CN104561260A - 磁性辅助的快速适配体选择方法 - Google Patents

磁性辅助的快速适配体选择方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种磁性辅助的快速适配体选择方法。磁性辅助的快速适配体选择方法能够有效地产生具有高亲和力以及特异性的适配体。旋转磁场或交变磁场与标靶结合的磁性微米粒子或纳米粒子组合使用以选择对标靶具有期望的亲和力以及特异性的DNA适配体。

Description

磁性辅助的快速适配体选择方法
技术领域
本发明涉及一种选择方法。具体地说，本发明涉及一种磁性辅助的快速适配体选择方法。
背景技术
指数式浓缩的配体系统进化法(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，简称SELEX)是一种用于从随机序列的大型组合库(原始库)分离DNA/RNA序列的体外选择方法，并且所分离的序列基于DNA/RNA折叠成与分子竞争的三维形状的能力结合于分子。成功的SELEX产品被称作‘适配体(aptamer)’，它的结构由结合袋组成，这些结合袋可以凭高特异性和亲和力结合于多种分子标靶，从微小分子(例如有机分子、离子、肽、蛋白质、核酸)、大分子到甚至整个细胞、病毒、寄生虫或组织。一旦针对分子标靶识别了适配体的序列，那么整个适配体可以通过化学合成来产生。此外，经官能团修饰的适配体可以增加其在各种生物应用中的稳定性，如对核酸是有害的环境。与传统的抗体产品相比较，适配体的一个优点在于不需要融合瘤和动物牺牲。适配体不仅具有成为一种出色的靶向病原性和恶性细胞或组织并且取代抗体的工具的潜能，而且还可以应用在纯化、诊断学、生物传感器以及抗感染剂上。然而，不同于抗体可以购得，对于进一步的应用适用的适配体较难以获得。
SELEX包括多轮交替的培育、分离、洗脱、扩增以及纯化步骤，这些步骤可以概括为：(1)将原始DNA库与标靶分子混合；(2)将结合于标靶分子的DNA与未结合的DNA分离；(3)将结合的DNA从标靶分子洗脱；(4)洗脱的DNA通过PCR扩增以产生一种适配体浓缩的DNA库；以及(5)从所述PCR产物纯化出单链寡核苷酸。从在前一轮中获得的浓缩的序列库开始，重复此程序若干轮。通常，执行至少五轮到十五轮SELEX选择，直到不再可检测到功能性核酸物质浓缩为止。需要多轮的选择以分离出具有足够特异性和结合亲和力(例如纳摩尔解离常数，Kd)的适配体。一般说来，SELEX是一种耗时又冗长的方法。即使对于其中适配体的选择可以在数天内完成的自动化SELEX程序来说，它仍然需要大量制剂和高操作成本。另外，提出了若干功能性策略来简化此冗长的程序，包含毛细管电泳(CE-SELEX)和微流体SELEX(M-SELEX)。然而，CE-SELEX筛选结合小分子的适配体不太有效，而M-SELEX需要昂贵的微流体仪器。
因为适配体在许多方面有潜力，所以希望发展一种有效的筛选方法，它足够简单地来快速筛选出适合应用的具有高亲和力和特异性的适配体。
发明内容
本发明提供一种磁性辅助的快速适配体选择方法，它利用生物功能化的磁性粒子从DNA库筛选能与标靶结合的寡核苷酸。所述磁性辅助的快速适配体选择(Magnetic-assisted rapid aptamer selection，简称MARAS)方法是一种有效获得高亲和力适配体的方法。此外，把其它适配体选择方法也需要的材料制备和事后分析排除在外，所述适配体选择方法可以在一小时内完成，并且可以自动化使之具高产能。
本发明提供一种适配体选择方法。首先，提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子。所述多个寡核苷酸序列的一部分结合于上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子。通过施加振荡磁场到所述样品执行磁性辅助的筛选以分离结合于上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的部分。接着对所分离的结合于上面未接合标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的部分执行阴性选择。接着通过使用磁性台架执行磁性分离以分离对标靶分子具有特异性的适配体。
本发明还提供一种适配体选择方法。首先，提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子。所述标靶分子通过附接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的第一组分和附接到所述标靶分子的第二组分来接合到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子。通过施加振荡磁场来执行磁性辅助的筛选以提供竞争机制。使用上面连接有第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子，对样品执行阴性选择，以分离未结合于上面连接有第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸的一部分。然后通过使用磁性台架执行磁性分离，以分离未结合于上面连接有第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的部分，从而选择对标靶分子具有特异性的适配体。
根据本发明的实施例，所述振荡磁场是旋转磁场。
根据本发明的实施例，执行磁性辅助的筛选的工艺进一步包括通过施加固定磁场强度和多种磁场频率的旋转磁场执行多轮磁性辅助的筛选，其中每轮磁性辅助的筛选中所用的磁场频率不同于其它轮磁性辅助的筛选的磁场频率。
根据本发明的实施例，旋转磁场以14高斯施加，磁场频率在2赫兹到27千赫兹之间变化。
根据本发明的实施例，所述振荡磁场是交变磁场。
根据本发明的实施例，执行磁性辅助的筛选的工艺进一步包括通过施加固定磁场强度和多种磁场频率的交变磁场执行多轮磁性辅助的筛选，其中每轮磁性辅助的筛选中所用的磁场频率不同于其它轮磁性辅助的筛选的磁场频率。
根据本发明的实施例，所述交变磁场以25高斯施加，磁场频率在2赫兹到200千赫兹之间变化。
根据本发明的实施例，执行磁性辅助的筛选的工艺进一步包括通过施加固定磁场频率和多种磁场强度的交变磁场执行多轮磁性辅助的筛选，其中每轮磁性辅助的筛选中所用的磁场强度不同于其它轮磁性辅助的筛选的磁场强度。
根据本发明的实施例，所述交变磁场以100千赫兹施加，磁场强度在12.5高斯到400高斯之间变化。
根据本发明的实施例，所述标靶是C-反应蛋白，第一组分是链霉抗生物素蛋白(streptavidin)并且第二组分是生物素(biotin)。
为了使本发明的以上提及和其它特征以及优点可理解，下文伴随附图详细描述若干例示性实施例。
附图说明
