JP2015073506A - 遺伝子多型の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】少数の被験体を対象とした、多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型の検出・同定に適した遺伝子多型の判定方法の提供。
【解決手段】第１のフラップ領域と第１型アレル特異的領域とを有する第１型アレル特異的プローブ、第２のフラップ領域と第２型アレル特異的領域とを有する第２型アレル特異的プローブ、インベーダプローブ、第１のＦＲＥＴプローブ及び第２のＦＲＥＴプローブを用いて、被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料、及び第１型コントロールオリゴヌクレオチドと第２型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率が異なる標準試料系列をそれぞれ鋳型としてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、標準試料ごとに描いたリアルタイムで計測した蛍光強度の反応軌道と、前記ＤＮＡ含有試料の結果に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、遺伝子多型の判定方法。
【選択図】なし
【解決手段】第１のフラップ領域と第１型アレル特異的領域とを有する第１型アレル特異的プローブ、第２のフラップ領域と第２型アレル特異的領域とを有する第２型アレル特異的プローブ、インベーダプローブ、第１のＦＲＥＴプローブ及び第２のＦＲＥＴプローブを用いて、被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料、及び第１型コントロールオリゴヌクレオチドと第２型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率が異なる標準試料系列をそれぞれ鋳型としてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、標準試料ごとに描いたリアルタイムで計測した蛍光強度の反応軌道と、前記ＤＮＡ含有試料の結果に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、遺伝子多型の判定方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、インベーダ法を利用した遺伝子多型の判定方法、特にコピー数多型（ＣＮＶ）の判定に適した方法に関する。
ある集団の中で１細胞あたりのコピー数が個体間で異なるゲノムの領域のことをコピー数多型（ＣＮＶ）という。ゲノムＤＮＡの数の多型としては、他に１塩基多型（ＳＮＰ）、ＶＮＴＲ（Variable Number of Tandem Repeat）やマイクロサテライト多型などが知られているが、これらはすべて１ｋｂｐ以下（通常、ＶＮＴＲでは数〜数十塩基程度、マイクロサテライト多型では２〜４塩基程度が１繰り返し単位）であるのに対し、コピー数多型は１ｋｂ以上の長さの大きな領域であり、遺伝子全体のコピー数の変化につながることが知られている。ＳＮＰ等の場合と同様に、集団の中で１％以上の頻度を有するコピー数多型を特にＣＮＰ（Copy Number Polymorphism）とも呼ぶ（本明細書においては、以下、頻度にかかわりなくコピー数多型の略称として「ＣＮＶ」を用いることとする）。
コピー数多型は、対照と比較して相対的にコピー数が多い場合と少ない場合とがあり、それぞれ重複及び欠失と呼ばれる。通常ヒト等の細胞には遺伝子は２個（２コピー）あり、１つは父方、もう１つは母方に由来するとされるが、個体によっては１細胞あたりある遺伝子が１個（１コピー）しかなかったり（欠失）、あるいは３個（３コピー）以上存在する（重複）。遺伝子におけるコピー数の差異は遺伝子産物のレベルに影響を及ぼすので、コピー数多型の中には、ある種の疾患に対する感受性や薬剤応答性及びその副作用に関連する可能性がある。また、遺伝子の中にも、正常な機能を有するアレル、機能が亢進又は減少するアレル、機能を全く失うようなアレルが存在することがあり、単に遺伝子レベルではなく、特定のアレルのコピー数の変化が表現型に影響を及ぼすことがある。
多型ごとにコピー数を算出するためには、遺伝子の総コピー数とアレル比を算出することが必要である。リアルタイム定量ＰＣＲを使用して総遺伝子コピー数を決定するための方法は既に確立されており、広く用いられている。また、特許文献１では、従来エンドポイント法として実施されていたインベーダアッセイを改変して、ＰＣＲ後の酵素反応の間にリアルタイム蛍光を検出できるようになった。当該方法は、ＰＣＲ−ＲＥＴＩＮＡ法（polymerase chain reaction−real−time Invader assay）と命名されている。当該方法により、インベーダ反応がプラトーに達する前の反応初期段階において、アレル比に比例したゲノムの重複、即ち重複から生じるアレルの非対称性を検出できることが見出され、当該方法を、リアルタイム定量ＰＣＲによって算出される総コピー数と組み合わせることにより、各アレルのコピー数を同定することに成功した（非特許文献１、２参照。）。
ホソノ（Hosono）、他７名、Human Mutation、２００８年、第２９巻、第１８２〜１８９ページ。
ホソノ（Hosono）、他１２名、Clinical Chemistry、２００９年、第５５巻、第１５４６〜１５５４ページ。
特許文献１に記載の方法では、多数の被験体を対象とした同時クラスター解析を主としているため、少数の被験体を対象とした解析や希少なアレル比の被験体に遭遇した場合の判定が困難であった。特に、臨床応用を見据えた場合、実臨床では一検体でも直ちに検査する必要があるため、単一の被験体を解析可能な方法が求められている。
本発明は、少数の被験体を対象とした、多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型の検出・同定に適した遺伝子多型の判定方法を提供することを目的とする。
本発明に係る遺伝子多型の判定方法及び遺伝子多型判定キットは、以下の通りである。
［１］ 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法であって、
（ａ）被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料を鋳型として、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
を用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｂ）前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドとの総量に対する前記第１型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する工程と、
（ｃ）前記標準試料系列の各標準試料について、それぞれ、当該標準試料を鋳型として、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブ、前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｄ）縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果をプロットし、標準試料ごとに反応軌道を描く工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において描かれたグラフに、前記工程（ａ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果をプロットし、前記反応軌道に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する工程と、
を有することを特徴とする、遺伝子多型の判定方法。
［２］ 前記工程（ｅ）において、前記工程（ａ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記反応軌道が相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、前記［１］の遺伝子多型の判定方法。
［３］ 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、リアルタイムインベーダアッセイを用いて判定する方法であって、
（ａ’）被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料の希釈系列を調製し、当該希釈系列をそれぞれ鋳型として、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
を用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｂ）前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドとの総量に対する前記第１型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する工程と、
（ｃ’）前記標準試料系列の各標準試料について、それぞれ希釈系列を調製し、当該希釈系列をそれぞれ鋳型として、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブ、前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｄ’）縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、蛍光強度が飽和に達するより前の時点における結果をプロットし、各標準試料の希釈系列ごとに反応軌道を描く工程と、
（ｅ’）前記工程（ｄ’）において描かれたグラフに、前記工程（ａ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記時点と同じ時点における結果をプロットし、前記反応軌道に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する工程と、
を有することを特徴とする、遺伝子多型の判定方法。
