JP2015029905A - 生物組織の調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】組織から細胞成分を除去し、体によって異組織として認識されなくなり、石灰化も生じず、寿命も最大限まで引き延ばされる人工心臓弁の製造方法の提供。【解決手段】人工心臓弁に使用する組織の調製方法において、少なくとも以下の工程：適切な洗浄剤で組織を脱細胞化することと、その後、適切な架橋剤で組織のコラーゲン繊維を架橋することと、を含み、前記脱細胞化用の洗浄剤は、両親媒性を有する少なくとも一つのリポペプチドであって、親水性の基礎構造と疎水性の側鎖とを包含するリポペプチドを含んでなる方法。【選択図】なし

Description

本発明は医療用の組織を調製する方法に関し、特に人工心臓弁に使用する組織の調製方法に関し、前記方法には少なくとも以下の工程：
・適切な洗浄剤で組織を脱細胞化することと、その後、
・適切な架橋剤で組織のコラーゲン繊維を架橋することと、が含まれる。

本発明は、人工心臓弁に使用する組織の調製方法に関連して、実施例を使って以下に記載される。本発明は、特に上記タイプの組織の調製に適しているが、本応用例に限定されるものではない。本発明は血管、軟骨、靭帯などの調製にも使用できる。

更に本発明は、リポペプチドを含む少なくとも一つの溶液の使用に関する。

基本的に二種類の心臓弁プロテーゼがあり、機械式弁を含むプロテーゼは人工的に作られるもので、一般的に熱分解炭素でコーティングされたグラファイトでできており、生物組織製の弁を含むプロテーゼは、一般的に動物源（豚や牛など）から得られる心膜組織である。生物組織製の心臓弁は一般的に基底（硬質のプラスチック製骨格、自己拡張型ステント等）中に置かれ、次に天然の弁の位置に移植される。本発明は、人工弁プロテーゼに使用して天然の心臓弁の位置に移植される斯かる組織の調製方法を記載する。

起源組織は、移植する前に充分に洗浄し準備しなければならない。そうすることにより、組織は最大限まで修飾され、その結果、体によって異組織として認識されなくなり、石灰化も生じず、寿命も最大限まで引き延ばされる。斯かる組織調製方法には、複数の中間洗浄処理を含む少なくとも二つの主要工程が実質的に含まれる。

最初の重要な調製工程は、いわゆる組織の脱細胞化である。この工程で、細胞膜、細胞内蛋白質、細胞核および他の細胞成分ができるだけ完全に除去され、可能な限り最高に純粋な細胞外マトリックスが得られる。組織に残っている細胞および細胞成分は、特に、生物移植物質の好ましくない石灰化の原因となる結晶核である。洗浄工程としての脱細胞化は、細胞外マトリックスの構造やコラーゲン繊維をできるだけそのまま残し、しかも組織に含まれる全細胞が充分に除去されるように、できるだけ温和に行われるべきである。

第二の重要な調製工程は、組織、特にコラーゲン繊維の架橋工程である。脱細胞化の後、全細胞成分が組織から除去され、生物物質がほとんど全て細胞外マトリックスで構成されているのが好ましい。心膜組織の場合、細胞外マトリックスは主にコラーゲン繊維である。できるだけ最適な機械的特性を有する生物物質を得るため、適切な架橋剤で化学結合を導入することによりコラーゲン繊維を架橋する。架橋剤はコラーゲン繊維のアミノ基に結合し、コラーゲン繊維間に化学的に安定な化合物を形成する。その結果、三次元的に配置されたコラーゲン繊維から長期間安定な生物物質が得られ、この生物物質はもはや異物質として認識されることはない。架橋剤によって個々のコラーゲン繊維を三次元的に架橋または結合することにより、組織の安定性および歪性が大幅に増大する。組織が短い間隔で開閉を繰り返す心臓弁のような組織においては、これは特に重要である。

生物組織を調製する別の方法が特許文献１に記載されている。この先行技術による方法では、組織は１−２％のデオキシコール酸溶液で脱細胞化される。洗浄工程を複数回繰り返した後、環状リポペプチドを含む溶液で組織を条件付けする。脱細胞化が完了し細胞の再増殖を行う前に、特に条件調節剤として環状リポペプチドであるサーファクチンが使用される。この先行技術における代替方法では、適切な架橋剤を使ったコラーゲン繊維の架橋は行われない。条件付けの後、組織を天然細胞で増殖させる。