附图包含在内以提供对本发明的进一步了解，并且并入并构成本说明书的一部分。所述图说明本发明的实施例，并且连同说明一起，用以解释本发明的原理。
图1A是根据本发明的一个实施例的旋转磁场磁性辅助的快速适配体选择(RO-MARAS)方法的实验装置的示意图；
图1B是根据本发明的一个实施例的交变磁场磁性辅助的快速适配体选择(AC-MARAS)方法的实验装置的示意图；
图2示意性说明根据本发明的一个实施例的RO-MARAS的频率相关性分析的工艺流程示意图；
图3示出在RO-MARAS中所施加的磁场频率与通过根据本发明的一个实施例的RO-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图；
图4示出在AC-MARAS中所施加的磁场频率与通过根据本发明的一个实施例的AC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图；
图5示出在AC-MARAS中所用的磁场强度与通过根据本发明的一个实施例的AC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图。
具体实施方式
本发明涉及一种适配体选择方法，它使用生物功能化的磁性粒子从DNA库筛选与标靶结合的寡核苷酸。因为C-反应蛋白(CRP)是发炎、心脏病发作、中风以及心血管疾病的一种常见指示物，所以CRP在以下实验中用作标靶并且用CRP涂布在生物官能化的磁性粒子上面以达成实验目的。本文中，CRP涂布的生物功能化的磁性纳米粒子(CRP-MNP)和CRP涂布的生物功能化的磁性微米粒子(CRP-MMP)由磁矩来驱动，磁矩是通过外加振荡磁场产生。本发明的适配体选择方法是一种磁性辅助的快速适配体选择(MARAS)方法。
在执行MARAS方法前，需要制备材料。材料制备包含制备随机序列库、制备标靶以及将标靶与随机序列库一起培育。这些制备步骤将概述于以下部分中。
寡核苷酸库和引物
三种类型的随机化的寡核苷酸序列60N、40N以及20N用作随机序列库。所述随机化的寡核苷酸序列书写为：5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-Xn-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，具有随机化的(N)聚体中间部分Xn，而n表示在10到100范围内的任何整数并且Xn意指n聚体核苷酸的核苷酸序列。举例来说，随机化的寡核苷酸序列60N、40N或20N可以是具有随机化的X60、X40或X20中间部分的核酸序列，并且随机化的X60、X40或X20中间部分分别表示随机化的60聚体序列(60个核苷酸的序列)、随机化的40聚体序列或随机化的20聚体序列。随机化的寡核苷酸序列以1毫摩尔规模合成并且进行PAGE纯化(从美国纽约州格兰德岛市的英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies,Grand Island,NY,USA)购买)。一组引物，包含Lab-正向(Lab-F)5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'(SEQ ID NO.1)和Lab-反向(Lab-R)5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'(SEQ ID NO.2)，用以在PCR扩增期间互补结合序列库的5'和3'简并区域。5'-生物素标记的引物：Lab-生物素-R，搭配有上述相同的序列，用以将正向单链从双链PCR产物分离。注意，如果选择反向单链适配体，那么Lab-生物素-F引物可以用来取代Lab-生物素-R用于单链纯化。通用的T7引物(T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID NO.3))用以对所选择的适配体的核苷酸进行测序。
CRP涂布的生物功能化的磁性粒子
含有用于此研究中的链霉抗生物素蛋白涂布的磁性纳米粒子(SA-MNP)的试剂是从磁量生技公司(Magqu)(台湾台北市的磁量生技公司(Magqu,Taipei,Taiwan))购买。试剂中SA-MNP的平均流体动力学直径是50纳米，浓度为0.3电磁单位/克。磁性纳米粒子通过将链霉抗生物素蛋白涂布在纳米粒子的最外表面上进行生物官能化并且分散在PBS(pH＝7.4)中。含有链霉抗生物素蛋白涂布的磁性微米粒子(SA-MMP)的试剂也是从磁量生技公司购买并且SA-MMP的平均流体动力学直径为约3微米，浓度为8毫克/毫升。其它的替代物，例如聚葡萄糖、单或多株抗体或胺基，亦可以用于对磁性粒子进行生物功能化。此研究中所用的人类CRP的纯度超过99％(从美国圣地亚哥市的麦伊生物资源公司(MYBIOSOURCE,San Diego USA)购买)。生物素化试剂盒(生物素标记试剂盒-NH2)是从亚诺法公司(Abnova)(台湾台北市的亚诺法公司(Abnova,Taipei,Taiwan))购买。在此研究中，使用600微克的纯CRP蛋白质并且根据制造商的说明书制备生物素化的CRP蛋白质。然后，将总共250微克生物素化的CRP蛋白质与50微升SA-MNP试剂或SA-MMP试剂混合，并且在4℃下培育过夜。链霉抗生物素蛋白与生物素之间的高亲和力结合确保了磁性粒子与生物素化的CRP蛋白质之间的结合。本文中，标靶CRP通过链霉抗生物素蛋白-生物素的结合连接到磁性粒子(MNP或MMP)，并且链霉抗生物素蛋白-生物素可以被认为是一个结合对。接着通过使用磁性台架(磁量生技公司)使培育的溶液经受磁性分离，以去除未结合的生物素化的CRP。CRP-MNP和CRP-MMP再悬浮于50微升PBS-T(50毫摩尔K2HPO4pH 7.5、150mM NaCl、0.05％吐温-20(Tween-20))中以分别形成CRP标记的磁性纳米粒子试剂(CRP-MNP试剂)和CRP标记的磁性微米粒子试剂(CRP-MMP试剂)，并且存储在4℃下。通过布拉福德分析(Bradford assay)(美国加利福利亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA.USA))进行测定，CRP-MNP试剂中生物素化的CRP的最终浓度是188.47±1.30纳克/微升，并且CRP-MMP试剂中是143.95±4.29纳克/微升。在使用前，CRP-MNP试剂与CRP-MMP试剂都用结合缓冲液(BD缓冲液(BD buffer)：50毫摩尔NaH2PO4pH 8.0、150mM NaCl、5mM KCl、2mMMgCl2、0.005％(v/v)吐温-20)洗涤三次。在每个洗涤步骤期间，磁性台架用以收集CRP-MNP和CRP-MMP。类似地，如果需要SA-MNP和SA-MMP，那么链霉抗生物素蛋白涂布的磁性纳米粒子试剂(SA-MNP试剂)和链霉抗生物素蛋白涂布的磁性微米粒子试剂(SA-MMP试剂)用结合缓冲液洗涤三次并且SA-MNP和SA-MMP使用磁性台架收集。
