JP2015061536A

JP2015061536A - Ｅｐｈ型マ−カ−の細胞／リガンド標識システム、そのシステムからなる細胞物質ならびにその製造方法および前脈管形成としての用途

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Publication number: JP2015061536A
Application number: JP2014255610A
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Inventors: フーベール、フィリップップ; Foubert Philippe; フーベール、フィリップ; シルヴェストル、ジャン−セバスチも�ャン−セバスチアン�ン; Jean-Sebastien Silvestre; シルヴェストル、ジャン−セバスチアン; リクース−ルサンヌ、ソフィー�ンヌ、ソフィール; Le Ricousse-Roussanne Sophie; リクース−ルサンヌ、ソフィール
Original assignee: Universite Paris Diderot Paris 7; IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Current assignee: Universite Paris Diderot Paris 7; IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
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Abstract

【課題】細胞マ−カ−が細胞の外側メンブレン上に存在する細胞マ−カ−／特異的リガンド前脈管形成システムを提供すること。
【解決手段】細胞マ−カ−が細胞の外側メンブレン上に存在する細胞マ−カ−／特異的リガンド前脈管形成システムが、（a）Eph類（特にEphB4またはEphB1）から選ばれる細胞マ−カ−からなる内皮前駆細胞（EPC）と、（b）構造式：L-K（I）で表されるタンパク物質であって、該マ−カ−に対して特異的なリガンド（L）からなりかつ結合タンパク質（K）と関連または融合しているタンパク物質から構成され、脈管形成を刺激する構造式：EPC-Eph-L-K（II）で表される細胞物質を提供できる。また、この発明は、脈管形成を刺激する生産物としての上記細胞物質、その製造方法およびその治療的用途、特に脈管不全の治療的用途に関するものである。
【選択図】図２

Description

この発明は、細胞マ−カ−ならびにそのマ−カ−に特異的なリガンドからなるシステムであって、該マ−カ−がEph類、特にEphB4マ−カ−であるシステムを用いた新規な技術的解決に関するものである。この発明はまた該システムからなる細胞物質、その製造方法および前脈管形成剤（proangiogenic agent）としての治療的用途に関するものである。

ニュ−ロン誘導の中枢系において最初に見つけられたエフリンファミリ−のメンバ−ならびにそのEph受容体チロシンキナ−ゼは脈管形成（angiogenesis）に関与するファクタ−であることは知られている。Eph受容体およびそれらのエフリンリガンドの多くのイソ型の組織発現特異性について記載されている。脊椎動物においては、第１に、少なくとも１６種類のEph受容体、つまり１０種類のEphA受容体（EphA1からEphA10）と６種類のEphB受容体（EphB1からEphB6）が知られている。第２に、少なくとも９種類のエフリンリガンド、つまりエフリン−A1からエフリン−A6ならびにエフリン−B1からエフリン−B3が知られている。元来、サブクラスEphAおよびEphBの区別は、それらの細胞外ドメイン配列のホモロジ−に基づいているが、この区別はまたそれらのリガンドの優先的結合にも相応している。つまり、エフリン−Aリガンドは一般的にはグリコシルホスファチジルイノシト−ル（GPI）によってそのメンブレンに結合していて、エフリン−BリガンドはPDZ−結合ドメインを有する細胞内細胞質ドメインを有するトランスメンブレンである。

図１に示すように、
・Eph受容体は、細胞外ドメイン、フィブロネクチンタイプIII反復体（リピ−ト）、システインリッチ領域および特異的リガンド結合ドメインから構成されている。また、Eph受容体は、チロシンキナ−ゼ活性を有するドメイン、ステイル（sterile）αモチ−フ（SAM）およびPDZ−結合モチ−フからなる細胞内ドメインの延長部を有していて；
・エフリン−Aリガンドは、GPI（GPIアンカ−）を介してメンブレンに結合していて；
・エフリン−Bトランスメンブレンリガンドは細胞質テ−ル（tail）およびPDZ−結合モチ−フからなる細胞内延長部を有している。

Eph受容体チロシンキナ−ゼ（特にEphB4）とそのリガンド（特にエフリン−B2）との間の相互作用、つまりトランスメンブレンタンパク質に関して、その表面でEphを発現する細胞中のEph受容体によって誘導されるシグナル伝達（フォワ−ドシグナル伝達）と、その表面でエフリンを発現する細胞中のエフリンリガンドによって誘導されるリバ−スシグナル伝達とからなる２方向シグナル伝達が発生する。この２方向シグナル伝達は細胞／細胞接触、移行および細胞粘着の役割を果たしている。

