JP2015059837A - 細胞解析装置、および細胞解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】がん細胞の識別をより高い精度で行なえるようにする。
【解決手段】第１ヒストグラム取得部１１は、細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムを取得する。第２ヒストグラム取得部１２は、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得する。判定部１４は、第１ヒストグラムと第２ヒストグラムのいずれかに基づいて、がん細胞の有無を判定する。出力部１５は、判定部１４による判定結果を出力する。
【選択図】図１

Description

本発明は、正常組織とがん化した組織の識別に用いられる細胞解析装置、および細胞解析方法に関する。

この種の装置として、単離および細胞核染色された細胞を計測して蛍光強度のヒストグラムを取得するものが知られている（例えば、特許文献１を参照）。当該装置においては、取得したヒストグラムから正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する細胞の数を求め、当該細胞数と上記ヒストグラムに基づいてがんの悪性度を判定する。

特開２０１２−４７５９４号公報

がん細胞を切除する手術において切除する範囲を最小限にするために、がん細胞の識別にはさらなる精度の向上が求められている。よって本発明は、がん細胞の識別をより高い精度で行なえるようにする技術を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために本発明がとりうる第１の態様は、細胞解析装置であって、
細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムを取得する第１ヒストグラム取得部と、
前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得する第２ヒストグラム取得部と、
前記第１ヒストグラムと前記第２ヒストグラムのいずれかに基づいて、がん細胞の有無を判定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力する出力部とを備える。

上記の目的を達成するために本発明がとりうる第２の態様は、細胞解析方法であって、
細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムを取得し、
前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲外にある場合、がん細胞の存在を判定し、
前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲内にある場合、当該蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得してがん細胞の有無を判定し、
前記判定の結果を出力する。

上記の構成によれば、第２ヒストグラムの取得に際しては、第１ヒストグラムの最大値が第１の所定値となるように規格化する（縦軸方向の規格化）のみならず、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が第２の所定値となるように規格化（横軸方向の規格化）される。これにより解析対象ごとに取得される第２ヒストグラムの形状に係る統計的なばらつきが抑制され、同一の尺度の下でがん細胞の有無を判定することが可能になる。したがって、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲外にある場合は、がん細胞の存在が明らかであると判断しうる。このような解析対象については、第２ヒストグラムの取得を省略して判定を行なうことにより、判定処理に係る負荷を抑制するとともに処理速度を向上できる。また最大値に対応する蛍光強度値が所定の範囲から逸脱した第１ヒストグラムを規格化すると、判定対象として本来想定している第２ヒストグラムの形状からの逸脱が大きくなる。このような解析対象を規格化の対象から除外することにより、規格化の効果が最大限に確保できるようにしている。したがって、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

前記第２ヒストグラムに対して周波数解析を施す解析部を備え、前記判定部は、前記周波数解析の結果に基づいて、がん細胞の有無を判定する構成としてもよい。前記周波数解析は、例えば高速フーリエ変換を含む。

上記のように、第２ヒストグラムは蛍光強度値についても規格化がなされているため、解析対象によらず同一の条件下で周波数解析を適用できる。よって周波数解析により得られる結果の比較検討を同一条件下で行なうことができる。したがって、周波数解析の効果が最大限に確保され、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

前記判定部は、前記第２ヒストグラムの蛍光強度値を、各々がデブリおよび複数のがん細胞周期のいずれかに対応付けられた複数の区間に区分するとともに、当該複数の区間の少なくとも１つについて、がん細胞の有無に係る指標を取得する構成としてもよい。上記のように、第２ヒストグラムは蛍光強度値についても規格化がなされているため、前記複数の区間の各境界に対応する蛍光強度値は、取得される第２ヒストグラムによらず一定である。

このような構成によれば、取得される第２ヒストグラムの形状に応じて上記複数の区間を設定する従来の方式と比較して、判断者の主観を排除できるだけでなく、上記複数の区間の設定に基づくがん細胞の有無の判定を自動化できる。したがって、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

前記判定部は、前記第２ヒストグラムに係る複数のパラメータの各々に基づいて、がん細胞の有無に係る複数の指標を取得し、当該複数の指標の組合せに基づいて、がん細胞の有無を判定する構成としてもよい。

このような構成によれば、同一の第２ヒストグラムに対して多面的な分析が可能となる。したがってがん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

