２．５ガウス（１２．５ｇ）、２５ガウス、５０ガウス、１００ガウス、２００ガウスおよび４００ガウスの高磁場強度の交流磁場（ＡＣ）下の２０Ｎランダム化ヌクレオチド配列ライブラリに基づき、これらの回収されたアプタマー配列は２０Ｎ ＨＡＣ １２．５ｇ（−１、−２）、２０Ｎ ＨＡＣ ２５ｇ（−１、−２）、２０Ｎ ＨＡＣ ５０ｇ（−２、−９）、２０Ｎ ＨＡＣ １００ｇ（−１、−２）、２０Ｎ ＨＡＣ ２００ｇ（−２、−３）、２０Ｎ ＨＡＣ ４００ｇ（−１、−５）および２０Ｎ ＨＡＣ ＞４００ｇ（−１、−４）と示され、アプタマーの配列決定結果は表３に挙げた。

HAC:高磁場強度
ＨＡＣ−ＭＡＲＡＳにより１００ＫＨｚの固定磁場周波数でスクリーニングされた２０Ｎアプタマーのもっとも低いＫｄ値は、２０Ｎ ＨＡＣ ４００ｇ−１アプタマーの５．６７ｎＭだった。図５は、本発明の１つの実施形態によるＨＡＣ−ＭＡＲＡＳにおいて用いられた磁場強度およびＨＡＣ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０Ｎアプタマーの解離定数（Ｋｄ）の関係を示す。図５の曲線は、ＨＡＣ−ＭＡＲＡＳの印加された磁場強度が増加すると、選択された２０ＮアプタマーのＫｄ値が減少することを示す。よって、標的に対してより高親和性のアプタマーは、印加されたＡＣ磁場の磁場強度の増加からもたらされた競合機構を向上させることにより得ることができる。向上は、磁性粒子がより高い強度を有する振動磁場下で回転または振動する場合、より高い磁場強度およびより大きな瞬間旋回速度からもたらされたより大きな駆動トルクによる。競合機構の同じ向上をＲＯ−ＭＡＲＡＳについて回転磁場の磁場強度を増加することにより達成することができることも推測することができる。
よって、ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされたアプタマーの結合親和性は、印加された磁場の強度または周波数のいずれかに依存する。さらに、所望の範囲の解離定数を有する標的分子に対するアプタマーは、ＭＡＲＡＳプロトコルの印加された磁場の下部カットオフおよび上部カットオフ周波数および／または強度を適切に選択することにより、選択することができる。
（ワンショットＭＡＲＡＳ（ＯＳ−ＭＡＲＡＳ）手順）
標的分子に対して高い結合親和性を有するアプタマーの選択のためのＭＡＲＡＳプロトコルの強度をさらに示すため、ＲＯ−ＭＡＲＡＳの図１Ａの装置を用いてワンショットＭＡＲＡＳ（ＯＳ−ＭＡＲＡＳ）が行われた。ワンショットＭＡＲＡＳ実験では、異なる長さの中央部を有する３タイプのランダム化オリゴヌクレオチド配列（６０Ｎ、４０Ｎおよび２０Ｎ）が配列ライブラリとして用いられ、選択されたアプタマーの標的分子に対する親和性に対する配列長さの影響が同時に評価される。ワンショットＲＯ−ＭＡＲＡＳ（ＯＳ−ＲＯ−ＭＡＲＡＳ）実験は１４ガウスおよび２０ＫＨｚで行われた。６０Ｎ、４０Ｎおよび２０ＮライブラリのＣＲＰ−ＭＮＰとの結合混合物は上述したように調製された。各結合混合物に１４ガウスおよび２０ＫＨｚの回転磁場が１０分間印加され、２．５分毎にピペティングにより撹拌された。１回の磁気アシストスクリーニング後、上澄みは磁気スタンドを用いることにより除去され、保持された結合混合物は１００μｌのＢＤバッファで再懸濁された。その後、保持された結合混合物は溶出のため９５℃まで５分間加熱された。上澄み中の溶出アプタマーは磁気スタンドにより分離され、回収された上澄みに上述したように陰性選択が行われた。陰性選択が行われ、いずれのＳＡ−ＭＮＰ結合アプタマーも除去された。もう１回磁気分離が行われ、上澄みが回収され、これは次にさらなる分析のため１ｍｌの１００％冷アルコールで沈殿された。２つのアプタマーが配列決定および結合親和性計算のため各実験から選択された。また、ＡＣ−ＭＡＲＡＳの図１Ｂの装置を用いる高磁場でのワンショットＡＣ−ＭＡＲＡＳ（ＯＳ−ＡＣ−ＭＡＲＡＳ）は、上述した同様の手順に従って、１００ガウスおよび１５０ＫＨｚのＡＣ磁場を用いて行われた。
ワンショットＲＯ−ＭＡＲＡＳ（ＯＳ−ＲＯ−ＭＡＲＡＳ）によりスクリーニングされた選択された６０Ｎ、４０Ｎおよび２０Ｎアプタマーは、ＯＳ−ＲＯ−６０Ｎ＞２０Ｋ（−１、−２）、ＯＳ−ＲＯ−４０Ｎ＞２０Ｋ（−１、−２）、およびＯＳ−ＲＯ−２０Ｋ＞２０Ｋ（−３、−６）と称され、配列決定結果は表４に挙げた。ＯＳ−ＲＯ−ＭＡＲＡＳ実験について、スクリーニングされた２０Ｎアプタマーは、ＲＯ−ＭＡＲＡＳによって連続した磁気アシストスクリーニングで選択されたＦ２７Ｋおよび＞２７Ｋと称される２０Ｎアプタマーに対応する。
６０Ｎ、４０Ｎおよび２０Ｎアプタマーの結合親和性はｑ−ＰＣＲおよび非線形適合曲線により計算され、ワンショットＲＯ−ＭＡＲＡＳ実験から選択されたアプタマーの解離定数Ｋｄの平均値は表５に示した。
結果は、ＯＳ−ＲＯ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされたアプタマーのＫｄ値が以前の結果、すなわちアプタマーのＫｄ値と一貫していることを示した。例えば、１２．１９±０．３１ｎＭのＫｄを有するアプタマーＯＳ−ＲＯ−２０Ｎ＞２０ＫＨｚ対２２．５３ｎＭのＫｄを有するアプタマー２０Ｎ ＲＯ Ｆ２７Ｋ−６および６．２６ｎＭのＫｄを有するアプタマー２０Ｎ ＲＯ ＞２７Ｋ−１が図３に示された。
１００ガウスおよび１５０ＫＨｚの周波数で行われたワンショットＡＣ−ＭＡＲＡＳについて、ＯＳ−ＡＣ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された６０Ｎ、４０Ｎおよび２０ＮアプタマーはＯＳ−ＡＣ−６０Ｎ（−１、−２）、ＯＳ−ＡＣ−４０Ｎ（−６、−７）、およびＯＳ−ＡＣ−２０Ｎ（−１、−２）と称され、選択されたアプタマーの配列決定結果は表６に示した。
ワンショットＡＣ−ＭＡＲＡＳ実験からの選択された６０Ｎ、４０Ｎおよび２０ＮアプタマーのＫｄの平均値は表７に示した。
異なる長さ（６０Ｎ、４０Ｎ、および２０Ｎ）のランダム化オリゴヌクレオチド配列から選択されたアプタマーの解離定数の結果を比較すると、選択されたアプタマ−の結合親和性がＭＡＲＡＳプロトコルのランダム化オリゴヌクレオチド配列の長さから独立していることを示す。