EphB4／エフリン−B2対（カップル）の動静脈での発現の特異性は既知である（非特許文献１）。EphB4は静脈でだけ発現し、エフリン−B2は動脈で発現する。

EphB受容体とエフリン−Bリガンドは特に胚発達中に発現する。またEphBはマウスの胚細胞（ES）の内皮細胞への分化に関与していると思われる（非特許文献２）。

ある種のEph受容体、特にEphB4は腫瘍中で過剰発現することが知られている。このことは、これらのEph受容体が腫瘍増殖の役割を果たしていることを示唆している。またEphB４によるエフリン−B2の活性化（リバ−スシグナル伝達）が腫瘍の成長を刺激していることを示している（非特許文献３）。

他方、（i）腫瘍形成中のエフリン−B2発現の増加ならびに二次的には（ii）この増加によるエフリン−B2の腫瘍誘発の可能性の懸念も先行技術には報告されている。このことは、いくつかの刊行物が、一方では腫瘍マ−カ−としてエフリン−B2の検出を利用すること、また他方ではエフリン−B2を阻害することを提案している理由を説明している。例えば、特に特許文献１は、腫瘍脈管構造のマ−カ−としてエフリン−B2の検出を推奨して、上記腫瘍脈管構造を視覚化する技法を記載している。他方、特許文献２は、受容体とそのリガンドとの相互作用を防止して脈管形成を制限するためにEph、特にEphB４インヒビタ−またはエフリン、特にエフリン−B2インヒビタ−の使用を提案している。また、特許文献３および特許文献４は、脈管形成を減少もしくは調節するために抗Eph抗体（特に抗EphB4抗体）または抗エフリン抗体（特に抗エフリン−B2抗体）のいずれかを使用することを推奨している。

簡潔に言えば、Eph／エフリン対(カップル)に関する先行特許文献は、特に下記に示す方法に関するものである：
・PDZドメインに結合するタンパク質によるエフリン−Bシグナル伝達（リバ−スシグナル伝達）（特許文献５、６参照）；
・エフリン−B2またはEphB4発現の調節（特許文献７、８参照）；
・がんおよび脈管形成関連疾患を処置する観点でのエフリン−B2／EphB4相互作用の阻害（特許文献８、９参照）；
・腫瘍脈管構造のマ−カ−としてのエフリン−B2の使用。

さらに、Fcタンパク質（つまり、抗体のFcフラグメント）と対をなしたエフリン−B2リガンドは内皮細胞HUVECの移動を誘発することが報告されている（非特許文献４）。

最後に、スフィンゴシンキナ−ゼ(sphingosine kinase)をコ−ドする配列および脈管形成タンパク質をコ−ドする配列を有するアデノウィルスが知られている（特許文献１０）。この文献は、アデノウイルスを局所注射した後のスフィンゴシンキナ−ゼと、エフリン−B2と考えられる脈管形成タンパク質の発現を目的としている。さらに、エフリン−B2の水溶性インヒビタ−を注射して造血幹細胞の異常な増殖を減少させる方法も知られている（特許文献１１）。

国際公開第０２／５８５３８号パンフレット米国特許出願公開第２００３／０２０７４４７号公報米国特許第６８６４２２７号公報国際公開第０３／１０２１４４号パンフレット国際公開第０２／０７９３８２号パンフレット国際公開第００／０３１１２４号パンフレット国際公開第０４／００６８４６号パンフレット国際公開第０４／０８０４１８号パンフレット国際公開第０４／０６９２６４号パンフレット米国特許第６６１０５３４号公報米国特許出願公開第２００５／００４９１９４号公報

H. U. Wang et al., "Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor EphB4", Cell, 1998; 93: 741-753 Z. Wang et al., "Ephrin receptor, EphB4, regulates ES cell differentiation of primitive mammalian hemangioblasts, blood, cardiomyocytes and blood vessels", Blood, 2004; 103: 100-109 N. K. Noren et al., "Interplay between EphB4 on tumor cells and vascular ephrin-B2 regulates tumor growth", Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 101: 5583-5588 Maekawa Hiromitsu et al. "Ephrin-B2 induces migration of endothelial cells through the phosphatidylinositol-3 kinase pathway and promotes angiogenesis in adult vasculature", Arteriosclerosis thrombosis and vascular biology, 2003, 23: 2008-2014

この発明は、上記先行文献に記載も示唆もされていない、脈管形成の刺激に関わる技術的課題に対する新規な解決方法を提供することを目的としている。さらに詳細には、この発明は、特定の細胞、つまり内皮前駆細胞に適用される"上記マ−カ−に特異的な細胞マ−カ−／リガンド"を使用した、脈管形成の刺激に関する課題を解決する新規な技術的解決方法を提供することを目的としている。この発明の目的は、細胞を注射する前にその細胞を活性化して、より効果的な脈管再生プロセス、特に虚血後の脈管再生プロセスを得ることによって、従来の細胞治療を改良する方法を提供することである。

この発明に係る新規解決方法は、そのマ−カ−が内皮細胞前駆細胞に関連している細胞マ−カ−／リガンドシステムを使用している。このシステムでは、そのマ−カ−はEph受容体であり、Eph特異的リガンドはエフリンリガンドである。

