JP2014526904A - リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法 - Google Patents

リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2014526904A
JP2014526904A JP2014528515A JP2014528515A JP2014526904A JP 2014526904 A JP2014526904 A JP 2014526904A JP 2014528515 A JP2014528515 A JP 2014528515A JP 2014528515 A JP2014528515 A JP 2014528515A JP 2014526904 A JP2014526904 A JP 2014526904A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
activity
lysosomal
neu1
subject
level
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2014528515A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6228121B2 (ja
JP2014526904A5 (ja
Inventor
アヌンジャタ アイダ
ダッツォ アレサンドラ
ホワイト−ギルバートソン シャイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
St Jude Childrens Research Hospital
Original Assignee
St Jude Childrens Research Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Jude Childrens Research Hospital filed Critical St Jude Childrens Research Hospital
Publication of JP2014526904A publication Critical patent/JP2014526904A/ja
Publication of JP2014526904A5 publication Critical patent/JP2014526904A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6228121B2 publication Critical patent/JP6228121B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/40—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to mechanical, radiation or invasive therapies, e.g. surgery, laser therapy, dialysis or acupuncture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/005—Sugars; Derivatives thereof; Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/16—Serine-type carboxypeptidases (3.4.16)
    • C12Y304/16005—Carboxypeptidase C (3.4.16.5), i.e. carboxypeptidase Y
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)

Abstract

癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する認知症を含めての種々の疾患状態の予後、診断及び治療のための方法が提供される。ここに記載されている方法は、高レベルのシアリル化を有する種々の蛋白質が、癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する認知症の如き疾患状態と関連するという発見に基づく。このような方法は、リソソームエキソサイトーシス活性を示す１又は複数の値を含んで成るリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供する。低いリソソームシアリダーゼ活性が、種々の疾患状態に関連するという発見も提供される。したがって、本方法はまた、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含んで成るリソソームシアリダーゼ活性プロファイルも提供する。リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルの１例である。それ自体、リソソームエキソサイトーシス活性及び／又はリソソームシアリダーゼ活性のレベルは、癌、化学療法耐性又はアルツハイマー病に関連する認知症を診断及び／又は予測させることである。
【選択図】なし

Description

本発明は、分子生物学、癌並びにアルツハイマー病の治療及び診断に関する。
対象者の疾患または病的状態の予後は、早期診断により大きく改良されうる。しかしながら、頼りになる予後及び診断方法は、疾患状態を管理するために欠けている。例えば、アルツハイマー病に関し、唯一の決定的診断試験は、対象者の脳組織にアミロイドプラークが存在するか否かを決定することであり、この決定は死亡後にのみ行われうる。すなわち、適当な診断方法の欠如のため、取り敢えずの診断が提供されうるのみである。他の例において、癌の診断及び予後は結果を改良するための最良の治療の選択肢を選ぶために重要である。また、対象者のために最良の治療の選択肢を決定するための特定の化学療法の効果を予測するために、診断及び予後試験の必要性が存在する。
したがって、当業界においては、癌及びアルツハイマー病のための一層正確な、頼りになる診断及び予後方法の必要性が存在する。
連邦政府により後援された研究及び開発
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられたGM060950の下での連邦政府支持によりなされた。米国政府は、この発明について何らかの権利を有する。本発明はまた、セントジュード子どもリサーチ病院の米国・レバノン・シリア関連慈善事業（ALSAC）による支援も受けている。
EFS-WEBを介してテキストファイルとして提出される配列表への言及
情報交換のための米国標準コード（ASCII）に従って、423475SEQLIST.txt、2012年８月22日の作成日、及び13 KBのサイズをもって、配列表の公式コピーが、EFS-Webを介するテキストファイルとしてこの明細書と共に提出される。EFS-Webを介して提出される配列表は本明細書の部分であり、そして引用により本明細書に組み込まれる。
癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する認知症を含めての種々の疾患状態の予後、診断及び治療の方法が提供される。ここに提供される方法は、高レベルのシアリル化（sialylation）を有する種々の蛋白質が、癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する認知症の如き種々の疾患状態と関連することが示されるという発見に基づいている。これらの方法は、リソソームエキソサイトーシス（lysosomal exocytosis）活性を提示する１又は複数の値を含むリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供する。低いリソソームシアリダーゼ（lysosomal sialidase）活性が種々の病的状態と関連するという発見も提供される。従って、この方法はまた、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含む、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供する。リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルの１例である。それ自体、リソソームエキソサイトーシス活性及び／又はリソソームシアリダーゼ活性のレベルは、癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する認知症の診断及び／又は予後を予測させるものである。
図１は、癌におけるNEU1の役割の概略モデルを示す。 図２は、CSFにおけるリソソーム蛋白質の存在及びそれらの蛋白質とアルツハイマー病との相互関係を示す。
以後、本発明が、添付図面に言及しながら一層十分に記載され、当該図面においては、本発明の全ての態様ではなく幾つかの態様が示される。確かに、これらの発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、そして本明細書に記載される態様に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、それらの態様は、本明細書の開示が適用される法的要求を満たすために提供される。本明細書にわたって、同様な番号は同様な要素を意味する。
本明細書の記載される多くの態様及び他の態様は、以下の記載及び添付図面に示される教示を当業者の心に刻むためのものである。したがって、本発明は、開示される特定の態様に限定されるべきものではなく、そして変更及び他の態様も特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本明細書において特定の用語が使用されるが、それらは一般的そして記述的な意味で使用され、限定の目的で使用されるのではない。
Ｉ．概観
サンプル中のリソソームエキソサイトーシス活性に注目することによる、種々の疾患状態の診断及び予後の方法が提供される。リソソームエキソサイトーシス活性のレベルが、例えば、癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する痴呆を含めての種々の疾患状態の診断及び／又は予後のためにマーカーとして役立つことができる。癌、化学療法耐性、及びアルツハイマー病に関連する認知症の診断及び／又は予後のために、種々の活性プロファイルが提供される。
II．プロファイルの形態
本明細書で使用される場合、「プロファイル」は、サンプル中の活性を提示するマーカーの測定の対応する１又は複数の値を含む。本明細書中に、所与の疾患状態の予後及び／診断のために使用され得る種々のプロファイルが開示される。このようなプロファイルには、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイル、シアリル化活性化プロファイル、リソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、及びNEU1レベル活性プロファイルが含まれる。これらのプロファイルのそれぞれが、本明細書中に詳細に説明され、そして表１及び表２に要約される。
「リソソームエキソサイトーシス活性プロファイル」は、リソソームエキソサイトーシス活性を示す１又は複数の値のプロファイルを意味する。本明細書において使用される場合、「リソソームエキソサイトーシス活性」は、サンプル中のエキソサイトーシスのレベルの測定値を意味する。サンプルのリソソームエキソサイトーシス活性を決定するために種々のマーカーを使用することができる。そのようなマーカーには次の１又は複数が含まれる：
（１）NEU1蛋白質のレベル又はNEU1の直接酵素活性；
（２）１又は複数のNEU1基質の蛋白質レベル；
（３）１又は複数のリソソーム蛋白質の蛋白質レベル；
（４）１又は複数のリソソームプロテアーゼの蛋白質レベル；
（５）LAMP-1の蛋白質レベル；
（６）ヘキソサミニダーゼβの蛋白質レベル；
（７）マンノシダーゼαの蛋白質レベル；
（８）１又は複数のカテプシンの蛋白質レベル；
（９）本明細書に記載されるシアリル化活性プロファイルの任意のマーカー；あるいは
（10）本明細書に記載されるリソソームシアリダーゼ活性プロファイルの任意のマーカー。
所与のマーカーのそれぞれのレベルが一旦決定された後、それはリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルにおける値となる。リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルは、本明細書に記載する種々のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルマーカーの１，２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はそれより多くのリソソームエキソサイトーシス活性値を含むことができる。
１つの態様において、１つの形態のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルがシアリル化活性プロファイルである。「シアリル化活性プロファイル」は、シアリル化活性を表す１又は複数の値のプロファイルを意味する。本明細書で使用される場合、「シアリル化活性」は、サンプル中の蛋白質集団のシアリル化レベル、又はサンプル中の１又は複数の蛋白質のシアリル化レベルの測定値を意味する。シアリル化活性を決定するための種々のマーカーを使用することができる。そのようなマーカーには次の１又は複数が含まれる：
（１）サンプル中のシアリル化の全体レベル；
（２）NEU1蛋白質のレベル又はNEU1の直接酵素活性；
（３）１又は複数のNEU1基質のシアリル化のレベル；
（４）１又は複数のNEU1基質の蛋白質レベル；或いは
（５）本明細書において別途更に詳細に検討するように又は表１及び表２に要約するような、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルのための任意のマーカー。
所与のマーカーのそれぞれのレベルが一旦決定された後、それはシアリル化活性プロファイルにおける値となる。シアリル化活性プロファイルは、本明細書に記載する種々のシアリル化活性マーカーの１，２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はそれより多くのシアリル化活性値を含むことができる。
１つの態様において、１つの形態のシアリル化活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルである。「リソソームシアリダーゼ活性プロファイル」は、リソソームシアリダーゼ活性を表す１又は複数の値のプロファイルを意味する。「リソソームシアリダーゼ活性」はリソソームシアリダーゼ活性の直接測定値又は間接的測定値を意味する。サンプル中のリソソームシアリダーゼ活性を決定するために種々のマーカーを使用することができる。サンプル中のリソソームシアリダーゼ活性を表わす種々のマーカーには、下記の１又は複数のいずれかが含まれる：
（１）NEU1蛋白質のレベル又はNEU1の直接酵素活性のレベル；
（２）１又は複数のNEU1基質の蛋白質レベル；
（３）１又は複数のNEU1基質のシアリル化のレベル；或いは
（４）１又は複数のNEU1基質の活性化レベル。
所与のマーカーのレベル又は活性が一旦決定された後、それはリソソームシアリダーゼ活性プロファイルにおける値となる。したがって、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、本明細書に記載されるリソソームシアリダーゼ活性マーカーの任意の組合せを含むことができる。リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、本明細書に記載する種々のリソソームシアリダーゼ活性マーカーの１，２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はそれより多くのリソソームシアリダーゼ活性値を含むことができる。
１つの態様において、１つの形態のリソソームシアリダーゼ活性プロファイルはNEU1基質シアリル化活性プロファイルである。「NEU1基質シアリル化活性プロファイル」は、１又は複数のNEU1基質のシアリル化のレベルを決定することによるサンプル中のリソソームシアリダーゼ活性の測定値を意味する。NEU1基質シアリル化活性プロファイルに含まれるリソソームシアリダーゼ活性を示す種々のマーカーには下記のものが含まれる：
（１）１又は複数のNEU1基質のシアリル化のレベル；
（２）LAMP-1のシアリル化のレベル；
（３）MUC-1のシアリル化のレベル；或いは
（４）NEU1及びMUC-1のシアリル化のレベル。
NEU1基質シアリル化活性プロファイルは、種々のNEU1基質のシアリル化レベルにより提供される１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はそれより多くのマーカー値を含むことができる。
他の態様において、１つの形態のリソソームシアリダーゼ活性プロファイルはNEU1レベル活性プロファイルである。「NEU1レベル活性プロファイル」は、いずれかの非−MUC-1 NEU1基質又はNEU1それ自体の蛋白質レベルを決定することによるサンプル中のリソソームシアリダーゼ活性の測定値を意味する。NEU1レベル活性プロファイルに含まれるリソソームシアリダーゼ活性を示す種々のマーカーには下記のものが含まれる：
（１）NEU1蛋白質のレベル；
（２）任意の１又は複数の非−MUC-1 NEU1基質の蛋白質レベル；或いは
（３）LAMP-1の蛋白質レベル；
NEU1レベル活性プロファイルは、種々のNEU1基質の蛋白質レベルにより提供される１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はそれより多くのマーカー値を含むことができる。
所与のプロファイルに多数マーカーが存在する場合、本明細書に記載する予後及び／又は診断を生成するために対応する対照又は参照プロファイルにおけるマーカー値に比べて変化した活性を、すべてのマーカーが示さなければならないわけではない。幾つかの場合、診断及び／又は予後のために単一のマーカーの変化で十分である。他の態様においては、診断及び／予後のために、対応する対照又は参照プロファイルにおける値に比べて、所与のプロファイルにおける２、３、４、５、６、７、８、９、10又はそれより多くの値の変化で十分である。
III．種々の活性プロファイルのマーカーについての測定
本明細書に記載される診断及び／又は予後の方法は、サンプルを、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性及び／又はNEU1レベル活性について分析し、そしてそれを、対照サンプルからの、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性及び／又はNEU1レベル活性についての参照値と比較することに基づいている。サンプル中の蛋白質、シアリル化又は活性の「レベル」又は「量」を測定することは、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性又はNEU1レベル活性を、例えば蛋白質及び／又は蛋白質のシアリル化及び／又は蛋白質の活性の相対量又は絶対量を決定することにより定量化することを意味する。
本明細書に記載する方法の１つの観点は、サンプルの文脈において、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性及びNEU1レベル活性を決定するために測定することに関する。これらの測定は、サンプルのリソソームエキソサイトーシス活性プロファイル、シアリル化活性プロファイル、リソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル又はNEU1レベル活性プロファイルを作り上げる値を決定する。
本明細書において使用される場合、「サンプル」又は「対象サンプル」は、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性及び／又はNEU1レベル活性を決定することが望まれる任意のサンプルを含むことができる。「対象」は、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性及び／又はリソソームシアリダーゼ活性を決定することが望まれる任意の動物（すなわち哺乳類）、例えばヒト、霊長類、齧歯動物、農業用動物及び家庭用動物、例えば限定的ではないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが意図される。
サンプルは、注目の動物からの任意の細胞、組織又は生物学的流体に由来することができる。サンプルは、臨床的に意味のある組織、例えば限定的ではないが、骨髄、脳脊髄液、腫瘍剖検体、穿刺吸引物、又は体液のサンプル、例えば、血液、血漿、血清、リンパ、腹水、嚢胞液、又は尿を含むことができる。本明細書に記載される方法において使用されるサンプルは、測定形態、検出方法の種類、及びサンプルとして使用される組織、細胞又は抽出物により異なるであろう。
本明細書において使用される「参照」リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性及び／又はNEU1レベル活性は、対照サンプルにおいて提供される。「対照」又は「対照サンプル」は、対象サンプルのリソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性及び／又はNEU1レベル活性の変化を測定するための参照点を提供する。「対照」は、サンプルの群に基づいて予め決定される値であることができ、又は個々のサンプルに基づく単一値であることができる。
対照は、対象サンプルと平行して試験されるサンプルであることができる。対照サンプルは、例えば、
（ａ）健康な１又は複数の個人からの任意のサンプル；
（ｂ）同じ対象からの腫瘍に隣接する位置から採取される正常組織；
（ｂ）対象組織として同じ組織型から採取される１又は複数の健康な個人からの対象組織；
（ｃ）１又は複数の健康な個人から採取される血清又は血漿サンプル；
（ｄ）１又は複数の健康な個人から採取される脳脊髄液；或いは
（ｅ）１又は複数の健康な個人からの尿サンプル；
を含むことができる。
本明細書で使用する場合、所与のマーカー（すなわち、本明細書に記載する種々のマーカーのいずれか）について「高い」又は「増加した」レベルは、対照サンプルにおける対応するマーカーのレベルに比べての、サンプルにおけるマーカーのレベルのいずれかの有意な増加を意味する。所与のマーカーについての増加した又は高いレベルは、対照サンプルにおける参照レベルと比べて、少なくとも５％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、400％又はそれより多くのマーカーのレベルにおける、統計的に有意ないずれかの増加であることができる。
或いは、所与のマーカーについてのレベルの増加は、対照サンプルにおける参照マーカーのレベルに対する値の、少なくとも1.5倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、又はそれより多くの、任意の倍数の増加であることができる。幾つかの態様において、所与のマーカーのレベルの増加は、サンプルにおける特定の活性（すなわち、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性又はNEU1レベル活性）の増加であることができる。他の態様において、所与のマーカーのレベルの増加は、サンプルにおける特定の活性の減少をもたらすことができる。
本明細書で使用する場合、所与のマーカー（すなわち、本明細書に記載する種々のマーカーのいずれか）について「減少した」、「低い」又は「低下した」レベルは、対照サンプルにおける対応するマーカーのレベルに比べての、サンプルにおけるマーカーのレベルのいずれかの有意な減少を意味する。マーカーの低い又は低下したレベルは、対照サンプルにおける参照レベルと比べて、少なくとも５％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれより多くの、統計的に有意な減少を意味する。
或いは、所与のマーカーについてのレベルの減少は、対照サンプルにおける参照マーカーのレベルと比べて、少なくとも1.5倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、又はそれより多くの、任意の倍数の減少であることができる。幾つかの態様において、所与のマーカーのレベルの減少は、サンプルにおける特定の活性（すなわち、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性又はNEU1レベル活性）の減少であることができる。他の態様において、所与のマーカーのレベルの減少は、サンプルにおける特定の活性の増加をもたらすことができる。
表３及び表４は、本明細書に記載する種々の活性プロファイルについてのマーカーの非限定的な例を提供し、そしてマーカーの増加又は減少が、サンプルにおける活性（すなわち、リソソームエキソサイトーシス活性、シアリル化活性、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性又はNEU1レベル活性）の増加又は減少を反映するか否かを示す。
Ａ．リソソームエキソサイトーシス活性
１つの態様において、サンプルにおける１又は複数のリソソームエキソサイトーシス活性マーカーのリソソームエキソサイトーシス活性が与えられる。本明細書で使用する場合、「エキソサイトーシス」は、ベシクル膜（vesicular membrane）と外細胞膜（outer cell membrane）との融合により小胞に含まれる物質が細胞から放出される過程である。２つの形態のエキソサイトーシス、すなわち構成的（constitutive）エキソサイトーシス及び制御される（regulated）エキソサイトーシスが存在する。構成的エキソサイトーシスはカルシウムにより制御されず、他方制御されるエキソサイトーシスはカルシウムに依存する。
エキソサイトーシスは、小胞の動員（recruitment）、原形質膜への小胞の繋ぎ及び結合、並びにベシクル膜と原形質膜との融合、及びそれによる小胞の内容物の細胞外空間への放出を含む。エキソサイトーシスの間に、小胞は種々の成分を細胞外環境に放出する。分泌性小胞の成分幾つかの例には、限定的ではないが、酵素、プロテアーゼ、細胞外マトリクス成分、ホルモン、神経伝達物質、及び細胞毒性化合物が含まれる。
リソソームエキソサイトーシスは、エキソサイトーシスの１つの形態である。「リソソームエキソサイトーシス」は、リソソームがその内容物を細胞外空間に放出する過程を意味する。リソソームエキソサイトーシスは、原形質膜へのリソソームの動員（recruitment）及び結合、リソソーム膜と原形質膜との融合、及びそれによるリソソームルミナル（luminal）内容物の細胞外空間への放出を含む、カルシウム依存性の過程である。リソソーム内容物の幾つかの例には、限定的ではないが、酵素、例えばリパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ及びアミラーゼ、並びにリソソームの機能に関連する他の蛋白質、例えばシアリダーゼ及びリソソームエキソサイトーシスに含まれる蛋白質が含まれる。
幾つかの態様において、対象の例は、対照サンプルに比べて高い又は増加したリソソームエキソサイトーシス活性を有する。「高いリソソームエキソサイトーシス活性」又は「増加したリソソームエキソサイトーシス活性」は、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルにおける１又は複数のマーカーのレベルの統計的に有意な変化を意味する。表３及び表４は、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルのためのマーカーの非限定的な例を提供し、そしてマーカーの増加又は減少が、高いリソソームエキソサイトーシス活性を反映するか否かを示す。
１つの態様において、リソソームエキソサイトーシス活性の増加は、所与のプロファイルにおいて、対照サンプルに比べてのリソソームエキソサイトーシス活性マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又は全ての変更により示される。幾つかの場合において、１つのマーカーのリソソームエキソサイトーシス活性の変更が、診断及び／又は予後のために十分である。他の場合においては、２又はそれより多くのリソソームエキソサイトーシス活性マーカーの変更が、診断及び／又は予後のために十分である。