また、前記のとおり、陽性選択前に陰性選択を行うことができ、これは逆方向ＭＡＲＡＳプロトコルと称される。逆方向ＲＯ−ＭＡＲＡＳ実験について、２０Ｎランダム化オリゴヌクレオチド配列が初期ライブラリとして用いられた。１ナノモルの２０Ｎランダム化オリゴヌクレオチド配列ライブラリにまず陰性選択が行われ、磁気分離が行われ、磁気スタンドを用いることにより結合混合物から上澄みが分離された。ライブラリの調製および陰性選択の手順は上述したとおりだった。陰性選択が行われる回収された上澄みは低減ライブラリとして作用させた。低減ライブラリは上述したようにＣＲＰ−ＭＮＰとインキュベートされた。結合混合物に１４ガウスおよび２０ＫＨｚの回転磁場が１０分間印加され、２．５分毎にピペティングにより撹拌された。１回の磁気アシストスクリーニング後、上澄みが除去され、保持された結合混合物が１００μｌのＢＤバッファで再懸濁された。その後、混合物は溶出のため９５℃まで５分間加熱され、もう１回磁気分離が行われ、上澄みが回収され、これは次にさらなる分析のため１ｍｌの１００％冷アルコールで沈殿された。逆方向ＡＣ−ＭＡＲＡＳ実験は１５０ＫＨｚおよび１００ガウスの交流磁場で行われた。逆方向ＡＣ−ＭＡＲＡＳの手順は逆方向ＲＯ−ＭＡＲＡＳのものと同様だった。
表８はＭＡＲＡＳおよび逆方向ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされたアプタマーの解離定数Ｋｄの比較を示す。
表８の結果は、ＭＡＲＡＳおよび逆方向ＭＡＲＡＳからの選択されたアプタマーの解離定数が同様および同等だったことを示す。従って、陽性選択および陰性選択を行う順番（すなわち、陽性選択が先か陰性選択が先か）は選択されたアプタマーの質（解離定数に関する標的への結合親和性）を変えないだろう。
ＭＡＲＡＳに用いられる磁性粒子を有効にするため、ナノメートルサイズに限定されず、磁性マイクロ粒子（Ｍｉ）を用いることによりＭｉ−ＭＡＲＡＳが行われた。ＣＲＰ−ＭＮＰは陽性および陰性選択中でＣＲＰ−ＭＭＰに置換された。アプタマー−ＣＲＰ−ＭＭＰの結合混合物の調製は、ＣＲＰ−ＭＭＰを用いる以外、アプタマー−ＣＲＰ−ＭＮＰのそれと同じだった。混合物にＡＣ磁場が１０分間印加され、２．５分毎にピペティングにより撹拌され、マイクロ磁性粒子の凝集および沈殿が回避された。１００ＫＨｚの周波数および４００ガウスの強度を有するＡＣ磁場がワンショットＭｉ−ＭＡＲＡＳプロトコルに用いられた。陽性選択後、陰性選択が行われ、５μｌのＳＡ−ＭＭＰ試薬の洗浄から得られたＳＡ−ＭＭＰを用いることにより、いずれのＳＡ−ＭＭＰ結合アプタマーも除去された。陰性選択の手順は、ＳＡ−ＭＭＰを用いる以外、前述したものと同じだった。なお、ＳＡ−ＭＮＰを陰性選択に用いることもできる。プロセスの詳細は上記のセクションに記載したとおりだった。ワンショットＭｉ−ＭＡＲＡＳによりスクリーニングされた選択された２０ＮアプタマーはＯＳ−Ｍｉ−２０Ｎ−１およびＯＳ−Ｍｉ−２０Ｎ−２と称され、選択されたアプタマーの配列決定結果は表９に示した。
ワンショットＭｉ−ＭＡＲＡＳ実験から選択されたアプタマーのＫｄの平均値は０．８２５±０．７１ｎＭ（Ｋｄ０．３３ｎＭのＯＳ−Ｍｉ−２０Ｎ−１およびＫｄ１．３３ｎＭのＯＳ−Ｍｉ−２０Ｎ−２）だった。より大きなサイズを有する磁性粒子は、磁性粒子に作用する磁気トルクおよび散逸トルクを増加することにより、競合機構を向上させることができることを示す。向上は、磁性粒子のより大きな双極子モーメントからもたらされたより高い駆動トルクおよび水溶液中で回転または振動する際の磁性粒子のより高い旋回速度からもたらされたより高い散逸トルクのためである。
要約すると、ＭＡＲＡＳプロセスによって選択されたアプタマーは標的と相互作用することができる。また、ＭＡＲＡＳによって選択されたアプタマーの解離定数は磁場依存性であり、そのＫｄ値は磁場周波数および磁場強度が増加すると減少する。加えて、標的と結合する一本鎖アプタマーの解離定数は、ＭＡＲＡＳプロトコル下で適切な周波数および強度の回転または交流磁場を印加することにより、数ナノモル（ｎＭ）のレベルであり得る。さらに、ＭＡＲＡＳプロトコルにおいて、磁性ナノ粒子の代わりにバイオ機能化磁性マイクロ粒子が用いられた場合、選択されたアプタマーの解離定数はピコモル（ｐＭ）レベルにさえ達し得た。ＡＣ−ＭＡＲＡＳにより選択された一本鎖アプタマーの結合親和性は、同じ磁場条件下でＲＯ−ＭＡＲＡＳにより選択されたアプタマーのそれと同様だった。
また、標的分子に特異的であり、これに対して所定の結合親和性を有する（すなわち所望の範囲内の解離定数を有する）１つ以上のアプタマーは、ＭＡＲＡＳプロトコルの印加された磁場の下部カットオフおよび上部カットオフ磁場周波数および／または磁場強度を適切に選択することにより、選択することができる。数週から数ヶ月を必要とする従来のｓｓ−ＳＥＬＥＸプロセスと比較して、この研究に記載されたＭＡＲＡＳプロトコルは１時間未満以内に完了することができ、消費する実験用品および労働力がより少ない。
本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明の構造にさまざまな変更および変形を行うことができることは当業者には明らかであるだろう。前述の観点から、本発明は、下記の特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内に該当する場合、本発明の変更および変形を含むことが意図される。
本発明は、ＤＮＡライブラリから標的結合オリゴヌクレオチドをスクリーニングするのにバイオ機能化磁性粒子を用いるアプタマー選択プロトコルを提供する。こうしたプロトコル、磁気アシスト迅速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）は、高親和性アプタマーを得るための効率的なプロトコルである。
１００：コイル
２００：電力増幅器
３００：信号発生器

Claims (35)