MARAS的实验装置
用于执行MARAS方法的实验装置描述如下。所述实验装置包含用于产生振荡磁场的至少两组线圈100、功率放大器200、信号产生器300，并且在拉维优计算机程序(LABVIEW computer program)下操作。MARAS中所用的振荡磁场可以是旋转磁场，如在旋转磁场-MARAS(RO-MARAS)的情况下，或者是交变磁场，如在交变磁场-MARAS(AC-MARAS)的情况下。对于RO-MARAS，旋转磁场是通过两组正交放置的赫姆霍兹线圈(Helmholtzcoil)产生。拉维优程序，经由NI BNC-2110捕捉盒，用以发送两个信号cos(ωt)和sin(ωt)到双通道功率放大器(HCA3030D)。此两个信号接着同等地放大，它们同时驱动两组线圈，从而产生旋转磁场。实验装置示意性示出于图1A中。图中，样品放在两组赫姆霍兹线圈的中线的交叉点。然而，其它的替代装置也可以用以产生旋转磁场。对于AC-MARAS，如图1B中示意性示出，磁场是通过由电流发生器单元驱动的单个激发螺线管产生，其中样品放在螺线管内部。注意，如果计算机程序只发送一个信号到一组赫姆霍兹线圈来产生AC磁场，那么图1A的装置也可以用于AC-MARAS。此外，其它的替代装置也可以用以产生交变磁场。此外，其它类型的振荡磁场也是可应用的，例如椭圆磁场，它可以通过针对来自信号产生器(300)的正弦和余弦信号使用不同的功率放大器(200)放大系数来产生。
DNA适配体是结合于特定标靶分子的寡核苷酸序列，并且所述适配体通常通过从一个大的随机序列库中筛选来获得。根据MARAS方法，通过MARAS方法筛选的所选择的适配体可以再进行事后分析，例如克隆、PCR扩增以及结合亲和力计算(根据解离常数)。
MARAS方法
MARAS方法可以概括为以下工艺：提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子；通过施加振荡磁场到样品来执行磁性辅助的筛选；执行磁性分离以收集结合的混合物，所述混合物由结合于上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子的寡核苷酸序列组成；将结合的混合物分散于结合缓冲液中；加热溶液以从上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子洗脱出多个寡核苷酸序列；通过使用磁性台架执行磁性分离以收集上清液并且去除上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子；加热所收集的上清液到95℃，保持5分钟，并且迅速冷却在4℃下；执行阴性选择以去除结合于上面未接合标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子的适配体以选择对标靶分子具有特异性的适配体；以及执行磁性分离以收集具有对标靶分子具有特异性的多个寡核苷酸序列的上清液。
所选择的适配体的克隆和测序分析
从每个MARAS实验步骤收集的上清液都用1毫升100％冷乙醇沉淀并且用100微升ddH2O稀释，用于随后的PCR扩增。所收集的上清液随后通过PCR，利用Lab-F和Lab-R引物扩增。PCR反应以含有1.25单位DNA聚合酶(英杰公司)、0.1mM dNTPs、0.5mM MgSO4、0.5nM引物在以下条件下执行：95℃下5分钟；95℃下40秒、60℃下40秒、72℃下40秒，循环35次；以及72℃下10分钟。PCR产物通过使用DNA提取小规模制备系统(DNAExtraction Miniprep System)(台湾台北市的富联生技公司(Viogene,Taipei,Taiwan))来纯化。纯化了的产物被亚克隆到pGEM-T伊斯载体(pGEM-T Easyvector)(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI,USA))中。克隆程序根据制造商的说明书执行。选出的菌落的质粒(plasmids)通过使用高速质粒小型试剂套组(台湾台北市的旭基公司(Geneaid,Taipei,Taiwan))来纯化。质粒通过使用应用生物系统公司普瑞姆3730DNA自动测序仪(Applied Biosystems PRISM 3730DNA automatic sequencer)和比格戴终止子循环测序试剂套组(Big Dye terminator cycle sequencing kit)(美国加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA,USA)测序。
通过即时定量的PCR估计适配体结合亲和力
适配体对标靶CRP的亲和力通过平衡解离常数(Kd)来描述，平衡解离常数是通过即时PCR来测量的。对于从克隆实验选出的每个质粒，10纳克适配体克隆质粒用作PCR模板以利用Lab-生物素-R和Lab-F引物产生双链DNA(dsDNA)。PCR条件和程序如上所述。在PCR扩增完成后，将PCR产物与从洗涤5微升SA-MNP试剂中获得的SA-MNP混合。通过与0.15当量浓度新鲜NaOH一起培育五分钟，使正向单链适配体(非生物素化的链)与固定的互补链分离。结合的SA-MNP通过磁性台架去除。等量的0.15N HCl添加到所收集的上清液中以调整最终pH值到7.0，接着正向ssDNA用1毫升100％冰冷乙醇沉淀。必须提到，反向单链适配体也可以通过在94℃下洗脱结合的混合物，接着执行磁性分离来产生。此外，正向和反向单链适配体也可以通过在PCR扩增期间使用Lab-生物素-F和Lab-R引物来分离。单链适配体的浓度用纳诺曲珀2000c分光光度计(NanoDrop 2000c spectrophotometer)(美国特拉华州威明顿的赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE,USA))测定。将一系列在20微升BD缓冲液中逐渐稀释的适配体(200纳摩尔到1.5625纳摩尔)加热到95℃，保持5分钟，并且冷却在4℃下，以形成二级结构。部分的稀释适配体作为输入对照(输入)而保留。将从洗涤5微升CRP-MNP试剂中获得的CRP-MNP添加到含有稀释适配体的每个微型管中并且在室温下培育30分钟。结合的CRP-MNP用100微升BD缓冲液洗涤两次。通过在最终体积20微升ddH2O中在94℃下加热10分钟，结合的适配体从CRP-MNP洗脱出来。溶液中的CRP-MNP利用磁性台架来去除，并且收集上清液。输入对照与洗脱的适配体都用1毫升100％冰冷乙醇沉淀。输入对照和洗脱的适配体分别溶于填充100微升ddH2O的试验管中。每个试验管，包含输入对照管和洗脱适配体管中适配体的量通过即时定量PCR(q-PCR)计算。q-PCR用麦克柔安光学96孔反应盘(MicroAmpoptical 96-well reaction plate)执行并且临界循环(ct)值使用最大相关系数方法，用斯网普实时PCR系统软件2.0版(StepOnePlus Real-Time PCR Systemssoftware,version 2.0)(应用生物系统公司)自动计算。每个q-PCR操作的混合物是10微升，含有2.5微升斯碧绿色PCR主混合物(SYBR Green PCRmaster mix)(应用生物系统公司)以及0.5纳摩尔引物Lab正向和Lab反向。反应条件如下：95℃3分钟；94℃30秒、60℃30秒以及72℃30秒，循环40次。使用200纳摩尔适配体作为最大结合的指示，计算输入对照和洗脱的适配体中适配体的浓度。所选择的适配体的Kd值接着通过基于实验数据，经由曲线拟合程序可维埃思1.3(CurveExpert1.3)(来自curveexpert.webhop.net)拟合饱和结合曲线来确定。