エキソサイトーシスマーカーのためにリソソームエキソサイトーシス活性を測定するための測定法がこの明細書において提供される。リソソームエキソサイトーシス活性の１つの測定は、サンプル中の蛋白質（すなわち、NEU1、NEU1基質又はリソソーム蛋白質）のレベルである。サンプル中の蛋白質を検出するための測定法の多様性は当業界において知られており、そして蛋白質の直接的及び間接的測定を含む。サンプル中の蛋白質の存在又は不存在或いは量を検出するための例示的方法は、サンプルを入手し、そして当該サンプルを、当該蛋白質に特異的に結合しそして検出することができる化合物又は剤と接触させて、サンプルにおいて蛋白質の存在が検出されるようにすることを含む。対象からのサンプルを用いて得られた結果は、対照である対象からの生物学的サンプルを用いて得られた結果と比較されよう。
１つの態様において、蛋白質を検出するための剤は、その蛋白質に特異的に結合することができる抗体である。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであることができる。抗体に関し、「標識された」なる用語は、当該抗体への検出可能な物質のカップリング（すなわち連結）による抗体の標識化、及び直接標識される他の試薬との反応による抗体の間接的標識化を含むことが意図される。間接的標識化の例には、蛍光標識された第二抗体を用いての第一抗体の検出が含まれる。
サンプル中の蛋白質のレベルは、特定の蛋白質のための抗体を用いる種々の測定法により定量的に測定することができる。これらには、例えば、免疫測定法、放射免疫測定法、酵素連結イムノソルバント測定法（enzyme-linked immunosorbant assays）及び二抗体サンドイッチ測定法が含まれる。定量的ウエスタンブロッティングもまた、蛋白質のレベルを決定するために用いることができる。ウエスタンブロットは、走査デンシトメーター法などのよく知られた方法により定量することができる。更に、抗体は、蛍光標識された抗体又は二次試薬を用いての蛍光及び共焦点顕微鏡法により、組織のサンプル中の蛋白質のレベルを検出及び定量するために用いることができる。
他の態様において、マーカーはサンプルのシアリル化のレベルである。サンプルにおけるシアリル化のレベルの測定法は本明細書の他の場所、例えばシアリル化活性の項において記載される。
更に他の態様において、マーカーは、サンプルにおける蛋白質活性のレベルである。本明細書に記載される任意の蛋白質についての蛋白質活性は、サンプル中の特定の蛋白質の活性を測定することにより測定することができる。例えば、蛋白質が酵素である場合、当該酵素の活性は、酵素活性測定法において測定することができる。酵素活性を測定するために、種々の測定法が当業界において知られている。例えば、サンプル中のNEU1酵素活性は、サンプルを、シアリル化されたNEU1基質と共にインキュベートし、そしてインキュベーション後にサンプル中に存在する遊離シアル酸の量を検出することにより測定することができる。それ自体、酵素活性の単位（すなわち蛋白質mg当たりの活性の量）を計算することができる。
Ｂ．シアリル化活性
１つの態様において、サンプルにおける１又は複数のシアリル化活性マーカーのシアリル化活性が提供される。この明細書において使用される場合、糖蛋白質又は糖脂質の末端部分にシアル酸が存在する場合、蛋白質又は脂質は「シアリル化されている」。「シアリル化」は、シアリル化される糖脂質の末端部分への叉は糖蛋白質のＮ−又はＯ−連結糖鎖へのシアル酸の移行を意味する。シアリル化は、それぞれ特定の糖基質についての特異性を有する多くの異なるシアリルトランスフェラーゼにより触媒され得る。
当業界において知られている非限定的なシアリルトランスフェラーゼの例には、例えば、シアリルトランスフェラーゼ、β−ガラクトサミドα−2,6−シアリルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−2,6−シアリルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシドα−2,3−シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルラクトサミニドα−2,3−シアリルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチル−ノイラミニドα−2,8−シアリルトランスフェラーゼ及びラクトシルセラミドα−2,3−シアリルトランスフェラーゼが含まれる。
シアリルトランスフェラーゼは、種々の連結によりシアル酸を基質に移送することができる。例えば、幾つかのシアリルトランスフェラーゼは、α−2,3結合によりシアル酸をガラクトースに付加し、他方、他のシアリルトランスフェラーゼは、α−2,6結合によりシアル酸をガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンに付加する。シアリルトランスフェラーゼの他の群は、α−2,8結合により、シアル酸を他のシアル酸に付加する。１つの態様において、シアル酸は、α−2,6結合により、糖蛋白質に付加される。他の態様においては、シアル酸は、α−2,3結合により、糖蛋白質に付加される。
１つの態様において、対象サンプルは、対照サンプルに比べて高い又は増加したシアリル化活性を有する。「高いシアリル化活性」又は「増加したシアリル化活性」は、シアリル化活性プロファイルにおける１又は複数のマーカーのレベルの統計的に有意な変更を意味する。表３及び表４は、シアリル化活性プロファイルについてのマーカーの非限定的な例を提供し、そしてマーカーの増加又は減少が高いシアリル化活性を反映するものであるかを示す。
１つの態様において、シアリル化活性の増加は、所与のプロファイルにおいて、対照サンプルに比べてのシアリル化活性マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はすべての変化により示される。幾つかの場合において、診断及び／又は予後のために１つのマーカーのシアリル化活性の変化で十分である。他の場合において、診断及び／又は予後のために２又はそれより多くのマーカーのシアリル化活性の変化が十分である。
サンプルにおけるシアリル化レベルを測定するための、種々の測定法が知られている。例えば、位置α−2,6で末端ガラクトースに結合したシアル酸に優先的に結合するサムブサス・ニグラ（sambuscus nigra）レクチン（SNA）と共にサンプルをインキュベートすることができる。シアリル化の他の測定法が当業界において知られており、そしてα−2,3結合により結合したシアル酸に結合するマチア・アムレンチス（Machia amurentis）レクチンの使用を含む。
１つの態様において、シアリル化活性は、サンプル中の蛋白質のグローバルなシアリル化を決定するために、蛋白質の集団についてシアリル化活性を測定することができる。例えば、この文脈において、シアリル化はレクチン結合測定法によりサンプルにおいて測定することができる。レクチン結合測定法は、ELISAに基づくものでもよく、又はゲルに基づくものであってもよい。他の態様において、単一蛋白質のシアリル化活性を測定することができる。この場合、ELISAに基づく又はゲルに基づくレクチン測定法を、注目の蛋白質に対する特異的抗体とカップリングすることができる。サンプルにおけるシアリル化のレベルを、測定における標準として既知の種々のシアリル化レベルのサンプルを用いて、定量することができる。
Ｃ．リソソームシアリダーゼ活性
１つの態様において、シアリル化活性はリソソームシアリダーゼ活性のレベルを含む。「シアリダーゼ」は、脱シアル化（desialylation）と称する過程により糖蛋白質から末端シアル酸を除去する酵素である。哺乳類においては、少なくとも４タイプのシアリダーゼが存在し、例えば、ノイラミダーゼ１（NEU1）、NEU2、NEU3及びNEU4が含まれ、これらは基質特異性及び細胞レベル下位置（subcellular localization）において異なる。例えば、NEU1はリソソームに局在し、そして糖蛋白質の如き基質から末端シアル酸を開裂させる。それ自体、NEU1は、サンプルの全体シアリル化活性に寄与する酵素である。
リソソーム中で、NEU1は、β−ガラクトシダーゼ及び保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）と一緒にヘテロ３量体複合体の部分である。NEU1複合体中のPPCAの存在がリソソーム中のNEU1を安定化する。NEU1は種々の基質を有する。本明細書で使用される場合、「NEU1基質」はNEU1により脱シアル化される任意の蛋白質である。NEU1の幾つかの非限定的例には、LAMP-1、カテプシンＡ、ムシン（mucin）（すなわち、MUC1）、カテプシンＤ、カテプシンＢ及びアミロイド前駆体蛋白質が含まれる。NEU1は、オリゴサッカライド、糖蛋白質及び糖脂質中の末端シアル酸残基のα2-3及びα2-6シアリル結合の加水分解を触媒する酵素である。例えば、糖蛋白質の脱シアル化は蛋白質の不安定化及び分解をもたらす。したがって、シアリダーゼ、NEU1は、糖蛋白質のターンオーバーに寄与する。
シアリダーゼとしての役割に加えて、NEU1は、リソソームエキソサイトーシスの構成的過程に関連効果を有する。本明細書の別のところに記載するように、リソソームエキソサイトーシスは、原形質膜へのリソソームの動員及び結合、リソソーム膜と原形質膜との融合、及び細胞外環境へのリソソーム内腔（luminal）内容物の放出を含む。前記動員及び結合段階は、リソソーム関連蛋白質１（lysosomal associated protein-1）（LAMP-1）により促進される。LAMP-1はNEU1基質であり、そしてそれ故に、LAMP-1の安定性及びターンオーバー速度はリソソームシアリダーゼ活性により影響される。
１つの態様において、対象サンプルは、対照サンプルに比較して低い又は低下したリソソームシアリダーゼ活性を有する。「低いリソソームシアリダーゼ活性」又は「低下したリソソームシアリダーゼ活性」は、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルにおける１又は複数のマーカーのレベルの統計的に有意な変化を意味する。表３及び表４は、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルのためのマーカーの非限定的な例を提供し、そしてマーカーの増加又は減少が低いリソソームシアリダーゼ活性を反映するか否かを示す。
１つの態様において、リソソームシアリダーゼ活性の減少は、所与のプロファイルにおいて、対照サンプルと比べての、リソソームシアリダーゼ活性マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はすべての変化により示される。幾つかの場合において、診断及び／又は予後のために１つのマーカーのリソソームシアリダーゼ活性の変化で十分である。他の場合において、診断及び／又は予後のために２又はそれより多くのシアリダーゼ活性マーカーの変化が十分である。
１つの態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、NEU1蛋白質のレベル又はNEU1の酵素活性により測定される。NEU1蛋白質のレベルを測定するための測定法は当業界においおてよく知られており、そしてサンプルをNEU1に対する抗体と接触させることを含む。更に、NEU1酵素活性は、サンプルにおいて直接に、シアリル化されたNEU1基質の存在下でサンプルのNEU1酵素活性を測定することにより測定され得る。すなわち、サンプルにおけるNEU1蛋白質及び／又は酵素活性レベルが低いか又は存在しない場合には、NEU1基質は脱シアル化されず又は低速で脱シアル化され、それにより基質のシアリル化の増加及び／又は基質の安定性の増加がもたらされ、そしてそれ故に、サンプルにおけるNEU1基質の蛋白質レベルの増加がもたらされるであろう。例えば、サンプル中にNEU1蛋白質が存在しない（すなわち、NEU1ノックアウト）条件下で、LAMP-1は過剰にシアリル化され、リソソームに蓄積し、原形質膜にリソソームを動員し、そして原形質膜へのリソソームの結合を促進する。このような場合、NEU1蛋白質／活性の喪失が、リソソームエキソサイトーシスの増加をもたらす。
本明細書で使用する場合、１又は複数の任意のNEU1基質のシアリル化の増加が、サンプルにおける低いリソソームシアリダーゼ活性をもたらす。更に、本明細書に記載するいずれか１叉は複数のNEU1基質の蛋白質レベル増加はまた、低いリソソームシアリダーゼ活性をもたらす。そのままに、これらの値は、リソソームシアリダーゼ活性のマーカーであり、そしてサンプルにおけるNEU1の低い蛋白質及び活性レベルを示すものである。サンプルにおけるシアリル化レベル又はサンプル中の特定の蛋白質のシアリル化レベルを測定するための測定法は本明細書中の別の場所で検討する。種々のリソソームシアリダーゼ活性マーカーのいずれかの蛋白質レベルを測定するための測定法は当業界において知られており、そして本明細書の別の場所に詳細に記載される。
他の態様において、NEU1の酵素活性レベル又は種々のNEU1基質のいずれかの活性レベルは、リソソームシアリダーゼ活性のマーカーである。種々の蛋白質の蛋白質活性を測定する測定法は当業界で知られており、そして本明細書において別途記載する。
Ｄ．NEU1基質シアリル化活性
１つの態様において、リソソームシアリダーゼプロファイルの１つの形態が、NEU1基質シアリダーゼ活性プロファイルである。
種々のNEU1基質シアリル化活性マーカーの非限定的な例が表１及び表２に要約される。
１つの態様において、対象サンプルは、対照サンプルに比べて高い又は増加したNEU1基質シアリル化活性を有する。「高いNEU1基質シアリル化活性」又は「増加したNEU1基質シアリル化活性」は、NEU1基質シアリル化活性プロファイルにおける１又は複数のマーカーのレベルの統計的に有意な変化を意味する。表３及び表４は、NEU1基質シアリル化活性プロファイルのためのマーカーの非限定的な例を提供し、そしてマーカーの増加又は減少が高いNEU1基質シアリル化活性を反映するか否かを示す。
１つの態様において、NEU1基質シアリダーゼ活性の増加は、所与のプロファイルにおいて、対照サンプルと比べての、NEU1基質シアリダーゼ活性マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はすべての変化により示される。幾つかの場合において、診断及び／又は予後のために１つのマーカーのNEU1基質シアリル化活性の変化で十分である。他の場合において、診断及び／又は予後のために２又はそれより多くのマーカーのNEU1基質シアリル化活性の変化が十分である。
種々のNEU1基質シアリル化活性マーカーのNEU1基質シアリル化活性の測定のための測定法が当業界で知られており、そして本明細書に記載する種々のNEU1基質の何れかのシアリル化のレベルを測定することを含む。このような測定法は本明細書において別途記載される。
Ｅ．NEU1レベル活性
他の態様において、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルの１形態が、NEU1レベル活性プロファイルである。種々のNEU1レベル活性マーカーの非限定的な例が表１及び表２にまとめられる。
１つの態様において、対象サンプルは、対照サンプルに比べて高い又は増加したNEU1レベル活性を有する。「高いNEU1レベル活性」又は「増加したNEU1レベル活性」は、NEU1レベル活性プロファイルにおける２又は複数のマーカーのレベルの統計的に有意な変化を意味する。表３及び表４は、NEU1レベル活性プロファイルのためのマーカーの非限定的な例を提供し、そしてマーカーの増加又は減少が高いNEU1レベル活性に反映するか否かを示す。
１つの態様において、NEU1レベル活性の増加は、所与のプロファイルにおいて、対照サンプルと比べての、NEU1レベル活性マーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15又はすべての変化により示される。幾つかの場合において、診断及び／又は予後のために２又はそれより多くのマーカーのNEU1レベル活性の変化が十分である。
種々のNEU1レベル活性マーカーのNEU1レベル活性を測定するための測定法が当業界で知られており、そして例えば、NEU1レベル活性マーカーに対して特異的な抗体を用いるイムノブロット法又はNEU1レベル活性マーカーに対して特異的な抗体を用いるELISA測定法を含む。これらの測定法は、本明細書において別途詳細に検討する。
IV．癌
本明細書に記載される種々のプロファイルを、対象における、化学療法の予後、癌の診断及び癌の予後の方法において使用することができる。本明細書において、「予後」は、疾患状態又は疾患の可能性ある結果（すなわち、予想される生存又は死亡、療法の予想される結果、又は転移の危険性）である。「診断」は、対象が疾患又は状態を有するか否かを決定することを意味する。
先行する項で述べたとおり、NEU1は、リソソームエキソサイトーシスの制御物質である。更に、NEU1は、知られている唯一のリソソームエキソサイトーシスの制御物質である。リソソームエキソサイトーシスの欠損は種々の疾患と関連づけられている。例えば、NEU1の欠損は、リソソーム貯蔵疾患であるシアリドーシス（sialidosis）をもたらす。
NEU1のレベル又は酵素活性が低い条件下で、NEU1基質、LAMP-1は、リソソーム中に過剰シアリル化状態で蓄積する。検討したとおり、LAMP-1はリソソームエキソサイトーシスを増強する。それとして、低いリソソームシアリダーゼ活性は、リソソームエキソサイトーシスの増加及び細胞外空間へのリソソーム内容物の放出をもたらす。
癌細胞及び種々のタイプの癌からの腫瘍が低いシアリダーゼ活性を有する（すなわち、本明細書に記載されるリソソームシアリダーゼ活性マーカーを用いて測定されるように）という発見が本明細書に記載される。例えば、本明細書に記載される実施例１を参照のこと。このような場合、NEU1の下方制御（down-regulation）が、癌細胞におけるリソソームエキソサイトーシスの脱制御（deregulation）をもたらし、したがってリソソームエキソサイトーシスを増加させる。
本明細書で検討するように、過剰なリソソームエキソサイトーシスは癌の診断、予後及び化学療法に重大な効果を有する。本明細書に記載するリソソーム作用性化学療法剤の予後、並びに癌の診断及び予後を決定する方法は、対象における任意のタイプの癌を含む。本明細書に記載される方法に含まれる癌のタイプの非限定的な例には、肉腫、白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫（Ewing’s sarcoma）、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、脳腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、及び骨癌が含まれる。特定の態様において、癌は横紋筋肉腫、乳癌、結腸癌、膵臓癌又はユーイング肉腫（Ewing’s sarcoma）を含む。
Ａ．化学療法の予後の方法
本明細書に、癌を有する対象における、リソソーム作用性化学療法剤療法の予後を決定するための方法が提供される。本明細書において使用する場合、「リソソーム作用性化学療法剤」は、細胞のリソソームに優先的に蓄積する任意の化学療法剤を意味する。多くの一般に使用される化学療法剤は、それらの弱塩基性のために、酸性リソソームに蓄積する。リソソーム作用性化学療法剤の非限定的な若干の例には、ドキソルビシン、シスプラチン及びドセタキセルが含まれる。
癌においてNEU1が下方修正される（down-regulated）場合には、これが癌細胞におけるリソソームエキソサイトーシスの脱制御を導き、したがってリソソームエキソサイトーシスが増加する。それとして、リソソームに蓄積する化学療法剤は癌細胞から細胞外空間に放出され、これにより化学療法が細胞に対して効果を有することが回避される。従って、低いリソソームシアリダーゼ活性が、リソソーム作用性化学療法剤への化学療法耐性を予測させる。化学療法に対する「耐性」は、化学療法剤の効果に抵抗する細胞又は腫瘍の能力を意味する。
癌を有する対象におけるリソソーム作用性化学療法剤療法についての予後は、癌を有する対象からのサンプルのリソソームシアリダーゼ活性プロファイルを得ることにより決定することができる。このような場合、例えば表３及び表４に示すように、対照サンプルに比べて１又は複数のリソソームシアリダーゼ活性マーカーのリソソームシアリダーゼ活性の変化が、サンプルについての低い又は低下したリソソームシアリダーゼ活性をもたらす。対照サンプルに比べて対象サンプルにおけるリソソームシアリダーゼ活性が低い場合、癌がリソソーム作用性化学療法に耐性であると予測される。
１つの態様において、癌を有する対象におけるリソソーム作用性（lysosomotropic）化学療法剤療法について予後を決定する方法は、下記の段階を含む：
ａ）前記対象からの腫瘍サンプルからの対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供し；
ｂ）対照サンプルからの参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供し、ここで、前記対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、対象におけるリソソーム作用性化学療法剤療法について予後を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性に比べて前記対象の低いリソソームシアリダーゼ活性が、前記癌が前記リソソーム作用性化学療法剤に対して耐性であるとの予測をもたらす。
１つの態様において、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、本明細書に記載する種々のリソソームシアリダーゼ活性マーカーのいずれかについてのリソソームシアリダーゼ活性値の任意の数及び組合せを含む。サンプルのリソソームシアリダーゼ活性プロファイルの限定されない例は表１及び表２に提供される。
特定の態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、LAMP-1蛋白質のレベルを含む。他の態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、MUC-1蛋白質のレベルを含む。更に他の態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、NEU1基質 LAMP-1及びMUC-1のレベルを含む。さらなる態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、LAMP-1シアリル化のレベルを含む。更に他の態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、MUC-1シアリル化のレベルを含む。他の特定の態様において、リソソームシアリダーゼ活性のレベルは、LAMP-1及びMUC-1シアリダーゼのレベルを含む。なお更なる態様において、リソソームシアリダーゼ活性は、LAMP-1のレベル、MUC-1のレベル、LAMP-1のシアリル化のレベル、及びMUC-1シアリル化のレベルを含む。
対象からの腫瘍のリソソームシアリダーゼ活性状態の知識は、医者が、低いリソソームシアリダーゼ活性プロファイルを伴う癌を有する対象のための最も適切な療法を予測することを可能にするであろう。例えば、低いリソソームシアリダーゼ活性プロファイルを有する腫瘍を治療するために、リソソーム作用性化学療法剤は選択されないであろう。何故なら、当該腫瘍が前記の剤に対して抵抗性であることが予測できるからである。したがって、リソソーム中に蓄積しない化学療法薬を用いる治療方法は、良い治療の選択肢ではないであろう。
Ｂ．癌の診断及び予後の方法
本発明の方法はまた、癌を有する対象の予後及び診断を決定する方法を提供する。診断及び予後から得られる情報は、適切な治療を選択するために有用でありうる。
本明細書に別途記載するように、NEU1はリソソームエキソサイトーシスの負の制御剤であり、そして低いリソソームシアリダーゼ活性がリソソームエキソサイトーシスの増加をもたらす。過剰のリソソームエキソサイトーシスは、細胞の細胞外環境に対して深刻な影響を有する。例えば、リソソームは、細胞外マトリクスを分解して細胞外環境の改造をもたらすプロテアーゼを含有する。細胞外マトリクスの分解は、侵入に対する組織の傷つきやすさを増加させる。それなりに、癌細胞を包囲する細胞外マトリクス中のプロテアーゼの高い濃度が、癌細胞の侵入の可能性及び転位を増強する。
「浸潤性」である癌は、周囲組織に広がる能力を有する。本明細書において使用される「転移」は、癌が最初の位置から体の他の領域に広がるか又は移行する過程を意味する。本明細書で別途記載するように、低いリソソームシアリダーゼ活性を有する癌は、増加した浸潤の可能性を有する。癌の浸潤性を測定する測定法は当業界で知られており、そして浸潤性測定の例は、本明細書の別途記載する実施例１に記載される。
浸潤癌はより一層転移しやすく、そしてそれ故に不都合な予後を有し、他方非−浸潤性癌は転移しにくく、そしてそれ故に好都合な予後を有する。腫瘍又は癌に関して診断される対象に関して「不都合な予後」は、転移の高い可能性及び／又は死を生じさせる高い可能性を有する腫瘍又は対象に言及する。癌について診断される対象に関し「好都合な予後」は、転移の低い可能性及び／又は死を生じさせる低い可能性を有する腫瘍又は対象に言及する。
癌の診断及び予後の目的で、サンプルのリソソームシアリダーゼ活性は、本明細書に記載される種々のリソソームシアリダーゼ活性マーカーのいずれか２叉はそれより多くについて値を測定することにより決定され得る。すなわち、対照サンプルの参照リソソームシアリダーゼ活性に比べて対象サンプルにおけるリソソームシアリダーゼ活性の低いレベルは、腫瘍が増加した浸潤の可能性（すなわち、不都合な予後）を有することを示し、他方、対照サンプルの参照リソソームシアリダーゼ活性に比べて対象サンプルにおけるリソソームシアリダーゼ活性の高い又は正常なレベルは、腫瘍が低い浸潤の可能性（すなわち、都合な予後）を有することを示す。
幾つかの態様において、癌の診断及び／又は予後は、サンプルのNEU1基質シアリル化活性又はNEU1レベル活性を測定することにより決定することができる。これらの活性は、表１〜表４に記載される種々のマーカーのいずれかの値を測定することにより決定することができる。NEU1基質シアリル化活性に関し、１又は複数のNEU1基質シアリル化活性マーカーのいずれかの高いレベルは、高いNEU1基質シアリル化活性をもたらし、そして癌及び不都合な予後を示す。NEU1レベル活性に関し、いずれか２又はそれより多くのNEU1基質活性マーカーの高いレベルは、高いNEU1レベル活性をもたらし、そして癌及び不都合な予後を示す。
１つの態様において、癌を有する対象について予後を決定する方法が提供され、そして次の段階を含む：
ａ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２又はそれ以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対象プロファイルであって前記対象からの腫瘍サンプルからのものを提供し；
ｂ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２又はそれ以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対応する参照プロファイルであって対照サンプルからのものを提供し、
ここで、前記対象プロファイル及び前記参照プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルNEU1基質シアリル化活性プロファイル又はNEU1レベル活性プロファイルを比較して、癌を有する前記対象について予後を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性に比べて前記対象の低いリソソームシアリダーゼ活性、高いNEU1基質シアリル化活性、又は高いNEU1レベル活性が、前記対象の浸潤癌（invasive cancer）の予測をもたらす。
他の態様において、対象における癌を診断する方法が提供され、この方法は下記の段階を含む：
ａ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２又はそれ以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対象プロファイルであって前記対象からの腫瘍サンプルからのものを提供し；
ｂ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２又はそれ以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対応する参照プロファイルであって対照サンプルからのものを提供し、