  1. ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのランダム配列ライブラリおよび上部に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む試料を提供するステップであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列の第１部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合される、ステップ；
    ｂ）磁気スタンドを用いることにより第１回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分を回収するステップ；
    ｃ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分をバッファ中に分散させるステップ；
    ｄ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の一部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離されるように、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分に振動磁場を印加することにより、磁気アシストスクリーニングを行うステップ；
    ｅ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離された前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記一部分が除去されるように、前記磁気スタンドを用いることにより第２回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の第２部分を回収するステップ；
    ｆ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分を前記バッファ中に分散させるステップ；
    ｇ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分を溶出するステップ；
    ｈ）前記磁気スタンドを用いることにより第３回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を除去するステップ；ならびに
    ｉ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分に陰性選択を行い、前記標的分子に特異的なアプタマーを選択するステップであって、前記標的分子に特異的な前記アプタマーが、上部に前記標的分子が結合していない前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合されない、ステップ、
    を含む、アプタマー選択プロトコル。
  2. 前記標的分子が、前記複数の磁性ナノ粒子またはミクロ粒子および前記標的分子のそれぞれに付着した結合対によって、前記標的分子が、前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合される、請求項１に記載のアプタマー選択プロトコル。
  3. 前記結合対が、前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に付着した第１成分および前記標的分子に付着した第２成分を含む、請求項２に記載のアプタマー選択プロトコル。
  4. 前記陰性選択を行うステップｉ）が、
    上部に前記第１成分が付着した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を、前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分へ加える工程、
    上部に前記第１成分が付着した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を、前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分とインキュベーションする工程；ならびに
    上部に前記第１成分が付着した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列を除去することにより、前記標的分子に特異的な前記アプタマーを得るために第４回目の磁気分離をする工程、
    を含む、請求項３に記載のアプタマー選択プロトコル。
  5. 前記振動磁場が、回転磁場である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  6. 前記回転磁場の周波数が、１Ｈｚ〜３００ＫＨｚである、請求項５に記載のアプタマー選択プロトコル。
  7. 前記回転磁場の強度が、５ガウス〜１０００ガウスである、請求項５に記載のアプタマー選択プロトコル。
  8. 前記振動磁場が、交流磁場である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  9. 前記交流磁場の周波数が、１Ｈｚ〜３００ＫＨｚである、請求項８に記載のアプタマー選択プロトコル。
  10. 前記交流磁場の強度が、５ガウス〜１０００ガウスである、請求項８に記載のアプタマー選択プロトコル。
  11. 前記磁性ナノ粒子のサイズが、５ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  12. 前記磁性マイクロ粒子のサイズが、０．５０μｍ〜５０μｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  13. ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのランダム配列ライブラリを含む試料を提供し、バッファで希釈するステップ；