［４］ 前記工程（ｅ’）において、前記工程（ａ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記工程（ｄ’）における各標準試料のプロットが相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、前記［３］の遺伝子多型の判定方法。
［５］ 前記多型が、一塩基多型である、前記［１］〜［４］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［６］ 前記ゲノム領域が、コピー数多型領域内にある、前記［１］〜［５］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［７］ アレル非対称性を伴う重複を検出するためのものである、前記［１］〜［６］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［８］ 前記工程（ａ）と前記工程（ｃ）を同時に行う、前記［１］又は［２］の遺伝子多型の判定方法。
［９］ 前記工程（ａ’）と前記工程（ｃ’）を同時に行う、前記［３］又は［４］の遺伝子多型の判定方法。
［１０］ 前記ゲノム領域が、複数の一塩基多型を含む、前記［１］〜［９］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［１１］ 前記ＤＮＡ含有試料が、前記被検体由来の前記ゲノム領域を増幅したＤＮＡを含有する、前記［１］〜［１０］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［１２］ 定量ＰＣＲを用いて得られる、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレル及び前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルの総コピー数に基づいて、各アレルのコピー数を判定する、前記［１］〜［１１］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［１３］ 前記定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ法により行われる、前記［１２］の遺伝子多型の判定方法。
［１４］ 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法に用いられるキットであって、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、
前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドと、
を有することを特徴とする、遺伝子多型判定キット。
［１］ 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法であって、
（ａ）被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料を鋳型として、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
を用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｂ）前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドとの総量に対する前記第１型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する工程と、
（ｃ）前記標準試料系列の各標準試料について、それぞれ、当該標準試料を鋳型として、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブ、前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｄ）縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果をプロットし、標準試料ごとに反応軌道を描く工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において描かれたグラフに、前記工程（ａ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果をプロットし、前記反応軌道に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する工程と、
を有することを特徴とする、遺伝子多型の判定方法。
［２］ 前記工程（ｅ）において、前記工程（ａ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記反応軌道が相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、前記［１］の遺伝子多型の判定方法。
［３］ 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、リアルタイムインベーダアッセイを用いて判定する方法であって、
（ａ’）被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料の希釈系列を調製し、当該希釈系列をそれぞれ鋳型として、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
を用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｂ）前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドとの総量に対する前記第１型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する工程と、
（ｃ’）前記標準試料系列の各標準試料について、それぞれ希釈系列を調製し、当該希釈系列をそれぞれ鋳型として、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブ、前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｄ’）縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、蛍光強度が飽和に達するより前の時点における結果をプロットし、各標準試料の希釈系列ごとに反応軌道を描く工程と、
（ｅ’）前記工程（ｄ’）において描かれたグラフに、前記工程（ａ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記時点と同じ時点における結果をプロットし、前記反応軌道に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する工程と、
を有することを特徴とする、遺伝子多型の判定方法。
［４］ 前記工程（ｅ’）において、前記工程（ａ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記工程（ｄ’）における各標準試料のプロットが相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、前記［３］の遺伝子多型の判定方法。
［５］ 前記多型が、一塩基多型である、前記［１］〜［４］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［６］ 前記ゲノム領域が、コピー数多型領域内にある、前記［１］〜［５］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［７］ アレル非対称性を伴う重複を検出するためのものである、前記［１］〜［６］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［８］ 前記工程（ａ）と前記工程（ｃ）を同時に行う、前記［１］又は［２］の遺伝子多型の判定方法。
［９］ 前記工程（ａ’）と前記工程（ｃ’）を同時に行う、前記［３］又は［４］の遺伝子多型の判定方法。
［１０］ 前記ゲノム領域が、複数の一塩基多型を含む、前記［１］〜［９］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［１１］ 前記ＤＮＡ含有試料が、前記被検体由来の前記ゲノム領域を増幅したＤＮＡを含有する、前記［１］〜［１０］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［１２］ 定量ＰＣＲを用いて得られる、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレル及び前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルの総コピー数に基づいて、各アレルのコピー数を判定する、前記［１］〜［１１］のいずれかの遺伝子多型の判定方法。
［１３］ 前記定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ法により行われる、前記［１２］の遺伝子多型の判定方法。
［１４］ 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法に用いられるキットであって、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、
前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドと、
を有することを特徴とする、遺伝子多型判定キット。
本発明に係る遺伝子多型の判定方法により、少数の被験体を対象とした各アレルのコピー数の比を簡便に判定することが可能となる。また、本発明に係る遺伝子多型の判定方法は、ゲノム領域由来のＤＮＡと同様にアレル特異的プローブとインベーダプローブの両方とハイブリダイズ可能なコントロールオリゴヌクレオチドを用いて、各アレルのコピー数比が任意の標準試料を使用することにより、希少なアレル比の被験体に遭遇した場合であっても、遺伝子多型の判定が可能となる。
また、本発明に係る遺伝子多型判定キットを用いることによって、本発明に係る遺伝子多型の判定方法より簡便に実施することができる。
また、本発明に係る遺伝子多型判定キットを用いることによって、本発明に係る遺伝子多型の判定方法より簡便に実施することができる。