ここで、前記対象プロファイル及び前記参照プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象の及び参照の、リソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル又はNEU1レベル活性プロファイルを比較して、前記対象について診断を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性に比べて前記対象のリソソームシアリダーゼ活性が低い場合、NEU1基質シアリル化活性が高い場合、又はNEU1レベル活性が高い場合、前記対象が癌を有すると診断する。
対象サンプルにおける、リソソームシアリダーゼ活性のレベル、NEU1基質シアリル化活性又はNEU1レベル活性の知識が、医者による、対象が癌を有するとの診断、癌の進行の予測、及び癌を有する対象のための適切な治療法の選択を可能にする。
Ｖ．アルツハイマー病に関連する認知症の診断方法
更に、アルツハイマー病に関連する認知症の診断方法がここに提供される。対象からのサンプルのリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルによりアルツハイマー病に関連する認知症が予測されるという証明がここに提供される。
この明細書で使用される場合、「アルツハイマー病に関連する認知症」は、アルツハイマー病の診断ガイドラインについてのNational Institute on Aging-Alzheimer’s Associationのワークグループからの推奨において報告されている認知症の標準的基準により特徴付られる。この標準的基準は、
（１）通常の活動又は仕事を行なう能力を欠き、今までの機能及び行動レベルからの減退を示し、主たる精神病的異常又は譫妄によっては説明できない認識又は挙動症状；
（２）患者からの生い立ちの話と知的報告者と客観的認識評価との組合せを通しての認識障害の検出及び診断；及び
（３）認識又は挙動の障害が下記の２又はそれ以上を含むこと：
（ａ）新しい情報を獲得又は記憶する能力の障害；
（ｂ）複雑な仕事、低下した判断力の理由付け及び取扱いの障害；
（ｃ）視空間能力の障害；
（ｄ）言語機能の障害；及び
（ｅ）人格、挙動又は振る舞いの変化。
アルツハイマー関連認知症は更に下記の１又は複数の特徴を有することができる。
（１）上記の認知症に関するすべての基準を満たす；
（２）陰険の開始；
（３）報告又は観察による認識又は悪化の来歴；
（４）記憶喪失の表示；及び
（５）非記憶喪失（nonamnestic）の表示、例えば言語表示、視空間表示または執行機能不全（executive dysfunction）。
アルツハイマー病認知症のガイドラインはMcKhann et al. (2011) Alzheimer’s & Dementia 7:263-69に詳細に記載されており、この記載を引用により本明細書に組み入れる。
本明細書に別途記載するように、NEU1はリソソームエキソサイトーシスの負の制御物質である。このような場合に、NEU1蛋白質レベル又は酵素活性が低ければ、リソソームエキソサイトーシスが増強される。本明細書に示すように、NEU1蛋白質レベルが低い条件下では、脳脊椎液中（CSF）に、高度にシアリル化された蛋白質が検出され得る。このような場合には、CSFの組成が変化し、そして多くの高度にシアリル化された蛋白質もまたCSF中で増加したレベルを有する。低いNEU1蛋白質及び活性レベルの条件下で、CSF中で変化するこれらの蛋白質は、アルツハイマー病に関連する認知症を予測するためのバイオマーカーと相互関連する。
例えば、アミロイド前駆体蛋白質（APP）、NEU1基質であることが示され、そして低NEU1条件の下、高度にシアリル化された形態で脳及びCSF中に蓄積する。リソソームはまた、APPを処理して毒性Ａβペプチドを形成することができるプロテアーゼを含む。したがって、過剰なリソソームエキソサイトーシス（すなわち、NEU1蛋白質又は酵素活性レベルが低い場合）は、アルツハイマー病に特徴的なプラーク形成を増強する。例えば、別途提供する実施例３を参照のこと。したがって、１つの態様において、別途詳細に記載するように、CSF中の増加したリソソームエキソサイトーシス活性は、アルツハイマー病に関連する認知症を予測できる。
種々の蛋白質が、増加したシアリル化レベルを有することができそして／又はCSF中のレベルを有することができる。いくつかの態様において、増加したシアリル化レベル及び／又は蛋白質レベルを有する蛋白質はNEU1基質である。他の態様において、増加したシアリル化レベル及び／又は蛋白質レベルを有する蛋白質はリソソーム蛋白質である。増加したシアリル化レベル及び／又は蛋白質レベルを有する蛋白質の非限定的な例には、LAMP-1、MUC-1、カテプシンＢ、カテプシンＤ、補体系蛋白質、フィブリノーゲン、ヘキソスアミニダーゼβ、マンノシダーゼα、トランスチレチン（Transthyretin）、β−２ミクログロブリン及びアミロイド前駆体蛋白質が含まれる。これらの任意の１又は複数の蛋白質は、リソソームエキソサイトーシス活性のためのマーカーであることができる。
対象におけるアルツハイマー病に関連する認知症の診断方法が本明細書に記載され、この方法は下記の段階を含む：
ａ）前記対象からの脳脊髄液のサンプルの対象リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供し；
ｂ）脳脊髄液の対照サンプルの参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供し、ここで、対象リソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び対応する参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルはリソソームエキソサイトーシス活性を表わす１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び前記参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを比較する、ここで、対象が、参照リソソームエキソサイトーシス活性に比べて高いリソソームエキソサイトーシス活性を有する場合、当該対象はアルツハイマー病に関連する認知症を有すると診断される。
１つの態様において、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを含む。リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、本明細書に記載される種々のリソソームシアリダーゼ活性マーカーのいずれかの任意の組合せを含むことができる。このような場合、対照サンプルにおける参照リソソームシアリダーゼ活性に比べて対象サンプルにおける低いリソソームシアリダーゼ活性は、対象がアルツハイマー病に関連する認知症を有すると診断される結果をもたらす。
他の態様において、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルは、シアリル化活性プロファイルを含む。シアリル化活性プロファイルは、本明細書に記載する種々のシアリル化活性マーカーのいずれかの任意の組合せを含むことができる。このような場合、対照サンプルにおける参照リソソームシアリル化活性に比べて対象サンプルにおける高いシアリル化活性は、対象がアルツハイマー病に関連する認知症を有すると診断される結果をもたらす。
アルツハイマー病に関連する認知症の診断のため、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイル、リソソームシアリダーゼ活性プロファイル又はシアリル化活性プロファイルは、本明細書に記載される種々のマーカーの任意の１又は複数を含むことができる（すなわち、表１〜４を参照のこと）。
対象サンプルにおける、シアリル化活性プロファイルの知識が、医者による、対象がアルツハイマー病に関連する認知症を有するとの診断を可能にする。したがって、対象について、早期の診断を行なうことができ、そして適切な治療の選択肢を考えることができる。
VI．リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及びリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを生じさせる方法
サンプルのために、リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び／又はリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを生じさせる方法も提供される。本明細書に示されるように、サンプルのリソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数のリソソームシアリダーゼ活性マーカー（すなわち、本明細書に記載されるリソソームシアリダーゼ活性の種々のマーカーのいずれか、表１及び表２を参照のこと）を含むことができる。ここでまた、サンプルのリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルは、リソソームエキソサイトーシス活性を示す１又は複数のリソソームエキソサイトーシス活性マーカー（すなわち、本明細書に記載されるリソソームエキソサイトーシス活性の種々のマーカーのいずれか、表１及び表２を参照のこと）を含むことができる。
１つの態様において、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを生じさせる方法は下記の段階を含む：
（ａ）対象からの腫瘍からのサンプルを得；そして
（ｂ）LAMP-1蛋白質のレベル又はLAMP-1シアリル化のレベルについて測定する。
更なる態様において、この方法は、１又は複数の追加のリソソームシアリダーゼ活性マーカーについて測定することを含む。この方法の更なる他の態様において、前記１又は複数の追加のリソソームシアリダーゼ活性マーカーはNEU1基質を含む。種々のリソソームシアリダーゼ活性マーカーを測定する測定法は、本明細書に別途記載される。
他の態様において、脳脊髄液からリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを生成する方法は下記の段階を含む：
（ａ）対象から脳脊髄液のサンプルを得；そして
（ｂ）リソソームエキソサイトーシス活性について測定する。
特定の態様において、リソソームエキソサイトーシス活性についての測定することは、LAMP-1蛋白質のレベル又はLAMP-1シアリル化のレベルについての測定を含んで成る。
非限定的な態様において、リソソームエキソサイトーシス活性を測定することは、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、ヘキソスアミニダーゼβ、マンノシダーゼα、トランスチレチン（Transthyretin）、β−２ミクログロブリン、又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質のレベルについて測定することを含む。
VII．治療方法
癌又はアルツハイマー病の関連する認知症を有する対象を治療する方法が更に提供される。癌又はアルツハイマー病の関連する認知症を有する対象を「治療する」とは、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症を有する対象への、療法的有効量のNEU1又はその活性変異体若しくは断片の投与、療法的有効量の保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）又はその活性変異体若しくは断片の投与、或いは療法的有効量のNEU1とPPCAの組合せの投与を意図し、ここでその目的は、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の状態又は症状を、救済し（cure）、癒し（heal）、緩和し（alleviate）、軽減し（relieve）、変更し（alter）、矯正し（remedy）、改良し（ameliorate）、改善し（impove）、又はそれに影響を及ぼす（affect）ことである。
更に、対象における、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症を予防する方法が提供される。対象における癌又はアルツハイマー病に関連する認知症を「予防する」とは、対象への、療法的有効量のNEU1又はその活性変異体若しくは断片の投与、療法的有効量の保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）又はその活性変異体若しくは断片の投与、或いは療法的有効量のNEU1とPPCAの組合せの投与を意図し、ここでその目的は、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の進展から対象を保護することである。幾つかの態様において、療法的有効量のNEU1又はその活性変異体若しくは断片、保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）又はその活性変異体若しくは断片、或いはNEU1とPPCAの組合せが、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の危険性を有する対象、例えばヒトに投与される。
本明細書で使用される場合、「療法的有効量」は、所与の状態及び投与処方について療法効果を与える量を意味する。すなわち、「療法的有効量」なる用語は、宿主における臨床的状態において改良を生じさせる量を意味するために使用される。特定の観点において、「療法的有効量」は、本明細書に記載されるNEU1、PPCA、又はNEU1とPPCAの組合せの量であって、対象に投与された場合に、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症についての対象の治療に関し陽性の（正の）（positive）療法応答を引き起こす量を意味する。癌の治療に関する陽性の（正の）（positive）療法応答は、当該疾患の症状を救済（curing）又は改善する（ameliorating）ことを含む。
この文脈において、宿主の応答の欠損は、癌の継続及び拡がりにより証明され得る。宿主における臨床的に有意な状態の改善は、腫瘍のサイズの減少、腫瘍の増加した壊死、宿主組織からの腫瘍の排除、転移の減少若しくは改善、又は癌に関連するいずれかの症状の減少を含む。アルツハイマー病に関連する認知症を有する対象の治療に関する陽性の療法応答は、当該疾患の症状を救済（curing）又は改善する（ameliorating）ことを含む。この文脈において、宿主の応答の欠損は、アルツハイマー病に関連する認知症の継続及び悪化により証明され得る。宿主における臨床的に有意な状態の改善は、対象における認知症の減少（すなわち、記憶、判断、視空間能力、言語苦悩、挙動又は本明細書に別途記載する認知症の他の症状のいずれかの改善）を含む。
特定の観点において、「療法的有効量」は、本明細書に記載されるNEU1、PPCA、又はNEU1とPPCAの組合せの量であって、対象に投与された場合に、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症についての対象の予防に関し陽性の（正の）（positive）療法応答を引き起こす量を意味する。癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の予防に関する陽性の（正の）（positive）療法応答は、例えば、当該疾患の進行の予防である。
１つの態様において、癌を有する対象を治療する方法は、それを必要とする対象に、療法的有効量の、配列番号：２と少なくとも85％の同一性を有するノイラミニダーゼ１（neuraminidase 1；NEU1）又はその活性変異体若しくは断片を投与することを含む。
他の態様において、アルツハイマー病に関連する認知症を有する対象を治療する方法は、それを必要とする対象に、療法的有効量の、配列番号：２と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼ１（neuraminidase 1；NEU1）又はその活性変異体若しくは断片を投与することを含む。
幾つかの態様において、当該方法は更に、配列番号：４と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有する保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）を投与することを含む。
他の態様において、NEU1及びPPCAの投与は別々であることができ、又はNEU1及びPPCAは同時に対象に投与することができる。投与は、本明細書において別途記載するように任意の既知の投与方法によることができる。１つの態様において、NEU1及び／又はPPCAの投与は、配列番号：１に対して少なくとも85％の配列同一性を有するヌクレオチド配列及び／又は配列番号：３に対して少なくとも85％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るウイルスベクターを投与することを含む。
本明細書に記載される方法において、NEU1の活性変異体又は活性断片を使用することができる。このような活性変異体は、配列番号：２に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はこれより高い配列同一性を含んで成ることができ、ここで、当該活性変異体は生物学的活性を維持しており、そしてそれ故にシアリダーゼ活性を有する。シアリダーゼ活性は、本明細書において別途詳細に記載される。NEU1の活性変異体は当業界において知られている。ウイルスからヒトにわたる色々な種からの130を超えるタイプの既知のノイラミニダーゼが存在する。例えば、Monti et al. (2010) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 64:403-79を参照のこと。この文献の記載を引用により本明細書に繰り入れる。
本明細書に記載される方法において、PPCAの活性変異体又は活性断片を使用することができる。このような活性変異体は、配列番号：４に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はこれより高い配列同一性を含んで成ることができ、ここで、当該活性変異体は生物学的活性を維持しており、そしてそれ故にNEU1酵素活性を増強する。NEU1酵素活性を測定するための測定法は、本明細書に別途記載される。PPCAの活性変異体は当業界において知られている。例えば、Galjart et al. (1988) Cell 54(6):755-64を参照のこと。この文献の記載を引用により本明細書に繰り入れる。
VIII．投与の方法
本明細書に記載される癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の治療方法は、筋肉内、腹腔内、静脈内、等を含むがこれらに限定されない種々の任意の非経口経路を介しての治療の投与を含む。
更に、本明細書において使用される「医薬として許容されるキャリアー」は当業界においてよく知られており、そして限定的ではないが、0.01−0.1 M 若しくは0.05M リン酸緩衝液又は0.8% 食塩水が含まれる。更に、このような医薬として許容されるキャリアーは、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳剤であることができる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の如き植物油、及びオレイン酸エチルのごとき注射可能な有機エステルである。水性キャリアーには、水、アルコール性／水性溶液、乳剤又は懸濁液が含まれ、これらには食塩水及び緩衝化媒体が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、又は不揮発性油が含まれる。静脈内賦形剤には、流体及び栄養補液（replenisher）、電解質補液、例えばリンゲルブドウ糖をベースにするもの、等が含まれる。代表的な及び他の添加剤も存在することができ、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、カレート剤（collating agents）、不活性ガスなどである。
制御された又は持続性放出の組成物には、親脂性デポット（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中での剤形が含まれる。更に、ポリマー（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）及び組織特異的受容体、リガンド又は抗原に対して向けられた抗体に連結された、又は組織特異的受容体のリガンドに連結された化合物によりコートされた粒状組成物が含まれる。本明細書に示される組成物の他の態様には、粒状の保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、又は非経口、肺、鼻及び経口を含めての種々の投与経路のための浸透増強剤が含まれる。
投与される場合、化合物はしばしば、粘膜又は循環から急速に排除され、そしてそれ故に比較的短期間の薬理学的活性を引き出す。したがって、療法効果を維持するためには、生物活性化合物の比較的大投与量の頻繁な投与が要求されるであろう。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロディドン又はポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合により修飾された化合物が、対応する未修飾の化合物に比べて、静脈注射後の血液中で、実質的に長い半減期を示すことが知られている（Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; and Katre et al., 1987）。
このような修飾はまた、水溶液中での化合物の溶解性を増加させ、凝集を除去し、化合物の物理的及び化学的安定性を増強し、そして化合物の免疫原性及び反応性を大きく低下させるであろう。結果として、未修飾の化合物に比べて、少ない頻度で又は少ない投与量で、上記のポリマー−化合物付加物の投与により所望の生体内生物活性が達成されるであろう。
十分な量は、限定的ではなく、約１μg/kg〜約100 μg/kg、約100 μg/kg〜約１mg/kg、約１mg/kg〜約10 mg/kg、約10 mg/kg〜約100 mg/kg、約100 mg/kg〜約500 mg/kg、又は約500 mg/kg〜約1000 mg/kgを含むであろう。量は10 mg/kgであることができる。組成物の医薬として許容される形態は、医薬として許容される賦形剤を含む。
活性化合物を含む療法組成物の調製は、当業界においてよく理解されている。典型的には、このような組成物は、微咽頭に送達されるポリペプチドのエアロゾルとして、液体溶液又は懸濁液としての注射剤として調製されるが、しかしながら、注射に先だち液中溶液又は懸濁液のために適当な固体形態としても調製されうる。調製物はまた、乳剤化されてもよい。活性療法成分はしばしば、医薬として許容されそして活性成分と相容性である賦形剤と混合される。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せである。更に、所望により、組成物は、微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、活性成分の効力を増強するpH緩衝剤を含むことができる。
活性化防物は、中和された医薬として許容される塩の形態で、療法組成物に製剤化され得る。医薬として供される塩には、酸付加塩であって、ポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成されるもの、及び無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、マンでル酸などと共に形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基かた形成される塩はまた、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄の水酸化物、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等に由来することができる。
本明細書において提供される療法組成物の１又は複数の成分は、非経口的に、粘膜経由で、例えば経口的に、経鼻的に、肺に、又は直腸に、或いは経皮的に、導入され得る。好ましくは、投与は非経口的であり、例えば、静脈内注射経由であり、そしてまた限定的ではないが、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、及び頭蓋内投与が含まれる。本明細書において提供される療法組成物に関して使用される場合、「単位投与」は、ヒトのための単為投与量として適当な、物理的に区別される単位を意味し、各単位は、要求される希釈剤、すなわちキャリアー又は担体と関連して所望の療法効果を生成するために計算された活性物質の予め定められた量を含有する。
他の態様において、活性成分は、担体中で、特にリポソーム中で送達される（Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 前掲., pp. 317-327; 一般に前掲、を参照のこと）。
更に他の態様において、療法化合物は、制御された放出系において送達され得る。例えば、蛋白質は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、又は他の投与様式を用いて投与することができる。１つの態様において、ポンプを使用することができる（Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507；Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574を参照のこと）。
他の態様において、ポリマー材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照のこと；更に、Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351；Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105を参照のこと）。
更に他の態様において、制御された放出系を、治療標的、すなわち脳又は腫瘍の近傍に配置し、全身投与量の部分のみが要求されるようにすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照のこと）。他の制御された放出系が、Langer (1990) Science 249:1527-1533による総説において検討されている。
前記の活性成分の投与が癌又はアルツハイマー病に関連する認知症のための効果的な療法である対象は、好ましきはヒトであるが、しかし任意の動物であってよい。すなわち、当業者が容易に理解できるとおり、本発明において提供される方法及び医薬組成物は、任意の動物、特に哺乳類、例えば、限定する意味ではないが、家庭用動物、例えばネコ又はイヌ対象、農場動物、例えば限定的ではないが、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及びブタ対象、野生動物（野生又は動物園のいずれか）、研究用動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等、すなわち、獣医科治療用途、への投与のために適切である。
本発明において提供される治療方法及び組成物においては、活性成分の療法的有効投与量が提供される。療法的有効投与量は、当業界においてよく知られているように、患者の特徴（年齢、体重、性別、状態、併合症、他の疾患など）に基づいて、当業者により決定されうる。更に、更なる日常的研究が行なわれるにしたがって、種々の患者における種々の状態の治療のために適当な投与量レベルに関し一層特異的な方法が明らかになり、そして当業者は、療法の状況、年齢、及び受容者の一般的な健康状態を考慮しながら、適切な投与量を突き止めることができる。
一般に、静脈内注射（injection）または注入（infusion）のためには、投与量は、腹腔内、筋肉内、又は他の投与経路に較べて少ないであろう。投与計画は、循環半減期、及び使用される剤形に依存して異なるであろう。組成物は、療法的有効量における投与剤形に適合する態様で投与される。投与のために要求される活性成分の正確な量は、医者の判断に依存し、そして各個体に特異的である。しかしながら、適当な投与量は、投与経路に依存して、１日当たり、固体の体重kg当たり、約0.1〜20mg、好ましくは約0.5〜約10mg、そして更に好ましくは１〜数mgの活性成分であろう。初期投与及び追加投与の方法もまた可変的であるが、しかし典型的には、初期投与と、それに続く注射又は他の投与方法による１時間又は複数時間の間隔での反復投与である。あるいは、血中10ナノモル〜10μモルを維持するために十分な連続静脈内注入（infusion）が考えられる。
