JP2014528921A - Ｔｒｐｃ６関連疾患の治療に使用するための二環式ラブダンジテルペン - Google Patents

Abstract

本発明は、一過性受容器電位陽イオンチャネル６（ＴＲＰＣ６）の活性化に関連する疾患、好ましくは肺疾患または腎疾患の処置に使用するための二環式ラブダンジテルペンに関する。一態様において、本発明は、ＴＲＰＣ６によるカルシウム輸送を遮断するための二環式ラブダンジテルペンの使用に関する。本発明の別の一態様は、薬物として使用するための、式（１）［式中、Ｒ１は、水素およびＣ１からＣ４アシルから選択され、二環式ラブダンジテルペンは、１位と２位、２位と３位、５位と６位、６位と７位、および／または１４位と１５位の炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合を場合により含み、１、２、３、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０位の炭素原子は水素原子に接続しており、または少なくとも１つの置換を含む］による二環式ラブダンジテルペンである。

Description

本発明は、ＴＲＰＣ６関連疾患、特に肺高血圧症、慢性肺閉塞、アレルギー起源の閉塞性気道疾患、急性呼吸窮迫症候群、または腎疾患の治療に使用するための二環式ラブダンジテルペンに関する。

一過性受容器電位陽イオンチャネル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ：ＴＲＰＣ）タンパク質は、細胞表面受容体およびホスホリパーゼＣに依存性の機序において活性化される、原形質膜に常在するＣａ^２＋透過性陽イオンチャネルである。ＴＲＰＣチャネルは、これら生理学的活性化機序のほかに、膜透過性ジアシルグリセロール、天然化合物（ヒペリシン）、ランタニド、酸性条件、または物理的伸展を含めた、いくつかの他のキュー（ｑｕｅｕｅ）によって活性化され、または正に調節され得る。ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６、およびＴＲＰＣ７からなる遺伝的に密接に関係するサブグループは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）によって直接活性化されるという独特の性質を共有する。ＴＲＰＣ６、ならびに最もこれに近い類縁体であるＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ７は、セカンドメッセンジャー依存性の、選択性の不十分な陽イオンチャネルである。ＴＲＰＣチャネルの発現は広範にわたるが、イソ型間で異なる。

正準のＴＲＰＣチャネルのＴＲＰＣ６イソ型は、最近、低酸素誘発性肺血管収縮（ＨＰＶ）などの肺疾患、および巣状分節性糸球体硬化症などの腎疾患（ＦＳＧＳ；ＵＳ ２００８／００３８３６５ Ａ１（特許文献１））における中心的存在として同定されている。さらに、ＴＲＰＣ６の調節不全は特発性肺動脈高血圧症の説明となることが示唆されており、ＴＲＰＣ６の決定的な役割は、慢性閉塞性およびアレルギー性の気道疾患において提唱されている。低酸素または急性肺傷害の間の肺浮腫の発症は、ＴＲＰＣ６依存性の過程によって部分的にひきおこされると記載されている。それゆえ、ＴＲＰＣ６チャネルの遮断は、様々な疾患の治療に適用可能である。

今日まで、肺高血圧症に対して様々な治療が提唱されている。肺血管収縮に対抗するには、エンドセリン受容体アンタゴニスト、一酸化窒素（ＮＯ）ガス、またはＮＯ放出性化合物、およびホスホジエステラーゼ阻害物質が利用できる。エンドセリン受容体アンタゴニストは、１クラスのＧタンパク質共役受容体の効果を遮断することができるにすぎず、他の血管収縮薬に対する反応は依然として影響を受けない。代替の戦略は、ＮＯ感受性可溶性グアニリルシクラーゼによるｃＧＭＰ形成の増大、またはＰＤＥ５ファミリーのｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの遮断によるｃＧＭＰの分解の阻止のいずれかによって、環状グアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルに集中している。

さらに、中国の薬用植物であるラブドシア・ルベセンス（Ｒａｂｄｏｓｉａ ｒｕｂｅｓｅｃｅｎｓ）に由来する三環ジテルペンであるオリドニンのプラス効果が、肺高血圧症の治療に対して記載されている（Ｗａｎｇ、２００９年）。当技術分野において、オリドニンは、肺動脈圧を効果的に低下させ、ミトコンドリア依存性の経路により平滑細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｃｅｌｌ）のアポトーシスを誘発することによって肺動脈構造のリモデリングを阻害することができると記載されている。

肺のＴＲＰＣチャネルを阻害することで、セカンドメッセンジャー依存性陽イオンチャネルによってもたらされる別の一クラスの薬理学的標的分子がもたらされ、これにより様々な血管収縮薬の反応のインプットが一体化される。