本発明の一実施形態に係る細胞解析装置の構成を示すブロック図である。 細胞解析装置による第２ヒストグラムの取得を模式的に示す図である。 第２ヒストグラムに適用される周波数解析の一例を示す図である。 第２ヒストグラムに適用される周波数解析の別例を示す図である。 複数の指標を用いてがん細胞の有無を判定する例を示す図である。 本発明の一実施形態に係る細胞解析方法を示すフローチャートである。

本発明に係る実施形態の例を添付の図面を参照しつつ以下詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施形態に係る細胞解析装置１の構成を示す機能ブロック図である。細胞解析装置１は、前処理が施された組織細胞を解析し、がん化した細胞の有無を判定する装置である。前処理は、撹拌などによる細胞単離、界面活性剤による組織細胞の裸核化、ＲＮＡ除去剤によるＲＮＡ除去、および蛍光染料色素によるＤＮＡ細胞核の染色を含む。

細胞解析装置１は、表示装置２と接続されている。細胞解析装置１は、第１ヒストグラム取得部１１、第２ヒストグラム取得部１２、解析部１３、判定部１４、および出力部１５を備えている。

第１ヒストグラム取得部１１は、フローサイトメトリを実行する。具体的には、単離および細胞核染色された細胞が分散された懸濁液に対してレーザ光が照射される。各細胞は染色処理により蛍光色素を含んでおり、それぞれレーザ光に対する蛍光強度が相違している。蛍光強度は、ＤＮＡに含まれる色素の量に対応しており、ＤＮＡの大きさを示す。

フローサイトメトリにより、蛍光強度値ごとの細胞の個数が測定される。結果として、図２の（ａ）に示す第１ヒストグラムが取得される。第１ヒストグラムの横軸は蛍光強度値を示し、縦軸は細胞の個数を示している。正常なＤＮＡを含む細胞の個数およびがん化したＤＮＡを含む細胞の個数に応じて、第１ヒストグラムの形状が変化する。

図２の（ａ）においては、正常な細胞のみを含む組織から取得された第１ヒストグラムＨ１１を実線で示し、がん細胞を含む組織から取得された第１ヒストグラムＨ１２を破線で示している。正常な細胞から得られる第１ヒストグラムは、蛍光強度値１７０から２３０の範囲に最大値（最大細胞個数）を有することが知られている。なお、ここに示した数字はあくまで例示であり、機器の設定条件等により適宜の変更が可能である。

判定部１４は、第１ヒストグラム取得部１１が取得した第１ヒストグラムに基づいて、がん細胞の有無について１次判定を実行する。具体的には、第１ヒストグラムの最大値が蛍光強度値１７０から２３０の範囲（所定の範囲の一例）外にある場合、解析対象にがん細胞が存在すると直ちに判定する。なお、ここに示した数字もあくまで例示であり、上記と同様に適宜の変更が可能である。

例えば図２の（ａ）に示す例の場合、破線で示す第１ヒストグラムＨ１２は、蛍光強度値３１０の近傍に最大値を有している。したがって判定部１４は、第１ヒストグラムＨ１２を取得した解析対象にがん細胞が含まれていると判定する。

判定部１４ががん細胞の存在を判定した場合、出力部１５は当該判定結果を表示装置２に出力する。表示装置２は、文字、記号、色などの適宜の態様で判定結果を表示する。

第２ヒストグラム取得部１２は、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得する。最大値が蛍光強度値１７０から２３０の範囲内にある第１ヒストグラムが、この処理の対象とされる。具体的には、第１ヒストグラムにおいて最大値を示す蛍光強度値が２００に規格化され、当該最大値が１に規格化されるように、第２ヒストグラムが生成される。なお、ここに示した数字はあくまで例示であり、適宜の変更が可能である。

例えば図２の（ａ）に示す例の場合、実線で示す第１ヒストグラムＨ１１は、蛍光強度値が２１０付近に最大値（約３２０）を有している。この第１ヒストグラムＨ１１が規格化されたものを図２の（ｂ）に示す。

解析部１３は、第２ヒストグラム取得部１２により取得された第２ヒストグラムに対して高速フーリエ変換を含む周波数解析を実行する。

図３の（ａ）は、正常な細胞のみを含む組織より得られた第２ヒストグラムＨ２１を示している。図３の（ｂ）は、当該第２ヒストグラムＨ２１に対して高速フーリエ変換を実行することにより取得されたパターンＰ１１を示している。図３の（ｃ）は、当該パターンＰ１１を微分することにより取得された微分パターンＰ２１を示している。微分パターンの取得も周波数解析の一例である。