本発明は、リアルタイムインベーダアッセイ（ＲＥＴＩＮＡ）を行うことを特徴とする、多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を判定（タイピング）する、遺伝子多型の判定方法（以下、「本発明に係るジェノタイピング法」ともいう。）を提供する。本発明に係るジェノタイピング法における被験体としては、多型部位を含むゲノムＤＮＡ又は当該ゲノムＤＮＡに由来する核酸を有するものであれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物、特に多型に関するデータが蓄積されているヒトやマウス等が挙げられる。
本発明において判定対象となる多型としては、インデル、遺伝子変換多型などが挙げられる。インデルとは、Insertion/Deletionの略称である。遺伝子変換とは、あるＤＮＡ配列が別のＤＮＡ配列に変化した多型をいう。これらの中でも、特に、ＳＮＰ（一遺伝子多型）を判定対象とすることが好ましい。タイピングの対象となるＳＮＰ部位を含むゲノム領域としては、特に限定されない。例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース［http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/］やＪＳＮＰデータベース［http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.html］に登録されている任意のＳＮＰ部位を含むゲノム領域が挙げられる。
本発明における多型部位を含むゲノム領域は、コピー数多型（ＣＮＶ）領域内に存在するものが好ましい。ヒトゲノムにおけるＣＮＶ領域はこれまでに種々の方法によって同定されており、the Database of Genomic Variants ［http://projects.tcag.ca/variation/］中にまとめられている。
被験体由来の多型部位を含むゲノム領域を含むＤＮＡを含有する試料（ＤＮＡ含有試料）としては、ゲノムＤＮＡそのものを含有する試料であってもよく、ゲノムＤＮＡを鋳型として、目的の多型部位を含むゲノム領域を予めＰＣＲ等で増幅して得られる増幅産物を含有する試料であってもよい。ゲノムＤＮＡを取得するために被験体から採取される試料としては、ゲノムＤＮＡを含有する限り特に制限されず、いかなる細胞・組織を含むものであってもよいが、被験体にとって低侵襲性であることが望ましいため、例えば、血液、血球成分、リンパ液、精液、毛髪などが好ましく、血液及びその分画である血球成分（例、白血球）がより好ましい。採取した試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知のいかなる方法により行ってもよく、当業者は、採取した試料の種類などに応じて好適な方法を適宜選択して用いることができる。
好ましい実施態様においては、被験体由来の目的のゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料は、目的の多型部位を含むゲノム領域を予めＰＣＲ等で増幅して得られる増幅産物を含有する試料である。したがって、本発明に係るジェノタイピング法は、好ましくは、インベーダ工程の前に多型部位を含むゲノム領域を増幅する工程をさらに含む。この増幅工程では、鋳型ＤＮＡとして準備したゲノムＤＮＡと、タイピング対象の多型部位を含む塩基配列を増幅するプライマー対とを用いて、常法に従ってＰＣＲ等を行えばよい。
前記多型部位を含むゲノム領域は、１個の多型部位を含むものであってもよく、２個以上の多型部位を含むものであってもよい。ゲノム領域が複数の多型部位を含む場合、個々の多型部位について、それぞれＤＮＡ含有試料を被験体から採取してインベーダ法を行うこともできるが、少量のゲノムＤＮＡから複数の多型部位のタイピングを行うことが望ましいため、１つのゲノムＤＮＡ含有試料から、当該ゲノム領域中の各多型部位を含む複数の部分領域を１回のＰＣＲ（多重ＰＣＲ、ｍＰＣＲという。）で同時に増幅し、この増幅産物を鋳型として個々の多型部位についてインベーダ反応を行うことが好ましい。多重ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）は、１つのゲノムＤＮＡ試料を鋳型とし、各多型部位を含む塩基配列を増幅する複数対のプライマーを用いて行う。例えば、３００以上のＳＮＰ部位を含む領域をｍＰＣＲにより同時に増幅することができる。ｍＰＣＲの詳細については、例えば、特開２００２−３００８９４号公報を参照することができる。
ゲノム領域の増幅に用いられる各プライマー対は、例えば、各多型部位を挟む約１００ｂｐ〜数ｋｂｐ、好ましくは約１００ｂｐ〜約３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できるように設計される。これらのプライマーは、目的の断片を特異的に増幅できるものであれば特に制限はなく、例えば約１５〜約３０塩基、好ましくは約１７〜約２５塩基であり、約１８〜約２２塩基であることがより好ましい。また、ｍＰＣＲを行う場合、用いるプライマー対は、同等の温度で鋳型ＤＮＡにアニーリング可能なように設計されることが好ましい。
ゲノム領域の増幅反応においては、プライマーのミスアニーリングやオリゴマー化を防止すべく、反応溶液が高温になってからＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を開始させる、いわゆるホットスタート法を適用することが好ましい。ホットスタート法の詳細については、例えば、特開２００２−３００８９４号公報を参照することができる。
本発明に係るジェノタイピング法では、判定対象である遺伝子多型のうちの２種類の遺伝子型（以下、「第１の遺伝子型」と「第２の遺伝子型」という。）について判定する。３種類以上の遺伝子型を有する遺伝子多型を判定する場合には、遺伝子多型のうちの２種類を選択して実施する。
本発明に係るジェノタイピング法では、まず、工程（ａ）として、目的のゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料を鋳型として、第１の遺伝子型のアレルと特異的にハイブリダイズする第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ（第１型アレル特異的プローブ）と、第２の遺伝子型のアレルと特異的にハイブリダイズする第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ（第２型アレル特異的プローブ）と、インベーダオリゴヌクレオチドプローブ（インベーダプローブ）と、第１のＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）オリゴヌクレオチドプローブ（第１型ＦＲＥＴプローブ）と、第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ（第２型ＦＲＥＴプローブ）とを用いて、リアルタイムインベーダアッセイ（ＲＥＴＩＮＡ）により行う。ＲＥＴＩＮＡとは、元来エンドポイントアッセイとして実施されているインベーダ法において、蛍光強度を反応開始からリアルタイムで測定するアッセイ手法を意味する。このようなリアルタイム蛍光の測定は、従来公知のリアルタイム定量ＰＣＲで使用される各種装置を用いて実施することができる。なお、インベーダ法の原理及びその実施態様については、例えば、特開２００２−３００８９４号公報を参照することができる。
本発明において用いられる第１型アレル特異的プローブは、前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドである。
本発明において用いられる第２型アレル特異的プローブは、前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドである。
本発明において用いられるインベーダプローブは、前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
本発明において用いられる第２型アレル特異的プローブは、前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドである。
本発明において用いられるインベーダプローブは、前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
なお、「前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする」とは、インベーダ反応の反応条件（温度、バッファー組成）下で、第１の遺伝子型であるアレル（又は当該アレルと同じ塩基配列を有する核酸）とはハイブリダイズするが、第２の遺伝子型であるアレルとはハイブリダイズしないことを意味する。前記第１型アレル特異的領域としては、例えば、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルと相補的な塩基配列からなる領域、又は当該アレルのうち前記多型部位以外の１〜２塩基を置換、挿入、又は欠損させた塩基配列と相補的な塩基配列からなる領域が挙げられる。同様に、「前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする」とは、インベーダ反応の反応条件（温度、バッファー組成）下で、第２の遺伝子型であるアレル（又は当該アレルと同じ塩基配列を有する核酸）とはハイブリダイズするが、第１の遺伝子型であるアレルとはハイブリダイズしないことを意味する。前記第２型アレル特異的領域としては、例えば、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルと相補的な塩基配列からなる領域、又は当該アレルのうち前記多型部位以外の１〜２塩基を置換、挿入、又は欠損させた塩基配列と相補的な塩基配列からなる領域が挙げられる。また、第１のフラップ領域及び第２のフラップ領域において、「前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない」とは、インベーダ反応の反応条件（温度、バッファー組成）下で、前記ゲノム領域（又は当該アレルと同じ塩基配列を有する核酸）とはハイブリダイズしないことを意味する。前記第１のフラップ領域及び前記第２のフラップ領域としては、前記ゲノム領域との相同性（配列同一性）が５０％以下の塩基配列からなる領域が挙げられる。
第１型アレル特異的領域、第２型アレル特異的領域、前記ゲノム領域中のインベーダプローブがハイブリダイズする領域、第１のフラップ領域、及び第２のフラップ領域は、前記ゲノム領域の塩基配列に基づいて、常法により設計することができる。