しかし、個々のＴＲＰＣタンパク質は密接に関係した構造を共有している。哺乳動物の７種のＴＲＰＣチャネル内では、より密接に関係するイソ型のサブファミリーが識別可能である。ＴＲＰＣ１／ＴＲＰＣ４／ＴＲＰＣ５サブファミリーおよびＴＲＰＣ３／ＴＲＰＣ６／ＴＲＰＣ７サブファミリーは、それぞれのメンバー内で約４０〜６５％のアミノ酸同一性を共有するが、サブファミリーをまたがるとアミノ酸同一性は２１〜２８％にすぎない。同様に、ヘテロマーのチャネル複合体を形成する可能性は、系統的および構造的により密接に関係するメンバーのサブファミリー内では、明らかにより顕著である。ＴＲＰＣタンパク質間に密接な関係があるため、ＴＲＰＣファミリーのメンバーの標的化を目標とする治療的適用には、ＴＲＰＣの個々のメンバーの選択的阻害薬を提供しなければならない。

ＵＳ ２００８／００３８３６５ Ａ１（特許文献１）は、肺血管収縮および巣状分節性糸球体硬化症の治療のための、２−アミノジフェニルホウ酸（２−ＡＰＢ）、ＳＫＦ−９６３６５、またはガドリニウム陽イオンなどの合成のＴＲＰＣチャネル阻害薬を開示している。

ＷＯ２００９／０５９７２ Ａ２（特許文献２）は、ＴＲＰＣ３／ＴＲＰＣ６／ＴＲＰＣ７サブファミリーの阻害薬としてノルゲスチメート、ならびに腎疾患および肺疾患の治療におけるその治療的適用を開示している。ＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ７に比べたＴＲＰＣ６に対する選択性は実現されていない。

ＷＯ２００６／７０７４８０２ Ａ１（特許文献３）は、不活性な、またはドミナントネガティブなＴＲＰＣ６のサブユニットでのＴＲＰＣ６の選択的阻害を開示している。しかし、当技術分野において、ＴＲＰＣ３／ＴＲＰＣ６／ＴＲＰＣ７サブファミリーのタンパク質のサブユニットは、ヘテロマー複合体を形成することによって集合することが知られている。不活性なまたはドミナントネガティブなＴＲＰＣ６のサブユニットで治療をすると、それによって、ＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ７も阻害し得る。

したがって、治療的適用のための、個々のイソ型またはサブグループのＴＲＰＣイソ型の活性を調節する選択的遮断薬を提供する必要性がある。

ＵＳ ２００８／００３８３６５ Ａ１ ＷＯ２００９／０５９７２ Ａ２ ＷＯ２００６／７０７４８０２ Ａ１

Ｗａｎｇ ２００９年：Ｗａｎｇ ＬＸ、Ｓｕｎ Ｙ、Ｃｈｅｎ Ｃ、Ｈｕａｎｇ ＸＹ、Ｌｉｎ Ｑ、Ｑｉａｎ ＧＱ、Ｄｏｎｇ Ｗ、Ｃｈｅｎ ＹＦ．Ｃｈｉｎ、Ｍｅｄ Ｊ （Ｅｎｇｌ）．、２００９年１月２０日；１２２巻（１２）：１３８０〜７頁

本発明の目的は、肺高血圧症などのＴＲＰＣ６関連疾患の処置に治療的に適用可能なＴＲＰＣ６の選択的遮断薬を提供することである。

この目的は、一過性受容器電位陽イオンチャネル６（ＴＲＰＣ６）によるカルシウム輸送を遮断するための二環式ラブダンジテルペンの使用によって解決される。

本発明者らは、二環式ラブダンジテルペン、特に、構造的にラリキソールに関係するラブダンジテルペンが、ＴＲＰＣ６に対する選択的阻害薬として作用することを見出した（図１）。二環式ラブダンジテルペンはＴＲＰＣ６に選択的に結合し、構造的に関係するそのサブファミリーメンバーであるＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ７に対して結合の著しい低減を示す。誘発マウスモデルにおいて、二環式ラブダンジテルペンは低酸素誘発性肺血管収縮（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）（ＨＰＶ）の強力な阻害薬であることが実証され得る（図４）。二環式ラブダンジテルペンは、ＴＲＰＣ６の選択的阻害薬であり、ＴＲＰＣ６の活性化に関連する疾患の治療的処置に適用可能である。