図４の（ａ）は、がん細胞を含む組織より得られた第２ヒストグラムＨ２２を示している。図３の（ｂ）は、当該第２ヒストグラムＨ２２に対して高速フーリエ変換を実行することにより取得されたパターンＰ１２を示している。図３の（ｃ）は、当該パターンＰ１２を微分することにより取得された微分パターンＰ２２を示している。

判定部１４は、解析部１３が実行した周波数解析により得られたパターンおよび微分パターン（周波数解析の結果の一例）に基づいて、がん細胞の有無を判定する。

例えば、高速フーリエ変換により得られたパターンの曲線下面積（ＡＵＣ）が、判定の指標として用いられうる。図３の（ｂ）に示す正常組織から取得されたパターンＰ１１と図４の（ｂ）に示すがん化した組織から取得されたパターンＰ１２を比較すると、後者のＡＵＣの値の方が小さいことが判る。したがって、ＡＵＣの値が所定の閾値を下回る事実をもって、がん細胞の存在を判定できる。

これに加えてあるいは代えて、高速フーリエ変換により得られたパターンの最大勾配値（ＳＬＯＰＥ）や極小値の分布（ＯＳＣ）が、判定の指標として用いられうる。ＳＬＯＰＥは、高速フーリエ変換を通じて得られた微分パターンの最小値より求められる。ＯＳＣは、微分パターンにおける極大値の分布（閾値を上回る極大値が存在する周波数帯域幅）より求められる。

図３の（ｃ）に示す正常組織から取得された微分パターンＰ２１と図４の（ｃ）に示すがん化した組織から取得された微分パターンＰ２２を比較すると、後者のＳＬＯＰＥの値の方が小さいことが判る。したがって、ＳＬＯＰＥの値が所定の閾値を下回る事実をもって、がん細胞の存在を判定できる。

また図３の（ｃ）に示す正常組織から取得された微分パターンＰ２１と図４の（ｃ）に示すがん化した組織から取得された微分パターンＰ２２を比較すると、後者のＯＳＣの値が大きいことが判る。したがって、ＯＳＣの値が所定の閾値を上回る事実をもって、がん細胞の存在を判定できる。

さらに図３の（ａ）および図４の（ａ）に示すように、第２ヒストグラムにおける蛍光強度値は、複数の区間に区分される。当該複数の区間は、第１区間ＳＣ１、第２区間ＳＣ２、第３区間ＳＣ３、第４区間ＳＣ４、および第５区間ＳＣ５を含む。

第１区間ＳＣ１は、デブリすなわち破壊された細胞（ゴミ）もしくは間質組織に染色体が付着したものが現れる領域である。第２区間ＳＣ２は、Ｇ０／Ｇ１期細胞群すなわち正常なＤＮＡ量を有する細胞が現れる領域である。第３区間ＳＣ３は、Ｓ期細胞群が現れる領域である。第４区間ＳＣ４は、Ｇ２／Ｍ期細胞群が現れる領域である。第５区間ＳＣ５は、その他のＤＮＡ量を有する細胞群が現れる領域である。

このように複数の区間に区分することにより取得されうる指標としては、検出全細胞数、正常細胞比率、悪性指数、デブリ比率、正常細胞ピーク幅などが挙げられる。検出前細胞数は、上記第１区間ＳＣ１から第５区間ＳＣ５に現れる全細胞数を指す。正常細胞比率は、上記第２区間に現れる細胞数の全細胞数に対する比率を指す。悪性指数は、上記第３区間ＳＣ３から第５区間ＳＣ５に現れる細胞数の全細胞数に対する比率を指す。デブリ比率は、上記第１区間に現れる細胞数の全細胞数に対する比率を指す。正常細胞ピーク幅は、上記第２区間に現れるピーク波形の幅（例えば細胞数が最大値の５％以上となる部分の幅）を指す。各指標における閾値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析などを用いて定められる。

判定部１４は、先に列挙した指標の少なくとも１つを用いてがん細胞の有無を判定する。出力部１５は、判定部１４による判定結果を表示装置２に出力する。表示装置２は、文字、記号、色などの適宜の態様で判定結果を表示する。

図５は、複数の指標を組み合わせてがん細胞の有無を判定する例を示している。図５の（ａ）は、ＳＬＯＰＥとＧ２／Ｍ（第４区間ＳＣ４に現れる細胞数の全細胞数に対する比率）を指標として採用した例を示している。図５の（ｂ）は、ＳＬＯＰＥとＯＳＣを指標として採用した例を示している。判定部１４は、２つの指標を座標軸とする２次元座標平面上に解析部１３が取得したデータをマッピングし、ＲＯＣ解析などを通じて定められた閾値領域Ａ内に属するか否かを判定する。