    ｂ）上部に標的分子が結合していない複数の第１磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子とインキュベートすることにより前記試料に陰性選択を行い、上部に前記標的分子が結合していない前記複数の第１磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合していない前記複数のオリゴヌクレオチド配列の第１部分を単離するステップ；
    ｃ）第１回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合していない前記複数の第１磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列を前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分から除去するステップ；
    ｄ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分を、上部に標的分子が結合した複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子とインキュベートするステップであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の第２部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合される、ステップ；
    ｅ）第２回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分を回収するステップ；
    ｆ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分を前記バッファ中に分散させるステップ；
    ｇ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の一部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離されるように、上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分に振動磁場を印加することにより、磁気アシストスクリーニングを行うステップ；
    ｈ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離された前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の前記部分が除去されるように、磁気スタンドを用いることにより第３回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の第３部分を回収するステップ；
    ｉ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の前記第３部分をｄｄＨ２Ｏで分散させるステップ；
    ｊ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の前記第３部分を溶出するステップ；ならびに
    ｋ）第４回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を除去し、前記標的分子に特異的なアプタマーを得るステップ、
    を含む、アプタマー選択プロトコル。
  14. 前記標的分子が、結合対によって前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合され、前記結合対が、前記複数の第２磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に付着した第１成分および前記標的分子に付着した第２成分を含む、請求項１３に記載のアプタマー選択プロトコル。
  15. 前記複数の第１磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子が、上部に結合した第１成分を有する、請求項１４に記載のアプタマー選択プロトコル。
  16. 前記振動磁場が、回転磁場である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  17. 前記回転磁場の周波数が、１Ｈｚ〜３００ＫＨｚである、請求項１６に記載のアプタマー選択プロトコル。
  18. 前記回転磁場の強度が、５ガウス〜１０００ガウスである、請求項１６に記載のアプタマー選択プロトコル。
  19. 前記振動磁場が、交流磁場である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  20. 前記交流磁場の周波数が、１Ｈｚ〜３００ＫＨｚである、請求項１９に記載のアプタマー選択プロトコル。
  21. 前記交流磁場の強度が、５ガウス〜１０００ガウスである、請求項１９に記載のアプタマー選択プロトコル。
  22. 前記第１または第２磁性ナノ粒子のサイズが、５ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  23. 前記第１または第２磁性マイクロ粒子のサイズが、０．５０μｍ〜５０μｍである、請求項１３〜２１のいずれか1項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  24. ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのランダム配列ライブラリおよび上部に標的分子が結合した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む試料を提供するステップであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列の第１部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合される、ステップ；