特許文献２は生物組織の調製方法を記載しており、蒸留水が脱細胞化に使用されている。その後の工程で、グルタルアルデヒドが架橋剤として機能する。

特許文献３では、脱細胞化のための、第一のイオン性洗浄剤と第二の非イオン性洗浄剤の使用が記載されている。この場合、ドデシル硫酸ナトリウムやドデシルスルホン酸ナトリウムなどのアニオン性洗浄剤が、第一のイオン性洗浄剤として提供されるのが好ましい。あるいは、第一の洗浄剤としてコール酸ナトリウムやドデシルコール酸ナトリウムなどの胆汁酸が使用できる。第二の洗浄剤は電気的に中性であり、ポリエチレングリコールを含む洗浄剤などである。

国際公開第２００４／０５２４１７号パンフレット 国際公開第２０１１／１０９４３３号パンフレット 国際公開第２００５／１１８０１４号パンフレット

従って、本発明が解決しようとする課題は、組織から細胞成分を除去することによる生物組織の調製方法の設計であって、後の工程で行われる架橋により、特に人工心臓弁の組織として使用するのに適した、機械的に安定で寿命も長い組織を充分かつ温和な方法で提供できるような方法の設計である。

本発明が解決しようとする更なる課題は、少なくとも一つのリポペプチドを含む溶液の新たな使用の発見である。

前記課題は、方法としては、請求項１に記載の特徴を組み合わせることにより解決される。前記課題は、応用例としては、請求項６に記載の特徴を組み合わせることにより解決される。本発明の好ましい実施形態が従属項に記載される。

本発明の基本概念は、脱細胞化用の洗浄剤としてリポペプチドを使用することである。本発明の概念によれば、ベータヒドロキシ脂肪酸またはベータアミノ脂肪酸は条件化のために使用するのではなく、脱細胞化用の洗浄剤として使用される。驚いたことに、リポペプチドは組織の脱細胞化において優れた結果を生むことが証明されている。極めて温和な条件で、細胞成分が組織から除去される。本発明の洗浄剤が使用される場合、先行技術の洗浄剤と比べて、著しく優れた規模で細胞外マトリックスが維持される。従って、本発明の洗浄剤は、両親媒性を有し、親水性の基礎構造と疎水性の側鎖とを包含する少なくとも一つのリポペプチドを含む。その結果、その後の架橋工程により、先行技術よりもはるかに改良され、従って特に心臓弁プロテーゼの使用に適している機械的特性を有する組織が得られる。

特に好ましいのは、脱細胞化用の洗浄剤が環状リポペプチド、特にサーファクチンを含む場合である。本発明の好ましいこの実施形態において、サーファクチンを含む洗浄剤は脱細胞化に使用される。特に、該洗浄剤は、以下に示される環状構造を有するサーファクチンを含んでいる。

（式中、ｎは１０から１２、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐはそれぞれアミノ酸のグルタミン酸、ロイシン、バリンおよびアスパラギン酸を示す）。

他の好ましいリポペプチドとして、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチン、エキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチドおよび／またはポリミキシンが挙げられる。望ましくは、サーファクチン、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチン、あるいはエキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチド、ポリミキシンからなるリストから選択される、少なくとも一つのリポペプチドが洗浄剤に含まれる。

架橋剤は好ましくはグルタルアルデヒドを含んでいる。本発明の別の実施形態では、架橋剤は、カルボジイミド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドアセタル、アシルアジド、シアンイミド、ゲニピン、タンニン、ペンタガロイルグルコース、フィチン酸塩、プロアンソシアニジン、ロイテリンおよび／またはエポキシド化合物を含む。

望ましくは、脱細胞化の前および特に好ましくはその後、少なくとも一度、好ましくは複数回、適切な溶媒、特に緩衝生理食塩溶液および／またはアルコール溶液で、組織をリンスする。緩衝塩化ナトリウム溶液および／またはエタノール溶液が特に望ましい。

特に好ましくは、洗浄剤は、リポペプチド特にサーファクチンを１００ｍｇ／Ｌから２０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５００ｍｇ／Ｌから７００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは６００ｍｇ／Ｌの濃度で包含する、望ましくはｐＨ７．４の緩衝液、特に好ましくはリン酸緩衝液を含む。洗浄剤サーファクチン用のキャリア溶液として、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水が特に望ましい。他の生物緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液または２−(４−（２−ヒドロキシメチル）−１−ピペラジニル)−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液も望ましい。

