JP2015048335A - 抗１６ＳｒＲＮＡメチラーゼ（ＡｒｍＡ）抗体、並びに、アミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出方法及びキット - Google Patents

Abstract

【課題】 抗16SrRNAメチラーゼ（ArmA）抗体を提供すると共に、実用性の高いアミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出方法及びその検出キットを提供すること。【解決手段】 16SrRNAメチラーゼ（ArmA）に対する抗体であって、アミノ酸配列MDKNDVVKKILESKKYENLDSDIVEKVVSISEKKYKLKEVENYSKKKLHQIWGSYYSAYPNWDKLLKKYNQGQLSIEDLLKIHSSTNERVATLをエピトープとする。また、アミノグリコシド系抗生剤に対する耐性菌を検出する方法であって、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）、または、これを認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備えたキットを用い、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）産生菌を検出する。【選択図】 図１

Description

本発明は、抗16SrRNAメチラーゼ（ArmA）抗体と、アミノグリコシド系抗生剤耐性菌を検出する方法と、その検出キットに関する。

しばしば重症細菌感染症の治療薬として投与される重要な抗菌薬として、アミカシンやゲンタマイシン等のアミノグリコシド系抗生剤がある。

しかし、近年、様々なアミノグリコシド系抗生剤に対して高度耐性を付与する16SrRNAメチラーゼ産生菌が報告されている。これらの細菌では、産生された16SrRNAメチラーゼが、アミノグリコシドの標的分子である16SrRNAの特定の塩基をメチル化することによって、アミノグリコシドの16Sリボソームへの結合を阻止し、アミノグリコシド耐性を獲得する（非特許文献１）。
16SrRNAメチラーゼ遺伝子は、大腸菌や肺炎桿菌等の腸内細菌科の細菌やブドウ糖非発酵細菌で広範に検出されるようになってきた。このような16SrRNAメチラーゼ産生グラム陰性病原体は、アフガニスタン、オマーン、インド、韓国、中国、日本、ネパール、パキスタン、バングラディシュ、フランス、香港で分離されている（非特許文献１〜２）。

16SrRNAメチラーゼ産生菌を迅速に検出できれば、適切な抗菌剤を選択して早期の治療開始を促し、それによって感染症重篤化を回避することが可能となる。また、アミノグリコシド耐性菌による院内感染を防止することも可能となる。

これまでに、10種類の16SrRNAメチラーゼ（ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, RmtD, RmtE, RmtF, RmtG, RmtH, NpmA）が報告されている（非特許文献３〜６）。このうち、ArmAは、腸内細菌科の病原菌やアシネトバクター属細菌など様々な科の細菌間で検出され、報告数も他の16SrRNAメチラーゼと比べて最も多い。

アミノグリコシド系抗生剤耐性に対する従来の関連技術には、特許文献１〜３があるが、実用性の点で難があった。

特表２０１１−５０９９８３「新規ネアミン誘導体の合成及び抗菌薬としてのその使用」 特表２００８−５３００８２「薬剤耐性菌による感染性病状のための非経口的併用療法」 特表２００８−５２４２０４「感染の処置に全面的解決を与えるための抗生物質の組合せ」

Wachino, J., K. Yamane,K. Shibayama, H. Kurokawa, N. Shibata, S. Suzuki, Y. Doi, K. Kimura, Y. Ike,and Y. Arakawa. 2006. Novel plasmid-mediated 16SrRNA methylase, RmtC, found ina proteus mirabilis isolate demonstrating extraordinary high-level resistanceagainst various aminoglycosides. Antimicrob. Agents Chemother. 50:178-184. doi:10.1128/AAC.50.1.178-184.2006 Tada, T., T. Miyoshi-Akiyama, R. K.Dahal, M. K. Sah, H. Ohara, T. Kirikae, and B. M. Pokhrel. 2013. NDM-8Metallo-beta-Lactamase in a Multidrug-Resistant Escherichia coli StrainIsolated in Nepal. Antimicrob. Agents Chemother. . doi: 10.1128/AAC.02553-12 Wachino, J., and Y. Arakawa. 2012.Exogenously acquired 16S rRNA methyltransferases found inaminoglycoside-resistant pathogenic Gram-negative bacteria: An update. DrugResist Updat. 15:133-148. doi: 10.1016/j.drup.2012.05.001 Galimand, M., P. Courvalin, and T.Lambert. 2012. RmtF, a New Member of the Aminoglycoside Resistance 16S rRNA N7G1405 Methyltransferase Family. Antimicrob. Agents Chemother. 56:3960-3962.doi: 10.1128/AAC.00660-12 Bueno, M. F., G. R. Francisco, J.A. O'Hara, D. de Oliveira Garcia, and Y. Doi. 2013. Co-production of 16SRibosomal RNA Methyltransferase RmtD and RmtG with KPC-2 and CTX-M-group ESBLsin Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. . doi:10.1128/AAC.02108-12 O'Hara, J. A., P. McGann, E. C.Snesrud, R. J. Clifford, P. E. Waterman, E. P. Lesho, and Y. Doi. 2013. Novel16S Ribosomal RNA Methyltransferase RmtH Produced by Klebsiella pneumoniaeAssociated with War-Related Trauma. Antimicrob. Agents Chemother. . doi: 10.1128/AAC.00266-13 web上の情報（http://www.shigei.or.jp/smri/smri1/monokurosakusei.htm） Ferenc Oroszら,Journal of Immunological Methods 270(2002) 155−162