解析部１３が取得したデータが閾値領域Ａ内に属する場合、判定部１４は、解析対象の組織にがん細胞が含まれていると判定する。出力部１５は、判定部１４による判定結果を表示装置２に出力する。表示装置２は、文字、記号、色などの適宜の態様で判定結果を表示する。

図６は、上記の構成を有する細胞解析装置１を用いてがん化した細胞の有無を判定する方法を示すフローチャートである。

まず第１ヒストグラム取得部１１により、フローサイトメトリが実行される（ステップＳ１）。これにより、細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムが取得される。

次に判定部１４により、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲内にあるかが判定される（ステップＳ２）。当該蛍光強度値が所定範囲外にあると判定された場合（ステップＳ２においてＮｏ）、判定部１４は、解析対象の組織内にがん細胞が存在すると判定する。当該判定結果は、出力部１５を通じて表示装置２に出力される（ステップＳ３）。

判定部１４により、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲内にあると判定された場合（ステップＳ２においてＹｅｓ）、第２ヒストグラム取得部１２により、当該蛍光強度値に基づき規格化された第２ヒストグラムが取得される（ステップＳ４）。

「第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値に基づき規格化された」とは、図２を参照して説明した規格化を意味する。すなわち、第１ヒストグラムの最大値が第１の所定値（図２の例では１）となるように規格化する（縦軸方向の規格化）のみならず、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が第２の所定値（図２の例では２００）となるように規格化（横軸方向の規格化）される。

次に解析部１３により、取得された第２ヒストグラムに対して高速フーリエ変換を含む周波数解析が実行される（ステップＳ５）。これにより、第２ヒストグラムに係る複数のパラメータに基づいて、がん細胞の有無に係る少なくとも１つの指標が取得される。

次に判定部１４により、周波数解析を通じて取得された少なくとも１つの指標に基づいて、がん細胞の有無が判定される（ステップＳ６）。当該判定結果は、出力部１５を通じて表示装置２に出力される（ステップＳ７）。

以上説明したように、本実施形態に係る細胞解析装置１によれば、まず第１ヒストグラム取得部１１が、細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムを取得し、第２ヒストグラム取得部１２が、前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得する。ここでは、第１ヒストグラムの最大値が第１の所定値となるように規格化する（縦軸方向の規格化）のみならず、第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が第２の所定値となるように規格化（横軸方向の規格化）される。これにより解析対象ごとに取得される第２ヒストグラムの形状に係る統計的なばらつきが抑制され、同一の尺度の下でがん細胞の有無を判定することが可能になる。したがって、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

さらに本実施形態に係る細胞解析装置１においては、第１ヒストグラムの最大値に対応する蛍光強度値が所定の範囲にない場合、第２ヒストグラムの取得が行なわれることなく、判定部１４によりがん細胞の存在が判定される。すなわち、判定部１４は、第１ヒストグラムと第２ヒストグラムのいずれかに基づいてがん細胞の有無を判定するように構成されている。

明らかにがん細胞の存在を判定可能な解析対象については、第２ヒストグラムの取得を省略して判定を行なうことにより、判定処理に係る負荷を抑制するとともに処理速度を向上できる。また最大値に対応する蛍光強度値が所定の範囲から逸脱した第１ヒストグラムを規格化すると、判定対象として本来想定している第２ヒストグラムの形状からの逸脱が大きくなる。このような解析対象を規格化の対象から除外することにより、規格化の効果が最大限に確保できるようにしている。したがって、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

本実施形態に係る細胞解析装置１は、第２ヒストグラムに対して周波数解析を施す解析部１３を備えている。判定部１４は、周波数解析の結果に基づいて、がん細胞の有無を判定する。

上記のように、第２ヒストグラムは蛍光強度値についても規格化がなされているため、解析対象によらず同一の条件下で周波数解析を適用できる。よって周波数解析により得られる結果の比較検討を同一条件下で行なうことができる。したがって、周波数解析の効果が最大限に確保され、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

本実施形態に係る細胞解析装置１においては、判定部１４は、第２ヒストグラムの蛍光強度値を、各々がデブリおよび複数のがん細胞周期のいずれかに対応付けられた複数の区間ＳＣ１〜ＳＣ５に区分するとともに、当該複数の区間ＳＣ１〜ＳＣ５の少なくとも１つについて、がん細胞の有無に係る指標を取得する。上記のように、第２ヒストグラムは蛍光強度値についても規格化がなされているため、複数の区間ＳＣ１〜ＳＣ５の各境界に対応する蛍光強度値は、取得される第２ヒストグラムによらず一定にできる。