本発明は、更に、生物組織、特に心臓弁プロテーゼ用の細胞組織を脱細胞化するための洗浄剤として、両親媒性を有し、親水性の基礎構造と疎水性の側鎖とを包含する少なくとも一つのリポペプチドを含む溶液の使用にも関する。本発明によれば、少なくとも一つのリポペプチドを含む溶液は、条件付けのためではなく生物組織の脱細胞化および浄化のために使用される。

驚いたことに、リポペプチドを含む溶液は、充分にしかも温和な条件で脱細胞化する。

生物組織の脱細胞化用の洗浄剤として、少なくともサーファクチン、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチン、エキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチドおよび／またはポリミキシンを含む溶液の使用が特に望ましい。

サーファクチン、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチンおよび／またはエキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチド、ポリミキシンを緩衝液、特にリン酸緩衝液に溶解するのが望ましい。ＴＲＩＳ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液も望ましい。

本発明は、特に、充分かつ信頼のおける脱細胞化を保証する生物組織の調製方法を提供するが、該方法は、脱細胞化および架橋の後、細胞の機械的特性が先行技術と比べて格段に改善されるように、組織に温和なやり方で同時に実施される。

生物組織の調製、特に心臓弁プロテーゼに使用される生物組織の調製に関する本発明の方法は、臨床使用の際に、組織（従ってプロテーゼ）の石灰化のリスクを最小限に抑える。組織の特性は、本発明に従って使用される脱細胞化用洗浄剤により、極めてポジティブな影響を受ける。本発明の方法を使って調製される組織は、格段に改善された機械的歪性を示す。

図の例示的実施形態を参照し、先行技術の方法と比較することにより、本発明を以下に詳細に説明する。

図１は、脱細胞化の後のＤＮＡ量を、本発明の例示的実施形態と先行技術の二つの例と間で比較した図である。 図２は、三種類の洗浄剤で処理した後の脱細胞化した組織の収縮温度を天然組織の収縮温度と比較した、縦座標（拡大図でゼロ位は示していない）を示す図である。 図３ａ−図３ｄは、天然組織および三種類の洗浄剤で脱細胞化した後の組織における組織構造の損傷を示した電子顕微鏡像である。 図４は、本発明の一実施形態による、移植用生物組織の全調製方法を示す図である。

本発明の例示的な一実施形態では、生物組織は、豚の心膜組織から、付着している異組織を機械的に除去し、その後等張食塩水液（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）で２０時間洗浄することにより得られる。この組織は、カルシウム／マグネシウムを含まないＤＰＢＳ溶液（Ｌｏｎｚａ；ＤＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋；Ａｒｔ．Ｎｏ．１７−５１２）および濃度６００ｍｇ／Ｌのサーファクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、枯草菌由来のサーファクチン、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｆ３５２３）を含む洗浄剤で脱細胞化する。

前記本発明の例示的実施形態は、先行技術の二つの洗浄剤と比較される。

先行技術の最初の例では、生物組織は、濃度５ｇ／Ｌのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｌ３７７１）を含む洗浄剤で脱細胞化される。この場合に使用される溶媒は、やはりカルシウム／マグネシウムを含まないＤＰＢＳ溶液（Ｌｏｎｚａ；ＤＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋；Ａｒｔ．Ｎｏ．１７−５１２）である。

先行技術の第二の例では、濃度１０ｇ／Ｌのデオキシコール酸（ＤＣＡ；Ｓｉｇｍａ−ＡＬｄｒｉｃｈ，Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｄ６７５０）を含む洗浄剤で脱細胞化される。この場合、溶媒として等張食塩水液（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）が使用される。

図１は、脱細胞化の後のＤＮＡ量を、本発明の例示的実施形態と先行技術の二つの例との間で比較した図である。図１において、脱細胞化後の心膜組織のＤＮＡ量が、脱細胞化前の最初のＤＮＡ量に対する％で、縦座標にプロットされている。それぞれ、１時間、３時間および２０時間、各洗浄液で生物組織を洗浄した後プロットされた。ＤＮＡ量は、生物組織から細胞成分を除去した後の直接の測定値である。