本発明において用いられる第１型ＦＲＥＴプローブは、５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合しているオリゴヌクレオチドである。
本発明において用いられる第２型ＦＲＥＴプローブは、５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合しているオリゴヌクレオチドである。
本発明において用いられる第２型ＦＲＥＴプローブは、５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合しているオリゴヌクレオチドである。
第１の蛍光物質と第１型ＦＲＥＴプローブに結合する消光物質は、ＦＲＥＴに使用可能な蛍光物質と消光物質の組み合わせの中から適宜選択して用いることができる。同様に、第２の蛍光物質と第２型ＦＲＥＴプローブに結合する消光物質は、ＦＲＥＴに使用可能な蛍光物質と消光物質の組み合わせの中から適宜選択して用いることができる。ＦＲＥＴに使用可能な蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、ＦＲＥＴに使用可能な消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。第１の蛍光物質と第２の蛍光物質は、互いに蛍光特性の異なるものを用いる。第１型ＦＲＥＴプローブに結合する消光物質と、第２型ＦＲＥＴプローブに結合する消光物質とは、同種の物質であってもよく、異なる種類の物質であってもよい。
被検体のゲノムＤＮＡ（又は、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ）中の多型部位が第１の遺伝子型であった場合、ゲノムＤＮＡに、第１型アレル特異的プローブ及びインベーダプローブを反応させると、ゲノムＤＮＡ中の当該多型部位を含むゲノム領域に対して、インベーダプローブの少なくとも３’末端の塩基が第１型アレル特異的プローブ中の第１型アレル特異的領域の５’側の塩基と重複するようにハイブリダイズすることによりフラップ構造が形成される。このフラップ構造をＣｌｅａｖａｓｅが認識して切断することにより、第１型アレル特異的プローブのフラップ領域を含む５’側の領域が遊離する。この遊離のフラップ領域を含むオリゴヌクレオチドは、少なくともその３’末端の塩基が、第１型ＦＲＥＴプローブの少なくとも５’末端の塩基と重複するように、ヘアピン構造を形成している第１型ＦＲＥＴプローブとハイブリダイズすることによりフラップ構造が形成される。このフラップ構造をＣｌｅａｖａｓｅが認識して切断することにより、第１型ＦＲＥＴプローブの５’末端に結合していた第１の蛍光物質が遊離して第１の消光物質の影響を受けなくなり、蛍光を発する。
被検体のゲノムＤＮＡ中の多型部位が第２の遺伝子型であった場合には、第１型アレル特異的プローブ及び第１型ＦＲＥＴプローブに代えて、第２型アレル特異的プローブ及び第２型ＦＲＥＴプローブが反応する以外は同様にＲＥＴＩＮＡが行われ、第２の蛍光物質から発される蛍光が検出される。被検体のゲノムＤＮＡ中に、多型部位が第１の遺伝子型であるアレルと第２の遺伝子型であるアレルの両方が含まれている場合には、ＲＥＴＩＮＡにより第１の蛍光物質から発される蛍光と第２の蛍光物質から発される蛍光の両方が検出され、被検体のゲノムＤＮＡ中にいずれの遺伝子型のアレルも含まれていない場合には、両蛍光物質から蛍光は検出されない。
従来のエンドポイントアッセイとしてのインベーダ法では、１５〜６０分間程度インベーダ反応を実施した後に蛍光強度を測定していたが、本発明に係るジェノタイピング法においては、リアルタイムで蛍光強度を測定し、蛍光強度が飽和に達する、即ちインベーダ反応がプラトーに達するより前のある時点における、第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度の比を用いて、被検体のゲノムＤＮＡにおける第１の遺伝子型のアレルと第２の遺伝子型のアレルのコピー数の比を判定する。
インベーダ反応がプラトーに達するより前の時点では、ＲＥＴＩＮＡにより検出される第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度の比は、ＤＮＡ含有試料に含有されている第１の遺伝子型のアレルと第２の遺伝子型のアレルのコピー数の比に主に依存する。このため、リアルタイムに測定した両蛍光強度の値を、縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフにプロットすると、両アレルのコピー数の比が同じ被験体についてはグラフ上のある領域にプロットが集中（クラスター化）し、コピー数の比が異なる被験体についてはグラフ上の異なる位置にプロットされる。したがって、本発明に係るジェノタイピング法は、単なる多型部位のタイピングに有用であるだけではなく、コピー数多型の検出及び同定に特に有用である。
遺伝子の重複、即ちＣＮＶが起こっていない被験体群では、インベーダ反応がプラトーに達する前のある時点における各アレルに対応する蛍光強度の比は、各アレルについてのホモ接合体（第１の遺伝子型のアレル：第２の遺伝子型のアレル＝１：０又は０：１）及びヘテロ接合体（第１の遺伝子型のアレル：第２の遺伝子型のアレル＝１：１）の３つの群（グラフ上にプロットした場合は３つのクラスター）に集約されるのに対し、遺伝子の重複が起こっている被験体、特に重複の結果アレル非対称性が生じている被験体では、上記３つのいずれとも異なる蛍光強度比をとり、３つのクラスターのいずれとも異なる位置にプロットされる。ここで「アレル非対称性」とは、両アレルのコピー数比が１：１以外（例えば、２：１、１：２など）であるヘテロ接合体を意味する。一方、アレル対称性とは、両アレルのコピー数比が１：１であるヘテロ接合体及びホモ接合体を意味する。
なお、本発明及び本願明細書において、「遺伝子の重複」とは、特定の遺伝子が同一染色体上又は相同染色体以外の染色体上に複数コピー存在することをいう。その場合、遺伝子は、１つの同一染色体上にタンデムに複数コピー存在しているか、別の染色体上にコピーされて存在し、ハプロイドゲノムとして２コピー以上存在している。相同染色体上に１コピーずつ、細胞当たり２コピーの遺伝子が存在する場合は重複と呼ばない。本明細書中では、重複（multiplication）は、１ハプロイドゲノムあたり、遺伝子が２コピー存在する場合（duplication）、３コピー存在する場合（三重化/triplication）又はそれ以上存在する場合などを包含する意味である。
本発明に係るジェノタイピング法においては、予め、第１の遺伝子型のアレルと第２の遺伝子型のアレルのコピー数の比が既知である標準試料を鋳型として、工程（ａ）におけるＲＥＴＩＮＡと同じ条件でＲＥＴＩＮＡを行い、リアルタイムで測定された第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度をグラフにプロットし、工程（ａ）におけるＲＥＴＩＮＡの結果の当該グラフ上のプロットの位置を、標準試料のプロットと比較することにより、被検体のゲノムＤＮＡの第１の遺伝子型のアレルと第２の遺伝子型のアレルのコピー数の比を判定する。
具体的には、まず、工程（ｂ）として、第１の遺伝子型のアレルの標準品として用いられる第１型コントロールオリゴヌクレオチド（第１型コントロールオリゴ）と、第２の遺伝子型のアレルの標準品として用いられる第２型コントロールオリゴヌクレオチド（第２型コントロールオリゴ）との総量に対する、前記第１型コントロールオリゴの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する。標準試料系列としては、少なくとも、第１型コントロールオリゴのみを含む（含有量比が、第１型コントロールオリゴ：第２型コントロールオリゴ＝１：０である）標準試料、第２型コントロールオリゴのみを含む（含有量比が、第１型コントロールオリゴ：第２型コントロールオリゴ＝０：１である）標準試料、第１型コントロールオリゴと第２型コントロールオリゴの含有量比が第１型コントロールオリゴ：第２型コントロールオリゴ＝１：１である標準試料を含むことが好ましく、さらに、第１型コントロールオリゴと第２型コントロールオリゴの含有量比が第１型コントロールオリゴ：第２型コントロールオリゴ＝１：２〜２：１の１又は複数の標準試料を含むことがより好ましい。
第１型コントロールオリゴは、第１の遺伝子型のアレルと同様に、前記第１型アレル特異的プローブ中の第１型アレル特異的領域及び前記インベーダプローブの両方と、インベーダプローブの少なくとも３’末端の塩基が第１型アレル特異的プローブ中の第１型アレル特異的領域の５’側の塩基と重複するようにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。第１型コントロールオリゴと第１型アレル特異的プローブとインベーダプローブとによる三者会合体は、Ｃｌｅａｖａｓｅが認識するフラップ構造を形成する。
第２型コントロールオリゴは、第２の遺伝子型のアレルと同様に、前記第２型アレル特異的プローブ中の第２型アレル特異的領域及び前記インベーダプローブの両方と、インベーダプローブの少なくとも３’末端の塩基が第２型アレル特異的プローブ中の第２型アレル特異的領域の５’側の塩基と重複するようにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。第２型コントロールオリゴと第２型アレル特異的プローブとインベーダプローブとによる三者会合体は、Ｃｌｅａｖａｓｅが認識するフラップ構造を形成する。
第１型コントロールオリゴは、第１の遺伝子型のアレルと同様に、第１型アレル特異的プローブとインベーダプローブの両方と同時にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されるものではなく、第１型アレル特異的プローブ及びインベーダプローブとハイブリダイズする領域以外のみからなるものであってもよく、その他の領域があってもよい。第２型コントロールオリゴも同様である。
次いで、工程（ｃ）として、工程（ｂ）において調製した標準試料系列の各標準試料をそれぞれ鋳型とする以外は工程（ａ）と同様にして、前記第１型アレル特異的プローブ、前記第２型アレル特異的プローブ、前記インベーダプローブ、前記第１型ＦＲＥＴプローブ、及び前記第２型ＦＲＥＴプローブを用いてＲＥＴＩＮＡを行う。
工程（ａ）と工程（ｃ）は、同時に行ってもよく、それぞれ別個に行ってもよい。例えば、工程（ａ）と工程（ｃ）における各ＲＥＴＩＮＡの反応溶液を、８連チューブ等のような複数の反応容器が互いに連結された反応プレートに調製し、当該反応プレートをリアルタイムＰＣＲ装置等に設置してＲＥＴＩＮＡを行うことにより、工程（ａ）と工程（ｃ）を同時に行うことができる。