MARAS程序的参数相关性
在微型管中将一纳摩尔的20N随机化的寡核苷酸库用BD缓冲液稀释到10微升，加热到95℃，保持5分钟，并且迅速冷却在4℃下。从洗涤5微升CRP-MNP试剂中获得的CRP-MNP添加到微型管中并且在室温下培育30分钟。因为结合于CRP-MNP的寡核苷酸序列被吸引到磁性台架，所以去除未结合的寡核苷酸序列，并且结合的混合物用1毫升BD缓冲液洗涤三次。在微型管中添加100微升BD缓冲液以使结合的混合物再悬浮，作为样品。施加的磁场是旋转(RO-MARAS)或者交变(AC-MARAS)磁场。磁场的强度通过高斯计在样品位置进行校正。
对于RO-MARAS的频率相关性研究，结合的混合物(样品)经受磁场强度恒定(14高斯)并且磁场频率变化(例如：2赫兹、20赫兹、200赫兹、2000赫兹、20千赫兹以及27千赫兹)的旋转磁场，供磁性辅助的筛选。执行多轮磁性辅助的筛选以分离(选择)对标靶分子具有不同结合亲和力的适配体。图2示意性说明根据本发明的一个实施例的RO-MARAS的频率相关性分析的工艺流程示意图。此实例中，由于使用功率放大器，所以对于RO-MARAS，可以到达的最高频率是27千赫兹，磁场强度为14高斯。最初，样品经受2赫兹的磁场10分钟并且通过吸量管每2.5分钟进行搅拌，以免因磁场对磁性纳米粒子的作用而凝聚。对样品施加振荡磁场的目的是对寡核苷酸序列与CRP-MNP中的结合产生竞争机制。当样品经受振荡磁场时，样品的结合的混合物经受由样品的磁性粒子的磁偶极矩与外加磁场的相互作用产生的诱发磁性粒子在溶液中的旋转或振荡动作的驱动力矩，以及由磁性粒子在水溶液中的动作而产生的逸散力矩。此两个反力矩对结合的寡核苷酸序列与CRP-MNP中的结合产生一个拉伸力。结合于CRP-MNP的序列不会解离，直到拉伸力抵消掉序列对CRP-MNP的结合强度。竞争机制的增强可以通过借助于增加振荡磁场的频率和强度以及磁性粒子的尺寸增加此两个力矩来实现。此实例中，当振荡磁场的频率增加时，磁性粒子的磁偶极矩与磁场方向之间的滞后相位增加，导致驱动力矩增加，驱动力矩是磁性粒子的磁偶极矩和施加磁场的向量积。同时，由于磁性粒子的角速度，随着驱动磁场的频率增加而增加，逸散力矩也增加。因此拉伸力可以通过增加外加振荡磁场的频率来增强。第一轮磁性筛选是在2赫兹的磁场频率下执行并且上清液中解离(未结合)的核苷酸序列通过使用磁性台架收集。基于20N随机化的核苷酸序列库，在14高斯磁场强度和2赫兹、20赫兹、200赫兹、2000赫兹、20千赫兹以及27千赫兹的磁场频率的旋转磁场(RO)下，这些所收集的未结合的核苷酸序列分别以个别参考数字命名为20N RO F2、F20、F200、F2K、F20K、F27K序列(如表1中所列)。然后，添加100微升BD缓冲液以使保留的结合的混合物再悬浮并且混合物随后经受下一频率20Hz的磁场，如图2中所示。重复以上提及的工艺，直到施加最终频率(27KHz)的磁场。施加最终频率的磁场后，执行最后一轮磁性分离以分离上清液并且保留结合的混合物。最终，将100微升BD缓冲液添加到保留的结合的混合物中并且加热到95℃，保持5分钟，以从CRP-MNP洗脱适配体，并且含洗脱的适配体的上清液通过使用磁性台架收集。接着所收集的上清液经受阴性选择，下文将进行描述。阴性选择后，最终的上清液表示为>27K。以上提及的通过施加振荡磁场的磁性筛选被称为阳性选择。因为在阳性选择期间使用标靶-链霉抗生物素蛋白-磁性纳米粒子，所以获得的适配体可能选自结合于SA-MNP而不是标靶的适配体。因此，每个所收集的上清液经受阴性选择，它通过使用SA-MNP执行以消除可能结合于SA-MNP的适配体任何的可能性。阴性选择可以在阳性选择前或后执行。对于阴性选择，将从洗涤5微升SA-MNP试剂中获得的SA-MNP添加到所收集的上清液并且在室温下培育30分钟。接着所收集的上清液通过使用磁性台架进行磁性分离，以去除适配体-链霉抗生物素蛋白-磁性纳米粒子并且收集上清液。必须注意，SA-MMP也可以用于阴性选择。从使用不同磁场频率的各轮磁性辅助的筛选获得并进行阴性选择后的上清液以相对应的频率命名。所收集的上清液用1毫升100％冷乙醇沉淀供进一步分析，例如PCR扩增、克隆以及测序。
通过使用RO-MARAS利用磁性纳米粒子选择的适配体的特征
从各种旋转磁场频率的磁性辅助的筛选(阳性选择和阴性选择)中获得的适配体命名为：20N RO F2(-1、-2)、20N RO F20(-4、-5)、20N RO F200(-1、-3)、20N RO F2K(-1、-4)、20N RO F20K(-1、-2)、20N RO F27K(-4、-6)以及20N RO>27K(-1、-5)，并且所选择的20N适配体的测序结果列于表1中。
表1
解离常数(Kd)通过q-PCR和非线性拟合曲线计算。图3示出在RO-MARAS中所施加的磁场频率与通过根据本发明的一个实施例的RO-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图。图3的结果展示通过RO-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)随着RO-MARAS的磁场频率增加而减小。通过14高斯的恒定磁场强度和一系列频率下的RO-MARAS筛选的20N适配体的最低Kd值是20NRO>27K-1适配体的6.26纳摩尔。换句话说，具有较高结合亲和力的适配体可以通过增加RO-MARAS的磁场频率来筛选。此证实竞争机制并且指示所选择的适配体对标靶的亲和力可以通过增加驱动磁场的频率来增强。此也显示通过RO-MARAS筛选的适配体对标靶分子的亲和力与施加的旋转磁场频率有关。