この発明の第１の態様は、細胞マ−カ−が細胞の外側メンブレンに存在する新規な細胞マ−カ−／特異的リガンド前脈管形成システムを提供するとであり、該システムが下記構成からなっていることを特徴としている：
（ａ）Eph類、特にEphB4またはEphB1からなる群から選ばれる細胞マ−カ−からなる内皮前駆細胞（EPC）と、
（ｂ）構造式：L-K （I)
で表されるタンパク物質であって、上記マ−カ−に特異的なリガンド（L）から構成され、かつ、結合タンパク質（K）、特に抗体Fcフラグメントに関連するかもしくは融合しているタンパク物質から構成され、また脈管形成を刺激する構造式：
EPC-Eph-L-K （II)
で表される細胞物質を提供できるものである。

さらに詳細には、脈管形成を刺激するために、Ephマ−カ−からなるEPC細胞は、エフリンファミリ−に属する特異的リガンドLによって活性化される。リガンドLはまたエフリン、例えばエフリン−B2のペプチドフラグメントであって、同じ生物学的活性を有するであろうものからなっていてもよい。

この発明は、その第２の態様として、脈管形成を刺激することができる細胞物質であって、構造式（II）：
EPC-Eph-L-K （II）
で表され、該リガンドLが結合タンパク質Kに関連するかまたは融合している細胞物質を提供する。

この細胞物質は、(i) 実質的に精製された細胞培養物の形であってももしくは他の前駆細胞、特に単核細胞と組み合わせた細胞培養物の形であって、または (ii) 適切であれば凍結されていてもよい。

この発明の第３の態様は、上記細胞物質の製造方法であって、
・その外側メンブレン上にEphファミリ−、特にEphB4もしくはEphB1のマ−カ−を発現するEPCを使用する工程と、
・上記EPCを、タンパク物質Ｌ−Ｋ（式中、Ｌは上記マ−カ−に特異的なリガンドを意味し、ＫはＬに関連するかもしくは融合する結合タンパク質を意味する）とインビトロで接触させる工程とからなる製造方法を提供する。

また、この発明は、損傷血管を再生するために使用できる医薬品であって、生理学的に許容できる賦形剤と組み合わせた、治療的に許容できる量のこの発明の細胞物質、特に前脈管形成的に活性な成分とからなる医薬品を提供する。

さらに、この発明は、その別の態様として、上記細胞物質の新規な用途であって、該細胞物質が、脈管不全の処置、特に虚血性心臓、脳もしくは末梢組織の再生に治療的に使用する組成物の製造のために、前脈管形成的に活性な成分として、生理学的に許容できる賦形剤と組み合わせて使用されることからなる用途を提供する。

先行技術としてのEph受容体チロシンキナーゼとそのエフリン-A型もしくはエフリン-B型のリガンドの概要を示す図である。本発明の細胞物質を試験した前脈管形成の性質を示す図である。本発明の細胞物質を試験した前脈管形成の性質を示す図である。本発明の細胞物質を試験した前脈管形成の性質を示す図である。

Eph受容体/エフリンリガンドシステムの成分の特異性については文献に記載されている（E. B. Pasquale, Curr. Opin. Cell Biol., 1997; 9(5):608）。便利なように、下記に示す本文献の表１（アメリカ特許第６５７９６８３号に記載されているような）には、ある種のカップルの特異性が記載されていて、第１欄に示した受容体に対する親和性を減少させる順に第２欄にリガンドを記載している。

この発明の細胞マ−カ−/特異的リガンドシステムにおいては、カップルの２成分はそれぞれアミノ酸配列の形であっても、または適切であれば核酸配列の形であってもよい。しかしながら、はじめは、Eph受容体はEPCメンブレン上にアミノ酸配列の形で発現させるのは明らかに好ましい。同様に、エフリンリガンドは、アミノ酸配列の形またはエフリンペプチドフラグメントの形で使用されるのが非常に有利である。これは、Ephとエフェリンとがアミノ酸の形で結合するからであって、タンパク質/タンパク質の相互作用は前脈管形成活性を観察するために必要である。その結果、後記するように、Ephとエフェリンは、アミノ酸配列のタンパク質の形で専ら阻害しあう。

Ephマ−カ−としては、EphA またはEphBが使用できる。しかしながら、Ephマ−カ−は、EphB マ−カ−が脈管形成に優先的に関与していることから、EphBであるのが好ましい。他方、現在の技術水準では、EphAマ−カ−は、中枢神経に主に関与していると思われる。

この発明においては、EphB マ−カ−としてはEphB4またはEphB1であるのが有利であり、EphB マ−カ−のうちでは、EphB4がEphB1よりも好ましい。