他の化合物との投与
癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の治療のため、本発明の活性成分を、癌又はアルツハイマー病に関連する認知症の治療に使用される１又は複数の医薬組成物と組合わせて投与することができ、このような医薬組成物には、限定的ではないが、（１）化学療法剤、又は（２）アルツハイマー病の症状を治療するための他の薬物、例えば、ドメぺジル（domepezil）、ガランタミン（galantamine）、メマンチン（memantine）、リバスチグミン（rivastigmine）又はタクリン（tacrine）が含まれる。投与は、同時的（例えば、本発明の活性成分と化学療法剤との混合物の投与）であってもよく、又は逐次的であってもよい。
更に、本発明において提供される少なくとも１つの蛋白質と、他の療法的に有効な薬物、例えばアルツハイマー病の治療のための化学療法剤又は薬物とを含んで成る乾燥粉末製剤が考慮される。
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) at Chapter 89に一般的に記載されている固体経口投与形の使用が考慮される。この文献の記載を引用により本明細書に組み入れる。固体投与形は、錠剤、カプセル、ピル、トローチ又は甘味入り錠剤、オブラート薬包（cachet）、又はペレットを包含する。更に、本発明の組成物を製剤化するために、リポソーム性又はプロテイノイド性封入（例えば、米国特許第4,925,673に報告されているプロテイノイドマイクロスフェアー）を用いることができる。
リポソーム封入を用いることができ、そしてリポソームは種々のポリマーにより誘導体化することができる（例えば、米国特許第5,013,556号）。療法剤のための可能性ある固体投与形の説明は、Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G.S. Banker and C.T. Rhodes Chapter 10, 1979により提供されており、この記載を引用により本明細書に組み入れる。一般に、製剤は、１又は複数の成分（又はその化学的に修飾された形態）、並びに胃環境に対する保護及び生物学的に活性な物質の腸での放出を可能にする不活性成分を含むであろう。
更に、上記の誘導体化された１又は複数の成分の経口投与形が考慮される。１又は複数の成分を化学的に修飾することにより、誘導体の経口送達が効果的であるようにすることができる。一般に、考慮される化学修飾は、成分分子それ自体への少なくとも１つの成分の結合であり、ここで当該成分は（ａ）蛋白質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は腸から血流への取込みを許容するものである。更に、１又は複数の成分の全体的安定性の増加及び体内での循環時間の増加が望ましい。このような成分の例には、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリプロリンが含まれる。Abuchowski and Davis (1981) “Soluble Polymer-Enzyme Abducts” In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383； Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189。使用しうる他のポリマーは、ポリ−1,3−ジオキソラン及びポリ−1,3,6−チオキソカンである。医薬用途のために、上に示したように、ポリエチレングリコール成分が好ましい。
成分（又は誘導体）について、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸又は回腸）、１又は大腸であろう。当業者は、胃では溶解しないが十二指腸又は小腸中の他の場所で放出する入手可能な製剤を有する。好ましくは、蛋白質（又は誘導体）の保護により、又は胃環境の後、例えば小腸における生物学的に活性な物質の放出により、放出は、胃環境の有害な効果を回避するであろう。
胃耐性を確実にするため、少なくともpH 5.0に対して不浸透性の被覆が必須である。腸内被覆として使用される更に一般的な成分の例は、酢酸セルローストリメリテート（cellulose acetate trimellitate；CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMCP）、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニル酢酸フタレート（PVAP）、ユードラギット（Eudragit）L30D、アクアテリック（Aquateric）、酢酸セルロースフタレート（CAP）、ユードラギットＬ（Eudragit L）、ユードラギットＳ（Eudragit S）、及びシェラック（Shellac）である。これらの被覆は混合フィルムとして使用することができる。
被覆又は被覆の混合物は、胃に対する保護が意図されない錠剤にも使用することができる。これは、糖被覆、又は錠剤を飲みやすくする被覆を含むことができる。カプセルは、乾燥医薬すなわち粉末の送達にために硬質外殻（例えばゼラチン）からなることができ、液体形のためにはソフトゼラチン外殻を使用することができる。カプセル（cachet）の外殻材料は厚い澱粉又は他の可食性材料の紙であることができる。ピルのためには、甘味錠剤（lozenge）、成型錠剤又は錠剤つぶし物（tablet triturates）、湿分固め技法を使用することができる。
ペプチド医薬は、約１mmの粒子サイズの顆粒又は粒子の形態で微細な多粒子として製剤中に含めることができる。カプセル投与のための材料の剤形はまた、粉末、軽く圧縮したクラブ又は錠剤としてでさえあってよい。医薬は圧縮により調製することができる。
着色剤及び香味剤はいずれも含めることができる。例えば、蛋白質（又は誘導体）は、製剤化（例えばリポソーム又はミクロスペアー封入により）、そして次に更に可食性製品、例えば着色剤又は香味剤を含む冷蔵飲料中に含めることができる。
医薬の体積を、不活性材料により希釈又は増量することができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、ａ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、蔗糖、修飾デキストラン及び澱粉が含まれる。或る種の無機塩も増量剤として使用することができ、これには三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが含まれる。幾つかの商業的に入手可能な希釈剤は、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、エムコンプレス（Emcompress）及びアビセルである。
崩壊剤を、医薬の製剤において固体投与形に含めることができる。崩壊剤として使用される材料には、限定的ではなく、澱粉、例えば澱粉を基礎とする商業的崩壊剤、エクスプロタブ（Explotab）、澱粉グリコール酸ナトリウム、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール（orange peel）、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトが含まれ、いずれも使用することができる。崩壊剤の他の形態は不溶性カチオン交換樹脂である。
粉末ガムは崩壊剤として及び結合剤として使用することができ、これらには、寒天、カラヤ又はトラガカントのごとき粉末ガムが含まれ得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩もまた崩壊剤として有用である。薬剤を一緒に保持して硬質錠剤を形成するために結合剤を使用することができ、これにはアカシア、トラガカント、澱粉及びゼラチンなどの天然産物からの材料が含まれる。他に、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）及びカルボキシメチルセルロース（CMC）が含まれる。ポリビニルピロリドン（PVP）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）はいずれも、医薬を造粒するためにアルコール溶液中で使用することができる。
製剤化工程中で付着を防止するために、医薬製剤中に減摩剤を含めることができる。医薬とダイ壁との間の層として潤滑剤を使用することができ、これらには、限定的ではなく、ステアリン酸、例えばそのマグネシウム塩及びカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、液体パラフィン、植物油及びワックスが含まれる。可溶性滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス4000及び6000もまた使用することができる。
製剤化中に薬剤の流動性を改良するため及び圧縮中に転移（rearrangement）を助けるために滑剤を加えることができる。滑剤には、澱粉、タルク、焼成シリカ、含水珪アルミン酸ナトリウムが含まれよう。
水性環境への薬物の溶解を助けるため、湿潤剤として界面活性剤を加えることができる。界面活性剤には、アニオン性洗剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチル琥珀酸ナトリウム及びクチルスルホン酸ナトリウムが含まれる。カチオン性洗剤を使用することもでき、これには塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトミウムが含まれよう。界面活性剤として製剤に含めることができる可能性ある非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール（lauromacrogol）400、ポリオキシ40ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ひまし油10、50及び60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート40、60、65及び80、蔗糖脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、蛋白質又は誘導体の製剤中に単独で又は種々の比率の混合物として存在する。
蛋白質（又は誘導体）の取込みを潜在的に増強する添加剤は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
１つの態様において、方法は、対象にNEU1及び／又はPPCAを投与するためのウイルスの使用を含む。投与は、NEU1及び／又はPPCAを発現するウイルス、例えば、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えアデノウイルス及び組換えヘルペス新プレックスウイルス（例えば、Mulligan, Science 260:926 (1993)； Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988)； LaSalle et al., Science 259:988 (1993)； Wolff et al., Science 247:1465 (1990)； Breakfield and Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)を参照のこと）の使用によることができる。
NEU1及び／又はPPCA遺伝子は、組換えウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター（例えば、Kass-Eisler et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993)； Kolls et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91:215 (1994)； Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993)； Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993)；及びZabner et al., Cell 75:207 (1993)を参照のこと）、アデノ随伴ウイルスベクター（Flotte et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:10613 (1993)を参照のこと）、アルファウイルス、例えばセムリキ森林熱ウイルス及びシンドビスウイルス（Hertz and Huang, J. Vir. 66:857 (1992)； Raju and Huang, J. Vir. 65:2501 (1991)；及びXiong et al., Science 243:1188 (1989)）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第4,769,331号、第4,859,587号、第5,288,641号及び第5,328,688号を参照のこと）、パブロウイルスベクター（Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)）、ポックスウイルスベクター（Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993)； Panicali and Paoletti, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 79:4927 (1982)）、ポックスウイルス、例えばカナリーポックスウイルス又はワクシニアウイルス（Fisher-Hoch et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:317 (1989)；及びFlexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)）、及びレトロウイルス（例えば、Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993)； Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993)； Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992)； Vile and Hart, Cancer Res. 53:962 (1993)； Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993)；及びAnderson et al., U.S. Patent No. 5,399,346）を用いて送達することができる。種々の態様において、ウイルスベクターそれ自体、又はウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかが後記の方法において使用されよう。
１つの系の例示として、二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスが、異種性核酸分子の送達のためのよく特徴付けられた遺伝子移行ベクターである（復習のため、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)； Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)を参照のこと）。アデノウイルス系は、幾つかの利点を提供し、それには下記のものが含まれる：
（ｉ）比較的大きなDNA挿入部を収容する能力；
（ii）高いタイターに増殖する能力；
（iii）広範囲な哺乳類細胞タイプに感染する能力；及び
（iv）普遍的プロモーター、種特異的プロモーター、及び制御可能なプロモーターを含めての多くの異なるプロモーターと共に使用される能力。
更に、アデノウイルスは、血流中で安定であるため、静脈内注射により投与することができる。
アデノウイルスのゲノムの部分が除去されるアデノウイルスベクターを用いて、挿入部はウイルスDNAに、直接ライゲーションにより、または同時トランスフェクトされるプラスミッドとの相同性組換えにより導入することができる。例示的な系においては、必須のE1遺伝子がウイルスベクターから除去され、そして当該E1遺伝子が宿主細胞により提供されなければ、ウイルスは複製しないであろう。インタクトな動物に静脈内投与された場合、アデノウイルスは一次的に肝臓を標的とする。E1遺伝子の除去を伴うアデノウイルス送達系は、宿主細胞中で複製することができないが、当該宿主の組織は、コードされた異種蛋白質を発現しそしてプロセスするであろう。対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、宿主細胞はまた異種性蛋白質を分泌するであろう。分泌された蛋白質は、異種性蛋白質を発現する組織（例えば、血管が高度に張り巡らされた肝臓）から循環に入るであろう。
更に、ウイルス遺伝子の種々の欠失を有するアデノウイルスは、ベクターに対する免疫応答を低下又は除去するために使用することができる。このようなアデノウイルスは、E1を欠いており、そして更にE2A又はE4の欠失を有する（Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)）。E2bの欠失もまた、免疫応答を低下させることが報告されている（Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)）。全アデノウイルスゲノムを除去することにより、異種性DNAの非常に大きな挿入部が収容されうる。すべてのウイルス遺伝子が除去された、いわゆる「はらわたの無い」アデノウイルスの生成は、異種性DNAの大きな挿入部を挿入するために特に有利である（復習のため、Yeh. and Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)を参照のこと）。
療法的遺伝子を発現することができる組換え遺伝子の高タイターのストックは、感染された哺乳類細胞から標準的方法を用いて得ることができる。例えば、組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、ベロ細胞において、Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991)； Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994)； Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991)； Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989)； Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992)；及びBrown and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997により記載されているようにして調製することができる。
組換えウイルスにより治療される対象がヒトである場合、療法は好ましくは体細胞遺伝子療法である。すなわち、組換えウイルスによるヒトの好ましい治療は、ヒトジャームライン部分を形成することができる核酸分子の細胞への導入及び逐次世代への引き継ぎ（すなわち、ヒトジャームライン遺伝子療法）を伴わない。
IX．変異体及び断片
NEU1及びPPCAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの断片及び変異体は、本発明の種々の方法及び組成物において使用することができる。「断片」は、ポリヌクレオチド及びそれ故にそれにコードされる蛋白質の部分又はポリペプチドの部分を意図する。ポリヌクレオチドの断片は、生来の蛋白質の生物学的活性を保持する蛋白質断片をコードする。したがって、ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約20ヌクレオチド、約50ヌクレオチド、約100ヌクレオチド、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600から、NEU1又はPPCAポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチドにわたることができる。
NEU1又はPPCAポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするポリヌクレオチドの断片は、少なくとも15、25、30、50、100、150、200又は250の連続するアミノ酸、或いは全長NEU1又はPPCAポリペプチドに存在するアミノ酸の全数までをコードするであろう。
NEU1又はPPCAポリペプチドの生物学的に活性な部分は、NEU1又はPPCAポリペプチドの部分をコードするポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、そしてポリペプチドのコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現）、そしてNEU1又はPPCAポリペプチドの部分の活性を測定することにより調製することができる。NEU1又はPPCAポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、又は1,400ヌクレオチド、或いは本明細書に開示する全長NEU1又はPPCAポリヌクレオチド配列に存在するヌクレオチドの数までを含んで成るヌクレオチド配列を含むことができる。
「変異体」配列は、高度な配列類似性を有する。ポリヌクレオチドに関し、保存的変異体は、遺伝子コードの縮重のために、NEU1又はPPCAポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような変異体は、既知の分子生物学的技法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及びハイブリダイゼ―ション技法を用いて同定することができる。変異体ポリヌクレオチドにはまた、合成的に誘導されたヌクレオチド配列、例えば部位特異的変異誘発を用いて発生させ、なおNEU1又はPPCAポリペプチドをコードするものが含まれる。一般に、特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書に別途記載される配列アラインメントプログラム及びパラメーターにより決定される場合、当該特定のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれより高い配列同一性を有するであろう。
特定のポリヌクレオチドの変異体はまた、変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとの間の配列同一性％の比較により評価することができる。したがって、例えば、NEU1又はPPCAポリペプチドに対する所与の配列同一性％を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが本明細書に記載される。任意の２つのポリペプチド間の配列同一性％は、記載される配列アラインメントプログラム及びパラメーターを用いて計算することができる。任意の所与の対のポリヌクレオチドが、それらがコードする２つのポリペプチドにより共有される配列同一性％の比較により評価される場合、２つのコードされるポリペプチド間の配列同一性％は、少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれより高い配列同一性である。
「変異体」蛋白質は、生来の蛋白質のＮ−末端及び／又はＣ−末端での１又は複数のアミノ酸の除去（いわゆる、トランケーション）又は付加；生来の蛋白質における１又は複数の部位における１又は複数のアミノ酸の除去又は付加；或いは生来の蛋白質における１又は複数の部位における１又は複数のアミノ酸の置換により、生来の蛋白質から異なる蛋白質を意図する。変異体蛋白質は生物学的に活性であり、すなわちそれらは、生来の蛋白質の所望の生物学的活性を持ち続ける。このような変異体は、例えば、遺伝的多形又は人の操作に由来するであろう。
NEU1又はPPCAポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本明細書に別途記載される配列アラインメントプログラム及びパラメーターにより決定される場合、生来の蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94%％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれより高い配列同一性を有するであろう。蛋白質の生物学的に活性な変異体は、当該蛋白質から、１〜15アミノ酸残基といった少数、１〜10といった少数、例えば６〜10、５といった少数、４、３、２といった少数、又は１アミノ酸残基だけ異なるであろう。
蛋白質は、種々の方法、例えばアミノ酸置換、除去、トランケーション、及び挿入により変えることができる。このような操作のための方法は当業界において知られている。例えば、NEU1又はPPCA蛋白質のアミノ酸配列変異体は、DNAにおける変異により調製することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列変更の方法は、当業界においてよく知られている。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492； Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382；米国特許第4,873,192号； Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)及び本明細書に引用される参照文献を参照のこと。注目の蛋白質の生物学的活性に影響を与えない適当なアミノ酸置換に関する手引きは、Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)のモデルに見出され、この記載を引用により本明細書に繰り入れる。保存的置換、例えば１つのアミノ酸を、類似の性質を有する他のアミノ酸と交換することが好ましい。
したがって、本発明で使用されるポリヌクレオチドは、天然に存在する配列、すなわち「生来の配列」及び変異型を含むことができる。同様に、本発明の方法において使用される蛋白質は、天然の蛋白質並びに変異体及びそれらの修飾された形態を含む。これらの変異体は、組換え事象を実行する能力を持ち続けるであろう。一般に、変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に作られる変異は、配列をリーディングフレーム外に置くべきではなく、そして／又は二次mRNA構造を生成できる相補領域を生成してはならない。欧州特許公開第75,444号を参照のこと。
本発明に含まれる蛋白質配列の除去、挿入及び置換は、蛋白質の特徴に根本的な変化を生成することは予測されない。しかしながら、置換、除去又は挿入の正確な効果を、それを行なう前に予測することが困難な場合、当業者は、効果が日常的選択測定により評価されると理解するであろう。
変異体ポリヌクレオチド及び蛋白質はまた、変異誘発法及び組換え法、例えばDNAシャフリングに由来する配列及び蛋白質を含む。このような方法に関し、１又は複数の異なるNEU1又はPPCAコード配列は、所望の性質を有する新しいNEU1又はPPCAポリペプチドを作り出すために操作することができる。このようにして、組換えポリヌクレオチドのライブラリーが、実質的な配列同一性を有しそしてインビトロ又はインビボで相同性組換えが可能な関連配列ポリヌクレオチドの集団から作られる。このようなDNAシャフリングの戦略は当業界において知られている。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751； Stemmer (1994) Nature 370:389-391； Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438； Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347； Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509； Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291；及び米国特許第5,605,793及び第5,837,458を参照のこと。