そこで、本発明は、抗16SrRNAメチラーゼ（ArmA）抗体を提供すると共に、実用性の高いアミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出方法及びその検出キットを提供することを課題とする。

本発明の抗16SrRNAメチラーゼ（ArmA）抗体は、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）に対する抗体であって、アミノ酸配列MDKNDVVKKILESKKYENLDSDIVEKVVSISEKKYKLKEVENYSKKKLHQIWGSYYSAYPNWDKLLKKYNQGQLSIEDLLKIHSSTNERVATLをエピトープとすることを特徴とする。

上記アミノ酸配列は、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、または、置換、付加されていても、それをエピトープとする抗体が、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）に対する抗体として機能すればよい。

なお、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）のアミノ酸配列は、全長（1〜257）が、MDKNDVVKKILESKKYENLDSDIVEKVVSISEKKYKLKEVENYSKKKLHQIWGSYYSAYPNWDKLLKKYNQGQLSIEDLLKIHSSTNERVATLNDFYTYVFGNIKHVSSILDFGCGFNPLALYQWNENEKIIYHAYDIDRAEIAFLSSIIGKLKTTIKYRFLNKESDVYKGTYDVVFLLKMLPVLKQQDVNILDFLQLFHTQNFVISFPIKSLSGKEKGMEENYQLWFESFTKGWIKILDSKVIGNELVYITSGFQKであり、上記エピトープは、このうちの1〜93である。

本発明のアミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出キットは、アミノグリコシド系抗生剤に対する耐性菌を検出するキットであって、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）、または、これを認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備え、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）産生菌を検出することを特徴とする。

本発明のアミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出方法は、アミノグリコシド系抗生剤に対する耐性菌を検出する方法であって、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）、または、これを認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備えたキットを用い、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）産生菌を検出することを特徴とする。

本発明によると、16SrRNAメチラーゼ産生菌を容易かつ確実に検出できるので、適切な抗菌剤の選択による感染症重篤化の回避や、アミノグリコシド系抗生剤耐性菌による院内感染の防止に寄与する。

直接的ELISA法での抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の16SrRNAメチラーゼ(ArmA)に対する反応性の確認と、反応エピトープの解析を示すグラフ 天然型16SrRNAメチラーゼ(ArmA)との抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の反応性を示すウエスタンブロッティングの写真 抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の16SrRNAメチラーゼ(ArmA)に対する親和性を示す表 抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体と、ArmA以外の16SrRNAメチラーゼとの反応性を示すウエスタンブロッティングの写真

以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。

本発明者は、アミノグリコシド系抗生剤耐性菌の検出には、抗原抗体反応を利用した手法が有用と考え、16SrRNAメチラーゼに対するモノクローナル抗体を調製し、それにより実際に16SrRNAメチラーゼが検出可能であることを検証した。

これにより、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）、または、これを認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備えたキットを用い、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）産生菌を検出して、アミノグリコシド系抗生剤耐性菌を検出することが可能になった。

上記タンパク質の認識及び定量には、該当タンパク質そのものでもよいが、該当タンパク質を認識する固有の部分タンパク質やポリペプチドなどでもよい。

なお、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含み得る。ポリペプチドを検出するために抗体を作製する場合に、ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。