したがって、本発明の別の一態様は、ＴＲＰＣ６の活性化に関連する疾患、好ましくは肺疾患または腎疾患の治療に使用するための二環式ラブダンジテルペンである。治療（または治療する）の語は、臨床症状が検出され得る前にＴＲＰＣ６遮断薬を適用することによってこれらの疾患を予防することを含む。具体的には、ＴＲＰＣ６を発現する細胞型および組織に関与する肺疾患および腎疾患は、ＴＲＰＣ６遮断薬で優先的に標的化される。治療される特定の肺疾患には、特発性または二次性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性気道疾患、肺浮腫、特に、虚血再灌流関連肺浮腫、肺移植後の肺血管収縮、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれる。ここで、ＴＲＰＣ６の活性化または過剰発現により病態生理学的プロセスに寄与する主要な細胞型には、肺の大血管および小血管における血管平滑筋細胞、気道の平滑筋細胞、ならびにＴＲＰＣ６を発現し、病理学的な設定において炎症反応を増強する免疫細胞がある。

治療される特定の腎疾患は、巣状分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、糸球体腎炎の微小変化、または子癇前症腎症であり、巣状分節性糸球体硬化症が特に好ましい。腎臓において、有足細胞におけるＴＲＰＣ６の活性または発現の調節不全は、有足細胞の機能不全を引き起こし、巣状分節性糸球体硬化症の発症をもたらす。

ラブダンジテルペンは、以下の式（５）による二環コア構造を共有する天然のジテルペン類である。このコア構造に基づいて、二環、三環、四環、または多環ジテルペン構造が形成される。

本発明によれば、二環構造を有するラブダンジテルペンを使用する。これら二環式ラブダンジテルペンが針葉樹から単離されるのが好ましい。

ラブダンジテルペンの個々の群の治療的使用は、ＤＥ １９８ ５３ ４７６ Ａ１において、プロラクチンを低減する薬剤において記載されている。これら薬剤は、月経前症候群の治療に適用可能である。しかし、ラリキソールに関係する二環式ジテルペンの治療的使用は記載されていない。

それゆえ、本発明の別の一態様は、好ましくは、肺疾患または腎疾患（特に好ましくは上記に記載した通り）の治療に使用するための、医薬として使用するための式（１）による二環式ラブダンジテルペンである。

本発明によると、式（１）において、Ｒ_１は、水素およびＣ_１〜Ｃ_４アシル、好ましくは水素またはＣ_１〜Ｃ_３アシル、より好ましくは水素またはＣＯＣＨ_３から選択される。本発明によると、式（１）による二環式ラブダンジテルペンは、１位と２位、２位と３位、５位と６位、６位と７位、および／または１４位と１５位の炭素原子の間に、好ましくは少なくとも１４位と１５位の炭素原子の間に、少なくとも１つの二重結合を場合により含む。本発明によると、１、２、３、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０位の、好ましくは１、２、３、７、１３、１７、１８、１９、もしくは２０位の、特に好ましくは１、２、３、７、もしくは１３位の炭素原子は水素原子に接続しており、または少なくとも１つの置換を含む。最大５個の、より好ましくは最大３個の前述の炭素原子が置換を含むのが好ましい。１、２、３、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０位の好ましい置換は、ハロゲンまたは−ＯＲ_２から選択され、Ｒ_２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アシルであり、好ましくは水素またはＣ_１〜Ｃ_３アシルであり、より好ましくは水素またはＣＯＣＨ_３である。１、２、３、または７位の好ましい置換はケト基である。

式（１）における二環式環構造が、好ましくは１位と２位、２位と３位、５位と６位、６位と７位の間に位置する環構造内に少なくとも１つの二重炭素結合を含むのが好ましい。

ラリキソールに関係する二環式ラブダンジテルペンは、式（１）における８位と１７位の炭素原子の間の二重結合、および６位の炭素原子の酸素含有置換ＯＲ_１を特徴とする。医薬として使用するための二環式ラブダンジテルペンが、１４位と１５位の炭素原子の間に二重結合を含むのが好ましい。医薬として使用するための二環式ラブダンジテルペンは、１３位の炭素原子に−ＯＲ_２の構造を有する官能基を含むのが好ましく、Ｒ_２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アシル、好ましくは水素またはＣ_１〜Ｃ_３アシル、より好ましくは水素またはＣＯＣＨ_３である。