Ｘ．配列同一性
本明細書において、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈で、「配列同一性」又は「同一性」は、特定された比較ウインドウにわたって最大対応について整列された場合に同一である２つの配列中の残基を意味する。蛋白質について配列同一性の％が使用される場合、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なると認識され、当該保存的アミノ酸置換の場合、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、荷電又は疎水性）を有し、そしてそれ故に分子の機能的性質を変更しない他のアミノ酸により置換される。保存的置換において配列が異なる場合、置換の保存的性質について補正するために同一性％は上方調整される。
このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行なうための手段は当業者によりよく知られている。典型的には、これは、保存的置換を全体ミスマッチとしてではなく部分的ミスマッチとしてスコアーし、これにより配列同一性％を増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアーが与えられ、そして非保存的置換にゼロのスコアーが与えられ、保存的置換にゼロと１の間のスコアーが与えられる。保存的置換のスコアリングが、例えばプログラムPC/GENE（Intelligenetics, Mountain View, California）において与えられているようにして、計算される。
本明細書で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウインドウにわたって、２つの最適に整列された配列を比較することにより決定される数値であり、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適整列についての参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失を含む。％は、両配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置に数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウインドウ中の位置の合計で割り、そしてその結果を100倍して、配列同一性の％を得ることにより計算される。
特に断らない限り、本明細書において与えられる配列同一性／類似性の数値は次のパラメーターを用いるGAPバージョン10を使用して得られる数値を意味する：GAPウエイト50及び長さウエイト３、並びにnwsgapdna.cmpスコアリングマトリクスを用いるヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％；GAPウエイト８及び長さウエイト２、並びにBLOSUM62スコアリングマトリクスを用いるアミノ酸配列の同一性％及び類似性％；あるいはその任意の同等なプログラム。「同等なプログラム」は、任意の２つの注目の配列について、GAPバージョン10により生成された対応する整列に比べて、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチを有する整列を生成し、そして同一配列同一性（％）を生成する任意の配列比較プログラムを意図する。
本明細書で使用される場合、特に断らない限り、単数表現は複数も含む場合がある。同様に、「又は」の表現は、特に断らない限り、「及び」の意味を含む場合がある。更に、核酸又はポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び分子量又は分子量値はおよそのものであり、説明のために提供されると理解される。
本開示の内容は更に、後記の非限定的実施例により説明される。
本明細書に開示される方法の非限定的な例は下記のとおりである：
１．癌を有する対象のための予後を決定する方法において、
ａ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対象プロファイルであって前記対象からの腫瘍サンプルからのものを提供し；
ｂ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対応する参照プロファイルであって対照サンプルからのものを提供し、
ここで、前記対象プロファイル及び前記参照プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、癌を有する前記対象について予後を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性に比べて前記対象の低いリソソームシアリダーゼ活性、高いNEU1基質シアリル化活性、又は高いNEU1レベル活性が、前記対象の浸潤癌（invasive cancer）の予測をもたらす；
段階を含んで成る方法。
２．対象における癌を診断する方法において、
ａ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対象プロファイルであって前記対象からの腫瘍サンプルからのものを提供し；
ｂ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むNEU1活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
を含んで成る対応する参照プロファイルであって対照サンプルからのものを提供し、
ここで、前記対象プロファイル及び前記参照プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、前記対象について診断を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性に比べて前記対象のリソソームシアリダーゼ活性が低い場合、NEU1基質シアリル化活性が高い場合、又はNEU1レベル活性が高い場合、前記対象が癌を有すると診断する；
を含んで成る方法。
３．癌を有する対象におけるリソソーム作用性（lysosomotropic）化学療法剤療法について予後を決定する方法において、
ａ）前記対象からの腫瘍サンプルからの対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供し；
ｂ）対照サンプルからの参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供し、ここで、前記対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、対象におけるリソソーム作用性化学療法剤療法について予後を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性に比べて前記対象の低いリソソームシアリダーゼ活性が、前記癌が前記リソソーム作用性化学療法剤に対して耐性であるとの予測をもたらす；
段階を含んで成る方法。
４．前記対照サンプルが、前記対象からの前記腫瘍に隣接する正常組織である、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．シアリダーゼ活性を表わす前記１又は複数の値が、LAMP-1蛋白質のレベルを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
６．リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1蛋白質のレベルを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
７．リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1シアリル化のレベルを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
８．リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1シアリル化のレベルを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
９．リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1シアリル化のレベルを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
10．リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1のレベル、MUC-1蛋白質のレベル、LAMP-1シアリル化のレベル及びMUC-シアリル化のレベルを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
11．リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1蛋白質のレベルを含む、態様１に記載の方法。
12．前記癌が、横紋筋肉腫、乳癌、結腸癌、膵臓癌、急性リンパ芽球白血病、又はユーイング肉腫（Ewing's sarcoma）である、態様１〜11のいずれか１項に記載の方法。
13．対象におけるアルツハイマー病に関連する認知症の診断方法において、
ａ）前記対象からの脳脊髄液のサンプルの対象リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供し；
ｂ）脳脊髄液の対照サンプルの参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供し、ここで、対象リソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルはリソソームエキソサイトーシス活性を表わす１又は複数の値を含んで成り；そして
ｃ）前記対象のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び前記参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを比較する、ここで、対象が、参照リソソームエキソサイトーシス活性に比べて高いリソソームエキソサイトーシス活性を有する場合、当該対象はアルツハイマー病に関連する認知症を有すると診断される；
を含んで成る方法。
14．前記対象のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び前記参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルが、
（ａ）リソソームシアリダーゼ活性プロファイル、ここで前記対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記対応する参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含んで成る、又は
（ｂ）シアリル化活性プロファイル、ここで対象シアリル化活性プロファイル及び対応する参照シアリル化活性プロファイルは、シアリル化活性を示す１又は複数の値を含んで成る、
を含んで成る、態様13に記載の方法。
15．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1シアリル化のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
16．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1シアリル化のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
17．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1シアリル化のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
18．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、アミロイド前駆体蛋白質のシアリル化のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
19．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、トランスチレチン（transthyretin）、β−２ミクログロブリン又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質のシアリル化のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
20．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1蛋白質のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
21．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1蛋白質のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
22．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、アミロイド前駆体蛋白質のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
23．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1蛋白質のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
24．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1蛋白質のレベル、MUC-1蛋白質のレベル、LAMP-1シアリル化のレベル及びMUC-1シアリル化のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
25．リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、ヘキソスアミニダーゼβ、マンノシダーゼα、トランスチレチン（Transthyretin）、β−２ミクログロブリン又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質のレベルを含んで成る、態様13に記載の方法。
26．癌を有する対象の治療方法において、それを必要とする対象に、療法的有効量の、配列番号：２に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するノイラミニダーゼ−１（Neuraminidase 1）（NEU1）ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
27．アルツハイマー病に関連する認知症を有する対象の治療方法において、それを必要とする対象に、療法的有効量の、配列番号：２に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するノイラミニダーゼ−１（Neuraminidase 1）（NEU1）ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
28．配列番号：４に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、NEU1酵素活性を増強する保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）ポリペプチドを投与することを更に含んで成る、態様26又は27のいずれか１項に記載の方法。
29．前記NEU1ポリペプチド及びPPCAポリペプチドが別々に又は同時に投与される、態様28に記載の方法。
30．前記NEU1ポリペプチドの投与が、配列番号：１に対して少なくとも85％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るウイルスベクターの投与を含んで成る、態様29に記載の方法。
31．リソソームシアリダーゼ活性プロファイルの生成方法において、
（ａ）対象からの腫瘍からのサンプルを得；そして
（ｂ）LAMP-1蛋白質のレベル又はLAMP-1シアリル化のレベルについて測定する；
ことを含んで成る方法。
32．１又は複数の追加のリソソームシアリダーゼ活性マーカーを測定することを含んで成る、態様31に記載の方法。
33．前記１又は複数の追加のリソソームシアリダーゼ活性マーカーが、NEU1基質を含んで成る、態様32に記載の方法。
34．脳脊髄液からリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを生成する方法において、
（ａ）対象から脳脊髄液のサンプルを得；そして
（ｂ）リソソームエキソサイトーシス活性について測定する；
ことを含んで成る方法。
35．前記リソソームエキソサイトーシス活性についての測定が、LAMP-1蛋白質のレベル又はLAMP-1シアリル化のレベルについての測定を含んで成る、態様34に記載の方法。
36．前記リソソームエキソサイトーシス活性についての測定が、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、ヘキソスアミニダーゼβ、マンノシダーゼα、トランスチレチン（Transthyretin）、β−２ミクログロブリン又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質についての測定を含んでなる、態様34に記載の方法。
37．得られる活性値の観点で、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを集合することを含んで成る、態様31〜33のいずれか１項に記載の方法。
38．得られる活性値の観点で、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを集合することを含んで成る、態様34〜36のいずれか１項に記載の方法。
39．対象がヒトである、態様１〜38のいずれか１項に記載の方法。
本件の開示事項を更に、下記の非限定的な実施例により説明する。
概観
本発明者らは、リソソームシアリダーゼNEU1で制御されるリソソームエキソサイトーシスと、２つの病的状態、すなわち（１）癌及び（２）アルツハイマー病との間の新規な関連性を発見した。NEU1の欠損がその基質LAMP-1をもたらし、今度はこれがリソソーム内容物のエキソサイトーシスを促進する。この生理的結果は影響される組織に依存する。例えば、細胞外環境への活性蛋白質の放出は、腫瘍を取り囲む組織の改変を生じさせるであろう。脳において、この放出はアミロイド発生性蛋白質のプロセッシング及びプラークの形成をもたらすであろう。更に、リソソームに蓄積するゼノバイオティクス（xenobiotics）は、このメカニズムを介して流出し、薬物代謝を変更するであろう。この応用は、癌細胞における化学療法耐性を予言する物として及びアルツハイマー病に関連する認知症の予後マーカーとして特に重要である。
本発明者らは、NEU1の欠失を可視化するために使用されるNEU1の喪失についての２つの読出し情報を同定した。これらは、NEU1の基質、ムチン、及び後記のLAMP-1である。これが実際に、NEU1欠損／下方制御、及びそれ故に増加したリソソームエキソサイトーシスのための可能性ある代理マーカーであることを、本発明者らは示唆する。したがって、このマーカーは、他のNEU1基質と組み合わされた場合、侵襲性及び化学療法耐性の両者を予言する、癌の脱制御されたリソソームエキソサイトーシスを示すものでありうる。
癌生検体においてNEU1の発現又は触媒活性を測定することは、２つの幾分関連する応用を有する。１）癌の状態を決定すること：高いNEU1活性＝少ない攻撃性／良好な予後；低いNEU1活性＝高い攻撃性／悪い予後；及び２）化学療法に対する応答性を予測すること：高いNEU1活性＝低いリソソームエキソサイトーシス／薬物の低い細胞外流出／高い応答性；低いNEU1活性＝増加したリソソームエキソサイトーシス／高い薬物流出／低い応答性。
或いは、この情報は、NEU1基質のパネルを介して収集することができる。これらの過剰シアリル化された状態における基質糖蛋白質及び活性なリソソーム酵素の蓄積は、発現における個別的な上方制御ではなくプロセッシングの全体的な変化を示し、これが現在仮定されていることである。次に、この全体的な変化は、結果を予測させ、そして侵襲性の低いNEU1腫瘍の指紋として使用できるであろう。
この発見はまた、療法的応用を有する。リソソームエキソサイトーシスの負の制御を回復することにより、癌細胞は、化学療法剤により一層治療されやすくなり、そして同時に侵略的でなくなる。このことは、NEU1自体を投与することにより、又はその安定化パートナー、保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）を投与することにより、或いは他の手段、すなわちLAMP1下方制御により可能であろう。
同様に、リソソームエキソサイトーシスの下流効果を、アルツハイマー病の分子指紋として使用することができる。例えば、脳脊椎液における活性なリソソーム酵素及びNEU1の他の潜在的な基質の高いレベルは、患者における後発アルツハイマー病に関連する認知症の診断を可能にし、現在存在する患者のケアーのギャップを埋める。
これは、攻撃性の低い癌から一層攻撃的な癌を区別するための新規なアプローチであり、療法的決定の指標となりうるものである。本発明はまた、新規な癌療法及び神経変性療法に導くことができ、これは既存の技法を補完し又は全く新たなアプローチを提供する。
実施例１． 癌の発達、進行、及び化学療法耐性におけるNEU1の欠損
リソソームシアリダーゼNEU1の欠失は、リソソーム貯蔵疾患であるシアリドーシスをもたらす。Ｉ型シアリドーシスは、破滅的な小児科疾患であり、他方II型又は成人開始シアリドーシスは、NEU1の残留活性を維持する遺伝子変異により惹起される比較的穏和な状態である。シアリドーシスのマウスモデルで行なわれた、NEU1欠失への発明者自身の研究は、リソソームエキソサイトーシスの阻害剤としてのNEU1の新しい機能を示した。NEU1の不存在下で、その基質LAMP-1は蓄積し、PMに繋がれたリソソームの数が増加し、リソソームエキソサイトーシスに乗り出す準備ができる。
その結果、カテプシンのような活性プロテアーゼを含めてのリソソーム内容物は、常軌を逸して細胞外に放出され、細胞外マトリクス構造及び組成にインパクトを与える可能性が高い。本発明者らは、細胞外マトリクスを大いに変える癌細胞にとって有利でありうると仮定した。したがって、本発明者らは、４つの癌タイプ：乳癌、直腸癌、ユーイング（Ewing）肉腫、及び胞巣状横紋筋肉腫からの種々の癌細胞系におけるNEU1の発現を試験した。試験した各タイプの癌について、低いレベルのNEU1活性が過剰シアリル化されたLAMP-1の増加した発現と相互関連した。ここの本発明者らは、低いNEU1、高い細胞外表現型、及び細胞の攻撃能力の間の相互関連について報告する。
幾つかの場合、試験した細胞系の攻撃性は知られていた。例えば、 the syngeneic system of SW480及びSW620結腸癌系の相乗系は、同じ患者からの、それぞれ一次及び転移腫瘍に由来する細胞から成る。ユーイング（Ewing）肉腫及び胞巣状横紋筋肉腫のような他の場合において、試験した細胞系の攻撃能力が、腹腔内侵入のエクスビボモデルを用いて発明者らの手により決定された。これらの研究は、癌の拡がりを理解するための新しい模範を確立する：攻撃能力は、活性プロテアーゼのリソソームエキソサイトーシスを介しての細胞外マトリクスの変性により増強される。
リソソームエキソサイトーシスは、癌細胞について特に重要性を有する構成的細胞生理学の部分である。細胞外マトリクス（ECM）へのリソソーム内容物の移行は、ECMの再構成及び攻撃に対する健康な組織の増加した弱みをもたらす。更に、多くの一般に使用される化学療法剤は、それらの弱塩基性のために、酸性リソソームに蓄積する。したがって、リソソームエキソサイトーシスは、生体異物の流出の方法を構成し、癌細胞の毒性負荷を救済する。本発明者らは、リソソーム酵素であるノイラミニダーゼをリソソームエキソサイトーシスの負の制御因子として特徴付けた。そしてここに幾つかの癌タイプにおけるNEU1の下方制御、及びNEU1の喪失と関連する癌細胞についての有利な生理学的結果を示す。
シアリダーゼとしてのその権威ある役割に加えて、NEU1は、リソソームエキソサイトーシスの構成的過程に対する関連する且つ深遠な効果を有する。この機能性は、NEU1の非存在下で超グリコシル化されたままであるNEU1基質リソソーム関連膜蛋白質１（Lysosomal Associated Membrane Protein 1；LAMP1）により介在される。LAMP１のこの超グリコシル化状態は、原形質膜（PM）でのリソソームの連結、及びそれに続く、影響された細胞及びその環境の両方に一連の有意な生理学的変化を惹起するエキソサイトーシスを促進するようである。ここに、本発明者らは、NEU1の喪失及びLEXの激化が、癌細胞における２つの主要な生理学的変化：増強された侵入能力、及び化学療法に対する増加した耐性をもたらすことを示すデータを提示する。
ヒト癌におけるNEU1の一般的役割を先ず確立するため、発明者らは、NEU1、及びその天然基質であるLAMP-1及びムチンの両方について多腫瘍アレーをプローブした。本発明者らは、健康な組織に較べて腫瘍におけるNEU1の下方制御が癌のタイプにわたって起こること、及びLAMP-1又はムチン染色の使用がこの変化のための代理マーカーとして機能したことを見出した（データは示さない）。この発見は有意である。何故なら、ムチンMUC-1は長い間信頼のおける癌マーカーとして使用されており、そしてこの研究が示唆するところによれば、それは多くの他の予測可能な機能的結果を有する他の変化の下流であるからである。
癌におけるNEU1レベルの変化の機能的結果を試験するため、本発明者らは、幾つかの細胞系を評価した（データは示さず）。各場合において、本発明者らは、細胞溶解物中のNEU1活性及び過剰装飾されたLAMP-1の対応する豊富さを評価した。評価された各セットについて、相対的攻撃能力が、文献又はマトリゲル侵入測定の何れかから決定された。一層侵入性の細胞は、同じ癌タイプの侵入性の低い細胞に比べて、一貫して低下したNEU1活性及び増加したLAMP1レベルを示した（データは示さず）。本発明者らはRH41及びRH30細胞系を選択した。何故ならこれらの胞巣状横紋筋腫系は、我々の研究室で長期間関心を持っていた骨格筋から生じたからである。
RH30細胞に比べてRH41細胞におけるNEU1の相対的に高いレベルは、記録保管されたマイクロアレイデータ、リアルタイムPCR、ウエスタンブロット、及び免疫蛍光法により更に確認された。RH41細胞における低下したLAMP-1に加えて、NEU1の高いレベルは、メディア活性測定及びTIRF造影により測定されるリソソームエキソサイトーシスの減少を相互関連する（データは示さず）。これらの生理学的マーカーに対するNEU1発現の重要性を試験するため、本発明者らは、それぞれの空ベクター対照と共に、RH30細胞におけるNEU1の上方制御及びRH41細胞における下方制御を伴う、各細胞系の安定なクローンを生じさせた。各細胞系の発現レベルが他方において再要約された後、本発明者らは、LAMP-1及びTIRF造影（並びに活性測定）を介してエキソサイトーシスの変化について試験した。予想どおりに、本発明者らは、NEU1が、LAMP-1の蓄積により印される、癌細胞環境におけるリソソームエキソサイトーシスの負の調節物質であることを力強く示した（データは示されず）。
癌細胞におけるリソソームエキソサイトーシスの調節物質を同定するための幾つかの即座の暗示が存在する。この過程は、侵入能力及び化学療法耐性の両方に寄与することが示されている。但し、この過程を変更する特定の標的は、NEU1に至るまで提案されていない。リソソームエキソサイトーシスは、細胞外マトリクスへの活性リソソーム酵素の流出のための最も可能性ある方法であり、そしてECM中カテプシンＢのような酵素の存在は、癌のタイプにわたっての転移と相互関連する。活性プロテアーゼはECM再構成に寄与し、そして腫瘍の拡がりを含む微環境の能力を阻害する。したがって、本発明者らは、安定な細胞系を、何れもカテプシンの如きリソソーム酵素による消化に対して感受性であるラミニン及びコラーゲンIVから主として構成されるマトリゲル基質に侵入するそれらの能力について試験した。