このような構成によれば、取得される第２ヒストグラムの形状に応じて上記複数の区間を設定する従来の方式と比較して、判断者の主観を排除できるだけでなく、上記複数の区間の設定に基づくがん細胞の有無の判定を自動化できる。したがって、がん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

本実施形態に係る細胞解析装置１は、図５を参照して説明したように、判定部１４は、第２ヒストグラムに係る複数のパラメータの各々に基づいて、がん細胞の有無に係る複数の指標を取得し、当該複数の指標の組合せに基づいて、がん細胞の有無を判定することができる。

このような構成によれば、同一の第２ヒストグラムに対して多面的な分析が可能となる。したがってがん細胞の識別をより高い精度で行なえる。

上記の実施形態は本発明の理解を容易にするためのものであって、本発明を限定するものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく変更・改良され得ると共に、本発明にはその等価物が含まれることは明らかである。

上記の実施形態においては、解析部１３が、周波数解析として、第２ヒストグラムに対して高速フーリエ変換を実行するとともに、当該高速フーリエ変換により得られたパターンの微分パターンを取得している。周波数解析は、必ずしもこれら２つの処理を含むことを要しない。取得する指標によっては、微分パターンの取得は省略可能である。また第２ヒストグラムそのものからがん細胞の有無を判断可能であれば、周波数解析そのものを省略してもよい。他に利用可能な周波数解析の例としては、最大エントロピー法、自己回帰モデル、自己回帰−移動平均モデル、短時間フーリエ変換、ウェーブレット変換、ウィグナー分布などが挙げられる。

上記の実施形態においては、出力部１５により出力された判定部１４による判定結果は、表示装置２において適宜の態様で表示されている。判定部１４による判定結果は、必ずしも視認可能な態様で表示されることを要しない。出力部１５は、適宜の外部装置と接続され、当該外部装置に応じた形式で信号を出力しうる。外部装置の例としては、音声出力装置、印刷装置、データ記憶装置などが挙げられる。

１：細胞解析装置、１１：第１ヒストグラム取得部、１２：第２ヒストグラム取得部、１３：周波数解析、１４：判定部、１５：出力部、ＳＣ１〜ＳＣ５：複数の区間

Claims (7)

1. 細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムを取得する第１ヒストグラム取得部と、
   前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得する第２ヒストグラム取得部と、
   前記第１ヒストグラムと前記第２ヒストグラムのいずれかに基づいて、がん細胞の有無を判定する判定部と、
   前記判定部による判定結果を出力する出力部とを備える、細胞解析装置。
2. 前記判定部は、
   前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲外にある場合、がん細胞の存在を判定し、
   前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が前記所定範囲内にある場合、前記第２ヒストグラムに基づいて、がん細胞の有無を判定する、請求項１に記載の細胞解析装置。
3. 前記第２ヒストグラムに対して周波数解析を施す解析部を備え、
   前記判定部は、前記周波数解析の結果に基づいて、がん細胞の有無を判定する、請求項１または２に記載の細胞解析装置。
4. 前記周波数解析は、高速フーリエ変換を含む、請求項３に記載の細胞解析装置。
5. 前記判定部は、前記第２ヒストグラムの蛍光強度値を、各々がデブリおよび複数のがん細胞周期のいずれかに対応付けられた複数の区間に区分するとともに、当該複数の区間の少なくとも１つについて、がん細胞の有無に係る指標を取得し、
   前記複数の区間の各境界に対応する蛍光強度値は、取得される第２ヒストグラムによらず一定である、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞解析装置。
6. 前記判定部は、前記第２ヒストグラムに係る複数のパラメータの各々に基づいて、がん細胞の有無に係る複数の指標を取得し、当該複数の指標の組合せに基づいて、がん細胞の有無を判定する、請求項１から５のいずれかに記載の細胞解析装置。
7. 細胞核染色された細胞数の計測結果を用いて蛍光強度の第１ヒストグラムを取得し、
   前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲外にある場合、がん細胞の存在を判定し、
   前記第１ヒストグラムの最大値を示す蛍光強度値が所定範囲内にある場合、当該蛍光強度値に基づいて規格化された第２ヒストグラムを取得してがん細胞の有無を判定し、
   前記判定の結果を出力する、細胞解析方法。

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