特に好ましい二環式ラブダンジテルペンは、以下の式（２）を特徴とする：

式（２）において、Ｒ_１およびＲ_２は、互いに独立に、水素およびＣ_１〜Ｃ_４アシル、好ましくは水素またはＣ_１〜Ｃ_３アシル、より好ましくは水素またはＣＯＣＨ_３から選択される。残りのＲ_１およびＲ_２が同一であるのが好ましい。式（２）による特に好ましい二環式ラブダンジテルペンにおいて、式（１）に記載した、任意選択による二重結合、置換、および置き換えが含まれる。好ましくは、式（２）による二環式ラブダンジテルペンは、１位と２位、２位と３位、５位と６位、および／または６位と７位の炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合を場合により含み、場合により１、２、３、７、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０位の、好ましくは１、２、３、７、１７、１８、１９、もしくは２０位の、特に好ましくは１、２、３、もしくは７位の炭素原子は水素原子に接続しており、または少なくとも１つの置換を含む。１、２、３、７、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０位の好ましい置換は、ハロゲンまたは−ＯＲ_２から選択され、Ｒ_２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アシルであり、好ましくは水素またはＣ_１〜Ｃ_３アシルであり、より好ましくは水素またはＣＯＣＨ_３である。１、２、３、または７位の好ましい置換はケト基である。式（２）の前述の炭素原子最大３個が、Ｈ以外の置換を含むのが好ましい。

特に好ましい二環式ラブダンジテルペンは、式（３）ならびに（４ａ、ｂ、およびｃ）をそれぞれ特徴とするラリキソールおよび酢酸ラリキソールである：

本発明の別の一態様は、治療有効量の二環式ラブダンジテルペン、好ましくは、上記に規定した通りの、好ましいラリキソールに関係する二環式ラブダンジテルペンを患者に投与するステップを含む、疾患を治療する方法である。本発明による方法で治療するのが好ましい疾患は、ＴＲＰＣ６の活性化に関連する疾患であり、特に好ましくは肺疾患または腎疾患である。本発明による好ましい一方法において、二環式ラブダンジテルペンを、経口的に、吸入器によってまたは非経口的に、好ましくは治療する疾患に応じて投与する。

本発明のさらなる一態様は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、二環式ラブダンジテルペン、好ましくは上記に規定したラリキソールに関係する二環式ラブダンジテルペンを含む医薬組成物である。

本発明による医薬組成物は様々な剤形を含み、経口、吸入または非経口に好ましく、特に好ましくは静脈内投与に適する。非経口医薬組成物が注射に適する形態であるのが好ましい。特に好ましい医薬組成物は、二環式ラブダンジテルペンの、薬学的に許容可能な担体における、液剤、乳剤、または懸濁剤である。薬学的に許容可能な担体は、好ましくは、無菌の液体、特に水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどである。医薬組成物は、慣例的な、よく知られている技術によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件を保証することが要求されるもの、および／または含まれる二環式ジテルペンの安定性を増大するものなど、薬学的に許容可能な補助物質を含むのが好ましい。好ましい補助物質は、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムから選択されるのが好ましい、ｐＨを調整するための薬剤および緩衝剤である。

ＴＲＰＣ６によるカルシウム輸送を遮断するための二環式ラブダンジテルペンの使用は、ＴＲＰＣ６活性化に関連する疾患に罹患している患者の治療などによる、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで生じ得る。好ましいｅｘ ｖｉｖｏ使用では、二環式ラブダンジテルペンは、単離された組織の貯蔵または灌流に使用する保存溶液に有効成分として含まれる。本明細書で使用する用語「組織」には、単離された組織、および単離された完全な器官が含まれる。それゆえ、本発明の別の一態様は、組織の貯蔵および／または灌流用の、上記に規定した通りの、好ましい二環式ラブダンジテルペン、好ましくはラリキソールに関係する二環式ラブダンジテルペンを含む水溶液（保存溶液）、好ましくは生理学的溶液の使用である。好ましい一実施形態において、外植した組織を、保存溶液と一緒に貯蔵し、かつ／または灌流して、再灌流時の肺血管収縮を防ぐ。再移植の前に、二環式ラブダンジテルペンを含む保存溶液を、好ましくは除去し、二環式ラブダンジテルペンを含まない生理学的溶液によって置き換える。

本発明は、ＴＲＰＣ６によるカルシウム流入を選択的に遮断し、したがって、ＴＲＰＣ６関連疾患を有する患者の治療的処置に適用可能である新しいクラスのＴＲＰＣチャネル阻害薬を提供する。二環式ラブダンジテルペンはＴＲＰＣ６を選択的に遮断し、構造的に密接に関係するサブファミリーメンバーであるＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ７によるカルシウム流入は阻害しない。二環式ラブダンジテルペンは天然化合物である。細胞毒性効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの実験において評価されなかった。