RH41及びRH30の安定なクローン系をそれぞれマトリゲルプラグ上に２日間プレートした。次に、プラグを、固定し、封入し、切片にし、そしてＨ＆Ｅにより染色して、基材への細胞の進入を可視化した（データは示されず）。親細胞系とは無関係に、低いNEU1を有するクローンは２日後にマトリゲルに好結果に侵入し、他方、高いNEU1を有する細胞はゲルから排除された。この実験は、癌細胞のNEU1状態がECMに侵入する細胞に能力を決定することができることを確立した。
しかしながら、本発明者らは更に、非−悪性組織に対するリソソームエキソサイトーシスの長期間の影響力を試験することを欲した。本発明者らは、腫瘍の境界において、癌からの過度のリソソームエキソサイトーシスが侵入のための周囲組織の条件を整え、健康な組織を転移事象に対して一層感受性にする、と仮定した。したがって、本発明者らは、野生型マウス又はNeul−ノックアウトマウスから収得した腹膜を用いて、エクスビボ設定で、親RH30及びRH41細胞の進入能力を試験した。ノックアウトマウスから集めた組織は、構成的過剰のリソソームエキソサイトーシスを受けており、そしてそれ故に、NEU1の下方制御のために過剰のリソソームエキソサイトーシスを受ける癌の周縁の健康な組織を代表することができる。
事実、一層侵入性のRH30細胞は、野生型動物の腹膜を横切って侵入することができたが、他方RH41細胞は大きく排除され、マトリゲル測定からの結果が再確認された。重要なことには、RH30細胞が野生型に好結果に侵入したのと同様に、侵入性の低いRH41細胞はノックアウト腹膜に侵入することができた。この結果が示唆するところによれば、癌の攻撃性とは独立に、長時間のリソソームエキソサイトーシスにより行われた損傷は、組織を侵入に対して感受性にする。更に、ノックアウト腹膜上に置かれたRH30細胞は、侵入に対して最も攻撃的な比率をもたらした。したがって、本発明者らは、エキソサイトーシスの原因には無関係に、リソソームエキソサイトーシスはECMに対して有意な損傷を与える、と結論した。癌細胞の場合には、エキソサイトーシスの一層高い比率を有する細胞は、標準基材にたいして一層好結果に侵入する。
NEU1の下流の機能的変化についての第二の予測はまた、胞巣状横紋筋肉腫にも妥当することが証明された。RH30細胞系はドキソルビシンに対するベースライン耐性を有し、この耐性はNEU1の添加により弱化されうる。逆に、RH41細胞は、ドキソルビシンに対して高度に感受性であり、そしてNEU1の上方制御に際して耐性を獲得する。この結果は、多くの理由によるリソソームを通した薬物の流出に特に向けられる。第一に、ドキソルビシンは、多くの化学療法剤と同様に、弱い塩基であり、これは酸性のリソソーム空間に蓄積する。第二に、これらの細胞系の何れもｐ−糖蛋白質を発現せず、薬物流出の伝統的に研究された方法である。これに対して、本発明者らは、12時間にわたるドキソルビシンの動きを予測することができ、そして次のことを観察した：
（１）リソソームは、細胞の崩壊に先立ち、RH41細胞の核の回りに集まる；
（２）リソソーム酵素であるカテプシンＢは、アポトーシスに先立ち核に移行する；
（３）これらの細胞におけるドキソルビシン負荷は、最終的に完全に核内に保持される；及び
（４）耐性細胞は、ドキソルビシンの可動性部分を、リソソーム内に維持する（データは示されない）。
NEU1の状態のへ変更はこれらの傾向を逆転させた；それは、アポトーシスに対してRH30細胞を完全には感受性にしなかったが、ドキソルビシンの今まで無害であった量において、PARPの開裂を観察することができた（データは示されない）。完全な阻害がドキソルビシン耐性を完全に除去することができるか否かを見るために、本発明者らはリソソームエキソサイトーシスを化学的に阻害することを決めた。これを行なうため、本発明者らは、ｐ−糖蛋白質の阻害剤であると従来考えられていたカルシウムチャンネルブロッカーであるべラパミル（verapamil）を使用した。
しかしながら、最近の研究が示すところによれば、この薬物は、ｐ−糖蛋白質の状態に無関係に細胞をこの薬物に対して感受性にすることができ、他のメカニズムがこの薬物の真の標的であることが示された。リソソームエキソサイトーシスはCa++流入に依存するので、カルシウムのキレート化が過程を化学的に停止させ、そして検証できる変化を提供するであろう。べラパミル及びドキソルビシンと共にインキュベートされたRh30細胞は、薬物に対して十分に感受性にされ、RH41細胞の表現型が再確認される（データは示されない）。ドキソルビシンは、ベラパミル−感受性化RH30細胞の核において殆ど排他的に可視化され、そして薬物の可動性部分の除去が示される（データは示されない）。
結論として、本発明者らは、NEU1により制御されるリソソームエキソサイトーシスは癌細胞表現型における重大な決定因子であるというモデルを提示する（図１を参照のこと）。NEU1の喪失がその基質の蓄積及びベースライン生理への変更をもたらす。細胞外空間へのリソソーム内容物の移動の２つの結果は、ECMの変性及びリソソームに蓄積する化学療法剤の流出である。したがって、NEU1の下方制御は、何れも少なくとも部分的にリソソームに集まることが知られている、一般に使用されるドキソルビシン、シスプラチン及びドセタキセル（docetaxel）を含めての或る種の化学療法剤に対する耐性についての重要な予言事象であろう。
更に、一緒に考えれば、これらのデータは、NEUの遺伝的欠損により人々は癌の獲得に一層感受性となり、そしてそれらの癌は攻撃的になる傾向があると予測させる。
実施例２． 化学療法耐性におけるNEU1の役割
背景
横紋筋肉腫（RMS）は、小児における最も一般的な軟組織悪性腫瘍である。転移性疾患を有すると診断された小児について、３年生存率は約30％でしかない。全身性化学療法が、これらの患者のための主たる治療法であり、---そしてここセントジュード（St. Jude）において幾つかの組合せ法が用いられているが、---しかし薬剤耐性はしばしば応答を鈍らせる。本発明者らは最近、薬物耐性が如何にして生じるかについて新規な仮説を発展させ、そしてここにメカニズムを解明するための研究を提案する。手短にいえば、化学療法剤はしばしば、多機能性酸性細胞小器官であるリソソームに蓄積する。次に、リソソームは細胞周辺に移送され、それらの膜を原形質膜と融合させ、そしてそれらの内容物を細胞外空間に放出することができる。リソソームエキソサイトーシス（LEX）と称されるこの過程は、薬物への細胞内暴露を効果的に限定することができる。
本発明者らの研究室における最近の研究は、LEXの負の制御物質としてリソソームシアリダーゼNEU1を同定した。NEU1が無い場合、その基質LAMP1（リソソーム関連膜蛋白質；Lysosome Associated Membrane Protein）がリソソーム中に蓄積し、そしてそれらの原形質膜への移行を助ける。RMS細胞系についての本発明者らの最初の研究が示すところによれば、NEU1の安定なノックダウンが、高レベルのLAMP1、更なるLEX、及び更なる薬物耐性をもたらす。逆に、NEU1の下方制御は、低いLAMP1、低いLEX、及び低下した薬物耐性をもたらす。したがって、NEU1の下方制御は癌細胞にとって有利であり、そして本発明者らは、小児科RMS腫瘍サンプルにおいて上記のような喪失を観察した。単にNEU1を患者に投与することは適当ではないであろう。NEU1蛋白質は、そのシャペロンである保護蛋白質カテプシンＡ（PPCA）との複合体形成を必要とし、これが律速段階であることが明らかにされよう。しかしながら、PPCAを増強することが、NEU1残留活性を有意に増強することが知られており、そしてこのことがLEXの臨床的コントロールへの一層従順な入口であることが証明されよう。
仮説及び特定の目的
リソソームエキソサイトーシスの下方制御は化学療法に対するRMS反応を増強するであろう。本発明者らは、下記の２つの目的において治療の増強のための機会をLEXが同定するという本発明者らの理解を補強することを意図する。
（１）PPCA上方制御が、NEU1活性を増加させることを介して結果を増強するか否かを決定すること。本発明者らの研究室はPPCAのためのAAVに基づく送達方法を開発しており、これは、ガラクトシアリドーシスを有する小児のための酵素置換法としての臨床試験の入り口である。この研究は、ベクターが癌治療にとっても同様に有意義であることを示唆する。
（２）LAMP1の標的化が改良された結果をもたらすか否かを決定すること。LAMP1の小部分は、輸送機構への結合のために利用可であり、そしてリソソームの抹消移行を促進する。本発明者らは、この配列に対する抗体の細胞内送達を、細胞小器官の競争的結合のため及び細胞小器官の動きを制限するために使用する。この方法の成功は、小分子の開発の可能性ある標的としてLAMP1を有効にするであろう。
設計
これらの実験は、インビトロ研究における原理の証拠（proof-of-principle）として、よく特徴づけられた肺胞RMS細胞系において行われるであろう。特定の目的１のため、AAV-PPCAの投与量曲線及び化学療法剤のパネル（ドキソルビシン、シスプラチン、ビンクリスチン）が、アポトーシスの導入のために試験されるであろう。特定の目的２のため、上記と同じパネルが、細胞内送達のための樹立された方法に従う２つ濃度のLAMP1抗体と共に使用されるであろう。各介入（intervention）について、LEXは培養液中のリソソーム酵素のレベルを測定することにより測定されるであろう。
潜在的衝撃
この研究は、LEXを化学療法の結果の決定因子として確立するであろう。次に、本発明者らが試験する蛋白質の組、PPCA、NEU1及びLAMP1は全て、LEXの能力について所与の患者の腫瘍を特徴付けるマーカーとして使用されるであろう。第二に、この研究は、LEXを阻害するために可能性ある標的化された方法を示すと期待される。これは、一般に癌の治療に衝撃を与えるのみならず、特に一旦転移した後、小児科肺胞RMSの治療の主たる障害となる。
背景
化学療法耐性は、転移胞巣状横紋筋肉腫を有する小児が直面する主たる問題である。癌細胞は、薬物を「排出する」ことにより化学療法を回避する。例えば、薬物はリソソームと称される細胞小器官に蓄積することができ、次に細胞小器官は細胞表面に移行し、細胞膜と融合し、そしてそれらの内容物を外に放出する。この過程は、リソソームエキソサイトーシスとして知られている。ここで、本発明者らは、この過程における主役を試験し、そして化学療法剤が標的にされた細胞内に残りそしてその崩壊を惹起するするように如何に阻害するかを研究する。先ず、PPCAは、酵素NEU1をリソソームに案内し、そしてその活性を増強するリソソームタンパク質である。次に、NEU1は、その標的基質の１つであるLAMP1を分解するのを助ける。当該後の工程は、リソソームでのLAMP1の蓄積を回避するのに重要であり、この蓄積は激しいエキソサイトーシスを生じさせる。ここに、本発明者らは、エキソサイトーシスを阻害しそして試験された薬物が癌細胞に維持されることを可能にする、上流（PPCA）及び下流（LAMP1）プレイヤーに影響を与える試験方法を提供する。
仮説及び特定の目的
薬物のリソソームエキソサイトーシスは化学療法の有効性を減少させるが、これは、PPCAを上方制御し又はLAMP1を下方制御することにより逆転させることができる。特定の目的１は、ウイルス送達方法を用いてPPCAの上方制御を試験することであろう。特定の目的２は、リソソーム移行を促進することができないように、LAMP1の結合部位に対する抗体の使用を介してLAMP1の阻害を試験することであろう。
潜在的衝撃
この研究は、化学療法応答の主要な決定因子としてリソソームエキソサイトーシスを確立することが期待される。したがって、このメカニズムの理解により、臨床医が腫瘍の細胞外放出能力を予測し、そして薬物の組合せ／投与量を適合させることが可能になる。更に、本発明者らは、リソソームエキソサイトーシスを阻害しそして患者の応答を増強するために、潜在的に薬剤としての可能性がある標的を樹立することを望む。
実施例３． リソソームシアリダーゼNeu1の欠損に関連する初期アルツハイマー病表現型
リソソームシアリダーゼNeu1は、末端シアル酸残基を除去することによりシアロ−糖接合体の加水分解を触媒する。ヒトにおいて、この酵素の一次的及び二次的欠損は、２つの臨床的に類似する神経変性的リソソーム貯蔵疾患：シアリドーシス及びガラクトシアリドーシスをもたらす。Neu1を欠損するマウスは、シアリドーシスの早発性重症型を発症する。本発明者らは、NEU1活性の欠失は、Lamp-1のシアル酸含量に影響を与えることにより、種々の細胞タイプにおけるリソソームエキソサイトーシスの過程を悪化させることを発見した。これは、リソソームのプールがPMに繋がり、そしてリソソームエキソサイトーシスに携わる可能性を増す。
この研究において、本発明者らは、過剰なリソソームエキソサイトーシスが、Neu1-/-マウスの脳において見られる神経学的観点の幾つかの基礎となるか否かを研究した。これらのマウスの脳組織病理学的試験が示したところによれば、特に海馬のCA3領域及び隣接する海馬采における、APP/Aβペプチドを含む封入体／沈着物の前進的且つ時間依存的沈着を示した。影響を受けた領域は、野生型脳のNeu1高発現部位と共存する。この異常は、過剰シアリル化Lamp-1及び活性化されたプロテアーゼの異常な発現と平行しており、これらの性質の両方は過剰なリソソームエキソサイトーシスと関連している。これらの発見は、神経変性疾患のマウスモデルにおけるAD−様表現型の自発的生成の例を提供し、そしてアルツハイマー病の病原メカニズムの幾つかの理解に寄与することができる。
リソソーム貯蔵疾患（LSD）は、リソソーム機能の50より多くの１群の遺伝的不全を含み、その殆どがグリカン開裂リソソーム性加水分解酵素により惹起される。酵素の欠損は、通常、損なわれた基質の分解、並びにそれらの、全身性器官及び神経系の細胞におけるそれらの蓄積を導く。ここで、本発明者らは、リソソームシアリダーゼNeu1を欠くマウスが、神経変性LSDシアリダーゼを再現する外に、脳の病的及び分子的変化を生じさせ、これは早期アルツハイマー病を暗示するものであるという証拠を提示する。Neulの機能の喪失の結果、神経細胞の過剰なリソソームエキソサイトーシス及び過剰シアリル化されたNeu1基質、アミロイド前駆体蛋白質（APP）を含めて、の蓄積の出現の組合せが、この病原的カスケードの基礎となる。これらの発見が、ADに貢献しそして／又はその素因となる今まで知られていなかった分子のメカニズムを明らかにする。
哺乳類リソソームシアリダーゼNEU1の基本的役割は、末端シアル酸除去することによりシアログリコン接合体（sialoglyconjugate）の加水分解を開始することである。この活性は、細胞の恒常性のために必須であり、何故なら、NEU1活性を変更する遺伝的欠損はリソソーム代謝を遮断しそしてLSDシアリドーシスをもたらすからである。本発明者らは最近、リソソームエキソサイトーシス（LEX）として知られる生理学的過程の唯一の負の調節因子としてNeu1を同定した。リソソームエキソサイトーシス（LEX）は、リソソームを原形質膜（PM）に動員しそしてそこに結合させるCa2+−依存性の制御されるメカニズムであり、この段階は、リソソーム関連蛋白質−１（LAMP-1）により促進され、そして次に、リソソーム膜とPMとの融合、及び細部外空間へのリソソーム内腔内容物の放出が起こる。本発明者らは次のことを示した。すなわち、マウスBMマクロファージでのNeu1の喪失によりリソソームのプールが増加し、これはLM上の過剰シアリル化されたLAMP-1により飾られ、細胞外放出性となる。この過程の続いて起こる悪化が疾患を導く。
ここに、本発明者らは、LEXのNeu1−依存的増加が、シアリドーシスのマウスモデル（Neu1-/-）における神経変性を担当する基礎となる分子メカニズムであるか否かを試験した。本発明者らは次のことを見出した。すなわち、Neu1は脳実質全体にわたって存在するが、野生型脳の２つの領域：海馬及び脈絡叢（CP）で優先的に発現された（データは示されず）。CPは脳の放出性構造であって、脳脊髄液（CSF）を生成し、そして分泌し、そして血液とCSFとの間の障壁面として機能する。KOマウスにおいて、CPは、リソソーム系の強い液胞形成及び拡大に関連する明白な形態的変化を受けた（データは示されない）。この表現型には、Neu1の標的基質である、長く維持される過剰シアリル化されたLamp-1の増加した発現が伴った（データは示されない）。本発明者らは、Neu1-/-マウスの他の細胞及び組織におけるこの特徴を示し、そしてそれが過剰なLEXの読出しとして使用できることを示した。これは、何れもKO CSF において増加したリソソーム酵素であるα−マンノシダーゼ及びβ−ヘキソスアミニダーゼの活性を測定することにより確認された（データは示されず）。
本発明者らは、CSFへのリソソーム内容物の過剰なエキソサイトーシスはその組成を劇的に変化させると理由付けた。本発明者らはこの可能性を、高い処理能力のプロテオームを用いてNeu1-/-CSFサンプル及び Neu1+/+CSFサンプルの総蛋白質含量を比較することにより研究した。本発明者らは、カテプシンＤ及びカテプシンＢ、並びにKO CSFに異常な量で存在する他の蛋白質を含めて多くのリソソーム酵素を見出した（図２）。これらの蛋白質の幾つかの増加したレベルはまたKO動物のCP細胞中に観察された（データは示されない）。本発明者らは、KOマウスのCSF中に増加した蛋白質の多くが、悪化したLEXを介して細胞外に分泌されるNEU1の未消化の基質を代表することを仮定した。
明白に、Neu1-/- CSFにおいて異なる態様で制御される多数の蛋白質がまた、アルツハイマー病と関連する可能性ある認知症予測性バイオマーカーとして同定された（図２）。したがって、１つの正常にNeu1に富む脳領域における細胞生理学の深遠な変化は、それに続く、Neu1が失われた場合にアルツハイマー−様状態を高度に示唆する下流変化を生じさせるであろう。この理由のため、本発明者らは、Neu1-/- CSFの組成の観察される変化に、脳実質における神経細胞の変化した特徴が平行すると仮定した。本発明者らは、Neu1を高レベルで発現するWT脳の他の領域は、ADの分野において最も高度に研究された脳の構造の１つである海馬である（データは示されない）との観察に興味をそそられた。Neu1の減少がLamp-1の蓄積及びそれに続く過剰なLEXをもたらすという本発明者らの明確な模範と一致して、本発明者らは、先ず、Lamp1に注目し、そしてKO脳にわたるこの蛋白質の顕著な増加を観察した（データは示されない）。これは、過剰シアリル化されたLamp-1の増加した量を同定する脳海馬蛋白質抽出物のイムノブロット分析により確認された（データは示されない）。
これらの結果に基づき、本発明者らは、Neu1-/-マウスの脳実質中の細胞はまた、過剰なLEXを働かせると仮定した。顕著なことに、Lamp1はミクログリア集団において高度に発現され（F4/80染色、データは示されない）、この細胞集団は、BMマクロファージについて既に証明されているように、脳実質の中で最も細胞外放出性であると示唆される。本発明者らはこれを、WTミクログリア及びKOミクログリアを培養することにより研究した。本発明者らは、それらの細胞外放出活性を、培地中に存在する活性なリソソームヒドロラーゼのレベルを測定することにより試験し、そしてKOミクログリアからの培地中の活性なリソソームβ−ヘキソスアミニダーゼの顕著な増加を見出した（データは示されない）。
本発明者らは次に、KO海馬及び注目される多くの異常な好酸性封入体の組織病理学的特徴を試験した（データは示されない）。これらは、サイズ及び殆どの含まれる顆粒状蛋白質性物質において変化に富む（データは示されない）。EMのレベルにおいて、これらの封入体は、自己貧食性液胞に類似する異常な形態の多くの液胞を含む膨潤した異栄養性神経突起として同定された（データは示されない）。これらの性質は、ADに関連する膨張した異栄養性神経突起を高度に暗示する。したがって、本発明者らは、これらの構造の十分な特徴付けを、APPのＮ−末端部分に反応性に抗体から出発して開始し、そしてNeu1-/-脳の海馬のアンモン角（CA3）の第三亜領域の錐体細胞における当該蛋白質の時間依存的前進的蓄積を見出した（データは示されない）。
この表現型がNeu1欠損に直接リンクしているか否かを試験するため、本発明者らは、Neu1-/-脳におけるAPPのシアリル化状態を分析した。APPの過剰シアリル化の証拠が免疫沈澱研究から得られた：野生型脳サンプル及びNeu1-/-脳サンプルからの海馬蛋白質抽出物の同じ量を、APP C−末端抗体を用いて免疫沈澱し、そして（α−2,6）結合により末端ガラクトースに結合したシアル酸に優先的に結合するサンブカス・ニグラ（sambucus nigra）レクチン（SNA）を用いて試験した（データは示されない）。
APPの僅かな過剰発現が家族性ADにおけるADの進行及びAPP遺伝子座の倍化のための危険因子であり、そしてダウン症候群患者が早発性ADの基礎であることはよく確立されている。したがって、本発明者らは、Neu1-/- マウスの脳におけるADの診断のために一般に適用される多数の権威ある組織学的マーカーを試験した。膨潤した変性神経突起がチオフラビンＳ蛍光により容易に検出され、それらがアミロイド沈着に構造的に類似していることが示唆された（データは示されず）。ビールショウスキー（Bielschowsky）銀染色の変法もまた、経年のマッチした野生型マウスでは見られない散乱した銀陽性神経突起構造を強調した（データは示されない）。APP蓄積神経突起はまた、APP/Aβを認識する抗体と免疫反応性であり（データは示されない）、そして42番目のアミノ酸で終わるβ−アミロイドアイソフォーム（Aβ42）に対する抗体により染色する場合陽性であった（データは示されない）。
最も重要なことには、殆どすべてのAPP+変性神経突起が、ユビキチン、ニューロフィラメント及びタウ抗体により免疫染色され、これらの構造における蛋白質凝集体及び広範な細胞骨格系異常の存在が示された（データは示されない）。Aβ40及びAβ42(43)の定量がNeu1-/-脳における上昇したAβを示した（データは示されず）ので、本発明者らは、前記の変性神経突起におけるAPPの蓄積が、毒性アミロイドペプチド（Aβ）の形成に寄与すると信ずる。これらのデータに基づき、本発明者らは、Neu1の欠損がADにおいて観察される初期病原事象に直接リンクしていと結論する。
APP+神経突起は、真のアミロイド及びプラークの沈着により特徴づけられる神経絨毛糸の発病における初期事象であろう。神経細胞及び神経突起におけるAPPの過剰発現は毒性であり、そしてこの蛋白質の放出を伴う変性を生じさせるであろう。次に、細胞外放出性ミクログリアは、APP生成毒性Aβペプチドを進行的に処理する活性化されたリソソーム酵素を細胞外空間に放出することにより、病原過程に寄与する可能性がある。
ここに、本発明者らは、過剰シアリル化されたAPPの沈着を促進し、今度は後発性の非家族性ADの進行のための危険因子を構成するであろうリソソームNeu1の欠損により統合される新規なメカニズムを同定した。APPを含めての新規な推定的なNeu1基質の発見、及び脳／CSFにおける脱制御されたLEXの存在が、ADの診断のための新規なセットのバイオマーカーを提供することができ、そしてAPP／Aβの形成を回避／調節する革新的療法アプローチをセットすることができる。
実施例４． 化学療法耐性及び転移の代謝的制御
要約
癌の進行の二重の危険性は、化学療法耐性及び転移成長であり、これらの何れも腫瘍細胞の代謝的状態に依存する。ここに、本発明者らは、リソソームシアリダーゼNEU1が、リソソームエキソサイトーシスの生理学的過程を負に制御することにより、両表現型の進行において決定的役割を演じることを証明する。癌細胞はこのメカニズムを用いてリソソーム指向性化学療法剤を引退させそして追い出し、これにより薬剤耐性を進行させる。
更に、腫瘍からの細胞外放出された活性なリソソーム酵素は、周囲組織の細胞外マトリクスを分解し、腫瘍の拡散を得るためのその能力を低下させる。Neu1についてハプロ不全の腫瘍発生性マウスは、高度に侵攻性の稀な癌を発生させ、悪性の制御におけるNEU1の役割を確認する。更に、NEU1の下方制御は多くのヒト癌において一般的である。本発明者らは、癌細胞におけるリソソームエキソサイトーシスを抑制し、薬剤耐性及び侵攻性表現型の進行を妨げることにより、誠実な腫瘍抑制剤として機能することを提案する。
最重要点
−リソソームシアリダーゼNEU1は、癌細胞におけるリソソームエキソサイトーシスを負に制御する；
−増加したリソソームエキソサイトーシスは、化学療法耐性及び侵攻性を提供する；
−Neu1ハプロ不全は、Arf-/-マウスにおける腫瘍の増殖及び拡散を増強する；
−NEU1下方制御は、多くのヒト癌において観察される。
序論
リソソームグリコシダーゼであるＮ−アセチル−α−ノイラミニダーゼ１（NEU1）は、最も豊富な、且つ広く発現される哺乳類のシアリダーゼである。その基準的な機能は、α2,6−又はα2,3−結合した末端シアル酸を、糖蛋白質、糖脂質（ガングリオサイド）、オリゴサッカライド、及びポリサッカライドのサッカライド鎖から除去することである（Monti et al., 2010）。NEU1の遺伝的欠損は、その標的基質上でのシアル酸の障害された異化作用（catabolism）をもたらし、このことは今度は、無数の細胞機能に影響を与え、そして細胞及び組織の恒常性の喪失を導く。NEU1の機能の喪失の病原効果は、リソソーム貯蔵疾患であるシアリドーシス、並びに全身器官及び神経系の殆どに影響を与える小児及び青年における重症な心−身状態において明らかである（d'Azzo, 2009; Thomas, 2001）。
癌において、しばしば、グリカン組成の変化が如何に常軌を逸した生物学的結果をもたらすかは明らかでないが、表面膜における糖接合体の変化したシアリル化は新生物過程の中心的な決定因子であると考えられる（Varki et al., 2009; Wang, 2005）。荷電した糖成分を巻き込むこのダイナミックな翻訳後修飾は、蛋白質及び脂質の生化学的及び機能的性質を大きく変更し、それにより細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリクス（ECM）の相互作用、細胞の遊走及び付着のパターン、細胞内シグナル伝達及び転移の可能性に影響を与えることができる（Varki et al., 2009; Wang, 2005; Hedlund et al., 2008; Uemura et al., 2009）。
過剰なシアル酸含量は、２つの対立する過程から生ずることができる：生成したばかりのオリゴサッカライド成分へのシアル酸の制御された移行を調節する合成酵素であるシアリルトランスフェラーゼ、及び同じ糖ヌクレオチド結合に影響を与えるシアリダーゼの活性の喪失、である。例えば、人を動かさずにはおかない最近の研究は、おそらく未だ同定されていない蛋白質の異常なシアリル化を介して、乳癌細胞の増加した転移の可能性におけるシアリルトランスフェラーゼST6GalNAc-Vの過剰発現を関与させている（Bos et al., 2009）。NEU1の喪失又は下方制御は、シアリル化された基質の異常なプロセシングを必然的にもたらし、この翻訳後修飾の異化性アームを癌の進行及び増殖のために有意義であるとすることができるかもしれない。実際に、シアリダーゼの発現レベルは、細胞の遊走及び転移と関連していた（Kato et al., 2001; Miyagi et al., 1994; Sawada et al., 2002; Uemura et al., 2009）。
癌への大きな意義を伴って今まで知られていなかったシアリダーゼNEU1の機能が最近発見された：リソソームエキソサイトーシス（LEX）の負の制御因子としてのそれである（Yogalingam et al., 2008）。この遍在するカルシウムで制御される生理学的過程は、原形質膜（PM）に結合するリソソームの選択的プールの細胞骨格ネットワームへの動員を伴い；次にそれらの限定膜がカルシウムの流入に応答してPMと融合し、そしてそれらの管腔内容物が細胞外に放出される（Bossi and Griffiths, 2005; Andrews, 2000; Rodriguez et al., 1997）。この過程におけるNEU1の機能は、以前リソソームの抹消移動において仮定されていた（(Reddy et al., 2001）、NEU1の天然基質であるリソソーム関連膜蛋白質１（LAMP1）を介して介在される（Yogalingam et al., 2008）。
LAMP1は、リソソーム膜の重くグリコシル化されそしてシアリル化された構造成分であり、その制御されたターンオーバーは、NEU1活性の喪失のために蛋白質が過剰シアリル化される場合に、かなり遅れる（Yogalingam et al., 2008）。長く生存し、過剰シアリル化されたLAMP1はリソソーム膜のトポロジー及び移動を変え、それにより、融合しそして内容物を分泌する用意ができている、PMに結合した細胞外放出性リソソームの数を増加する（Yogalingam et al., 2008）。
