JP2015053906A - 早期癌転移検出法および新規癌転移抑制薬のスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

【課題】早期に癌転移を検出することができる新たなバイオマーカー及び抗転移薬の新規スクリーニング法の提供。
【解決手段】早期癌転移を検出する目的で、癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定する方法並びにＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を抑制する被験物質をスクリーニングすることにより癌転移抑制薬又はＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、早期に癌転移の有無を検出する方法及び癌転移抑制薬のスクリーニング方法に関する。

癌患者の死因の９０％は転移に起因するが、癌転移の分子機構は未だ明らかにされてない。癌転移の早期診断法や有効な治療法も乏しい。従来の多くの研究は、ヒト癌転移巣より転移性癌細胞株を樹立し、免疫不全マウスに移植後、遠隔臓器に誘導される転移を調査するものであった。またトランスジェニックマウスに特定な癌遺伝子を強制発現することにより生じた癌より自発的に誘導される転移が調査された。

従来、癌転移は癌細胞内のゲノムの変異により起こる稀な悪性癌細胞の増殖により生じると推測されていた。しかしながら、癌化と転移化の表現型の違いを説明する遺伝子変異や分子機構は未だ明確ではない。最近の研究により、癌間質よりのパラクラインのシグナルを受けた癌細胞が上皮間葉移行などのｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃな変化を呈し、癌浸潤、転移のプログラムを活性化することが示唆されている（非特許文献１）。本発明者は、以前患者乳癌塊より癌内線維芽細胞（ＣＡＦｓ）を抽出し、この細胞が非癌部に存在する線維芽細胞と比較して、癌塊中でｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ １（ＳＤＦ−１）ケモカインを高発現し、癌血管新生や癌細胞の増殖を顕著に促進することを明らかにした（非特許文献２、３）。加えて、癌化の過程において、ＳＤＦ−１とＴＧＦ−ｂｅｔａの ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ の獲得が、ＣＡＦｓの癌の進展促進能の誘導と維持に必須であることを示した（非特許文献４）。

Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．６：３，１９３−２０２（２０１２） Ｃｅｌｌ，１２１，３３５−３４８（２００５） Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，５，１６０２−１６０６（２００６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０７，２０００９−２００１４（２０１０）

しかしながら、ＣＡＦｓが近傍の癌細胞に作用して転移能を教授する際に特異的に誘導される遺伝子等については未だ明らかにされていない。
本発明の課題は、ＣＡＦｓとの相互作用により作製された強転移癌細胞の遺伝子発現プロファイルを利用して、早期に癌転移を検出することができる新たなバイオマーカーを提供することにある。

本発明者は、癌微小環境中に多数存在し癌の進展に重要であることが知られているＣＡＦｓの癌転移促進作用に着目した。ＣＡＦｓと免疫不全非ヒト動物に共移植された非（弱）転移性のヒト癌細胞が、癌化の過程で経時的に癌塊内で強転移性の癌細胞に変化することを見出した。そして、当該強転移性を獲得したヒト癌細胞と非転移性のヒト癌細胞の遺伝子発現プロファイルをＤＮＡマイクロアレイ解析したところ、ＣＥＡＣＡＭｓ（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule）遺伝子群中のＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ：Carcinoembryonic antigen）及びＣＥＡＣＡＭ６の発現が、強転移性ヒト癌細胞において顕著に亢進していることが明らかになった。また、高転移性癌細胞のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現をｓｈＲＮＡにより抑制することにより、その癌転移能が顕著に抑制されることも見出した。ＣＥＡＣＡＭ５は既に臨床的に癌再発の予知に役立つマーカーとして知られている。ＣＥＡＣＡＭ６の高発現も予後不良癌のマーカーとして報告されている。しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６の両方の遺伝子発現を同時に評価し癌細胞の転移能を予知できること示唆した報告はない。また本発明者は、高転移性癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を指標にして、癌転移抑制薬を同定するために、１４５種類の被験物質をスクリーニングした。現在までコントロールに比べてＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現を５０〜７０％抑制する薬剤として、複数の異なるＭＥＫ−Mitogen−activated protein kinases（ＭＡＰＫ）シグナル抑制剤を同定することに成功した。ＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナルの亢進は癌化、薬剤耐性能の獲得や転移促進に関与しており、このシグナルの抑制剤が癌患者の転移抑制に有用であることも一部の治験で報告されている。
かかる知見から、１）ＣＡＦｓとの相互作用により作製された強転移癌細胞がＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６などの早期癌転移検出のバイオマーカーの同定に有用であること、２）またこれらのバイオマーカーの発現量を指標とすれば癌転移抑制薬のスクリーニングができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。