为了最佳化在更高磁场频率和磁场强度下的MARAS的选择参数，研究施加的交变磁场(AC-MARAS)，包含磁场强度和频率，对所选择的适配体的亲和力的影响。20N随机化的寡核苷酸序列库与CRP-MNP的结合混合物的制备如上所述。在磁场频率相关性分析中，经由图1B的装置施加磁场强度恒定(25高斯)并且磁场频率变化(例如：2赫兹、20赫兹、200赫兹、2千赫兹、20千赫兹以及200千赫兹)的AC磁场。首先，使结合的混合物经受25高斯和2赫兹的AC磁场10分钟。在磁场施加期间，混合物通过吸量管每2.5分钟进行搅拌。在一轮磁性辅助的筛选后，执行磁性分离以收集上清液并且结合的混合物再悬浮于100微升BD缓冲液中。混合物依序经受另一个更高频率(例如20赫兹)的AC磁场。重复以上程序，直到施加最终频率(200KHz)的AC磁场。
施加最终频率的磁场后，执行磁性分离以分离上清液并且保留结合的混合物。最终，添加100微升BD缓冲液以再悬浮保留的结合的混合物，并且接着加热到95℃，保持5分钟，供洗脱。含洗脱出适配体的上清液通过磁性台架分离并且所收集的上清液经受如上所述的阴性选择。经历阴性选择以消除任何可能结合于SA-MNP的适配体的最终上清液表示为>200K。同样，对每个从施加不同频率的AC磁场获得的所收集的上清液执行阴性选择以去除适配体-链霉抗生物素蛋白-磁性纳米粒子并且收集上清液。阴性选择可以在AC-MARAS中进行阳性选择前或后执行。从使用不同磁场频率的各轮磁性辅助的筛选获得的进行阴性选择后的上清液以相对应的频率命名。所有收集的上清液都用1毫升100％冷乙醇沉淀供进一步分析，例如克隆、PCR扩增以及测序。
通过使用AC-MARAS利用磁性纳米粒子选择的适配体的特征
基于20N随机化的核苷酸序列库，在交变磁场(AC)下并且在2赫兹、20赫兹、200赫兹、2000赫兹、20千赫兹以及200千赫兹的磁场频率下，这些收集的未结合核苷酸序列以个别参考数字表示为20N AC F2(-2、-4)、F20(-2、-4)、F200(-1、-2)、F2K(-1、-4)、F20K(-1、-3)、F200K(-1、-2)、>200K(-1、-2)序列(如表2中所列)。
表2
图4示出在AC-MARAS中所施加的磁场频率与通过根据本发明的一个实施例的AC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图。图4的结果展示通过AC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)随着AC-MARAS的磁场频率增加而减小。通过25高斯下AC-MARAS筛选的20N适配体的最低Kd值是20N AC>200K-2适配体的8.35纳摩尔。通过AC-MARAS或通过RO-MARAS获得的相对应的Kd值以及Kd值对磁场频率的曲线是类似的。基于图3或图4的结果，对于RO-MARAS或AC-MARAS，所选择的适配体的Kd是频率相关性方式。
根据以上结果，通过MARAS(包含AC-MARAS和RO-MARAS)选择的适配体的结合亲和力与MARAS的施加磁场频率高度相关。为了最佳化MARAS的磁场条件，在随后实验中使用更高的磁场强度。
对于磁场强度相关性分析，使用图1B的装置，执行使用频率固定(100千赫兹)并且磁场强度变化(例如：12.5高斯、25高斯、50高斯、100高斯、200高斯以及400高斯)的AC磁场的AC-MARAS。实验程序类似于频率相关性分析的程序。另外，使用与上述类似的命名流程，表示所收集的上清液。收集阴性选择后的一系列上清液并且所有收集的上清液都用1毫升100％冷乙醇沉淀供进一步PCR扩增、克隆以及测序。
通过高磁场强度MARAS(HAC-MARAS)选择的适配体的特征
基于20N随机化的核苷酸序列文库，在交变磁场(AC)下，在100千赫兹的固定磁场频率下和在12.5高斯(12.5高斯)、25高斯、50高斯、100高斯、200高斯以及400高斯的高磁场强度下，这些收集的适配体序列表示为20N HAC 12.5g(-1、-2)、20N HAC 25g(-1、-2)、20N HAC 50g(-2、-9)、20N HAC 100g(-1、-2)、20N HAC 200g(-2、-3)、20N HAC 400g(-1、-5)以及20N HAC>400g(-1、-4)，并且适配体的测序结果列于表3中。
表3
HAC：高磁场强度
通过100千赫兹的固定磁场频率下的HAC-MARAS筛选的20N适配体的最低Kd值是20N HAC 400g-1适配体的5.67纳摩尔。图5示出在HAC-MARAS中所用的磁场强度与通过根据本发明的一个实施例的HAC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图。图5的曲线显示所选择的20N适配体的Kd值随着HAC-MARAS的施加磁场强度增加而减小。因此，对标靶具有较高亲和力的适配体可以通过增加施加AC磁场的磁场强度使竞争机制增强来获得。所述增强是由于更高磁场强度引起的更大驱动力矩，以及当磁性粒子在具有更高强度的振荡磁场下旋转或振荡时更大的瞬时切向速度。也可以推断，通过增加旋转磁场的磁场强度，亦可以实现RO-MARAS的竞争机制的类似强化。
因此，通过MARAS筛选的适配体的结合亲和力与施加磁场的强度或者频率相关。此外，可以通过恰当地选择MARAS方法的下部截止和上部截止频率和/或强度，来选择针对标靶分子所需解离常数的范围的适配体。
一次性MARAS(OS-MARAS)程序
为了进一步显示MARAS方法用于选择对标靶分子具有高结合亲和力的适配体的有效，使用图1A关于RO-MARAS的装置，执行一次性MARAS(OS-MARAS)。在一次性MARAS实验中，具有不同长度的中间部分的三种类型随机化的寡核苷酸序列(60N、40N以及20N)用作序列库来同时评估序列长度对所选择适配体对标靶分子的亲和力的影响。一次性RO-MARAS(OS-RO-MARAS)实验在14高斯和20千赫兹下执行。60N、40N以及20N序列库与CRP-MNP的结合的混合物如上所述制备。每个结合的混合物经受14高斯和20千赫兹的旋转磁场10分钟并且通过吸量管每2.5分钟进行搅拌。在一轮磁性辅助的筛选后，通过使用磁性台架去除上清液并且保留的结合的混合物用100微升BD缓冲液再悬浮。然后，保留的结合的混合物加热到95℃，保持5分钟，供洗脱。含洗脱出的适配体的上清液通过磁性台架分离并且所收集的上清液经受如上所述的阴性选择。执行阴性选择以消除可能与SA-MNP结合的适配体。执行另一轮磁性分离以收集上清液，接着上清液用1毫升100％冷乙醇沉淀供进一步分析。从每个实验选择两个适配体用于测序和结合亲和力计算。并且，根据与上述类似的程序，使用100高斯和150千赫兹下的AC磁场，执行使用AC-MARAS的图1B的设置的利用高磁场的一次性AC-MARAS(OS-AC-MARAS)。
通过一次性RO-MARAS(OS-RO-MARAS)筛选的所选择的60N、40N以及20N适配体命名为OS-RO-60N>20K(-1、-2)、OS-RO-40N>20K(-1、-2)以及OS-RO-20N>20K(-3、-6)，并且测序结果列于表4中。对于OS-RO-MARAS实验，所筛选的20N适配体对应于经由RO-MARAS，使用连续多轮的磁性辅助的筛选所选择的名为F27K和>27K的20N适配体。