最近の報告は、制御されるエキソサイトーシス及び癌の分野への更なる注目のための明示の呼びかけを行っている（Chan and Weber, 2002; Hendrix et al., 2010； Palmer et al., 2002）。悪性増殖及び侵攻の仲介因子としての上記過程の関与は、幾つかの癌において観察される小胞移動活性因子の観点から仮定されている（Hendrix et al., 2010; Palmer et al., 2002）。エキソサイトーシスは、悪性の進行の少なくとも２つの分野：ECMの異常な再構成及び化学療法剤の流出に対して衝撃を与えることができ、その多くはリソソーム作用的である。
アントラサイクリン、シスプラチン、及びスニチニブ（sunitinib）そのような薬物の例であり、リソソーム中で直接に可視化されており、その移動は薬物への細胞内暴露に大きく影響を与えうる（Gotink et al., 2011; Hurwitz et al., 1997; Safaei et al., 2005）。ECMの分解及び再構成は、細胞外環境におけるリソソームプロテアーゼの存在に帰せられ、そして腫瘍の侵攻性及び転移に関連付けられている（Khan et al., 1998a; Khan et al., 1998b; Matarrese et al.）。
この研究において、本発明者らは、侵攻性癌におけるNEU1活性レベルの下方制御が、過剰シアリル化されたLAMP1の蓄積及び増強されたリソソームエキソサイトーシスをもたらすことを示す。これらの過程の組合せが、好意的腫瘍進行、侵攻性、及び化学療法剤に対する耐性のカスケードを開始する。これらの結果は、NEU1が、リソソームエキソサイトーシスを制御することにより、腫瘍抑制因子として機能することを確立する。
結果
NEU1の発現は横紋筋肉腫細胞系におけるリソソームエキソサイトーシスと逆方向に関連づけられる
骨格筋において生ずる横紋筋肉腫（RMS）は、小児及び青年における最もありふれた軟組織癌である（Ognjanovic et al., 2009）。この癌は、２つのサブタイプ、すなわち典型的には好都合な予後を有する胎児型RMS、及び悪い予後に関連する胞巣型RMSである（Ognjanovic et al., 2009）。RMSは一次的に外科切除及び化学療法により治療され、共通の合併症は転移及び化学療法耐性であり、この何れも過剰のLEXから生ずる。
癌細胞でのLEXの制御におけるNEU1の役割を研究するため、本発明者らは、異なる量のNEU1を発現する２つのヒトRMS細胞系を選択した（Houghton et al., 2007）。NEU1発現のアフィメトリックスmRNAマイクロアレイ分析が示すところによれば、RH30細胞により発現されるNEU1 mRNAに比べて、RH41細胞は比較的高いレベルのNEU1 mRNAを発現する。本発明者らは、この知見を半定量的及びリアルタイムPCRを用いて確認した（データは示されない）。当該mRNAの結果は、NEU1活性のレベルとよく相互関連した（データは示されない）。免疫蛍光標識もまた両細胞系におけるNEU1の典型的なリソソーム分布を示したが、発現はRH41細胞において顕著に高かった（データは示されない）。
RMS細胞系におけるNEU1の発現の異なるパターンに基づいて、本発明者らはそれらのLEXプロフィールを特徴付けた。LAMP1のウェスタンブロット分析が確認したところによれば、当該蛋白質は、低−NEU1 RH30細胞において一層豊富であり、そしてより高い分子量を有しており、これは増加したシアル酸含量を示すものであった（データは示されない）。更に、共焦点免疫蛍光法を用いて、本発明者らは、透過処理されていないRH30細胞の細胞表面上にLAMP1+シグナルを観察したが、RH41細胞上には観察されなかった。このことは、低−NEU1細胞中のリソソームがPMに結合しそれと融合し、その部位におけるLAMP1の蓄積を導くという（データは示されない）、当該リソソームのLAMP1でマークされたプールの増強された傾向を示唆する。
本発明者らは更に、リソトラッカーレッド（lysotracker red）で標識された斑点の共焦点像を捕捉することにより、リソソームの動きをリアルタイムにモニターした。RH30細胞においては、リソソームは細胞周辺で優先的に捕捉され、そして細胞の中心から外側に連続的に移送され、これに対して、RH41細胞は最終的に、核周囲腔の外側に位置するリソソームを有しなかった（データは示されない）。全内部反射（TIRF）顕微鏡分析により、RH30細胞中の周縁リソソームはPMの直ぐ近傍にあることが確認された。リソトラッカーグリーン（lysotracker green）により染色された生きたRH30細胞は、TIRF感知領域内でのシグナルの局在の証拠を示したが、RH41細胞はそうではなかった（データは示されない）。最後に、本発明者らは、放出されたリソソーム内容物の測定として、各細胞系からの培養液中のリソソーム酵素であるβ−ヘキソスアミニダーゼ（β−Hex）の細胞外活性を測定した。RH30でコンディショニングされた培地は、RH41でコンディショニングされた培地に比べて、かなり多くのβ−Hexを含んでおり、それらのNEU1のそれぞれのレベルと逆の関係にあった。
NEU1の発現レベルはリソソームエキソサイトーシスの程度に影響を与える
細胞外放出表現型におけるNEU1の主たる役割を特定するため、本発明者らは、２つのRMS細胞系の安定なNEU1−修飾クローンを、レトロウイルスベクターを用いて操作した。NEU1を過剰発現する修飾されたRH30細胞（RH30NEU1）及びサイレンスNEU1を有するRH41細胞（RH41shNEU1）を先ず、それらのNEU1蛋白質レベル及び活性について特徴付け、対応する空ベクター対照と比較してそれらのNEU1の発現パターンの好結果の逆転を確認した（データは示されない）。次に、両方の修飾された細胞系及び対応する対照において、３つのパラメーターすなわちコンディショニングされた培地におけるLAMP1レベル、TIRF分析、及び酵素活性を用いてLEXを測定した。
LAMP1のレベルは、修飾された細胞系におけるNEU1活性のレベルに対して逆比例した（データは示されない）。更に、LAMP1+の免疫蛍光は、高−NEU1対応物（RH30NEU1; RH41empty）に比べて、RH41shNEU1細胞及び対照RH30empty細胞の細胞周縁に顕著に局在した（データは示されず）。TIRFの造影により、RH41shNEU1細胞における、リソソームの周辺移動、及び細胞延長の末端に密集する傾向が確認された（データは示されず）。これに対して、この特徴はRH30NEU1細胞においては失われた（データは示されず）。
最後に、リソソームβ−Hexの活性が、それぞれ修飾された細胞及び対照からの培養液において測定された。低−NEU1細胞からの培地は有意に高いβ−Hex活性を含んでいた（データは示されない）。一緒にして、これらの結果は、細胞のNEU1の状態が、そのLEX表現型を決定するのに十分であることを示している。
増加したリソソームエキソサイトーシスはドキソルビシン耐性と関連する
本発明者らは次に、化学療法剤に対する親細胞系の応答に関して、LEXに対するNEU1対照の機能的結果に注目した。RH41及びRH30細胞は、種々の抗癌療法に対して非常に異なる態様で応答することが示されている（Houghton et al., 2007; Petak et al., 2000）。本発明者らは、ドキソルビシン（DOXO）への暴露に際し、RH41細胞は容易にアポトーシスを受け、RH30細胞は治療に対して耐性であることを見出した（データは示されない）。これらの表現型をこれらの細胞におけるNEU1活性のレベルと結びつけるため、本発明者らはまず、DOXOがそれらのリソソームに濃縮されることを確認した。
薬物の基の赤蛍光をリソトラッカーグリーンにより同時位置決めし、原形質にわたって異なって分布しているとしても、DOXOが負荷されたリソソームが両方の親RMS細胞系に存在することが示された（データは示されない）。具体的には、２時間の処理の後、RH41細胞中のDOXOが負荷されたリソソームは核周囲領域に集合したが、RH30細胞中のリソソームはそうではなかった（データは示されない）。DOXO曝露後のリソソーム移動の１晩の生体造影はこれらの蛍光を確認した（データは示されない）。４時間におけるDOXOの細胞内可視化により、薬物は主としてRH41細胞の核に濃縮され、一方RH30細胞においては薬物の部分がリソソームに残った（データは示されず）。
低−NEU1 RH30細胞において観察されるLEXの増加はDOXOの流出を促進し、それ故に細胞を治療に対して非感受性にする可能性がある。この予測は更に、これらの細胞が、薬物毒性を回避するためのよく知られている細胞メカニズムにおいて機能する多剤耐性蛋白質１（ｐ−糖蛋白質１）を発現しないという事実により支持される（Cocker et al., 2000）。RH30培地から流出する赤蛍光を捕捉しそして定量することにより、本発明者らはDOXOが本当にこれらの細胞から放出されることを示した（データは示されない）。
最後に、本発明者らは、親細胞系及び修飾された細胞系の両方においてDOXO投与量応答曲線を作成することにより、それらのアポトーシス応答の相違を試験した。この目的のために、規準的なアポトーシスマーカーである開裂されたポリ（ADP−リボース）ポリメラーゼ（PARP）のイムノブロットを用いた（データは示されない）。RH41shNEU1細胞は、対応する未修飾の細胞に比べてアポトーシスに対して耐性であった（データは示されない）。これに対して、RH30NEU1細胞は、その非修飾対照に比べてDOXOに対して一層感受性であった（データは示されない）。これらの結果の観点において、本発明者らは、カルシウムチャンネル遮断剤であるべラパミル（verapamil）によるLEXの阻害が親RH30細胞を感受性にするか否かを試験した。
べラパミルは、ｐ−糖蛋白質阻害剤であるが、更にｐ−糖蛋白質の非存在下で薬物の流出を阻害し、これは他の流出メカニズムを示唆する（Chiu et al., 2010）。LEXはカルシウムの流入に依存するので、本発明者らは、この一般に使用されるカルシウムチャンネル遮断剤はこの過程を阻害すると仮定した。べラパミル及びDOXOによりRH30細胞の同時処理の際、リソソームは薬物を蓄積し、そして核周囲領域に集合した（データは示されない）。次に、PARP開裂及び形態学的分析により測定した場合、細胞はアポトーシスを受けた（データは示されない）。
リソソームエキソサイトーシスのNEU1依存性悪化は癌細胞の侵入能力を増加する
本発明者らが過剰のLEXにより影響を受けるだろうと予測する癌細胞の第二の特徴は侵入性である。何故なら、ECMの分解が腫瘍を含む組織の能力と妥協するからである。リソソームに存在する活性なプロテアーゼ、特にカテプシンＢの放出は、基底膜穿孔及び転移と相関する（Khan et al., 1998a; Khan et al., 1998b; Matarrese et al.）。
本発明者らは、腫瘍細胞におけるNEU1のレベル、及び今度はLEXの程度がそれらの侵入性とリンクしていることを決定した。この目的のため、本発明者らは、親RH41及びRH30細胞系を、それぞれ高−NEU1細胞及び低−NEU1細胞の代表として使用した。これらの細胞のエクスビボ侵入性が、野生型マウス又はNeu1−ノックアウトマウスから得た奪核腹腔基底膜（Marshall et al., 2011）を用いて測定された（データは示されず）。Neu1−ノックアウトマウスは構成的、過剰LEXのモデルであるので、その組織及びECMは既に、腫瘍隣接組織を模倣する進行する環境ストレスにかけられている（Yogalingam et al., 2008; Zanoteli et al., 2010）。
高−NEU1 RH41に比べて、低−NEU1 RH30細胞系は、野生型基体に首尾よく侵攻した（データは示されない）。しかしながら、Neu1−ノックアウトマウスからの腹膜は、野生型腹膜に比べて、RMS細胞系からの侵攻に対して有意に一層感受性であった（データは示されない）。明白に、Neu1−ノックアウト腹膜に接種された高−NEU1 RH41細胞は、野生型腹膜上のRH30細胞と同様に感受性であり、本来のLEXがそうでなければ健康な組織を癌の侵攻に介して条件づけていることが示唆される（データは示されない）。RMS細胞系の進攻性が更に、Neu1−ノックアウトの腹膜切片において、何れもカテプシンＢの基質である、基底膜成分であるラミニン及びコラーゲンIVの免疫組織化学的可視化により評価された（Buck et al., 1992）。RH30細胞に曝露された組織は、RH41細胞に曝露された組織に較べて、一層分解／再構成を受けた（データは示されない）。
RMS細胞の侵攻性能力とNEU1活性との間の逆の関係は、これが他の癌により使用される一般的メカニズムであることを示唆した。したがって本発明者らは、他の腫瘍細胞系を、それらの進攻性能力及びNEU1の状態に関して特徴付けた。本発明者らは、ユーイング肉腫細胞系EW8及びSKNEP1を、それらの異なるNEU1レベルのために選択した。RMS細胞系と同様に、高−NEU1 DOXO−感受性EW8細胞に比べて、低−NEU1 SKNEP1細胞は、過剰シアリル化されたLAMP1を蓄積し、DOXOに対して耐性であり、そしてマトリゲル及び腹腔基底膜に対して一層好結果に侵攻した（データは示されない）。本発明者らはまた、結腸癌細胞系SW480及びSW620を分析した。これらはよく特徴付けられているからである（Leibovitz et al., 1976）：SW480細胞は原発性結腸癌からのものであり、SW620細胞は転移再現からのものである。後者の細胞はまた、SW480細胞に比べて、抗癌剤に対して一層耐性であることが示されており（Walker et al., 2010)、本発明者らは、それがNEU1活性を下方制御することを見出した。これはまた、SW480に比べて、LAMP1レベルの劇的な増加と平行する（データは示されず）。
RMS細胞のNEU1の状態はその侵攻性能力の相違の主たる決定因子である
NEU1レベルがRMS細胞の侵攻性に如何に影響するかを決定するため、本発明者らは、RH41shNEU1細胞及びRH30NEU1 細胞を、空ベクター対照とともに、主としてラミニン及びコラーゲンIVから成るマトリゲル基材に接種した。細胞を２日間培養した後、マトリゲルプラグを固定し、そして基材への細胞の進入を可視化するために処理した。低−NEU1活性を有する細胞（RH41shNEU1及びRH30empty)はマトリゲルに首尾よく侵入し、他方高−NEU1活性を有する細胞は侵入しなかった（データは示されず）。これらの結果は、これらの癌細胞のNEU1状態が、標準化された基材に侵入するそれらの能力を予測するのに十分であることを確立した。
発癌性モデルにおいてNeu1欠損マウスは一層侵攻性の癌を生じさせる
発癌性（tumor-prone）モデルであるArf−ノックアウトマウス（Kamijo et al., 1999）と交配したNeu1−ヘテロ接合性マウスを用いて、本発明者らは、過剰なLEXが悪性侵攻にインビボで影響するか否かを試験した。２群のマウスを腫瘍の発生において比較した。第一の群であるArf-/-/Neu1+/+マウスは、Arfシングルノックアウトにおいて既に報告されている癌のタイプ（Kamijo et al., 1999）を反映する一連の腫瘍を生じさせた。10箇月より若いArf−ノックアウトマウスにおける典型的な腫瘍は僅かに分化した肉腫であるが、神経膠腫、リンパ腫及び癌腫も低い頻度で観察されている（Kamijo et al., 1999）。これらのマウスにおける腫瘍は、平均９月齢で生じ、そして典型的には点在的（focal）である（データは示されない）。
第二群はArf-/-/Neu1+/-遺伝子型を有するマウスから成った。本発明者らは、これらのマウスにおける低−Neu1活性が、発達中のいずれかの腫瘍のより早く、より活発な増殖を促すことを予測した。これは確かであった。マウスは平均６月齢で腫瘍を生じさせ、この月齢はArfシングルノックアウトにみられるそれに比べて有意に早かった（ｐ＝0.029）。更に、腫瘍の増殖は、マウスが急速に死にかけるほど活動的であった。これらの腫瘍はしばしば局所的に侵攻的であり、そして短時間に大きな体積を達成した。１つの事例において、腫瘍は劇症的に転移性であった（データは示されず）。Neu1ヘテロ合性マウスにおける腫瘍は時として、多形性であり、遺伝子操作されたマウスにおいて一般に見られるものには似ていなかった。
２つのこのような悪性腫瘍は、腫瘍の横紋筋肉腫様／類上皮肉腫様グループの形態学的及び免疫化学的特徴を有した。これらは、それぞれ骨髄間質細胞及び上皮細胞のためのサイトケラチンマーカーであるビメンチン（vimentin）及びサイトケラチン８の両方に対して陽性である横紋筋肉腫タイプの細胞を含んでいた（データは示されない）。本発明者らの知識によれば、この群の腫瘍はマウスにおいてはまだ報告されておらず、そしてヒトにおいては侵攻的生物学的挙動及びよくない予後と関連している（Oda and Tsuneyoshi, 2006）。
追加の小さな一群のArf-/-/Neu1-/-二重ノックアウトマウスがこの育種プログラムの間に生じた。この遺伝子型のマウスは非常に稀に生まれ（合計122マウス中17）、そして当該マウスは、非常に早い時期にシアリドーシス関連死に屈服した。これらの理由のため、本発明者らは統計的解析に上記の動物群を含めなかった。但し、シアリドーシスが致命的になる前に腫瘍を発生させた、１件の転移を含む小数のマウスの結果を報告する（データは示されない）。
Arf-/-/Neu1+/+マウスにおいて生じた容易に特徴づけられた腫瘍が、元の細胞に比べて腫瘍中のNeu1の発現を研究する機会を提供した。本発明者らは、同一のマウスの正常な組織と比べて腫瘍におけるNeu1免疫染色の喪失を観察した。この相違は、癌腫及び肉腫において見られ（データは示されず）、Neu1の下方制御が腫瘍増殖への選択的利点を提供するという意見を支持した。
ヒトの癌におけるNEU1の喪失
本発明者らは、Arf-/-/Neu1+/+マウスにおけるNeu1発現のパターンは、正常なNEU1活性を有すべき癌患者において再現されるだろうと、理由付けた。本発明者らは先ず、健康な骨格筋対照との比較において、NEU1のレベルについて一層一般的な胎児性サブタイプヒトRMS組織サンプルをプローブした。実際に、NEU1は、12個中10個（83.3％）のRMSサンプルにおいて下方制御された（データは示されず）。10個中４個はNEU1染色の完全な不存在を示した（データは示されず）。NEU1の下方制御の生理学的インパクトを更に特徴づけるため、本発明者らは、その基質LAMP1のレベルを評価した。LAMP1の免疫化学は、NEU1の完全喪失を４サンプル全て含めて12個中７個（58.3％）におけるこの蛋白質の強い上方制御を明らかにした（データは示されない）。
本発明者らは次に、NEU1の下方制御が如何に一般的に癌のタイプにわたっているかを評価するため、上記の分析を膵管腺癌サンプルに対して反復することを決定した。やはり、12個中10個（83.3％）のサンプルが、元の管細胞に比べて、NEU1の喪失を示した（データは示されず）。LAMP1染色を更に行い、そして12個中７個（58.3％）の癌サンプルが上方制御を示すという、RMSにおいて見られた結果を再現した（データは示されない）。一緒になって、これらの結果は、NEU1の下方制御は癌細胞において一般に用いられる戦略であり、しばしばLAMP1の蓄積及びLEXの同時的悪化と連携する。
議論
この研究において、本発明者らは、NEU1の下方制御及びそれに続く増強されたLEXが、癌細胞の少なくとも２つの重要な利点：リソソーム作用性化学療法剤耐性並びに拡大性及び浸潤性となる能力、を付与するという証拠を提供する。これらの発見はNEU1の腫瘍抑制機能を示唆する。
この多面的リソソーム酵素の制御された発現は、２つの細胞過程、すなわち糖接合体のシアリル化、並びにリソソーム移動の程度及びタイプに影響を与え、この両者は一貫してインビボでの腫瘍細胞の挙動を説明するために引用されている（Hendrix et al., 2010; Varki, 2009）。今まで、過剰シアリル化は、生合成酵素シアリルトランスフェラーゼの上方制御に大きく帰せられている（Dall'Olio and Chiricolo, 2001）。例えば、ST6GalNAc-I [(α-N-アセチル-ノイラミニル-2,3-β-ラクトシル-1,3)-N-アセチルガラクトサミニドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ-I]は、転移性癌のマーカーであるムチン−関連シアリル−Tn抗原生成に寄与すると考えられ（Heimburg-Molinaro et al., 2011; Marcos et al., 2011）、そしてST6GalNAc-Vは乳癌に転移能力を付与する（Bos et al., 2009）。これらのシアリルトランスフェラーゼの何れも、糖蛋白質及び糖脂質中に見出されるGalNAc（N-アセチル-ガラクトサミン）残基へのα2,6-結合によるシアル酸の移行を触媒し、この過程はNEU1により容易に逆転される。
本発明者らは、低下した又は不十分なNEU1活性が、シアリルトランスフェラーゼの過剰発現と同等な態様で、癌細胞を侵害し、これにより標的NEU1基質の障害されたシアル酸の異化を生じさせると提案する。この点に関し、オンコミン（Oncomine）データベース（Finak Breast www.oncomine.org/resource/main.html）の質問が、ST6GalNAc-I酵素並びにST6GalNAc-III及びST6Gal-IIを含めての少なくとも３種類のα2,6−シアリルトランスフェラーゼの実質的な上方制御（ｐ＜0.01）を示すことが注目に値する。本発明者らは、これらがNEU1の発現と逆に関連し、これ自体有意に下方制御される（ｐ＜0.01）ことを見出した。癌におけるこれらの酵素の対立する発現レベルが、シアリル化の細胞性制御に対し過小評価された二重の損傷を生じさせる可能性がある。
本発明者らの研究は、過剰シアリル化されたLAMP1を癌におけるLEXの重要な制御因子として同定し、そして過剰LEXのマーカー及びこの過程を阻害するための可能性ある標的を提供した。小胞移動に関与する他の蛋白質の脱制御が幾つかの癌において観察された。すなわち、２つのLEXエフェクターであるRab27B及びBAIAP3の上方制御が、それぞれ乳癌及び線維形成性小細胞腫瘍の転移性増殖及び細胞増加を増強することが示され（Hendrix et al., 2010; Palmer et al., 2002）、癌における細胞外放出メカニズムの関与が示唆された（Chan and Weber, 2002）。ここに、本発明者らは、侵攻性及び薬剤耐性の重要な癌表現型にLEXが明確に関連するという証拠を提供する。
リソソームの移動が多剤耐性に影響を与えるという示唆は既に報告されており、幾つかの総説はこの分野の更なる研究を明示的に求めている（Castino et al., 2003; Groth-Pedersen, 2010）。初期の報告は、その内容物を細胞外に放出することができる小胞にDOXOが濃縮されることを記録している（Klohs and Steinkampf, 1988）。後に、vinブラスチンが特異的にリソソームに蓄積し、そしてリソソーム酵素と共に放出されることが報告されている（Warren et al., 1991）。化学療法剤が如何にして腫瘍細胞から放出されるかについての研究は、すでにｐ−糖蛋白質又は他のABCトランスポーターの上方制御に焦点を当てている（Coley, 2010）。しかしながら、これらのポンプの特異的阻害剤はしばしば、臨床試験において不成功であることを示し、流出の他のメカニズムが関与することが示唆される（Broxterman et al., 2009; Coley, 2010）。やはり、オンコミン（Oncomine）データベースの本発明者らの研究は、重要な耐性メカニズムをNEU1が仲介するという支持的証拠を示した。
ｐ−糖蛋白質の発現は、転移性結腸癌についてのデータセットにおいて、５−FU及びトポイソメラーゼ毒素イリノテカンに対するレスポンダーと非−レスポンダーとの間で有意な差はなかったが（ｐ＝0.81）が、NEU1発現は耐性患者において強く下方修正された（ｐ＝0.0064）（Graudens Colon data set www.oncomine.org/resource/main.html）。ここで、本発明者らは、DOXO−耐性RMS細胞系は、ｐ−糖蛋白質を欠くにも拘わらずDOXOを放出することを確立した。次に、NEU1を上方制御するか又はカルシウムチャンネル遮断剤べラパミルを使用することによってLEXを阻害することにより、同じ細胞をDOXOに対してより感受性にすることができる。したがって、リソソーム利用性薬物流出は、LEXの重要な決定因子としてのNEU1の制御下にある。
NEU1により制御されるLEXはまた、癌細胞の侵入性／転移性能力に対して直接的影響力を有する。第一に、Neu1−ノックアウトマウスの場合のように、過剰のLEXにかけられている以外では健康な組織は、癌細胞の侵攻に対して一層感受性である。第二に、癌細胞中のNEU1のレベルは、その侵攻能力に関して逆の関係にある。第三に、腫瘍及び周囲組織におけるNEU1の組み合わされた喪失はインビボで高度に攻撃的な癌のための条件を作り出す。Arf-/-/Neu1+/-マウスは、不確実な組織発生の高度に攻撃的な、稀な棒状／類上皮−様肉腫を含めての種々の腫瘍を発生させた。このタイプの癌のためにはマウスモデルが同定されていないので、これらの腫瘍の自然的発生は、稀なそして致死的な悪性腫瘍の研究への機会の可能性ある窓を提供する。
癌の発生の潜在的危険因子である低−NEU1状態に加えて、Arfシングルノックアウトマウスにより作られる腫瘍におけるNeu1発現の喪失により示されるように、悪性形質転換は、腫瘍細胞にNEU1を下方制御する選択圧を与えるであろう。正常なヒト集団におけるNEU1活性レベルは、未知の効果をもって、広範囲にわたる。低いNEU1活性を有する個人、すなわちＩ型シアリドーシスを有する個人は、健康な対照に比べて、癌に対して一層感受性であろう。これはその通りであろう：Yagi及び共同研究者は最近、Ｉ型シアリドーシスを有する３人の兄弟において異なる悪性腫瘍を報告し、そしてこれらの滑性とNEU1欠損との関連性を示唆した（Yagi et al., 2011）。
本発明者らはここに、無比の健康な組織に較べて、ヒトRMSからの悪性組織及び膵腺癌においてNEU1が強く下方制御されることを示す。これが前もって存在する欠損によるものであるか、又は形質転換−関連変化によるものであるかは知られておらず、そして更に注目するに値する。いずれにしても、低下したNEU1の発現は、その下方制御の一貫性のため及びその喪失の生理学的悪化のための両方により、情報豊かなマーカーであろう。基質の蓄積と連携して、NEU1の喪失は、過剰なLEX、及び腫瘍における侵攻性及び薬剤耐性の予測因子として機能することができるであろう。このような情報は、治療の決定を形成し、そして新薬の組合せ実験の理論的な設計を最適化するために役立つであろう。
実験方法
動物
Neu1+/-マウスをArf-/-マウス（Dr. Charles Sherrにより提供）と交配させた。コロニーを１年間拡張し、その間に出生率及び腫瘍担持を記録した。すべての剖検はSt. Jude Veterinary Pathology Coreにより行われた。すべてのマウス実験は、発明者らの研究機関である「Animal Care and Use Committee and NIH guidelines」により承認された動物プロトコールに従って行われた。
細胞培養物
RMS細胞系RH41、RH30及びユーイング（Ewing）肉腫細胞系EW8、並びにSKNEP-1は、 Gerard Grosveld博士及びAndrew Davidoff博士から得た。これらの細胞系は、St. Jude Children’s Research Hospital（Houghton et al., 2007）にあるPediatric Preclinical Testing Programにより特徴づけられた。SW480及びSW620腺癌血統癌細胞系はATCCから得た。細胞は、Glutamax（Sigma）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Invitrogen）及び10％コスミックウシ血清（Hyclone）を補充したDMEM又はRPMI（Invitrogen）培地中で維持した。ピューロマイシン（Puromycin）耐性クローンは、ピューロマイシン（２μg/mL, Sigma）を補充した培地中で選択しそして維持した。
抗体及び試薬
本発明者らは市販の抗体：抗−LAMP1（Sigma）、抗−ラミニン（Sigma）、抗−α/βチューブリン及び抗−開裂PARP（Cell Signaling）を用いた。ポリクローナル抗−NEU1抗体はすでに記載されている（Bonten et al., 2004）。ベラパミル（Verapamil）（50 μM, Sigma）及びDOXO（３μg/mL, LKT Laboratories）を培地に添加した。リソトラッカーグリーン（Lysotracker Green）DND-26及びリソトラッカーレッド（Lysotracker Red）DND-99はInvitrogenから入手し、そして製造者の指示に従って適用した。