    ｂ）磁気スタンドを用いることにより第１回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分を回収するステップ；
    ｃ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分をバッファ中に分散させるステップ；
    ｄ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の一部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離されるように、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分に第１振動磁場を印加することにより、第１磁気アシストスクリーニングを行うステップ；
    ｅ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離された前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記部分が除去されるように、前記磁気スタンドを用いることにより第２回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の第２部分を回収するステップ；
    ｆ）上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分を前記バッファ中に分散させるステップ；
    ｇ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の一部分が、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離されるように、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分に第２振動磁場を印加することにより、第２磁気アシストスクリーニングを行うステップ；
    ｈ）前記磁気スタンドを用いることにより第３回目の磁気分離を行い、上部に前記標的分子が結合した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子から解離された前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の第３部分を回収するステップ；ならびに
    ｉ）前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の前記第３部分に陰性選択を行い、前記標的分子に特異的なアプタマーを選択するステップであって、所望の親和性を有する前記標的分子に特異的な前記アプタマーが、上部に前記標的分子が結合していない前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合されない、ステップ、
    を含む、選択されたアプタマーが標的に対して所望の範囲の親和性を有するアプタマー選択プロトコル。
  25. 前記標的分子が、前記複数の磁性ナノ粒子またはミクロ粒子および前記標的分子のそれぞれに付着した結合対によって前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合され、前記結合対が、前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に付着した第１成分および前記標的分子に付着した第２成分を含む、請求項２４に記載のアプタマー選択プロトコル。
  26. 前記陰性選択を行うステップｉ）が、
    上部に前記第１成分が付着した複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を加える工程、
    上部に前記第１成分が付着した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子を、前記複数のオリゴヌクレオチド配列の前記第１部分の前記第２部分の前記第３部分とインキュベーションする工程；ならびに
    上部に前記第１成分が付着した前記複数の磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子に結合した前記複数のオリゴヌクレオチド配列を除去することにより、前記標的分子に特異的な前記アプタマーを得るため第４回目の磁気分離をする工程、
    を含む、請求項２５に記載のアプタマー選択プロトコル。
  27. 前記第１振動磁場が、前記第２振動磁場より低い磁場周波数および／または磁場強度を有する、請求項２４〜２６のいずれか1項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  28. 前記第１および第２振動磁場が、回転磁場である、請求項２７に記載のアプタマー選択プロトコル。
  29. 前記回転磁場の磁場周波数が、１Ｈｚ〜３００ＫＨｚである、請求項２８に記載のアプタマー選択プロトコル。
  30. 前記回転磁場の磁場強度が、５ガウス〜１０００ガウスである、請求項２８に記載のアプタマー選択プロトコル。
  31. 前記第１および第２振動磁場が、交流磁場である、請求項２７に記載のアプタマー選択プロトコル。
  32. 前記交流磁場の磁場周波数が、１Ｈｚ〜３００ＫＨｚである、請求項３１に記載のアプタマー選択プロトコル。
  33. 前記交流磁場の磁場強度が、５ガウス〜１０００ガウスである、請求項３１に記載のアプタマー選択プロトコル。
  34. 前記磁性ナノ粒子のサイズが、５ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
  35. 前記磁性マイクロ粒子のサイズが、０．５０μｍ〜５０μｍである、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載のアプタマー選択プロトコル。
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