〔１〕癌転移を検出する目的で、癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の両者の発現量を測定する方法。
〔２〕ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量が亢進している場合に癌転移が生じているあるいは癌転移が生じ易いと判定する〔１〕記載の測定方法。
〔３〕癌細胞が、対象患者から採取した癌組織由来である〔１〕又は〔２〕記載の測定方法。
〔４〕被験物質で処理された癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定することを特徴とする、癌転移抑制薬のスクリーニング方法。
〔５〕癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量の抑制の有無を測定する〔４〕記載のスクリーニング方法。
〔６〕被験物質で処理された癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定することを特徴とする、ＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤のスクリーニング方法。
〔７〕癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量の抑制の有無を測定する〔６〕記載のスクリーニング方法。

患者から採取した癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定すれば、当該患者の癌が転移性のものか否かが早期に判定できるため、早期の治療対策を立てることができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、ＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤などの特異的なシグナル抑制剤および新規の癌転移抑制薬のスクリーニングが可能である。

ＣＡＦｓを利用した高転移性ヒト乳癌細胞株の樹立方法例を示す。 マウスの皮下に移植されたＤｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ（ＤＣＩＳ）^CAFsの肺転移能の亢進を示す図である。 マウスの尾静脈に注射されたＤＣＩＳ^CAFsの肺転移能の亢進を示す図である。 Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析によるＤＣＩＳ^CAFsにおけるＣＥＡＣＡＭｓ遺伝子発現量の亢進を示す図である。 ウエスタンブロット解析によるＤＣＩＳ^CAFsにおけるＣＥＡＣＡＭｓ遺伝子の発現量の亢進を示す図である。 ＣＥＡＣＡＭ６の発現がｓｈＲＮＡにより抑制されたＤＣＩＳ^CAFsが、ＣＥＡＣＡＭ６の発現が維持されたＤＣＩＳ^CAFsに比べて転移能が低下していることを示す図である。 ＣＥＡＣＡＭ５の発現がｓｈＲＮＡにより抑制されたＤＣＩＳ^CAFsが、ＣＥＡＣＡＭ５の発現が維持されたＤＣＩＳ^CAFsに比べて転移能が低下していることを示す図である。 ＤＣＩＳ^CAFsにおけるＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を抑制する被験物質をスクリーニングし、４種類の異なったＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナルの抑制剤が同定されたことを示す図である。

本発明は、癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定することにより、当該癌細胞の転移能力を判定するものである。

癌転移検出の対象となる癌細胞は、対象患者から採取した癌組織由来の癌細胞が好ましい。癌の種類は限定されず、例えば上顎洞癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、食道癌、胃癌、直腸癌、結腸癌、肝臓癌、胆管癌、胆のう癌、すい臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、外陰癌、皮膚癌、甲状腺癌などが挙げられる。

癌細胞の転移能を推測するには、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の遺伝子の発現量を測定するのが好ましい。当該ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の遺伝子の発現量を正確に測定する手段としては、ＰＣＲ解析、ウエスタンブロット解析等が好ましい。

癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量が、コントロールに比べて亢進している場合には、当該癌細胞は転移性を獲得したものであると判定できる。ここでコントロールとしては、転移能を有していない同じ種類の癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６遺伝子発現量を用いることができる。
より具体的には、コントロールに比べてＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量が３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上の場合に、その癌細胞が転移性を獲得している（近い将来転移を生じ易い）又は転移を生じていると判定することができる。

本発明の癌転移抑制薬又はＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤のスクリーニング方法は、被験物質で処理された癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定することを特徴とする。

被験物質で処理された癌細胞には、インビトロで培養癌細胞を被験物質で処理した場合、及び癌細胞を有する非ヒト動物に被験物質を投与した場合の両者が含まれる。前者の場合には、確立されている癌細胞株を被験物質の存在下に培養し、その癌細胞株中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定すればよい。

一方、後者の場合には、癌細胞株を移植された免疫不全非ヒト動物に被験物質を投与し、当該動物から癌細胞を採取し、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定すればよい。

癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量は、前記と同様に行えばよい。

癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量がコントロールに比べて抑制されていれば、被験物質は癌転移抑制薬又はＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤として有用であると判定できる。ここで、コントロールとしては、インビトロの場合には、被験物質非存在下で培養した癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量である。またインビボの場合には、被験物質を投与しない動物の癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量である。

ここで、癌転移抑制薬又はＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤のスクリーニング方法に用いる癌細胞は、高転移性癌細胞であるのが望ましい。このような癌細胞のモデルとしては、非転移性又は弱転移性癌細胞とＣＡＦｓとを免疫不全非ヒト動物に共移植したモデル動物が好ましい。このモデル動物においては、共移植された癌細胞が免疫不全非ヒト動物体内で強転移性癌細胞に変換される。