ポリペプチドは、上記の遺伝子産物におけるアミノ酸置換の他に、ポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能する限り、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、付加されたものであってもよい。抗体が認識するエピトープ以外の部位に、このような変異が含まれていてもよい。
このようなポリペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発法などにより作製し、適当な系で発現させることによって調製することも可能である。

ポリペプチドの検知は、例えば、本発明の抗体を用いたＥＩＡやＥＬＩＳＡなどの免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサーなどペプチドのアミノ酸配列分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳやＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法などの質量分析によって検出することができる。

上記タンパク質、その部分タンパク質、ポリペプチドの合成には、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。
その方法では、例えばタンパク質またはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくは公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
遊離型のものとして得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で遊離型のものまたは他の塩に変換することができる。塩としては、生理的に許容されるものまたは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。その塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。また、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。

抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
なお、抗体としては、上記タンパク質及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2 , Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えばクワドローム、トリオームなどの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾または加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成または半合成技術を使用して得られた抗体、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、標的抗原物質または標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含してもよい。

好ましくは抗体は、天然型の上記タンパク質を特異的に識別できるものである。
ポリクローナル抗体として得るためには、免疫源である上記タンパク質またはそのフラグメント、配列の一部のペプチドを、哺乳動物、鳥類などに免疫し、その哺乳動物、鳥類などから抗血清を採取し、その抗血清に含まれるポリクローナル抗体を使用することができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、さらに、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サルなどの霊長類、ニワトリなどの鳥類等が使用される。さらに、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、動物から採血した血液から調製することができる。

モノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる公知の方法を用いて産生される。
個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なったエピトープに対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常のポリクローナル抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないかまたは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、または軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、またはヘテロジーニアスなタンパク質と融合させたりして得ることができる。
モノクローナル抗体を製造する方法の例には、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、トリオーマ法、EBV-ハイブリドーマ法などが挙げられる。

モノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるキメラ抗体（免疫グロブリン) を包含する。

また、哺乳動物由来のハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものを挙げることができる。
抗体を産生するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して作製できる。すなわち、上記タンパク質またはそのフラグメントを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
上記タンパク質またはそのフラグメントの調製方法及び哺乳動物に対する免疫方法等に関しては、上述したポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する手法に準じて行うことができる。この場合、特に、哺乳動物に対して免疫した後、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、哺乳動物のミエローマ細胞を利用できる。免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合などは、基本的には公知の方法、例えば、ケラー及びミルステイン方法等に準じて行うことができる。
モノクローナル抗体は例えば、次のような工程で作製できる。(1) 免疫原性抗原の調製、(2) 免疫原性抗原による動物の免疫、(3) ミエローマ細胞の調製、(4) 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、(5)ハイブリドーマの選択及びモノクローン化、(6) モノクローナル抗体の製造。

また、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明による免疫原ポリペプチド産物に対する抗体を発現するのに用いることができる。
また、こうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの公知の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNAは、発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ネコの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である。所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。
また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。さらに、トリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。

抗体は、公知の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、免疫沈降検定に使用することができる。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、公知の方法を使用することができ、標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質または放射性同位元素などがある。

本発明での検知・測定は、免疫染色、例えば組織または細胞染色、免疫電子顕微鏡、免疫クロマトクグラフィー、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができる。好ましくは、放射免疫測定法(RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA などを用いることができる。
例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の上記タンパク質ポリペプチドに対する抗体または上記タンパク質の関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を上記タンパク質のC末端側残基に対する抗体とし、一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちポリペプチド抗原の量と比例する。このアッセイは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワードサンドイッチ型アッセイまたは逆サンドイッチ型アッセイなどと分類される。

本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることも同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
免疫学的測定法の際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製またはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子または試験管などの種々の材料及び形態を任意に選択し、使用することができる。

測定には、至適pH、例えばpH約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０〜約６０℃の間の温度で行うことが好ましい。酵素などで標識された抗血清、精製抗体、またはモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合させられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりも早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相または固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。
測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように処置することができる。

非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、または測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。非特異的結合反応を防ぐための公知のブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清や血清タンパク質、アルブミン、ヘモグロビン、オボアルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。
試料や固相などの洗浄には、緩衝液系や食塩液から適宜適当な液を選択でき、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤の他、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などを添加して使用できる。