その後、工程（ｄ）として、縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ）におけるＲＥＴＩＮＡで測定された結果をプロットし、標準試料ごとに反応軌道を描く。インベーダ反応の初期では、第１の蛍光物質の蛍光強度と第２の蛍光物質の蛍光強度の比は、鋳型中（すなわち、各標準試料中）の第１型コントロールオリゴと第２型コントロールオリゴの含有量比に依存して一定であるが、最終的にはインベーダ反応はプラトーに達する。プラトーに達すると、第１型コントロールオリゴと第２型コントロールオリゴの両方を含む標準試料では、元々の含有量比にかかわらず、第１の蛍光物質の蛍光強度と第２の蛍光物質の蛍光強度はある特定の蛍光強度にそれぞれ収束する。
最後に、工程（ｅ）として、工程（ｄ）において描かれたグラフに、工程（ａ）におけるＲＥＴＩＮＡで測定された結果をプロットし、各標準試料の反応軌道に基づいて、被験体の遺伝子型を判定する。工程（ａ）におけるＲＥＴＩＮＡの結果のプロットに近似した反応軌道を描いた標準試料がある場合には、被験体の遺伝子型は当該標準試料とほぼ同じであると判定できる。
工程（ｅ）においては、反応軌道が相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定することが好ましい。鋳型として用いるＤＮＡの種類や反応条件などによって差はあるが、通常インベーダ反応は反応開始から１５〜２０分程度でプラトーに達する。このため、本発明に係るジェノタイピング法では、反応開始から１５分後まで、好ましくは反応開始約１〜約１０分後における蛍光強度のプロットを用いて判定することが好ましい。このように、本発明に係るジェノタイピング法は、従来のエンドポイント法によるインベーダアッセイよりも迅速に目的の多型部位をタイピングすることができる。
好ましい一実施形態においては、工程（ａ）及び工程（ｃ）におけるＲＥＴＩＮＡでは、反応開始から反応が完全にプラトーに達するまでの時間、例えば約１５秒〜約１分毎、好ましくは約３０秒毎に蛍光強度を測定・記録することが好ましい。
工程（ａ）において、前記ゲノムゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料を数段階に希釈した希釈系列を調製し、当該希釈系列を構成する各試料を鋳型として、それぞれリアルタイムインベーダアッセイを行い、工程（ｄ）において、前記標準試料系列の各標準試料を数段階に希釈した希釈系列を調製し、当該希釈系列を構成する各試料を鋳型として、それぞれリアルタイムインベーダアッセイを行い、得られた結果のうち、蛍光強度が飽和に達するより前の時点における結果をプロットし、各標準試料の希釈系列ごとに反応軌道を描くことによっても、被検体のゲノムＤＮＡの遺伝子型を判定することができる。
グラフにプロットするデータは、蛍光強度が飽和に達するより前の時点のデータであれば特に限定されるものではないが、各標準試料のプロットが相互に最も分離される反応時点におけるデータであることが好ましい。
なお、本願明細書では、見た目でも簡単に遺伝子型判定やコピー数比判定ができるグラフにプロットする方法を示したが、臨床応用へ向けて線形回帰曲線を利用した判定ソフトウェア等の作成も考案できる。
本発明に係るジェノタイピング法は、迅速かつ簡便にアレル非対称性を伴う遺伝子重複を検出し得るという利点を有する反面、両アレルのコピー数の比を判定し得るのみであるため、アレル対称性の遺伝子重複（例えば、２コピー：２コピー）と遺伝子重複のないヘテロ接合体（１コピー：１コピー）とを判別できない。また、遺伝子重複のあるホモ接合体（３コピー：０コピー）と遺伝子重複のないホモ接合体、さらにはホモ接合体と欠失（１コピー：０コピー）とを判別できない。そこで、被験体由来の目的のゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料を鋳型として、別途定量ＰＣＲを行うことにより両アレルの総コピー数を求めれば、ＲＥＴＩＮＡより得られる両アレルのコピー数の比と組み合わせて各アレルのコピー数を特定することができる。したがって、本発明はまた、ＲＥＴＩＮＡと定量ＰＣＲとを組み合わせて各アレルのコピー数を判定する、被験体のジェノタイピング方法を提供する。
例えば、定量ＰＣＲより得られる両アレルの総コピー数が４コピーであり、ＲＥＴＩＮＡより得られる両アレルのコピー数の比が１：１の場合、各アレルが２コピーずつであると判定できる。また、定量ＰＣＲより得られる両アレルの総コピー数が３コピーであり、ＲＥＴＩＮＡより得られる両アレルのコピー数の比が１：０の場合、被験体は重複を伴うホモ接合体であると判定することができる。さらに、定量ＰＣＲより得られる両アレルの総コピー数が１コピーであり、ＲＥＴＩＮＡより得られる両アレルのコピー数の比が１：０の場合、被験体は欠失を伴うと判定することができる。
ＲＥＴＩＮＡと定量ＰＣＲの結果に不一致が生じる場合、対象領域のゲノムＤＮＡ配列を直接シークエンスして検証することができる。後述の実施例に示されるとおり、例えば、定量ＰＣＲに使用されるプライマー配列部分に多型を有する被験体の場合、プライマーのアニーリング効率が悪いために、定量値が実際より低コピー数となる場合がある。ＲＥＴＩＮＡを用いる本発明に係るジェノタイピング法は、それ単独では限定的な情報を与えるが、その信頼性はきわめて高いことが理解されよう。
ここで用いられる定量ＰＣＲとしては、リアルタイムＰＣＲとして公知の任意の手法を用いて行うことができる。これらの手法は、蛍光試薬を用いてＤＮＡの増幅量をリアルタイムで検出する方法であり、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、例えば、インターカレンター法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法等が挙げられる。いずれも、鋳型ゲノムＤＮＡ及び目的の多型部位を含むゲノム領域を増幅するためのプライマー対を含むＰＣＲ反応系に、インターカレーター、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎプローブと呼ばれる蛍光試薬又は蛍光プローブを添加するというものである。インターカレーターは合成された二本鎖ＤＮＡに結合して励起光の照射により蛍光を発するので、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ＤＮＡ量を推定することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは両端を蛍光物質と消光物質のそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ＤＮＡ量を推定することができる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブは両端を蛍光物質と消光物質のそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るとともにヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドであり、ヘアピン構造をとっている時は消光物質の存在により蛍光を発せず、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズして蛍光物質と消光物質との距離が広がることにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ＤＮＡ量を推定することができる。本発明においては、好ましくはＴａｑＭａｎ法が用いられる。
本発明に係る遺伝子多型判定キット（以下、「本発明に係るジェノタイピングキット」）は、多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法に用いられるキットであって、前記第１型アレル特異的プローブ、前記第２型アレル特異的プローブ、前記インベーダプローブ、前記第１型ＦＲＥＴプローブ、前記第２型ＦＲＥＴプローブ、前記第１型コントロールオリゴ、及び前記第２型コントロールオリゴを備える。当該ジェノタイピングキットを用いることによって、本発明に係るジェノタイピング法をより簡便に実施することができる。
当該ジェノタイピングキット中には、その他にも、前記第１型コントロールオリゴと前記第２型コントロールオリゴによる標準試料系列を調製するためのバッファーや、ＲＥＴＩＮＡに用いる反応用バッファー、Ｃｌｅａｖａｓｅ、当該ジェノタイピングキットの使用説明書等を備えていてもよい。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ＲＥＴＩＮＡを利用した本発明に係るジェノタイピング法により、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＳＮＰ及びインデルのアレル比を推定した。対象のアレルは、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）、１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）の５種類とした。各アレルについて、野生型を第１の遺伝子型、バリアント型を第２の遺伝子型として、本発明に係るジェノタイピング法を行った。
ＲＥＴＩＮＡを利用した本発明に係るジェノタイピング法により、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＳＮＰ及びインデルのアレル比を推定した。対象のアレルは、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）、１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）の５種類とした。各アレルについて、野生型を第１の遺伝子型、バリアント型を第２の遺伝子型として、本発明に係るジェノタイピング法を行った。
＜ＲＥＴＩＮＡのためのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＰＣＲ増幅＞