エフリンリガンドのなかでは、エフリン−Bリガンド、特にエフリン−B2リガンドまたはエフリン−B1リガンドが好ましい。加えて、同じ生物学的活性を有するエフリン−B2のペプチドフラグメントに相応する、例えばエフリン−B2リガンドの変形もまた好ましい。この結果、この発明のシステムにおいては、第１に、EphB4またはEphB1マ−カ−を使用すること、第２に、エフリン−B2またはエフリン−B1リガンドを使用することが有利であり、Eph/エフリンカップルはEphB4/エフリン−B2であるのが特に好ましい。

リガンドＬがEPC−Ephを活性化することができるためには、大部分の場合、それが下記構造のタンパク物質の形状で結合たんぱく質Ｋに関連するかまたは融合することが重要であり：
Ｌ−Ｋ（I）
また組換えエフリン−B2タンパク質は、出願人の知る限りでは、上記結合タンパク質Kの導入なしにEPC-Ephだけを活性化できる物質であると考えられる。

この発明に適している結合タンパク質Kとしては、特に数多くの抗体Fcフラグメントであって、例えばペプシン、パパインもしくはあらゆるその他の適切な物質による抗体の分解によって得られるもの）が挙げられる。例えば、抗体製造の副産物として市販されているFcフラグメント、例えばFab'やF(ab)'なども好ましい。

変法として、上記タンパク物質L-Kは、好ましくはヒトの組換えエフリン−B2タンパク質で置換されていてもよい。

この発明に適するEPCは、外側メンブレンで発現したEph細胞マ−カ−（特にEphB、好ましくはEphB1、より好ましくはEphB4）からなる細胞である。かかるEPC細胞は、骨髄、末梢血、好ましくは臍帯血からの単核細胞またはCD34もしくはCD133を発現する細胞から得ることができる。

単核細胞は骨髄で産生され、そこでは高濃度で見いだされ、血流中を通過し、帯血や末梢血中で見いだされる。単核細胞は、数多くの細胞が（i）Ephマ−カ−（より好ましくはEphB4マ−カ−）を発現するためにまたは（ii）その外側メンブレン上に既に発現した上記マ−カ−を含有するために必要な遺伝的物質を有していることから、かかる細胞から選択することができる。この発明においては、単核細胞としては、分化した後実質的に発現するかまたはEphB4を含む比較的大量のEPCを提供することから、CD34＋またはCD133＋細胞が好ましい。

分化によって産生されるEPCの単核細胞中の濃度は、その細胞の由来によって変化する。その濃度は、骨髄や臍帯血中では多かれ少なかれ均等であるが、末梢血中では低い。

タンパク物質Ｌ−Ｋが組換えエフリン−B2タンパク質で置換できる上記構造式（II）で表されるこの発明の細胞物質は、その外側メンブレン上に、その特異的リガンドに結合したEphマ−カ−、特にEphB4またはEphB1をそれぞれ有する１種または複数種の細胞からなっている。変形として、上記細胞物質は、上記構造式（II）で表される数種類の細胞と、また適切であれば上記タンパク物質で活性化されない他の細胞とを含んでいる培養物からなっていてもよい。したがって、かかる培養物は、活性化EPCと、非活性化EPCまたは単核細胞との細胞混合物であってもよい。

この発明の具体的な態様によれば、上記培養物は、その投与部位に接触する前に、下記（a）と（b）との培養によって得ることができる：
（ａ）Eph類、特にEphB4またはEphB1からなる群から選ばれる内皮前駆細胞（EPC）；
（ｂ）構造式：
Ｌ−Ｋ（I）
で表されるタンパク物質であって、上記マ−カ−に特異的なリガンド（Ｌ）であって、結合タンパク質（Ｋ）、特に抗体Fcフラグメントに関連しているかまたは融合するタンパク物質である。

有利な態様としては、培養は１０〜６０分間、特に３０分間インビトロで行うのがよい。この培養時間は細胞物質の投与直前の時間である。

変形として、上記細胞物質は、精製された細胞培養物の形または（i）Ｌ−Ｋもしくは組換えエフリン−B2タンパク質で活性化されたEPC細胞と、（ii）Ｌ−Ｋもしくは組換えエフリン−B2タンパク質で活性化されない非活性化前駆体、例えば単核細胞ならびに/もしくはEPCとを含む細胞混合物からなる細胞培養物の形であるのがよい。さらに、細胞物質は凍結状態で保存するのがよい。

細胞物質は、上気した観点からして、上記構造式（II）で表されるように、上記マ−カ−がEphB4またはEphB1であり、上記リガンドがエフリン−B2またはエフリン−B1である。

好ましい態様によれば、この発明に係る上記細胞物質の製造方法は、下記の工程からなっている：
（工程１）骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核細胞を使用する工程；
（工程２）工程１で得た上記細胞を、Ephマ−カ−を有するEPCを得るために分化させる工程；
（工程３）工程２で得たEPCを、エフリンをEphに結合することによって、インビトロで活性化する工程。