本発明を、以下の図面および例によってさらに説明するが、これらに限定されない。

様々なイソ型の一過性受容器電位陽イオンチャネル（ＴＲＰＣ）を遮断する、ラリキソールおよび酢酸ラリキソールの選択性。ヒトＴＲＰＣ６、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＡ１、およびマウスＴＲＰＣ６に対する結合の比較により、ＴＲＰＣ６に対する選択的結合が示される。ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭ２、およびＴＲＰＭ３などの他の一過性受容器電位陽イオンチャネルは、ラリキソールおよび酢酸ラリキソールによる影響を受けない。 酢酸ラリキソールは細胞の外側から作用する。Ａ：電気生理学的に全細の記録を行って、５０μＭ ＯＡＧでの直接刺激時に、またはＡｌＦ_４ ⁻（５０μＭ）を細胞内に適用してヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化することによって、ホスホリパーゼＣ活性化のトリガーにより内在性ジアシルグリセロールの形成をもたらすＴＲＰＣ６媒介性電流を決定した。チャネルタンパク質のサイトゾル側を酢酸ラリキソールに暴露するために、酢酸ラリキソールを細胞内溶液に加えた（斜線バーおよび黒抜きバー）。酢酸ラリキソールを含まない対照溶液（白抜きバー）を並行して測定した。酢酸ラリキソールに対する細胞内暴露（斜線バー）は、ＯＡＧまたはＡＬＦ_４ ⁻誘導性ＴＲＰＣ６活性化を抑制するのに十分ではなかったが、浴溶液に適用した酢酸ラリキソールは（「外側」；黒抜きバー）チャネル活性を効果的に遮断した。Ｂ：浴溶液によって与えた場合の酢酸ラリキソールによるＴＲＰＣ６活性の遮断を実証するオリジナルの記録の例。 ラリキソールおよび酢酸ラリキソールは、ＨＥＫ２３９細胞に対して細胞毒性効果を示さない。細胞の完全性を、ＤＮＡ結合性蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の排除によって決定した。 酢酸ラリキソールによる、低酸素誘発性肺血管収縮（ＨＰＶ）の阻害。単離した、灌流したマウスの肺において、低酸素ガスで換気すると、肺動脈圧（ＰＡＰ）の上昇がもたらされるが、これは灌流溶液に酢酸ラリキソール５μＭを加えた場合に完全に抑制される。 酢酸ラリキソールによる、虚血−再灌流に関連する肺浮腫の形成の阻害。ウサギの肺を外植し、Ｐｅｒｆａｄｅｘ溶液で体外灌流し、酸素供給（ｏｘｙｇｅｎｉｚｅｄ）条件下（白丸）または低酸素条件下（黒丸）で換気した。次いで、肺を氷上に２時間配置し、タイロード溶液で９０分間再灌流した。上パネル：酢酸ラリキソールなしでの対照実験、下パネル：Ｐｅｒｆａｄｅｘ（登録商標）および５μＭ酢酸ラリキソールを補ったタイロード溶液での同様の実験。肺の湿重量における増加は、浮腫の形成を示す。示したデータは、各処置群に対し６つの個々の実験の平均値およびＳ．Ｅ．Ｍ（平均値の標準誤差）を示す。

例１：ＴＲＰＣ発現性ＨＥＫ２９３細胞の作成
ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）細胞を、１０Ｖｏｌ．％ウシ胎仔血清、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を３５ｍｍ培養皿に播種し、２４時間増殖させ、８０％コンフルエンスで、無血清培地１００μｌ中Ｃ末端がＹＦＰでタグ付されたヒトＴＲＰＣ６をコードするプラスミドＤＮＡ２μｇおよびＦｕｇｅｎｅＨＤ試薬（Ｒｏｃｈｅ）４μｌをトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたＨＥＫｈＴＲＰＣ６−ＹＦＰクローンを選択するために、１ｍｇ／ｍｌジェネテシン（Ｇ４１８）を培地に加えた。限外希釈法によって単一のクローンを得、倒立型落射蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して光学制御し、均一な蛍光を示したクローンを手動で選定した。機能発現を確証するために、異なるクローンを単離し、単一細胞［Ｃａ^２＋］_ｉ画像化実験（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ［Ｃａ^２＋］_ｉ ｉｍａｇｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって試験した。同手順をやはり適用して、他のＴＲＰチャネル構築物を発現する細胞株を作成した。以下の細胞株を作成した：