ＤＣＡを含む脱細胞化用清浄剤の助けにより、ＤＮＡは３時間後、約４％まで減少する。ＤＮＡ量は、本発明の例示的実施形態によるサーファクチン含有洗浄剤により２０時間後、同様な値にまで減少させることができる。２０時間以内にサーファクチンによって達成される心膜組織の脱細胞化のレベルは、デオキシコール酸のそれに匹敵する。ＳＤＳ含有洗浄剤によるＤＮＡ量の値は、この場合、限定的に匹敵しているに過ぎず、これは脱細胞化が鮮明に可視化できるほどに、ＳＤＳが蛋白質構造を顕著に変化させ、ＤＮＡ検出方法の効果を大幅に損なうからである。先行技術による脱細胞化工程と比較した本発明の方法による顕著な効果が、図２から図３ｄに示してある。

図２は、三種類の洗浄剤で処理した後の脱細胞化した組織の収縮温度を天然組織の収縮温度と比較した、縦座標（拡大図でゼロ位は示していない）を示す図である

心膜組織の細胞外マトリックスの主要部分はコラーゲンであるので、収縮温度はコラーゲンが熱的に変性する温度、すなわち該蛋白質の空間的構造を不可逆的に変化させる温度である。コラーゲン分子が構造的に変化することにより、組織は大規模に不可逆的構造変化を起こし、その変化は、収縮温度に達したとき明らかに目立たなくなる。

収縮温度は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって実験的に決定した。該方法では、測定対象の試料の温度を時間的に直線的に増大させ、試料へ出入りする熱の流れを参照試料と比較して測定する。試料に熱力学的プロセスが生じた場合、例えばコラーゲンに不可逆的な構造変化が生じた場合、測定された温度自記記録の収縮温度に顕著なピークが形成される。収縮温度のレベルは、コラーゲン分子の空間構造を直接示す指標である。従って、天然組織の状態と比べて変化が可能な限り少ないという事は、分子レベルにおいて、サーファクチンによる脱細胞化が格段に温和であることを直接示している。

図２に明示されているように、本発明の例示的実施形態による、脱細胞化後の心膜組織の収縮温度は、未処理の天然心膜組織の収縮温度とほぼ同一である。しかし、ＤＣＡおよびＳＤＳを用いた先行技術による二つの例示的実施形態では、脱細胞化により、収縮温度が顕著に、すなわちそれぞれ摂氏３度と５度、減少している。従って、天然の生物組織の機械的特性と本発明による脱細胞化後の組織のそれとはとても類似している。従って、脱細胞化は、本発明による方法の助けにより、とても温和な状態で生じていることが証明された。

天然組織および三種類の洗浄剤で脱細胞化した後の組織における組織構造の損傷を電子顕微鏡像で図３ａ−図３ｄに示してある。

図３ａに示される天然組織と図３ｂに示される前記本発明の例示的実施形態による脱細胞化された組織とを比較した場合、画像はかなりの類似性を示している。両組織とも、コラーゲン繊維および房が互いに離れている様子を示している。

対照的に、図３ｃおよび３ｄに示される組織は、先行技術による前記洗浄剤で脱細胞化した後、著しく変化している。この場合、特に、小さ目のコラーゲン繊維が互いに付着し合う傾向にある。その結果、組織構造が大幅に変化しており、電子顕微鏡像ではかなりコンパクトな状態になっているように見える。

図４は、本発明の一実施形態による、移植用生物組織の全調製方法を示す図である。

工程１では、心膜を屠殺場で豚から除去し、殺菌した等張塩化ナトリウム溶液（９ｇ／Ｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）に摂氏４度で２時間貯蔵する。殺菌するため、前記溶液には、塩化ナトリウムの他にペニシリンおよび／またはストレプトマイシンが含まれている。

工程２では、組織を塩化ナトリウム溶液（９ｇ／Ｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）中で湿らせ、調製する。つまり、心膜の層を互いに分離させ、付着している脂肪組織や結合組織を注意して除き、組織を応用例に適したサイズおよび形状に切断する。

工程３の組織を軽く動かしながら塩化ナトリウム溶液（９ｇ／Ｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）で洗浄した後、該組織を工程４で脱細胞化する。

工程４における脱細胞化は、サーファクチン入りの緩衝液を含む洗浄剤を使って行う。この本発明の例示的実施形態では、６００ｍｇ／Lの濃度を有するサーファクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、枯草菌由来のサーファクチン、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｆ３５２３）をＤＰＢＳリン酸緩衝液（Ｌｏｎｚａ；ＤＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋；Ａｒｔ．Ｎｏ．１７−５１２）に溶解する。前記組織を摂氏３７度で２０時間、該洗浄液中に保持する。次に、前記組織を洗浄し、コラーゲン繊維の構造を実質的に変化させることなく、中に含まれる細胞成分のほぼ全てを除去する。