ＲＥＴＩＮＡの鋳型として用いるために、ゲノムＤＮＡ中のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を含む領域のＰＣＲ増幅を実施した。サンプルとして、第Ｉ期International HapMap projectにおいて用いられた４５人の日本人被験体及び４５人の中国人被験体（ＪＣＨ）由来のゲノムＤＮＡサンプルを５検体（ＮＡ１８５５２、ＮＡ１８６３７、ＮＡ１８５７６、ＮＡ１８５３７、ＮＡ１８６２２）用いた。これらは特許文献１において、ディプロタイプが既に判定されたものである。ＪＣＨサンプルは、Coriell Cell Repositories（Camden、New Jersey、USA）から購入した。各アレルの多型部位を含むゲノム領域を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、表１に示す。ＮＡ１８５５２を鋳型とし、２Ｄ６ｘ２＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ２＿Ｒプライマーを用いて、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８６３７を鋳型とし、２Ｄ６ｘ４＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ４＿Ｒプライマーを用いて、１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８５７６を鋳型とし、２Ｄ６ｘ６＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ６＿Ｒプライマーを用いて、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８５３７を鋳型とし、２Ｄ６ｘ１０＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ１０＿Ｒプライマーを用いて、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８６２２を鋳型とし、２Ｄ６ｘ４１＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ４１＿Ｒプライマーを用いて、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）のゲノム領域を増幅させた。
ＲＥＴＩＮＡの鋳型として用いるために、ゲノムＤＮＡ中のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を含む領域のＰＣＲ増幅を実施した。サンプルとして、第Ｉ期International HapMap projectにおいて用いられた４５人の日本人被験体及び４５人の中国人被験体（ＪＣＨ）由来のゲノムＤＮＡサンプルを５検体（ＮＡ１８５５２、ＮＡ１８６３７、ＮＡ１８５７６、ＮＡ１８５３７、ＮＡ１８６２２）用いた。これらは特許文献１において、ディプロタイプが既に判定されたものである。ＪＣＨサンプルは、Coriell Cell Repositories（Camden、New Jersey、USA）から購入した。各アレルの多型部位を含むゲノム領域を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、表１に示す。ＮＡ１８５５２を鋳型とし、２Ｄ６ｘ２＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ２＿Ｒプライマーを用いて、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８６３７を鋳型とし、２Ｄ６ｘ４＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ４＿Ｒプライマーを用いて、１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８５７６を鋳型とし、２Ｄ６ｘ６＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ６＿Ｒプライマーを用いて、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８５３７を鋳型とし、２Ｄ６ｘ１０＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ１０＿Ｒプライマーを用いて、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）のゲノム領域を増幅させた。ＮＡ１８６２２を鋳型とし、２Ｄ６ｘ４１＿Ｆプライマー及び２Ｄ６ｘ４１＿Ｒプライマーを用いて、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）のゲノム領域を増幅させた。
ＰＣＲの反応溶液は、２０μＬの反応容量で、２０ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（Takara Bio、Otsu、shiga、Japan）を製造者の指示に従って使用して調製した。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（Applied Biosystems、Foster City、California、USA）を用いて実施した。ＰＣＲのサイクル条件は、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）のゲノム領域の増幅は、９５℃で２分間を１サイクル、その後９８℃で１０秒間及び６８℃で３分間を３５サイクル行った。１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）のゲノム領域の増幅は、９５℃で２分間を１サイクル、その後９８℃で１０秒間及び６８℃で３０秒間を３５サイクル行った。ＰＣＲ後、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物の増幅を確認した。
＜ＲＥＴＩＮＡに用いる標準試料系列の調製＞
各アレル中の多型部位について、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比が１：０、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、又は０：１である７種の標準試料からなる標準試料系列を調製した。
各アレル中の多型部位について、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比が１：０、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、又は０：１である７種の標準試料からなる標準試料系列を調製した。
＜ＲＥＴＩＮＡ＞
調製した標準試料系列の各標準試料、又は前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の５種類のアレルのゲノム領域の増幅産物を希釈したＤＮＡ含有試料を鋳型として、ＲＥＴＩＮＡを実施した。２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表２に、１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表３に、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表４に、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表５に、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表６に、それぞれ示す。表２〜６の「役割」欄のうち、「ｉｎｖａｄｅｒ」はインベーダプローブを、「ａｌｌｅｌｅ＿Ｗｔ」は野生型アレル特異的プローブを、「ａｌｌｅｌｅ＿Ｖ」はバリアント型アレル特異的プローブを、「ｃｏｎｔｒｏｌ＿Ｗｔ」は野生型コントロールオリゴを、「ｃｏｎｔｒｏｌ＿Ｖ」はバリアント型コントロールオリゴを、それぞれ示す。
調製した標準試料系列の各標準試料、又は前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の５種類のアレルのゲノム領域の増幅産物を希釈したＤＮＡ含有試料を鋳型として、ＲＥＴＩＮＡを実施した。２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表２に、１８４６Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表３に、１７０７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ２Ｄ６＊６）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表４に、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表５に、２９８８Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡに用いた各プローブの塩基配列を表６に、それぞれ示す。表２〜６の「役割」欄のうち、「ｉｎｖａｄｅｒ」はインベーダプローブを、「ａｌｌｅｌｅ＿Ｗｔ」は野生型アレル特異的プローブを、「ａｌｌｅｌｅ＿Ｖ」はバリアント型アレル特異的プローブを、「ｃｏｎｔｒｏｌ＿Ｗｔ」は野生型コントロールオリゴを、「ｃｏｎｔｒｏｌ＿Ｖ」はバリアント型コントロールオリゴを、それぞれ示す。
各野生型アレル特異的プローブからＣｌｅａｖａｓｅにより切断されて遊離するフラップとハイブリダイズするＦＡＭで標識されたＦＲＥＴプローブは、Third Wave Technologies（Madison、Wisconsin、USA)から購入した。同様に、各バリアント型アレル特異的プローブからＣｌｅａｖａｓｅにより切断されて遊離するフラップとハイブリダイズするＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）で標識されたＦＲＥＴプローブも、Third Wave Technologies（Madison、Wisconsin、USA)から購入した。Ｒｏｘ色素（Sigma社製、Saint Louis、Missouri、USA)をレポーターシグナルの正規化に使用した。
ＲＥＴＩＮＡは、１０μＬの反応容量で、Third Wave Technologiesにより推奨されるプロトコルに従って、ABIprism 7900 (Applied Biosy stems)を用いて実施した。各反応溶液は、４連チューブのそれぞれに分注されてABIprism 7900内に設置され、全てのＲＥＴＩＮＡ、すなわち、標準試料を鋳型としたＲＥＴＩＮＡとアレルの増幅産物を鋳型としたＲＥＴＩＮＡの両方を、同時に実施した。２０分間のインベーダ反応中、３０秒毎にリアルタイム蛍光検出を実施した。データ解析は、Excel program (Microsoft)を用いて実施した。