ＣＡＦｓとしては、ヒト乳癌より抽出され、不死化された細胞株が好ましい（Kojima, Y. et al. Autocrine TGF-b and SDF-1 signaling drives evolution of mammary stromal fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 20009-20014, 2010)。

これらの細胞を共移植する免疫不全非ヒト動物としては、非ヒト動物であってヒト由来の細胞を移植しても拒絶反応を示さない動物であればよいが、免疫不全マウスが好ましい。また、免疫不全マウスとしては、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、Ｒａｇ欠損（Ｒａｇ^null）マウス、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒγｎｕｌｌ）マウス等が挙げられる。このうち、ＮＯＧマウスがより好ましい。ＮＯＧマウスは、ＷＯ２００２／０４３４７７に記載のマウスであり、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配したマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配して得られたマウスであり、異種細胞の生着に適している。

前記細胞の皮下移植量は、動物あたり１×１０⁴〜１×１０⁶細胞数、より好ましくは１×１０⁵細胞数程度でよい。またＣＡＦｓの移植量は、動物あたり３×１０⁴〜３×１０⁶細胞数、より好ましくは３×１０⁵細胞数程度でよい。

前記ヒト癌細胞とＣＡＦｓとの共移植は、これらの細胞を同じ部位に同時に移植すればよく、これらの細胞を混合してから移植する。

共移植の部位は、免疫不全非ヒト動物の体内であればどこでもよいが、共移植された部位で同時に増殖し、非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞がＣＡＦｓの作用を受けやすい点から、皮下が好ましい。

共移植後、１ヶ月〜２ヶ月増殖させることにより、非転移性又は弱転移性ヒト癌細胞は、強転移性ヒト癌細胞株に変換される。

また、免疫不全非ヒト動物体内で増殖した前記ヒト癌細胞を採取し、当該採取した細胞とＣＡＦｓとを免疫不全非ヒト動物に再度共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させる工程を、繰り返すことにより、当該ヒト癌細胞の強転移性をさらに強くすることができる。この共移植は、合計で２回行うのが好ましい。

このようにして得られた強転移性ヒト癌細胞株は、免疫不全非ヒト動物から採取し、培養して維持することができる。培養条件は、原料として用いたヒト癌細胞株と同様である。

本発明のスクリーニング方法によって選択された癌転移抑制薬は、癌転移予防薬としても有用である。また、本発明のスクリーニング方法によって選択されたＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤は、ＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナルを抑制することによる癌転移抑制薬として有用である。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

参考例１
ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子が導入されたｄｓ−ｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク陽性の弱転移性ＤＣＩＳヒト乳癌細胞は、ＧＦＰ陽性のＣＡＦｓとＮＯＧマウスの皮下に共移植された。１ヶ月後に切除された癌塊を酵素処理により消化し、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ存在下で５日間培養し、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性の培養ＤＣＩＳ細胞（ＤＣＩＳ−１ ｃｙｃｌｅ）を抽出した（図１）。この条件では、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ非耐性のＣＡＦｓやマウスの間質細胞は生存不可能である。さらにＣＡＦｓによる教育を施す為に、ＤＣＩＳ−１ ｃｙｃｌｅ細胞は再度ＣＡＦｓとＮＯＧマウスに共移植された。１ヶ月後に切除された癌塊を消化後、抽出されたｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性の培養ＤＣＩＳ細胞（ＤＣＩＳ−２ｃｙｃｌｅ）をＤＣＩＳ^CAFsと名付けた。また非癌部より抽出された対照線維芽細胞で同様に教育されたＤＣＩＳ−２ｃｙｃｌｅはＤＣＩＳ^CntFsと名付けられた。

ＤＣＩＳ^CAFsあるいはＤＣＩＳ^CntFsを線維芽細胞の非存在下でＮＯＧマウスに皮下移植した。１ヶ月後に原発癌を切除し、転移巣の増大を促すために、さらに１ヶ月間マウスの生存させた後に肺を切除し、顕微鏡下で観察した（図２）。ＤＣＩＳ^CntFsと比較して、ＤＣＩＳ^CAFsにより肺に形成されたｔｏmaｔｏ陽性の転移巣（矢印で示された）の増大が観察された（図２）。また、ＤＣＩＳ^CAFsがＮＯＧマウスの尾静脈に注入された場合でも、ＤＣＩＳ^CntFsと比較して、移植後１ヶ月後の肺に著明な転移（ｔｏｍaｔｏ陽性）が観察された（図３）。またH-E染色された組織標本においても転移巣の増大が確認された(図３)。さらに１×１０⁴あるいは４×１０⁴ＤＣＩＳ癌細胞を尾静脈より注射し、その1か月後に形成される肺転移巣の容積を定量化した。ＤＣＩＳ^CntFsと比較して、ＤＣＩＳ^CAFsで誘導された転移巣の容量が顕著に増加していることが示された。以上よりＤＣＩＳ^CAFsの肺転移能の亢進が示唆された。