工程５、６、７では、前記脱細胞化された組織を無菌液中で充分にリンスする。工程５では、１００ｍＬ塩化ナトリウム溶液（９ｇ／Ｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）中、室温で、前記組織を軽く動かしながらリンスする。この本発明の例示的実施形態では、工程５は１０分間行い、８回繰り返す。次に、工程６で、７０％エタノール溶液１００ｍＬを用いて、摂氏３７度で１０分間、前記組織をリンスする。工程７では、前記組織を軽く動かしながらもう一度１００ｍＬ塩化ナトリウム溶液（９ｇ／Ｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）でリンスする。

工程８では、コラーゲン繊維を架橋剤で架橋する。この本発明の例示的実施形態では、グルタルアルデヒドを含むｐＨ７．４の溶液中に、摂氏４度で４８時間、前記組織を放置する。前記グルタルアルデヒドを含む溶液は、カルシウム／マグネシウムを含まないＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ；ＤＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋；Ａｒｔ．Ｎｏ．１７−５１２）に６ｇ／Ｌの濃度のグルタルアルデヒドを含んでいる。

工程９は、工程８を室温で繰り返す。工程９は１４日間行い、溶液は４８時間毎に置き換える。

工程１０の洗浄プロセスの後、前記組織はグルタルアルデヒド中に保存してもよいが、工程１１で更に処理してもよい。工程１０では、この発明の例示的実施形態における前記組織は、軽く動かしながら１００ｍＬ塩化ナトリウム溶液（９ｇ／Ｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ）を用いて、室温で２０分間、リンスする。

本明細書記載の例示的実施形態は、本発明を明確にするためのものである。リンス工程の番号および／または設計（特に洗浄用溶液または緩衝液の濃度および組成）は、当業者により適切な方法で変更可能である。

Claims (9)

1. 医療用の組織を調製する方法、特に人工心臓弁に使用する組織の調製方法において、少なくとも以下の工程：
   ・適切な洗浄剤で組織を脱細胞化することと、その後、
   ・適切な架橋剤で組織のコラーゲン繊維を架橋することと、を含み、前記脱細胞化用の洗浄剤は、両親媒性を有する少なくとも一つのリポペプチドであって、親水性の基礎構造と疎水性の側鎖とを包含するリポペプチドを含んでなる、ことを特徴とする、方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記脱細胞化用の洗浄剤は、環状リポペプチド、特にサーファクチンを含んでなる、ことを特徴とする、方法。
3. 請求項１または２に記載の方法において、前記洗浄剤は、サーファクチン、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチン、エキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチドおよび／またはポリミキシンを含んでなる、ことを特徴とする、方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法において、前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドアセタル、アシルアジド、シアンイミド、ゲニピン、タンニン、ペンタガロイルグルコース、フィチン酸塩、プロアンソシアニジン、ロイテリンおよび／またはエポキシド化合物を含んでなる、ことを特徴とする、方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、前記組織は、脱細胞化の前および／または後に、適切な溶媒、特に緩衝生理食塩溶液および／またはアルコール溶液で少なくとも一度リンスされる、ことを特徴とする、方法。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、前記洗浄剤は、１００ｍｇ／Ｌから２０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５００ｍｇ／Ｌから７００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは６００ｍｇ／Ｌの濃度を有する少なくとも一つのリポペプチド特にサーファクチンを包含する緩衝液、特にリン酸緩衝液を含んでなる、ことを特徴とする、方法。
7. 生物組織、特に心臓弁プロテーゼ用生物組織の前記脱細胞化用洗浄剤として、両親媒性を有し、親水性の基礎構造と疎水性の側鎖とを包含する少なくとも一つのリポペプチドを含んでなる溶液の使用。
8. 請求項７に記載の使用において、前記溶液が、サーファクチン、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチン、エキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチドおよび／またはポリミキシンを含んでなる、ことを特徴とする、使用。
9. 請求項８に記載の使用において、サーファクチン、ダプトマイシン、カスポファンギン、アルスロファクチンおよび／またはエキノカンジン、イツリン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチドポリミキシンが、緩衝液、特にリン酸緩衝液に溶解される、ことを特徴とする、使用。