標準試料を含む全サンプルについて、インベーダ反応開始後０．５分〜７．５分の間でＸ−Ｙプロット（Ｘ軸にＦＡＭ蛍光強度、Ｙ軸にＹｅｌｌｏｗ蛍光強度）を作成し、反応軌道を描いた（図１〜５）。各ＲＥＴＩＮＡにおいて、リアルタイムに測定した蛍光強度のプロット同士を結んだものが、反応軌道である。図１〜５中、「ｘ：ｙ」（ｘとｙは０〜３の整数）と付されている黒丸のプロットは、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比がｘ：ｙである標準試料を鋳型とした場合の測定結果であり、白抜き丸のプロットは、ゲノムＤＮＡの増幅産物の希釈物（被検体由来のＤＮＡ含有試料）を鋳型とした場合の測定結果である。
種々のアレル比を有する標準試料は、反応の初期段階においてアレル比に比例して明確に分離されたが、反応時間が２０分を経過した後には、いずれの反応溶液においても、ＦＡＭ蛍光強度とＹｅｌｌｏｗ蛍光強度はある特定の値に収束し、１つのヘテロ接合体として融合した。図１〜図５において、これらの標準試料の反応軌道と各ゲノム由来のＤＮＡの反応軌道を比較したところ、野生型アレル：バリアント型アレルのコピー数比は、明らかに、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＮＡ１８５５２）は１：１であり、１８４６Ｇ＞Ａ（ＮＡ１８６３７）は１：１であり、１７０７ｄｅｌＴ（ＮＡ１８５７６）は２：１であり、１００Ｃ＞Ｔ（ＮＡ１８５３７）は１：２であり、２９８８Ｇ＞Ａ（ＮＡ１８６２２）は１：１であることが分かった。これらの結果は、特許文献１における判定結果と一致した。
また、図１から、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＮＡ１８５５２）のアッセイにおいては、インベーダ反応開始から２．５分後付近（原点から５個目のプロット付近）が、反応軌道が相互に最も分離されており、帰属判定に適していることが分かった。同様に、図４から、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）のアッセイにおいては、インベーダ反応開始から４分後付近（原点から８個目のプロット付近）が、反応軌道が相互に最も分離されており、帰属判定に適していることが分かった。
これらの結果より、ＲＥＴＩＮＡにおいてアレル由来ＤＮＡを模したコントロールオリゴを用いることにより、従来はサンプル同士によるクラスター解析を要した両アレルのコピー数比判定が、単一の被験体のアッセイでも可能となることが示された。
［実施例２］
実施例１において、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡの鋳型として用いた標準試料系列の各標準試料、及びＮＡ１８５５２の増幅産物（被検体由来ＤＮＡ）を希釈したＤＮＡ含有試料について、それぞれ、４段階に希釈した希釈系列を調製した。これらの希釈系列を構成する各試料を鋳型とした以外は、実施例１と同様にしてＲＥＴＩＮＡを実施した。
実施例１において、インベーダ反応開始から２．５分後の蛍光強度が帰属判定に適していることが分かったため、各ＲＥＴＩＮＡのインベーダ反応開始から２．５分後の結果について、Ｘ−Ｙプロット（Ｘ軸にＦＡＭ蛍光強度、Ｙ軸にＹｅｌｌｏｗ蛍光強度）を作成し、反応軌道を描いた（図６）。反応軌道は、各ＲＥＴＩＮＡにおいて、同一の希釈系列に属する各試料の蛍光強度のプロット同士（４プロット）を結んだものが、反応軌道である。図６中、「ｘ：ｙ」（ｘとｙは０〜３の整数）と付されている黒丸のプロットは、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比がｘ：ｙである標準試料の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果であり、白抜き丸のプロットは、ゲノムＤＮＡの増幅産物（被検体由来のＤＮＡ含有試料）の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果である。希釈倍率が高い試料ほど、原点近くにプロットされた。標準試料の希釈系列の反応軌道と被検体由来のＤＮＡ含有試料の希釈系列の反応軌道を比較すると、明らかに、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＮＡ１８５５２）の野生型アレル：バリアント型アレルのコピー数比は１：１であることが分かった。
実施例１において、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡの鋳型として用いた標準試料系列の各標準試料、及びＮＡ１８５５２の増幅産物（被検体由来ＤＮＡ）を希釈したＤＮＡ含有試料について、それぞれ、４段階に希釈した希釈系列を調製した。これらの希釈系列を構成する各試料を鋳型とした以外は、実施例１と同様にしてＲＥＴＩＮＡを実施した。
実施例１において、インベーダ反応開始から２．５分後の蛍光強度が帰属判定に適していることが分かったため、各ＲＥＴＩＮＡのインベーダ反応開始から２．５分後の結果について、Ｘ−Ｙプロット（Ｘ軸にＦＡＭ蛍光強度、Ｙ軸にＹｅｌｌｏｗ蛍光強度）を作成し、反応軌道を描いた（図６）。反応軌道は、各ＲＥＴＩＮＡにおいて、同一の希釈系列に属する各試料の蛍光強度のプロット同士（４プロット）を結んだものが、反応軌道である。図６中、「ｘ：ｙ」（ｘとｙは０〜３の整数）と付されている黒丸のプロットは、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比がｘ：ｙである標準試料の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果であり、白抜き丸のプロットは、ゲノムＤＮＡの増幅産物（被検体由来のＤＮＡ含有試料）の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果である。希釈倍率が高い試料ほど、原点近くにプロットされた。標準試料の希釈系列の反応軌道と被検体由来のＤＮＡ含有試料の希釈系列の反応軌道を比較すると、明らかに、２８５０Ｃ＞Ｔ（ＮＡ１８５５２）の野生型アレル：バリアント型アレルのコピー数比は１：１であることが分かった。
［実施例３］
実施例１において、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡの鋳型として用いた標準試料系列の各標準試料、及びＮＡ１８５３７の増幅産物（被検体由来ＤＮＡ）を希釈したＤＮＡ含有試料について、それぞれ、４段階に希釈した希釈系列を調製した。これらの希釈系列を構成する各試料を鋳型とした以外は、実施例１と同様にしてＲＥＴＩＮＡを実施した。
実施例１において、インベーダ反応開始から４分後の蛍光強度が帰属判定に適していることが分かったため、各ＲＥＴＩＮＡのインベーダ反応開始から４分後の結果について、Ｘ−Ｙプロット（Ｘ軸にＦＡＭ蛍光強度、Ｙ軸にＹｅｌｌｏｗ蛍光強度）を作成し、図６と同様にして反応軌道を描いた（図７）。図７中、「ｘ：ｙ」（ｘとｙは０〜３の整数）と付されている黒丸のプロットは、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比がｘ：ｙである標準試料の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果であり、白抜き丸のプロットは、ゲノムＤＮＡの増幅産物（被検体由来のＤＮＡ含有試料）の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果である。希釈倍率が高い試料ほど、原点近くにプロットされた。標準試料の希釈系列の反応軌道と被検体由来のＤＮＡ含有試料の希釈系列の反応軌道を比較すると、明らかに、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の野生型アレル：バリアント型アレルのコピー数比は１：２であることが分かった。
実施例１において、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の遺伝子型判定のためのＲＥＴＩＮＡの鋳型として用いた標準試料系列の各標準試料、及びＮＡ１８５３７の増幅産物（被検体由来ＤＮＡ）を希釈したＤＮＡ含有試料について、それぞれ、４段階に希釈した希釈系列を調製した。これらの希釈系列を構成する各試料を鋳型とした以外は、実施例１と同様にしてＲＥＴＩＮＡを実施した。
実施例１において、インベーダ反応開始から４分後の蛍光強度が帰属判定に適していることが分かったため、各ＲＥＴＩＮＡのインベーダ反応開始から４分後の結果について、Ｘ−Ｙプロット（Ｘ軸にＦＡＭ蛍光強度、Ｙ軸にＹｅｌｌｏｗ蛍光強度）を作成し、図６と同様にして反応軌道を描いた（図７）。図７中、「ｘ：ｙ」（ｘとｙは０〜３の整数）と付されている黒丸のプロットは、野生型コントロールオリゴとバリアント型コントロールオリゴの含有量比がｘ：ｙである標準試料の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果であり、白抜き丸のプロットは、ゲノムＤＮＡの増幅産物（被検体由来のＤＮＡ含有試料）の希釈系列を鋳型とした場合の測定結果である。希釈倍率が高い試料ほど、原点近くにプロットされた。標準試料の希釈系列の反応軌道と被検体由来のＤＮＡ含有試料の希釈系列の反応軌道を比較すると、明らかに、１００Ｃ＞Ｔ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の野生型アレル：バリアント型アレルのコピー数比は１：２であることが分かった。
本発明によれば、多型遺伝子の遺伝子型が判定可能であるのみならず、少数の被験体を対象としたコピー数多型、すなわち両アレルのコピー数の比をも簡便に判定することが可能となる。本発明に係るジェノタイピング法を遺伝子型検査に適用することにより、臨床応用の可能性が広がるため、当該方法は、オーダーメイド医療の実現を図るためにも有用である。
Claims (14)
- 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法であって、