例２：ＴＲＰチャネル構築物に対するラリキソールおよび酢酸ラリキソールの阻害作用の評価
ＴＲＰチャネルによるカルシウム輸送に対する二環式ラブダンジテルペンの効果を評価するために、ラリキソールおよび酢酸ラリキソールを、例１からの細胞株に加えた。懸濁液中［Ｃａ^２＋］_ｉにおける増加を決定することによって、それぞれのＴＲＰチャネルの遮断を決定した。ＴＲＰチャネルを活性化するために、それぞれのチャネルの活性化物質を加え、細胞内にロードしたｆｌｕｏ−４の蛍光強度における変化を、マルチウェルプレートリーダー装置（Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で決定した。ＨＥＫｒＴＲＰＶ１細胞に対して、同時発現されるＹＦＰの蛍光の減少をもたらす細胞内酸性化をモニタリングすることによって、活性化の評価を行った。

１３２ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５．５ｍＭグルコース、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整したＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）中で以下の実験を行った：
着色した、底面の透明な３８４ウェルスクリーニングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）にＨＢＳをあらかじめ満たし（２６μｌ／ウェル）、ラリキソールおよび酢酸ラリキソールの段階希釈溶液（０．０１μＭ〜２０μＭの最終濃度を実現するように４μｌ／ウェル）を加えた。例１からのＴＲＰチャネルを発現するＨＥＫ２９３細胞をコンフルエンスに増殖させ、０．２５％トリプシンで剥離し、４μＭ ｆｌｕｏ−４／ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補った培地中３７℃で３０分間ロードした。細胞を洗浄し（１００×ｇ、３分）、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＨＢＳ中に再懸濁し、細胞数を１０００細胞／μｌに調整した。細胞懸濁液（１０μｌ／ウェル）を、調製したスクリーニングプレート中に分散させて、最終濃度の試験化合物を得た。

マルチウェルプレートリーダー（Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）中、繰返しのオンザフライ（ｏｎ−ｔｈｅ−ｆｌｙ）プレートスキャニングモードを適用し、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで蛍光を検出した。プレートを、各１９２ウェルの２群においてスキャンした。１０回のベースラインサイクルの後、最終濃度５０μＭでＯＡＧを注射した。全ての実験において、細胞内にロードした［Ｃａ^２＋］_ｉ指示色素から生じた蛍光シグナルに比べて、タグ付したｈＴＲＰＣ６−ＹＦＰの蛍光は無視できるものであった（＜１％）。主に適合した、または記録された化合物の濃度−反応曲線を作成するために、段階希釈の化合物を各々２回ずつ試験した。ＴＲＰＣ６を、ＯＡＧで、またはカルバコール（１ｍＭ）、アデノシン−５’−三リン酸（３００μＭ）およびトロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）を含むＧＰＣＲアゴニスト過剰の混合物のいずれかで活性化した。可能な受容体拮抗作用の効果を避けるために、３つのアゴニストと組み合わせた刺激を適用した。ストア枯渇（ｓｔｏｒｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）から生じた［Ｃａ^２＋］_ｉシグナル、およびＴＲＰＣ依存性流入経路の［Ｃａ^２＋］_ｉシグナルを分離するために、細胞をタプシガルジンでプレインキュベートした後（２μＭで５分間）、アゴニストを注射した。ＧＰＣＲアゴニストを適用する時に、ＢＳＡをＨＢＳバッファーから除いた。特異性の試験において、化合物の濃度−反応曲線を、他のＴＲＰチャネルを過剰発現する細胞株において決定した。それぞれの活性化物質は、ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ７に対して５０μＭ ＯＡＧ、ＴＲＰＭ２に対して１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、ＴＲＰＡ１に対して１００μＭ ＡＩＴＣ、ならびにＴＲＰＶ１に対して２μＭカプサイシンであった。

試験の結果を図１に示す。ラリキソールおよび酢酸ラリキソールは、ＴＲＰＣ６によるカルシウム流入を選択的に阻害し、他のＴＲＰチャネルは阻害せず、またはほんの不十分に阻害する。

例３：酢酸ラリキソールによるＴＲＰＣ６阻害の機序の電気生理学的キャラクタリゼーション
ＴＲＰＣ６発現細胞をカバーガラス上に播種し、倒立顕微鏡のステージ上に搭載し、細胞内溶液を充填したホウケイ酸ガラスピペットと接触させた。ギガオームシールに到達した後、ピペットの陰圧を穏やかに適用することによって、ホールセル記録（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を得た。ホールセルの電流を、−６０ｍＶの保持電位の電圧固定モードにおいて測定し、電流振幅を細胞の静電容量によって除することによって細胞のサイズを標準化した（ｐＡ／ｐＦ）。浴溶液にＯＡＧを添加することによって、またはピペット溶液中に５０μＭ ＡｌＦ_４ ⁻を含めることによってのいずれかでＴＲＰＣ６を活性化した。ＴＲＰＣ６活性化の典型的な例を、図２Ｂに示す。