実施例１
ＤＣＩＳ^CAFsとＤＣＩＳ^CntFsの遺伝子発現を比較したＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量が、 ＤＣＩＳ^CAFsで顕著に亢進していることを見出した。すなわち、参考例１で得た各４つの異なる癌塊よりＤＣＩＳ^CntFsおよびＤＣＩＳ^CAFsを抽出した。図４に示すように、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析は、すべての４ラインのＤＣＩＳ^CAFsが、ＤＣＩＳ^CntFsと比較してＣＥＡＣＡＭ５（３０〜１１０倍）とＣＥＡＣＡＭ６（１５〜３０倍）ｍＲＮＡの高発現を示した。転移促進因子として知られているＭＭＰ１の発現は亢進していない。図５に示すように、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析は、すべての４ラインのＤＣＩＳ^CAFsが、ＤＣＩＳ^CntFsと比較してＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６蛋白の明らかな高発現を示した。

実施例２
ＣＡＦｓで促進された肺転移におけるこれらのＣＥＡＣＡＭｓ遺伝子の機能を調査するために、ＣＥＡＣＡＭ６あるいはＣＥＡＣＡＭ５の発現を抑制するレンチウイルス由来ｓｈＲＮＡ ｖｅｃｔｏｒを作製した。ＣＥＡＣＡＭ６の発現を抑制するために、ｓｈＣＡＭ６−１ ｖｅｃｔｏｒおよびｓｈＣＡＭ６−２ ｖｅｃｔｏｒが、ＣＥＡＣＡＭ５の発現を抑制するために、ｓｈＣＡＭ５−１ ｖｅｃｔｏｒおよびｓｈＣＡＭ５−２ ｖｅｃｔｏｒが用いられた。ｓｈＧＦＰ ｖｅｃｔｏｒは、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量も抑制しない対照のベクターとして使用された。
ＣＥＡＣＡＭ５あるいはＣＥＡＣＡＭ６の発現が抑制されたＤＣＩＳ^CAFs細胞がＮＯＧマウスの尾静脈より注入された時、その肺への転移能が顕著に抑制されていることが明らかになった（図６と図７）。

すなわち、ＮＯＧマウスの尾静脈より種々のＤＣＩＳ細胞を注入した。ＣＥＡＣＡＭ６の発現量が低いＤＣＩＳ^CAFs（ＤＣＩＳ^CAFs−ｓｈＣＡＭ６−１あるいはＤＣＩＳ^CAFs−ｓｈＣＡＭ６−２）やＤＣＩＳ^CntFs−ｓｈＧＦＰと比較して、ＣＥＡＣＡＭ６の高発現を維持したＤＣＩＳ^CAFs−ｓｈＧＦＰは強い転移能を示した（図６）。

ＮＯＧマウスの尾静脈より種々のＤＣＩＳ細胞を注入した。ＣＥＡＣＡＭ５の発現量が低いＤＣＩＳ^CAFs（ＤＣＩＳ^CAFs−ｓｈＣＡＭ５−１あるいはＤＣＩＳ^CAFs−ｓｈＣＡＭ５−２）やＤＣＩＳ^CntFs−ｓｈＧＦＰと比較して、ＣＥＡＣＡＭ５の高発現を維持したＤＣＩＳ^CAFs−ｓｈＧＦＰは強い転移能を示した（図７）。

癌転移抑制薬を同定するために、ＤＣＩＳ^CAFsにおけるＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を抑制する被験物質をスクリーニングした。４種類の異なったＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナルの抑制剤（赤矢印）が対照のＤｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ （ＤＭＳＯ）処理（青矢印）と比較して、ＤＣＩＳ^CAFsにおけるＣＥＡＣＡＭ５（上）及びＣＥＡＣＡＭ６（下）の発現量を５０〜７０％程度抑制した（図８）。

Claims (7)

1. 癌転移を検出する目的で、癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定する方法。
2. ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量が亢進している場合に癌転移が生じているあるいは癌転移が生じ易いと判定する請求項１記載の測定方法。
3. 癌細胞が、対象患者から採取した癌組織由来である請求項１又は２記載の測定方法。
4. 被験物質で処理された癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定することを特徴とする、癌転移抑制薬のスクリーニング方法。
5. 癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量の抑制の有無を測定する請求項４記載のスクリーニング方法。
6. 被験物質で処理された癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量を測定することを特徴とする、ＭＥＫ−ＭＡＰＫシグナル抑制剤のスクリーニング方法。
7. 癌細胞中のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の発現量の抑制の有無を測定する請求項６記載のスクリーニング方法。