上記方法は、必要に応じて、工程１と工程２との間に、工程１ａを追加することもできる：
（工程１ａ）CD34＋および/またはCD133＋単核細胞を単離する工程。

工程１ａは、（工程１）＋（工程１ａ）＋（工程２）からなる３工程を構成する。しかしながら、上記工程１ａを実行すると、（工程１）＋（工程２）からなる２工程に比べて製造費用が増加する。実際には、非活性化EPC細胞は細胞培地中の活性化EPC細胞を希釈するのに役立つことから、２工程方法は、現状では３工程方法よりも明らかに利益がより一層上がる方法である。

この発明の方法によれば、上記リガンドＬは、構造式（II）：
EPC−Eph−L−K （II）
（式中、上記Ephマ−カ−はEphB4 またはEphB1、上記リガンドＬがB2 またはエフリン−B1であるのが好ましい）
で表される細胞物質を得るために、結合タンパク質Ｋに関連するかまたは融合する。

医薬品として、この発明の細胞物質は、特に脈管不全の処置、より好ましくは虚血性心臓、脳または末梢組織の脈管再生のために使用することができる。

この発明の細胞物質は、各用量に上記構造式（II）で表される物質が含まれる単位用量の形で調剤することができる。変法として、上記物質（II）の成分、つまり、EPC-Eph とタンパク物質L-Kを接触しないように調剤することも可能である。培養は、下記反応式：
EPC−Eph + L−K → EPC−Eph−L−K
に従って投与前に特に１０〜６０分間（好ましくは２０〜３０分間）行ないのがよい。

この場合、この発明は、治療的に許容される量のこの発明の前脈管形成システムの２つの成分であって、それぞれが生理学的に許容される賦形剤と調剤されている医薬組成物を提供する。これら２成分は投与前に培養されて構造式（II）で表される細胞物質に生成される。

上記したように、この発明の細胞物質は、特に心臓もしくは脳のレベルまたは末梢レベルで損傷を受けた脈管組織を再生するのに使用される。この物質は、動脈炎、冠状もしくは心臓の脈管不全または脳の脈管不全の処置に使用する組成物の製造に特に適している。動物モデルにおいては、第１に、下肢の重篤な虚血の処置に、第２に、切断を避けることを可能にする回復を確保するという点でよい結果を得ている。

この発明の細胞物質は、哺乳動物、特に人にそれ自体既知の方法で投与することができる。例えば、上記細胞物質は、（i）脈管患部内にまたはその付近に注射すること、（ii）静脈注射することまたは（iii）適切なベクタ−を使用してその患部部位に伝達させることができる。変法として、上記細胞物質は、第１に、EPC-Eph細胞と、第２に、遺伝子治療分野で知られているベクタ−に結合させたタンパク物質を、注射、特に静脈注射によって別々に投与することができる。

成人においては、この細胞物質は、適切である場合には非活性化EPCの細胞混合物に含まれたその細胞（II）を静脈注射によって投与することができる。かかる細胞混合物は、注射１回当たり全体として約１０５ないし１０9個の細胞を含んでいてもよい。

この発明の他の利点ならびに特徴は、製造ならびに薬理学的試験に関する下記の実施例によってより一層理解されるであろう。当然のことながら、下記実施例の各要素は限定的なものではなく、例示として挙げたものであって、例えば細胞物質はEPC-EphB4-エフリン-B2-Fcとして例示する。

EPC-EphB4の製造：
（A）ヒト臍帯血（30〜50 ml）を採取し、ヘパリンナトリウムの抗凝固剤溶液を入れた殺菌チュ−ブに注入した。臍帯血単核細胞をパンコ−ル（1.077 g/ml；Dominique Dutscher S.A., Brumath, France）を用いて密度こう配遠心分離によって単離した。得られた単核細胞はプラスチック皿上で２４時間３７℃で培養して付着細胞から分離した。EphB4マ−カ−を発現する単核細胞と、上記マ−カ−を発現しない単核細胞とを含む細胞混合物が得られた。

（B）上記（A）で得られた細胞混合物を、コラ−ゲンタイプＩ（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin, France）でコ−ティングした６ウェルプレ−トの各ウェルに注入した分化のためにhVEGFを含む培地に注入した（Le Ricousse-Roussanne S/ et al., Cardiovasc. Res., 2004; 62: 176-184参照）。１５日間培養した後、EPC−EphB4に富む細胞混合物を回収した。

EPC-EphB4の製造：
（A）上記実施例１（A）で得られた細胞混合物を用いて、CD34+細胞を単離し、標準の免疫磁気分離法、特に抗CD34モノクロ−ナル抗体からなるCD34単離キット（Miltenyi Biotech, Paris, France）によって非付着細胞から精製した。抗CD34モノクロ−ナル抗体（前の抗体と異なる抗体が好ましい）を用いたフロ−サイトメトリによって得られた細胞の分析によって、その細胞の75%（±5.6%）がCD34マ−カ−であることが判明した。