いくつかの実験において、ピペット溶液に１μＭ酢酸ラリキソールをさらに補って細胞内にモジュレーターを適用した（図２Ａ、「内側」）。１μＭ酢酸ラリキソールによる効果的な遮断は、しかしながら、浴溶液によって遮断薬を適用した場合に観察されたにすぎなかった（図２Ａ、「外側」、図２Ｂ）。

これらの実験は、酢酸ラリキソールは細胞外に暴露されたＴＲＰＣ６のドメインに対して結合し、細胞内シグナル伝達経路は酢酸ラリキソールでＴＲＰＣ６遮断を実行するのに必要とされないことを実証するものである。

例４：ＨＥＫ２９３細胞に対するラリキソールおよび酢酸ラリキソールの細胞毒性
ラリキソールおよび酢酸ラリキソールの可能な細胞毒性効果を評価するために、ヨウ化プロピジウム排除試験を行った。細胞を、２４ウェルプレート中１８時間増殖させ、次いで、指摘した化合物と一緒にさらに２４時間インキュベートした（図３）。ヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、蛍光（励起５４４ｎｍおよび検出６２０ｎｍ）を追跡した。最大の基準値を得るために、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をいくつかの試料に加えた後、ヨウ化プロピジウムを注射した。以下の対照を試験した。
− 陰性対照：ＨＢＳバッファー（「対照」）、または１０μＭラリキソールと同じ体積のＨＢＳバッファー中０，１％ＤＭＳＯを増殖培地に加えたもの（「０，１％ＤＭＳＯ」）。
− 陽性対照：２μｍスタウロスポリン、５０μｍジギトニン。
１０μＭまでの濃度では、細胞に対するラリキソールおよび酢酸ラリキソールの細胞毒性効果は認められなかった。

例５：酢酸ラリキソールによる低酸素誘導性肺血管収縮（ＨＰＶ）の阻害
酢酸ラリキソールのＴＲＰＣ６遮断作用はＨＰＶを予防するのに強力であるか否かを評価するために、酢酸ラリキソールをＨＰＶの誘発マウスモデルにおいて供給した。

麻酔したＣ５７ＢＬ／６成年オスマウスに気管開口術を施し、次いで従量式（ｖｏｌｕｍｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）正常酸素圧人工呼吸を行った。胸骨中線開胸術を行い、カニューレ（内径１ｍｍ）２本を肺動脈および左心房中にそれぞれ挿入した。次いで、肺を、ｐＨ７．４の、５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５％デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、一定流量の３７℃ハンクス平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で灌流した。インドメタシン（３０μＭ）およびＮ^Ｇ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（１ｍＭ）を灌流液に加えて、プロスタグランジンおよび一酸化窒素の内因性の合成を阻害した。Ｎ_２中２１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の正常酸素圧の混合ガスから、１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、バランスのＮ_２を含む低酸素混合ガスに切り換えることで、約４０％の肺動脈圧（ＰＡＰ）の上昇がもたらされた。このよく知られている反応は、「フォン・オイラー・リルエストランドのメカニズム（ｖｏｎ Ｅｕｌｅｒ−Ｌｉｌｌｊｅｓｔｒａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」とも呼ばれ、５μＭの酢酸ラリキソールを灌流溶液に加えた場合、完全に抑制された（図４）。

例６：酢酸ラリキソールによる再灌流傷害関連肺浮腫の形成の阻害
酢酸ラリキソール媒介性ＴＲＰＣ６遮断が、内皮の機能不全を予防することができるか否かを評価するために、酢酸ラリキソールの効果を、ウサギ肺移植モデルにおける肺浮腫形成に対して試験した。