表4
60N、40N以及20N适配体的结合亲和力通过q-PCR和非线性拟合曲线计算，并且从一次性RO-MARAS实验选择的适配体的解离常数Kd的平均值展示于表5中。
表5
结果指示通过OS-RO-MARAS筛选的适配体的Kd值与先前的结果，即适配体的Kd值一致。举例来说，具有12.19±0.31纳摩尔Kd的适配体OS-RO-20N>20KHz对比图3中具有22.53纳摩尔Kd的适配体20N RO F27K-6和具有6.26纳摩尔Kd的适配体20N RO>27K-1。
对于在100高斯和150千赫兹频率下执行的一次性AC-MARAS，通过OS-AC-MARAS筛选的所选择的60N、40N以及20N适配体命名为：OS-AC-60N(-1、-2)、OS-AC-40N(-6、-7)以及OS-AC-20N(-1、-2)，并且所选择的适配体的测序结果展示于表6中。
表6
从一次性AC-MARAS实验选择的60N、40N以及20N适配体的Kd的平均值展示于表7中。
表7
当比较从不同长度(60N、40N以及20N)的随机化的寡核苷酸序列选择的适配体的解离常数的结果时，其显示所选择的适配体的结合亲和力与用于MARAS方法的随机化的寡核苷酸序列的长度无关。
另外，如前所提及，可以在阳性选择前执行阴性选择，其被称作反向MARAS方法。对于反向RO-MARAS实验，20N随机化的寡核苷酸序列用作初始序列库。首先一纳摩尔的20N随机化的寡核苷酸序列库经受阴性选择，并且通过使用磁性台架执行磁性分离以将上清液从结合的混合物分离。序列库的制备和阴性选择的程序如上所述。经历阴性选择的所收集的上清液用作简化序列库。简化序列库与如上所述的CRP-MNP一起培育。结合的混合物经受14高斯和20千赫兹的旋转磁场10分钟并且通过吸量管每2.5分钟进行搅拌。在一轮磁性辅助的筛选后，去除上清液并且保留的结合混合物用100微升BD缓冲液再悬浮。然后，将混合物加热到95℃，保持5分钟，供洗脱，并且执行另一轮磁性分离以收集上清液，接着上清液用1毫升100％冷乙醇沉淀，供进一步分析。在150千赫兹和100高斯的交变磁场下执行反向AC-MARAS实验。反向AC-MARAS的程序类似于反向RO-MARAS的程序。
表8展示通过MARAS和通过反向MARAS筛选的适配体的解离常数Kd的比较。
表8
表8的结果展示从MARAS和反向MARAS选择的适配体的解离常数类似并且可比。因此，阳性选择和阴性选择的执行顺序(即先阳性选择还是先阴性选择)不会改变所选择的适配体的品质(根据解离常数，对标靶的结合亲和力)。
为了验证用于MARAS的磁性粒子不局限于纳米尺寸，通过使用磁性微米粒子(Mi)执行Mi-MARAS。在阳性和阴性选择期间CRP-MNP被CRP-MMP取代。除了使用CRP-MMP外，用于适配体-CRP-MMP的结合混合物的制备与适配体-CRP-MNP相同。混合物经受AC磁场10分钟，并且通过吸量管每2.5分钟进行搅拌以避免微米磁性粒子的凝聚和沉淀。100千赫兹频率和400高斯强度的AC磁场用于一次性Mi-MARAS方法。阳性选择后，通过使用从洗涤5微升SA-MMP试剂中获得的SA-MMP执行阴性选择以消除可能的SA-MMP结合适配体。除了使用SA-MMP外，用于阴性选择的程序与之前描述相同。必须注意，SA-MNP也可以用于阴性选择。详细工艺如以上部分中所述。通过一次性Mi-MARAS筛选的所选择的20N适配体命名为OS-Mi-20N-1和OS-Mi-20N-2，并且所选择的适配体的测序结果展示于表9中。
表9
从一次性Mi-MARAS实验选择的适配体的Kd的平均值是0.825±0.71纳摩尔(0.33nM Kd的OS-Mi-20N-1和1.33nM Kd的OS-Mi-20N-2)。其显示具有较大尺寸的磁性粒子可以通过增加作用于磁性粒子的磁矩和逸散力矩来增强竞争机制。所述增强是由于磁性粒子的更大磁偶极矩引起的更大驱动力矩，以及当磁性粒子在水溶液中旋转或振荡时更高的切向速度引起的更高逸散力矩。
概括地说，通过MARAS工艺选择的适配体可以与标靶相互作用。并且，经由MARAS选择的适配体的解离常数与磁场相关，其中Kd值随着磁场频率和磁场强度增加而减小。另外，通过在MARAS方法下施加适合频率和强度的旋转或交变磁场，结合标靶的单链适配体的解离常数可以在几纳摩尔(纳摩尔)的水平下。此外，如果在MARAS方法中使用生物功能化的磁性微米粒子而不是磁性纳米粒子，那么所选择适配体的解离常数甚至可以达到皮摩尔(皮摩尔)水平。在相同的磁场条件下通过AC-MARAS选择的单链适配体的结合亲和力类似于通过RO-MARAS选择的适配体。
此外，一种或超过一种对标靶分子具有特异性并且具有预定结合亲和力的适配体(即具有在期望的范围内的解离常数)可以通过恰当地选择MARAS方法的施加磁场的下部截止和上部截止磁场频率和/或磁场强度来选择。如与传统的需要几个星期到几个月的ss-SELEX工艺相比，在此研究中描述的MARAS方法可以在不到一小时内完成，消耗更少的实验供给和工作。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (35)

1.一种适配体选择方法，其特征在于，包括：
a)提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子，其中所述多个寡核苷酸序列的第一部分结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；
b)通过使用磁性台架执行第一轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分；
c)使所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分分散在缓冲液中；
d)通过施加振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分，执行磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开；
e)通过使用所述磁性台架执行第二轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的第二部分，以便去除与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述部分；
f)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分分散于所述缓冲液中；
g)从上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子洗脱所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；