（B）上記（A）で得られた細胞混合物（1.5 x 106 〜3.5 x 106 CD34＋細胞）は、フィブロネクチン、ラミニン（laminin）、ヘパリンナトリウムスルフェ−ト、コラ−ゲンタイプ I およびIV（Sigma-Aldrich）を含むマトリックスでコ−ティングした６ウェルプレ−トの各ウェルに注入したhVEGF、bFGFならびにIGF1を含む培地（R&D Systems Inc., Oxford, UK）に注入した。１５日間培養した後、EPC−EphB4に富む細胞混合物を回収した。

EPC-EphB4−エフリン−B2−Fcの製造：
上記実施例１（B）で得られた細胞混合物（EphB4マ−カ−と共にEPC細胞を含む）は、融合タンパク質エフリン−B2−Fc、EphB4−FcまたはCD6−Fc（CD6−Fcはエフリン−B2でのEPC活性化によって認められる効果を示すためのネガティブコントロ−ルとして使用した）3μg/mlを用いて３７℃で３０分間培養した。それぞれの非結合融合タンパク質は洗浄（少なくとも２回）して除去した。この処理によって３種類の細胞混合物を得た。１つは構造式：EPC-EphB4−エフリン−B2−Fcで表されるこの発明の細胞物質を含む細胞混合物、２つ目はEphB4−Fc融合タンパク質でのEPC活性化によって得られた細胞を含む細胞混合物、３つ目はCD6−Fc融合タンパク質でのEPC活性化によって得られた細胞を含む細胞混合物であった。

実施例2（B）で得られた細胞混合物を出発物質として使用する以外は、上記実施例３の方法と同様にして構造式：EPC-EphB4−エフリン−B2−Fcで表される細胞を得た。
試験プロトコル：
時間Ｔ＝０に、７週齢の雄ヌ−ドマウス（PBS、非活性化EPCおよびHUVECコントロ−ルを含む試験および実験製品当たり１バッチ６匹）の右大腿動脈を結紮し虚血を誘発させた。Ｔ＝＋４．５時間に、実施例３に従って培養して構造式：EPC-EphB4−エフリン−B2−Fcで表されるこの発明の細胞物質と、その他の２種類の比較用細胞物質を得た。次に、Ｔ＝＋５時間に、実施例３で得た３種類の細胞混合物（106細胞／マウス）を下眼窩にそれぞれ静脈注射した。T=＋１２日に、マウスを解剖して、虚血肢と非虚血肢の腓腹筋を摘出して、下記について調べた：
・脈管形成スコア；
・毛細血管（キャピラリ−）密度（キャピラリ−数／mm2）；
・皮膚血流フロ−。
試験１：脈管形成スコア
脈管形成スコア（つまり血管密度）は、マイクロアンジオグラフィ−によって決定した。詳細には、虚血肢の血管密度は、非虚血肢と比較して、高解像マイクロアンジオグラフィ−によって測定した（Silvestre J.S. et al., Cir. Res., 2001; 89: 259-264参照）。得られた結果は、図２のグラフに示すように、虚血肢／非虚血肢の割合で決定した。

エフリン−B2−FcまたはCD6−Fc融合タンパク質で活性化されたまたは活性化されていないEPCを注射すると、PBSを注射したコントロ−ル群に比べて血管密度の僅かな増加が観測された。EPCがエフリン−B2−Fc融合タンパク質で活性化されたときの血管密度は、非活性化EPCの注射の場合に比べて、25.5%、つまり、1.34倍脈管形成スコアが増加した。
試験２：キャピラリ−密度（キャピラリ−数／mm2）
虚血した筋肉のキャピラリ−（毛細血管）密度は、内皮細胞に特異的なCD31マ−カ−に対する抗体で腓腹筋の標識切片を用いて、非虚血肢の同一筋肉の切片と比較して調べた。得られた結果は、図３のグラフに示すように、虚血肢／非虚血肢の割合で表した。

この発明のエフリン−B2−Fc融合タンパク質で活性化したEPCをマウスに注射した場合、そのキャピラリ−密度は、非活性化EPCに比べて36.7%、つまり1.57倍増加したことが観測された。
試験３：皮膚血流フロ−
血流フロ−の定量的評価（虚血肢／非虚血肢の割合で表す）は、血管数の変化が機能適合、つまり虚血肢の浸潤の変化に対応していることを証明するために行った。その結果は図４のグラフに示す通りであった。

この発明のエフリン−B2−Fc融合タンパク質で活性化したEPCを注射すると、虚血肢においては、非虚血肢の場合に比べて、1.37倍（27.1%の増加）の血液フロ−の増加が観測された。

本実施例では、EphB4マ−カ−タンパク質合成が阻害されている細胞製剤によるEphB4マ−カ−の役割を示した。

このために、特に所定の遺伝子、具体的にはEphB4マ−カ−を発現する遺伝子をコ−ドするメッセンジャ−RNAを特異的に分解可能な「干渉RNA」または「siRNA」を使用した。これらの干渉RNAの作用はトラスンスフェクション（形質転換）と呼ばれている。