キットの基本構成としては、例えば、湿潤状態で物質の移動を可能にする担体に、(a) 検体を適用する部位、(b) 標識抗体を含有した部位、(c) 抗原検出部位、(d) 反応終了判定部位を順次形成してあるものから成る。(i) 標識抗体を含有した部位には、湿潤状態において該担体上を抗原検出部位、反応終了判定部位へと順次移動し得る、上記タンパク質に対する標識した抗体を含有させ、(ii) 検出部位には、固相化したコーキシンに対する抗体を存在させるようにし、(iii)反応終了判定部位には、標識抗体として使用した抗体に対する第二抗体
を固相化した部位を形成して、検体を適用する部位に検体を適用することにより、検体を担体において移動させ、標識抗体を溶出させ、抗原検出部位の固相化抗体及び反応終了判定部位の第二抗体部位を通過させることにより、検体中の上記タンパク質を検出する。

更に、上記タンパク質またはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として具備させてもよい。
ハイブリダイゼーションする核酸としては、例えばプローブ及びプライマーなどが挙げられる。上記タンパク質遺伝子またはその産物とハイブリダイゼーションするプローブであれば、その目的に合致するかぎり制限なく利用できる。

16SrRNAメチラーゼ(ArmA)遺伝子を大腸菌発現ベクター(キアゲン社、TAGZyme pQE2)に組み込み、そのベクターを大腸菌に導入して、16SrRNAメチラーゼ(ArmA)組み換え蛋白質を発現させた。その組み換え蛋白質を略単一に精製し（キアゲン社のプロトコール：TAGZyme Handbook）、動物免疫用抗原として使用した。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ラットリンパ節法(非特許文献７)により作製した。抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、組換え16SrRNAメチラーゼ(ArmA)を固相とし、結合抗体をHRP標識２次抗体で検出する直接的ELISA法により実施した。
抗体の16SrRNAメチラーゼ(ArmA)に対する親和性測定は、非特許文献８の方法に従いELISA法により測定した。

なお、本実施例で抗体作成に使用した菌種は、Acinetobacter baumannii CP003907.1である。他の菌種、例えば、Citrobacter amalonaticus EF158302.1、Citrobacter freundii AF550415.2、Enterobacter aerogenes EF158297.1、Enterobacter cloacae HQ204573.1、Escherichia coli AB117519.1、Klebsiella oxytoca CP003684.1、Klebsiella pneumonia JQ724540.1、Providencia stuartii JN687470.1、Pseudomonas aeruginosa GU437214.1、Salmonella enterica subsp.enterica serovar Oranienburg Q177329.1、Serratia marcescens AB116388.1も同一のアミノ酸配列を持っているので利用可能である（アクセッション番号は代表的なもの）。

図１は、直接的ELISA法での抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の16SrRNAメチラーゼ(ArmA)に対する反応性の確認と、反応エピトープの解析を示すグラフである。
組み換え16SrRNAメチラーゼ（ArmA）の全長（1〜257、full）、アミノ酸配列1〜93（fr1）、79〜〜179(fr2)、165〜257(fr3)の各蛋白質50ng/wellを固相化し、表示したモノクローナル抗体500ng/wellを添加して、反応後、結合抗体をHRP標識２次抗体により検出した。なお、表示1D1、1E7、1H3、2C8は実験時の呼称である。
得られた抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)抗体は組換え16SrRNAメチラーゼ(ArmA)と反応することが確認された。また、同時に実施したエピトープマッピングから、16SrRNAメチラーゼ(ArmA)は257アミノ酸配列のうち１〜93番目部分（fr1）と反応することが確認された。

なお、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）のアミノ酸配列は、全長（1〜257、full）が、MDKNDVVKKILESKKYENLDSDIVEKVVSISEKKYKLKEVENYSKKKLHQIWGSYYSAYPNWDKLLKKYNQGQLSIEDLLKIHSSTNERVATLNDFYTYVFGNIKHVSSILDFGCGFNPLALYQWNENEKIIYHAYDIDRAEIAFLSSIIGKLKTTIKYRFLNKESDVYKGTYDVVFLLKMLPVLKQQDVNILDFLQLFHTQNFVISFPIKSLSGKEKGMEENYQLWFESFTKGWIKILDSKVIGNELVYITSGFQKであり、アミノ酸配列1〜93（fr1）は、MDKNDVVKKILESKKYENLDSDIVEKVVSISEKKYKLKEVENYSKKKLHQIWGSYYSAYPNWDKLLKKYNQGQLSIEDLLKIHSSTNERVATLである。