h)通过使用所述磁性台架执行第三轮磁性分离以去除上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；以及
i)对所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分执行阴性选择以选择对所述标靶分子具有特异性的适配体，其中对所述标靶分子具有特异性的所述适配体不结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子。
2.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述标靶分子通过分别连接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子与所述标靶分子的结合对来接合到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子。
3.根据权利要求2所述的适配体选择方法，其特征在于，所述结合对包含连接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的第一组分以及连接到所述标靶分子的第二组分。
4.根据权利要求3所述的适配体选择方法，其特征在于，步骤i)执行所述阴性选择包括：
将上面连接有所述第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子添加到所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；
将上面连接有所述第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子与所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分一起培育；以及
执行第四轮磁性分离以通过去除结合于上面连接有所述第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列，获得对所述标靶分子具有特异性的所述适配体。
5.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述振荡磁场是旋转磁场。
6.根据权利要求5所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的频率是从1赫兹到300千赫兹。
7.根据权利要求5所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的强度是从5高斯到1000高斯。
8.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述振荡磁场是交变磁场。
9.根据权利要求8所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的频率是从1赫兹到300千赫兹。
10.根据权利要求8所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的强度是从5高斯到1000高斯。
11.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子的尺寸是从5纳米到500纳米。
12.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述磁性微米粒子的尺寸是从0.50微米到50微米。
13.一种适配体选择方法，其特征在于，包括：
a)提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库，并且用缓冲液稀释；
b)通过与上面未接合标靶分子的多个第一磁性纳米粒子或微米粒子一起培育，对所述样品执行阴性选择，以分离未结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个第一磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的第一部分；
c)执行第一轮磁性分离以从所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分去除结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个第一磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列；
d)将所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分与上面接合有标靶分子的多个第二磁性纳米粒子或微米粒子一起培育，其中所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的第二部分结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；
e)执行第二轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；
f)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分分散于所述缓冲液中；
g)通过施加振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分，执行磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子分开；
h)通过使用磁性台架执行第三轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的第三部分，以便去除与上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述部分；
i)将结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述第三部分用ddH2O分散；
j)将所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述第三部分从上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子洗脱；以及
k)执行第四轮磁性分离以去除上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子并且获得对所述标靶分子具有特异性的适配体。
14.根据权利要求13所述的适配体选择方法，其特征在于，所述标靶分子通过结合对来接合到所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子，并且所述结合对包含连接到所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的第一组分以及连接到所述标靶分子的第二组分。