これらの細胞製剤は、上記の試験プロトコルに類似する試験プロトコルに従って雄ヌ−ドマウスに投与した。

第１ステップでは、内皮プロジェニタ−（progenitor）細胞、つまりEPCを80%融合（confluence)するまで培養した。EphB4マ−カ−タンパク質合成を阻害することができるEphB4 siRNA溶液、つまり干渉RNAを含有する溶液を、抗生物質も血清も含有していないM199培地に希釈し、室温で５分間培養した。さらに、どの特定の遺伝子とも対応していないコントロ−ルsiRNAの溶液を同様に希釈した。EphB4マ−カ−の発現に対して何ら生物学的効果を有しない後者の希釈溶液は、干渉RNAがインヒビタ−としての独自の役割を有していないことを証明することができる。その上、トランスフェクション剤Dharmafect2（Dharmacon, Perbio）を上記溶液と同様の条件で調製し、これらの溶液と混合した。次いで、得られた混合物を培養した。

これらの培養溶液を内皮プロジェニタ−（progenitor）細胞、つまりEPCと接触させて、第１の細胞製剤では、EphB4マ−カ−タンパク質合成を阻害させた製剤、また第２の細胞製剤では、EphB4マ−カ−をコ−ドする遺伝子の発現が阻害されていない製剤をコントロ−ルとして調製した。

本実施例の結果の要約は、下記表１に示す通りである。

表中、「１」はコントロ−ルsiRNAでトランスフェクションし、注射前に刺激していないEPC；
「２」はコントロ−ルsiRNAでトランスフェクションし、注射前にエフリン−B2−Fcで刺激したEPC；
「３」はEphB4 siRNAでトランスフェクションし、注射前に刺激していないEPC；
「４」はEphB4 siRNAでトランスフェクションし、注射前にエフリン−B2−Fcで刺激したEPC。

投与した上記４種類の細胞製剤についての脈管形成スコア、血流フロ−およびキャピラリ−密度の測定は実質的には平行であることが判明した。

その上、細胞製剤１、３および４の測定結果は実質的に同じであったが、細胞製剤２の測定結果はほぼ４０％高かった。

前脈管形成活性がEphB4マ−カ−とエフリン−B2−Fcタンパク物質との関連によって促進されることは仮説であるので、表１に示す細胞製剤１と４との結果を比較すると、コントロ−ルsiRNAを導入したがエフリン−B2−Fcタンパク物質と関連していない内皮プロジェニタ−細胞の効果が、EphB4マ−カ−の発現を阻害させ、エフリン−B2−Fcタンパク物質と関連させた内皮プロジェニタ−細胞の効果と実質的に均等であることは注目すべきである。したがって、干渉RNAは、インヒビタ−の役割としての活性を有してなく、EphB4マ−カ−を発現する内皮プロジェニタ−細胞、つまりEPCの活性が、そのマ−カ−を発現せずかつエフリン−B2−Fcタンパク物質と関連させた内皮プロジェニタ−細胞、つまりEPCの活性よりも高くないことが示されている。

さらに、細胞製剤１および３の測定結果を比較すると、EpHB4マ−カ−を発現するかまたは発現しない内皮プロジェニタ−細胞EPC単独では相当の活性を有することが示されている。

その上、最も重要な側面として、細胞製剤２とその他の製剤との測定結果の比較からして、EphB4マ−カ−とエフリン−B2−Fcタンパク物質との特異的関連によって、相当の前脈管形成活性を有していることが示されている。