（ａ）被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料を鋳型として、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
を用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｂ）前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドとの総量に対する前記第１型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する工程と、
（ｃ）前記標準試料系列の各標準試料について、それぞれ、当該標準試料を鋳型として、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブ、前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｄ）縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果をプロットし、標準試料ごとに反応軌道を描く工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において描かれたグラフに、前記工程（ａ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果をプロットし、前記反応軌道に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する工程と、
を有することを特徴とする、遺伝子多型の判定方法。 - 前記工程（ｅ）において、前記工程（ａ）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記反応軌道が相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、請求項１に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、リアルタイムインベーダアッセイを用いて判定する方法であって、
（ａ’）被験体由来の前記ゲノム領域を含むＤＮＡ含有試料の希釈系列を調製し、当該希釈系列をそれぞれ鋳型として、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第２の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
を用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｂ）前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドとの総量に対する前記第１型コントロールオリゴヌクレオチドの含有比率（モル比）が異なる標準試料系列を調製する工程と、
（ｃ’）前記標準試料系列の各標準試料について、それぞれ希釈系列を調製し、当該希釈系列をそれぞれ鋳型として、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ、前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブ、前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いてリアルタイムインベーダアッセイを行う工程と、
（ｄ’）縦軸と横軸のいずれか一方を前記第１の蛍光物質の蛍光強度とし、残る他方を前記第２の蛍光物質の蛍光強度としたグラフに、前記工程（ｃ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、蛍光強度が飽和に達するより前の時点における結果をプロットし、各標準試料の希釈系列ごとに反応軌道を描く工程と、
（ｅ’）前記工程（ｄ’）において描かれたグラフに、前記工程（ａ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記時点と同じ時点における結果をプロットし、前記反応軌道に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する工程と、
を有することを特徴とする、遺伝子多型の判定方法。 - 前記工程（ｅ’）において、前記工程（ａ’）におけるリアルタイムインベーダアッセイで測定された結果のうち、前記工程（ｄ’）における各標準試料のプロットが相互に最も分離される反応時点における第１の蛍光物質の蛍光強度及び第２の蛍光物質の蛍光強度に基づいて、前記被験体の遺伝子型を判定する、請求項３に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記多型が、一塩基多型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記ゲノム領域が、コピー数多型領域内にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子多型の判定方法。
- アレル非対称性を伴う重複を検出するためのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記工程（ａ）と前記工程（ｃ）を同時に行う、請求項１又は２に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記工程（ａ’）と前記工程（ｃ’）を同時に行う、請求項３又は４に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記ゲノム領域が、複数の一塩基多型を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記ＤＮＡ含有試料が、前記被検体由来の前記ゲノム領域を増幅したＤＮＡを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 定量ＰＣＲを用いて得られる、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレル及び前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルの総コピー数に基づいて、各アレルのコピー数を判定する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 前記定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ法により行われる、請求項１２に記載の遺伝子多型の判定方法。
- 多型部位を含むゲノム領域における被験体の遺伝子型を、インベーダアッセイを用いて判定する方法に用いられるキットであって、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第１のフラップ領域と、前記第１のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第１の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第１型アレル特異的領域とを有する第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記ゲノム領域とはハイブリダイズしない第２のフラップ領域と、前記第２のフラップ領域の３’側に、前記多型部位が第２の遺伝子型であるアレルに対して特異的にハイブリダイズする第２型アレル特異的領域とを有する第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチド及び前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドと、少なくとも１塩基重複するように、前記ゲノム領域のうち前記多型部位の３’側の領域とハイブリダイズするインベーダオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第１のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第１の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
５’側がヘアピン構造をとり得る塩基配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５’末端の塩基と対をなす塩基から３’側に連続する塩基配列が前記第２のフラップ領域と相補的な塩基配列であり、５’末端に第２の蛍光物質が結合しており、ヘアピン構造を形成した際に前記第１の蛍光物質からの蛍光を消光する消光物質が結合している第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと、
前記第１のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第１型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第１型コントロールオリゴヌクレオチドと、
前記第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ中の前記第２型アレル特異的領域及び前記インベーダオリゴヌクレオチドプローブの両方とハイブリダイズし得る第２型コントロールオリゴヌクレオチドと、
を有することを特徴とする、遺伝子多型判定キット。
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| JP2008263974A (ja) * | 2007-03-28 | 2008-11-06 | Institute Of Physical & Chemical Research | 新規多型検出法 |
| WO2009054474A1 (ja) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Toppan Printing Co., Ltd. | アレル判定装置及び方法、ならびに、コンピュータプログラム |
| JP2010104360A (ja) * | 2008-10-01 | 2010-05-13 | Shimadzu Corp | 遺伝子多型判定方法 |
-
2013
- 2013-10-10 JP JP2013213234A patent/JP2015073506A/ja active Pending
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