ニュージーランドシロウサギを麻酔し、気管開口術を施した。動物を、室内気で人工呼吸した（４０呼吸・分^−１）。正中線開胸術によって胸部を開き、肺動脈および左心房にカニューレ挿入し、心臓−肺区画を切開し、サーモスタットで調節した人工の胸部チャンバー（ｔｈｏｒａｘ ｃｈａｍｂｅｒ）に移した。肺を、アルブミン含有タイロード溶液で簡単に灌流し、次いで酸素供給（室内気による通気）または低酸素（窒素ガス供給）いずれかの、５μＭ酢酸ラリキソールまたは対応する溶媒対照を補った、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（登録商標）溶液（５％デキストラン４０（ｗ／ｖ、分子量４０．０００）、Ｎａ^＋１３８ｍＭ、Ｋ^＋６ｍＭ、Ｍｇ^２＋０．８ｍＭ、Ｃｌ⁻１４２ｍＭ、ＳＯ_４ ^２−０．８ｍＭ、Ｈ_２ＰＯ_４ ⁻＋ＨＰＯ_４ ^２−０．８ｍＭ、およびグルコース５ｍＭ）で灌流した。次いで、灌流および換気を停止し、肺を氷上に４時間維持した。引き続き、５μＭ酢酸ラリキソールなし（対照の肺）またはありで、正常酸素圧の換気（室内気）およびタイロード溶液での灌流を再開して、移植の状況を擬した。全手順の間、肺の湿重量を記録した。低酸素処置を受けた肺における肺の湿重量の時間依存性の増加に注目されたい。Ｐｅｒｆａｄｅｘおよびタイロード溶液中に酢酸ラリキソールが含まれると、低酸素の処置条件下で肺の湿重量の増加が妨げられた（図５）。

引用した非特許文献
Ｗａｎｇ ２００９年：Ｗａｎｇ ＬＸ、Ｓｕｎ Ｙ、Ｃｈｅｎ Ｃ、Ｈｕａｎｇ ＸＹ、Ｌｉｎ Ｑ、Ｑｉａｎ ＧＱ、Ｄｏｎｇ Ｗ、Ｃｈｅｎ ＹＦ．Ｃｈｉｎ、Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ）．、２００９年１月２０日；１２２巻（１２）：１３８０〜７頁

Claims (14)

1. 医薬として使用するための、式（１）
   

   

   ［式中、Ｒ_１は水素およびＣ_１〜Ｃ_４アシルから選択され、場合により少なくとも１つの二重結合が、１位と２位、２位と３位、５位と６位、６位と７位、および／または１４位と１５位の炭素原子の間に存在し、１、２、３、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０位の炭素原子は、単結合によって水素原子に接続しているかまたは少なくとも１つの置換を含み、場合により１８、１９または２０位の炭素原子１個がＣＯＯＨによって置き換えられている］
   で表される二環式ラブダンジテルペン。
2. １、２、３、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０位の炭素原子の置換がハロゲンまたは−ＯＲ_２から選択され、Ｒ_２が水素もしくはＣ_１〜Ｃ_４アシルであり、かつ／または１、２、３または７位の少なくとも１つがケト基である、請求項１に記載の二環式ラブダンジテルペン。
3. 二重結合が１４位と１５位の炭素原子の間に存在する、請求項１または２に記載の二環式ラブダンジテルペン。
4. １３位の炭素原子が−ＯＲ_２で置換されている、請求項１〜３のいずれか一つに記載の二環式ラブダンジテルペン。
5. 式（２）
   

   

   ［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、互いに独立に、水素およびＣ_１〜Ｃ_４アシルから選択され、任意選択による置換が、請求項３または４のいずれか一つにおいて定義する通りに存在する］
   を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の二環式ラブダンジテルペン。
6. 二環式ラブダンジテルペンがラリキソールまたは酢酸ラリキソールである、請求項１〜５のいずれか一つに記載の二環式ラブダンジテルペン。
7. 肺疾患または腎疾患の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一つに記載の二環式ラブダンジテルペン。
8. 肺疾患が、特発性もしくは二次性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性気道疾患、肺浮腫、肺血管収縮または急性呼吸窮迫症候群であり、あるいは腎疾患が巣状分節性糸球体硬化症である、請求項７に記載の二環式ラブダンジテルペン。
9. 肺疾患または腎疾患の治療に使用するための、二環式ラブダンジテルペン。
10. 肺疾患が、特発性もしくは二次性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性気道疾患、肺浮腫、肺血管収縮または急性呼吸窮迫症候群であり、あるいは腎疾患が巣状分節性糸球体硬化症である、請求項９に記載の二環式ラブダンジテルペン。
11. 一過性受容器電位陽イオンチャネル６（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ６）によるカルシウム輸送を遮断するための、好ましくは請求項１〜６のいずれか一つに記載の二環式ラブダンジテルペンの使用。
12. 薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、請求項１〜６のいずれか一つに記載の二環式ラブダンジテルペンを含む医薬組成物。
13. 水性溶液の形態にある、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 貯蔵および／または組織の灌流用の保存溶液としての、好ましくは請求項１〜６のいずれか一つにおいて記載の二環式ラブダンジテルペンを含む水溶液の使用。

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