下表２はいくつかのEph／エフリンカップルの特異性を示す。

Claims

細胞マ−カ−が細胞の外側メンブレン上に存在する細胞マ−カ−／特異的リガンド前脈管形成システムであって、該システムが、
（a）Eph類、特にEphB4またはEphB1から選ばれる細胞マ−カ−からなる内皮前駆細胞（EPC）と、
（b）構造式：
L-K （I）
で表されるタンパク物質であって、該マ−カ−に対して特異的なリガンド（L）からなりかつ結合タンパク質（K）と関連または融合しているタンパク物質から構成され、脈管形成を刺激する構造式：
EPC-Eph-L-K （II）
で表される細胞物質を提供できることからなる細胞マ−カ−／特異的リガンド前脈管形成システム。
請求項１に記載のシステムにおいて、前記Ephマ−カ−がアミノ酸配列の形であることを特徴とするシステム。
請求項１または２に記載のシステムにおいて、前記Ephマ−カ−がEphB4であることを特徴とするシステム。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のシステムにおいて、前記マ−カ−がEphB4またはEphB1であり、前記リガンドがエフリン−B2またはエフリン−B1であることを特徴とするシステム。
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のシステムにおいて、前記リガンド（L）がエフリンのペプチドフラグメントであることを特徴とするシステム。
請求項１に記載のシステムにおいて、前記タンパク物質L-Kが組換えエフリン−B2タンパク質で置換されていることを特徴とするシステム。
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のシステムにおいて、前記EPCが、骨髄、末梢血またはより好ましくは臍帯血由来の単核細胞またはCD34もしくはCD133を発現する細胞から得られることを特徴とするシステム。
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のシステムにおいて、前記EPCが末梢血または臍帯血から得られることを特徴とするシステム。
構造式：
EPC-Eph-L-K （II）
（式中、Lはリガンドを意味し、Kは結合タンパク質を意味する）
で表される脈管形成を刺激可能な細胞物質であって、該リガンド（L）が該結合タンパク質（K）と関連または融合していて、該細胞物質が、（i）実質的に精製された細胞培養物の形態もしくは他の前駆細胞、特に単核細胞と組み合わせた細胞培養物の形態であるか、または（ii）必要に応じて凍結可能であることを特徴とする細胞物質。
請求項９に記載の細胞物質において、該細胞物質が、
（ａ）Eph類、特にEphB4またはEphB1から選ばれる細胞マ−カ−からなる内皮前駆細胞（EPC）と、
（ｂ）構造式：
L-K （I）
（式中、Lはリガンドを意味し、Kは結合タンパク質を意味する）
で表されるタンパク物質であって、該タンパク物質が前記マ−カ−と特異的である該リガンド（L）からなり、該結合タンパク質（K）と関連するかもしくは融合しているタンパク物質とを、投与部位に伝達する前に培養することによって得られることを特徴とする細胞物質。
請求項９または１０に記載の細胞物質において、前記マ−カ−がEphB4またはEphB1であり、前記リガンドがエフリン−B2またはエフリン−B1であることを特徴とする細胞物質。
請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の細胞物質において、前記リガンドがエフリンのペプチドフラグメントであることを特徴とする細胞物質。
請求項８または９に記載の細胞物質の製造方法であって、該製造方法が下記工程から構成されていることを特徴とする製造方法：
・Ephファミリ−、特にEphB4またはEphB1マ−カ−をその外側メンブレン上に発現するEPCを使用する工程；
・構造式： L-K （式中、Lは前記マ−カ−に対して特異的なリガンドを意味し、KはLに関連するかまたは融合している結合タンパク質を意味する）で表されるタンパク物質をインビトロで前記EPCに接触させる工程。
請求項１３に記載の製造方法において、該方法が、
（工程１）骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核細胞を使用する工程；
（工程２）前工程の細胞を、Ephマ−カ−を有するEPCを得るために分化させる工程；および
（工程３）工程２によって得たEPCをエフリンとEphとをインビトロで活性化する工程からなることを特徴とする製造方法。
請求項１４に記載の製造方法において、工程１と工程２の間に、下記工程１ａをさらに行うことを特徴とする製造方法：
（工程１ａ）CD34+および／またはCD133+単核細胞を単離する工程。
請求項１４に記載の製造方法において、工程１で、単核細胞が末梢血または臍帯血に由来することを特徴とする製造方法。
請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の製造方法において、前記リガンド（L）が、構造式：
EPC-Eph-L-K （II）
（式中、KはFcを意味する）
で表される細胞物質を提供するために、結合タンパク質（K）と関連するかまたは融合することを特徴とする製造方法。
請求項１３ないし１７のいずれか１項に記載の製造方法において、前記マ−カ−がEphB4またはEphB1であり、前記リガンドLがエフリン−B2またはエフリン−B1であることを特徴とする製造方法。
請求項１３ないし１８のいずれか１項に記載の製造方法において、前記リガンドがエフリンのペプチドフラグメントであることを特徴とする製造方法。
損傷血管再生のために使用可能な医薬品であって、該医薬品が、前脈管形成に活性な成分として、生理学的に許容できる賦形剤と組み合わせた治療的に許容できる量の請求項９ないし１２のいずれか１項に記載の細胞物質であることを特徴とする医薬品。
損傷血管再生のための医薬組成物であって、該組成物が、治療的に許容される量の請求項１ないし８のいずれか１項に記載の前脈管形成システムの２成分が別個にそれぞれ生理学的に許容される賦形剤中に調剤されていて、前記２成分が投与前に培養されて構造式（II）で表される細胞物質に形成されることを特徴とする医薬組成物。
請求項９ないし１２のいずれか１項に記載の細胞物質を、生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて、前脈管形成の活性成分として、脈管不全の処置、特に虚血性心臓、脳または末梢組織の脈管再生化のための治療用組成物の製造のために使用することを特徴とする細胞物質の使用方法。
請求項２２に記載の細胞物質の使用方法において、前記組成物が動脈炎、冠状もしくは心臓の脈管不全または脳の脈管不全の処置に使用することを特徴とする細胞物質の使用方法。