15.根据权利要求14所述的适配体选择方法，其特征在于，所述多个第一磁性纳米粒子或微米粒子上面接合有所述第一组分。
16.根据权利要求13所述的适配体选择方法，其特征在于，所述振荡磁场是旋转磁场。
17.根据权利要求16所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的频率是从1赫兹到300千赫兹。
18.根据权利要求16所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的强度是从5高斯到1000高斯。
19.根据权利要求13所述的适配体选择方法，其特征在于，所述振荡磁场是交变磁场。
20.根据权利要求19所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的频率是从1赫兹到300千赫兹。
21.根据权利要求19所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的强度是从5高斯到1000高斯。
22.根据权利要求13所述的适配体选择方法，其特征在于，所述第一或第二磁性纳米粒子的尺寸是从5纳米到500纳米。
23.根据权利要求13所述的适配体选择方法，其特征在于，所述第一或第二磁性微米粒子的尺寸是从0.50微米到50微米。
24.一种适配体选择方法，其特征在于，其所选择的适配体对标靶具有期望的亲和力范围，包括：
a)提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子，其中所述多个寡核苷酸序列的第一部分结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；
b)通过使用磁性台架执行第一轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分；
c)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分分散于缓冲液中；
d)通过施加第一振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分，执行第一磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开；
e)通过使用所述磁性台架执行第二轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的第二部分，以便去除与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述部分；
f)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分分散于所述缓冲液中；
g)通过施加第二振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分，执行第二磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开；
h)通过使用所述磁性台架执行第三轮磁性分离以收集与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的第三部分；以及
i)对所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述第三部分执行阴性选择，以选择对所述标靶分子具有特异性的适配体，其中对所述标靶分子具有特异性以及期望的亲和力的所述适配体不结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子。
25.根据权利要求24所述的适配体选择方法，其特征在于，所述标靶分子通过分别连接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子与所述标靶分子的结合对来接合到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子，并且所述结合对包含连接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的第一组分以及连接到所述标靶分子的第二组分。
26.根据权利要求25所述的适配体选择方法，其特征在于，步骤i)执行所述阴性选择包括：
添加上面连接有所述第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子；
将上面连接有所述第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子与所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述第三部分一起培育；以及
执行第四轮磁性分离以通过去除结合于上面连接有所述第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列，获得对所述标靶分子具有特异性的所述适配体。
27.根据权利要求24所述的适配体选择方法，其特征在于，所述第一振荡磁场具有低于第二振荡磁场的磁场频率和/或磁场强度。
28.根据权利要求27所述的适配体选择方法，其特征在于，所述第一振荡磁场以及所述第二振荡磁场是旋转磁场。
29.根据权利要求28所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的磁场频率是从1赫兹到300千赫兹。
30.根据权利要求28所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的磁场强度是从5高斯到1000高斯。
31.根据权利要求27所述的适配体选择方法，其特征在于，所述第一振荡磁场以及所述第二振荡磁场是交变磁场。
32.根据权利要求31所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的磁场频率是从1赫兹到300千赫兹。
33.根据权利要求31所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的磁场强度是从5高斯到1000高斯。
34.根据权利要求24所述的适配体选择方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子的尺寸是从5纳米到500纳米。
35.根据权利要求24所述的适配体选择方法，其特征在于，所述磁性微米粒子的尺寸是从0.50微米到50微米。
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