図２は、天然型16SrRNAメチラーゼ(ArmA)との抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の反応性を示すウエスタンブロッティングの写真である。メインのバンドは、30kDaである。
大腸菌に天然型16SrRNAメチラーゼ(ArmA)を発現するプラスミド(レーン3)、コントロールプラスミド(レーン2)を導入し、その蛋白質が発現した大腸菌のライセートを調製した。ポジティブコントロールとして組み換え16SrRNAメチラーゼ(ArmA)蛋白質(レーン1)を使用した。SDS-PAGEによる展開後、各蛋白質とのモノクローナル抗体の反応性を、ウエスタンブロッティングにより解析した。

レーン１は、組み換え16SrRNAメチラーゼ(ArmA)を10ng/laneとなるように希釈し、レーン３は16SrRNAメチラーゼ(ArmA)発現プラスミド導入大腸菌、レーン２はコントロールプラスミド導入大腸菌の終夜培養液薬を30μl/laneとなるようにした。抗原の実際量は、概算で3ng/laneほどである。抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)抗体は、1D1と2C8は1μg/ml、1E7と1H3は10μg/mlに希釈して使用した。
得られた抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)抗体は、大腸菌内で発現させた天然型16SrRNAメチラーゼ(ArmA)と反応することが確認された。

図３は、抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の16SrRNAメチラーゼ(ArmA)に対する親和性(Kd値)を示す表である。
親和性測定は、引用文献８の方法に従い、ELISA法により測定した。
各抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体の親和性は、nM以下であり非常に高親和性であった。

図４は、抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)モノクローナル抗体と、ArmA以外の16SrRNAメチラーゼとの反応性を示すウエスタンブロッティングの写真である。メインのバンドは、30kDaである。
各16SrRNAメチラーゼ保有菌培養液（ArmA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtF,npmA)を30μl/laneとなるように泳動させた。蛋白質量は概算で3ng/laneである。使用抗体濃度は抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)は、1D1と2C8は1μg/ml、1E7と1H3は10μg/mlに希釈して使用した。ポジティブコントロールに使用したラットポリクローナル16SrRNAメチラーゼ(ArmA)抗体は5000倍希釈で使用した。

どの抗体も16SrRNAメチラーゼ(ArmA)以外とは反応しなかった。抗16SrRNAメチラーゼ(ArmA)抗体は、16SrRNAメチラーゼ(ArmA)のみと反応し（赤色矢印）、ポリクローナル抗体はArmA以外の16SrRNAメチラーゼと交差反応していることが推察された（黄色矢印）。
なお、アミノ酸配列の相同性については、16SrRNAメチラーゼ(ArmA)はArmA以外の16SrRNAメチラーゼとはほとんど相同性を示さない。部分的に似ている部分でも20%程度である。

本発明によると、16SrRNAメチラーゼ産生菌を容易かつ確実に検出でき、適切な抗菌剤の選択による治療や、アミノグリコシド系抗生剤耐性菌による院内感染の防止に有効であり、産業上有用である。

Claims (4)

16SrRNAメチラーゼ（ArmA）に対する抗体であって、アミノ酸配列
MDKNDVVKKILESKKYENLDSDIVEKVVSISEKKYKLKEVENYSKKKLHQIWGSYYSAYPNWDKLLKKYNQGQLSIEDLLKIHSSTNERVATLをエピトープとする
ことを特徴とする抗16SrRNAメチラーゼ（ArmA）抗体。

請求項１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、または、置換、付加されたアミノ酸配列から成る
請求項１に記載の抗16SrRNAメチラーゼ（ArmA）抗体。

アミノグリコシド系抗生剤に対する耐性菌を検出するキットであって、
16SrRNAメチラーゼ（ArmA）、または、これを認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備え、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）産生菌を検出する
ことを特徴とするアミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出キット。

アミノグリコシド系抗生剤に対する耐性菌を検出する方法であって、
16SrRNAメチラーゼ（ArmA）、または、これを認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備えたキットを用い、16SrRNAメチラーゼ（ArmA）産生菌を検出する
ことを特徴とするアミノグリコシド系抗生剤耐性菌検出方法。

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