イムノブロッティング
組織及び細胞ペレットの調製、ウエスタンブロッティング、並びにデータの解析は既に記載されている（Zanoteli et al., 2010）。
免疫組織化学及び蛍光顕微鏡
マウス組織切片の免疫組織化学的分析、及びヒト組織サンプルのマイクロアレイ分析（米国 BioMax, Inc.）は既に記載されているようにして行った（Yogalingam et al., 2008）。ヒト組織サンプルの使用はInstitutional Review Boardにより承認された。
酵素測定
NEU1及びβ−Hexの酵素活性は適切な蛍光基質（Sigma）を用いて測定し、そしてすでに記載されている（Yogalingam et al., 2008）ようにして、BCA蛋白質濃度に標準化した（Pierce Biotechnology）。
安定なクローン細胞系
RH30細胞は、pBABE−puroレトロウイルスベクター（AddGene）（修飾されていないか、又はヒトNEU1 cDNAを含む）により形質転換した。形質転換された細胞は、当該細胞系の予め定められた感受性に従って、ピューロマイシン（２ μg/mL）により選択し、そして0.5 μg/mL選択培地中に維持した。RH41細胞は、NEU1 shRNAプラスミッド（RHS4533-NM000434, Open Biosystems）のパネル又は付属の空ベクター対照により形質転換した。細胞は、ピューロマイシンにより選択し、そして選択培地のもとに維持した。
ドキソルビシン放出測定
細胞をプレートし、そして50％コンフルエンシーに維持した。翌日、それらを３μg/mL DOXOを含む培地で２時間処理した。次に、処理された細胞をPBSにより３回洗浄し、そしてDOXO−不含培地中で更に２時間培養して、新鮮な培地への薬物の放出を許容した。次に、コンディショニングされた培地を1000 rpm（867 xg）にて５分間遠心分離し、そして500 μLのアリコートをUltrafree-MC 0.1 μmエッペンドルフ遠心フィルター（Millipore）を通して回転させて、溶出した薬物を捕捉した。次に、フィルターを顕微鏡スライド上に載置し、そして赤蛍光フィルターの像をニコンCI顕微鏡上で採取した。
侵攻測定
すでに記載されているようにして（Marshall et al., 2011）、マッチした齢の野生型又はNeu1−ノックアウトマウスからの腹膜切片を採取し、そしてトランスウエルインサート（Fisher）上に載置した。次に、細胞系当たり合計250,000 RMS細胞を、腹膜調製物上に置き、そして培地中の８日間維持した。
別のセットの実験において、すでに記載されているよういにして（Sabeh et al., 2009）、細胞系当たり250,000 RMS細胞を、トランスウエル皿中200μL上に接種し、そして２日間培養液中に維持した。
統計処理
データは平均±標準偏差（SD）として表現し、そして独立（unpaired）サンプルについてはスチューデントのｔ−試験を用いて評価した。0.05より小さいＰ−値を統計的に有意と考えた。
参照文献
Bos, P.D., Zhang, X.H., Nadal, C., Shu, W., Gomis, R.R., Nguyen, D.X., Minn, A.J., van de Vijver, M.J., Gerald, W.L., Foekens, J.A., et al. (2009). Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature 459, 1005-1009.
Broxterman, H.J., Gotink, K.J., and Verheul, H.M. (2009). Understanding the causes of multidrug resistance in cancer: a comparison of doxorubicin and sunitinib. DrugResist Updat 12, 114-126.
Buck, M.R., Karustis, D.G., Day, N.A., Honn, K.V., and Sloane, B.F. (1992). Degradation of extracellular-matrix proteins by human cathepsin B from normal and tumour tissues. Biochem J 282 ( Pt 1), 273-278.
Castino, R., Demoz, M., and Isidoro, C. (2003). Destination 'lysosome': a target organelle for tumour cell killing? J Mol Recognit 16, 337-348.
Chan, A.M., and Weber, T. (2002). A putative link between exocytosis and tumor development. Cancer Cell 2, 427-428.
Chiu, L.Y., Ko, J.L., Lee, Y.J., Yang, T.Y., Tee, Y.T., and Sheu, G.T. (2010). L-type calcium channel blockers reverse docetaxel and vincristine-induced multidrug resistance independent of ABCB1 expression in human lung cancer cell lines. Toxicol Lett 192, 408-418.
Cocker, H.A., Pinkerton, C.R., and Kelland, L.R. (2000). Characterization and modulation of drug resistance of human paediatric rhabdomyosarcoma cell lines. Br J Cancer 83, 338-345.
Coley, H.M. (2010). Overcoming multidrug resistance in cancer: clinical studies of p-glycoprotein inhibitors. Methods Mol Biol 596, 341-358.
d'Azzo, A., Kolodny, E.H., Bonten, E., Annunziata, I. (2009). Hematology of Infancy and Childhood (Philadelphia, PA, Saunders Elsevier).
Dall'Olio, F., and Chiricolo, M. (2001). Sialyltransferases in cancer. Glycoconj J 18, 841- 850.
Gotink, K.J., Broxterman, H.J., Labots, M., de Haas, R.R., Dekker, H., Honeywell, R.J., Rudek, M.A., Beerepoot, L.V., Musters, R.J., Jansen, G., et al. (2011). Lysosomal sequestration of sunitinib: a novel mechanism of drug resistance. Clin Cancer Res 17, 7337-7346.
Groth-Pedersen, L., Jaattela, M. (2010). Combating apoptosis and multidrug resistant cancers by targeting lysosomes. Cancer Letters doi:10.1016/j.canlet.2010.05.021.
Hedlund, M., Ng, E., Varki, A., and Varki, N.M. (2008). alpha 2-6-Linked sialic acids on N-glycans modulate carcinoma differentiation in vivo. Cancer Res 68, 388-394.
Heimburg-Molinaro, J., Lum, M., Vijay, G., Jain, M., Almogren, A., and Rittenhouse-Olson, K. (2011). Cancer vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine 29, 8802- 8826.
Hendrix, A., Westbroek, W., Bracke, M., and De Wever, O. (2010). An ex(o)citing machinery for invasive tumor growth. Cancer Res 70, 9533-9537.
Hinek, A., Bodnaruk, T.D., Bunda, S., Wang, Y., and Liu, K. (2008). Neuraminidase-1, a subunit of the cell surface elastin receptor, desialylates and functionally inactivates adjacent receptors interacting with the mitogenic growth factors PDGF-BB and IGF-2. Am J Pathol 173, 1042-1056.
Houghton, P.J., Morton, C.L., Tucker, C., Payne, D., Favours, E., Cole, C., Gorlick, R., Kolb, E.A., Zhang, W., Lock, R., et al. (2007). The pediatric preclinical testing program: description of models and early testing results. Pediatr Blood Cancer 49, 928-940.
Hurwitz, S.J., Terashima, M., Mizunuma, N., and Slapak, C.A. (1997). Vesicular anthracycline accumulation in doxorubicin-selected U-937 cells: participation of lysosomes. Blood 89, 3745-3754.
Kamijo, T., Bodner, S., van de Kamp, E., Randle, D.H., and Sherr, C.J. (1999). Tumor spectrum in ARF-deficient mice. Cancer Res 59, 2217-2222.
Kato, T., Wang, Y., Yamaguchi, K., Milner, C.M., Shineha, R., Satomi, S., and Miyagi, T. (2001). Overexpression of lysosomal-type sialidase leads to suppression of metastasis associated with reversion of malignant phenotype in murine B16 melanoma cells. Int J Cancer 92, 797-804.
Khan, A., Krishna, M., Baker, S.P., and Banner, B.F. (1998a). Cathepsin B and tumor- associated laminin expression in the progression of colorectal adenoma to carcinoma. Mod Pathol 11, 704-708.
Khan, A., Krishna, M., Baker, S.P., Malhothra, R., and Banner, B.F. (1998b). Cathepsin B expression and its correlation with tumor-associated laminin and tumor progression in gastric cancer. Arch Pathol Lab Med 122, 172-177.
Klohs, W.D., and Steinkampf, R.W. (1988). The effect of lysosomotropic agents andb secretory inhibitors on anthracycline retention and activity in multiple drug- resistant cells. Mol Pharmacol 34, 180-185.
Leibovitz, A., Stinson, J.C., McCombs, W.B., 3rd, McCoy, C.E., Mazur, K.C., and Mabry, N.D. (1976). Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res 36, 4562-4569.
Lillehoj, E.P., Hyun, S.W., Feng, C., Zhang, L., Liu, A., Guang, W., Nguyen, C., Luzina, I.G., Atamas, S.P., Passaniti, A., et al. (2012). NEU1 Sialidase Expressed in Human Airway Epithelia Regulates Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and MUC1 Protein Signaling. J Biol Chem 287, 8214-8231.
Marcos, N.T., Bennett, E.P., Gomes, J., Magalhaes, A., Gomes, C., David, L., Dar, I., Jeanneau, C., DeFrees, S., Krustrup, D., et al. (2011). ST6GalNAc-I controls expression of sialyl-Tn antigen in gastrointestinal tissues. Front Biosci (Elite Ed) 3, 1443-1455.
Marshall, A.D., Lagutina, I., and Grosveld, G.C. (2011). PAX3-FOXO1 induces cannabinoid receptor 1 to enhance cell invasion and metastasis. Cancer Res 71, 7471-7480.
Matarrese, P., Ascione, B., Ciarlo, L., Vona, R., Leonetti, C., Scarsella, M., Mileo, A.M., Catricala, C., Paggi, M.G., and Malorni, W. (2010).Cathepsin B inhibition interferes with metastatic potential of human melanoma: an in vitro and in vivo study. Mol Cancer 9, 207.
Miyagi, T., Sato, K., Hata, K., and Taniguchi, S. (1994). Metastatic potential of transformed rat 3Y1 cell lines is inversely correlated with lysosomal-type sialidase activity. FEBS Lett 349, 255-259.
Monti, E., Bonten, E., D'Azzo, A., Bresciani, R., Venerando, B., Borsani, G., Schauer, R., and Tettamanti, G. (2010). Sialidases in vertebrates: a family of enzymes tailored for several cell functions. In Adv Carbohydr Chem Biochem, D. Horton, ed. (Elsevier Inc.), pp. 403-479.
Ognjanovic, S., Linabery, A.M., Charbonneau, B., and Ross, J.A. (2009). Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer 115, 4218-4226.
Palmer, R.E., Lee, S.B., Wong, J.C., Reynolds, P.A., Zhang, H., Truong, V., Oliner, J.D., Gerald, W.L., and Haber, D.A. (2002). Induction of BAIAP3 by the EWS-WT1 chimeric fusion implicates regulated exocytosis in tumorigenesis. Cancer Cell 2, 497-505.
Petak, I., Douglas, L., Tillman, D.M., Vernes, R., and Houghton, J.A. (2000). Pediatric rhabdomyosarcoma cell lines are resistant to Fas-induced apoptosis and highly sensitive to TRAIL-induced apoptosis. Clin Cancer Res 6, 4119-4127.
Reddy, A., Caler, E.V., and Andrews, N.W. (2001). Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell 106, 157-169.
Sabeh, F., Li, X.Y., Saunders, T.L., Rowe, R.G., and Weiss, S.J. (2009). Secreted versus membrane-anchored collagenases: relative roles in fibroblast-dependent .collagenolysis and invasion. J Biol Chem 284, 23001-23011.
Safaei, R., Larson, B.J., Cheng, T.C., Gibson, M.A., Otani, S., Naerdemann, W., and Howell, S.B. (2005). Abnormal lysosomal trafficking and enhanced exosomal export of cisplatin in drug-resistant human ovarian carcinoma cells. Mol Cancer Ther 4, 1595-1604.
Sawada, M., Moriya, S., Saito, S., Shineha, R., Satomi, S., Yamori, T., Tsuruo, T., Kannagi, R., and Miyagi, T. (2002). Reduced sialidase expression in highly metastatic variants of mouse colon adenocarcinoma 26 and retardation of their metastatic ability by sialidase overexpression. Int J Cancer 97, 180-185.
Thomas, G.H. (2001). Disorders of glycoprotein degradation and structure: a-mannosidosis, b-mannosidosis, fucosidosis, and sialidosis. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, and D. Valle, eds. (New York, McGraw Hill, Inc.), pp. 3507-3534.
Uemura, T., Shiozaki, K., Yamaguchi, K., Miyazaki, S., Satomi, S., Kato, K., Sakuraba, H., and Miyagi, T. (2009). Contribution of sialidase NEU1 to suppression of metastasis of human colon cancer cells through desialylation of integrin beta4. Oncogene 28, 1218-1229.
Varki, A., Kannagi, R., Toole, B.P. (2009). Glyosylation Changes in Cancer. In Essentials of Glycobiology, A. Varki, Cummings, R.D., Esko, J.D., Freeze, H.H., Stanley, P., Bertozzi, C.R., Hart, G.W., Etzler, M.E., ed. (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Walker, T., Marshall, C., Parke, M.A., Yacoub, A., Rahmani, M., Haussinger, D., Reinehr, R., Voelkel-Johnson, C., Fisher, P.B., Grant, S., Dent, P. (2010). 17-Allylamino-17-Demethoxygeldanamycin and MEK 1/2 Inhibitors Kill GI Tumor Cells via Ca2+-Dependent Suppression of GRP78/BiP and Induction of Ceramide and Reactive Oxygen Species. Mol Cancer Ther 9, 1378-1395.
Wang, P.H. (2005). Altered Glycosylation in Cancer: Sialic Acids and Sialyltransferases. Journal of Cancer Molecules 1, 73-81.
Warren, L., Jardillier, J.C., and Ordentlich, P. (1991). Secretion of lysosomal enzymes by drug-sensitive and multiple drug-resistant cells. Cancer Res 51, 1996-2001.
Yagi, Y., Machida, A., Toru, S., Kobayashi, T., and Uchihara, T. (2011). Sialidosis type I with neoplasms in siblings: the first clinical cases. Neurol Sci 32, 737-738.
Yogalingam, G., Bonten, E.J., van de Vlekkert, D., Hu, H., Moshiach, S., Connell, S.A., and d'Azzo, A. (2008). Neuraminidase 1 is a negative regulator of lysosomal exocytosis. Dev Cell 15, 74-86.
Yonezawa, S., Goto, M., Yamada, N., Higashi, M., and Nomoto, M. (2008). Expression profiles of MUC1, MUC2, and MUC4 mucins in human neoplasms and their relationship with biological behavior. Proteomics 8, 3329-3341.
Zanoteli, E., de Vlekkert, D.V., Bonten, E.J., Hu, H., Mann, L., Gomero, E.M., Harris,
A.J., Ghersi, G., and d'Azzo, A. (2010). Muscle degeneration in neuraminidase 1 deficient mice results from infiltration of the muscle fibers by expanded connective tissue. Biochim Biophys Acta 1802, 659-672.
実施例５． リソソーム機能不全及び過剰なリソソームエキソサイトーシスがアルツハイマー様アミロイド形成を導く
概要
リソソームエキソサイトーシスは、特殊化された分泌細胞からの代謝物の制御された分泌及び殆どの細胞型における原形質膜の恒常性の維持を担当する制御された生理学的過程である。リソソームシアリダーゼNEU1は、この過程の主たる負の制御因子である。小児疾患シアリドーシスのマウスモデルにおけるNeu1の遺伝的除去は、組織及び細胞外マトリクスの一体性の有害効果を伴って、リソソーム内容物の細胞外への激化した放出を導く。ここで本発明者らは、Neu1-/-マウスが、アルツハイマー病（AD）を暗示する脳における病的及び分子的変化を生じさせることを示す。
神経細胞の過剰なリソソームエキソサイトーシスと、アミロイド前駆体蛋白質を含めての過剰シアリル化されたNeu1基質のリソソーム蓄積との相乗作用が、アミロイド生成カスケードに寄与する。更に、ADの既知のモデルにおけるNeu1下方制御は、アミロイド生成過程を促進し、逆に、同じモデルにおけるNeu1の上方制御はアミロイドの沈着及びプラークの形成を低下させる。これらのデータは、ADの病理メカニズムの幾つかを説明し、そして今まで知られていない経路に沿っての新しい治療標的を提供するであろう。
序説
リソソームは、糖蛋白質、糖脂質及び経齢オルガネラの区分された分解の主たる場所であり、そしてこの能力においてそれらは細胞の恒常性の維持のために重要である。その統合された活性が全リソソーム機能を制御するリソソームの構成成分のいずれかの下方制御又は不足は、多くの組織及び器官に対する有害な効果を伴って、合成と分解との間の均衡を崩す。これは特に、代謝的変化に対して極めて感受性である脳について妥当する。これらの基本的リソソーム酵素の１つがシアリダーゼNEU1であり、当該酵素は、末端シアル酸を除去することにより多くのシアロ糖接合体基質の異化を開始する。その規準的な分解機能はさておき、最近、NEU1は、リソソーム関連膜蛋白質の１つである標的基質LAMP1のシアル酸含量をコントロールすることによりNEU1が働く機能である、リソソームエキソサイトーシス（LEX）の生理学的過程を制御する酵素として同定された。
LEXは、事実上すべての細胞型に存在する、Ca2+−依存性の制御されるメカニズムである。それは細胞骨格に沿ってのリソソームのサブセットの原形質膜（PM）への動員から始まり、次にそれらはPMに結合（ドッキング）し、そしてPMと融合し、これによりリソソーム管内容物が細胞外空間に放出される。この経路の結合（ドッキング）段階は、LAMP1により介在される。NEU1の不存在下で、長く生きた、過剰にシアリル化されたLAMP1は、PMに結合しそしてCa2+の流入の際にLEXに連携するようにされた増加した数のリソソームを特定する。最終結果が、リソソーム内容物の細胞外への激しい放出であり、これは細胞外マトリクスの異常な再構成、並びにPM及びECM組成の変化をもたらす。本発明者らは、シアリドーシスのマウスモデルにおけるNEU1欠損の下流の全身的異常の多くが過剰なLEXに帰せられることを決定した。但し、この表現型の下流効果は影響された組織の生理学的特徴に依存して異なるかもしれないが。
ここで、本発明者らは、脱制御されたLEXが、Neu1-/-マウスの進行する神経病理的表現に寄与し、これがシアリドーシスを有する小児におけるそれを反映するか否かを決定することを欲した。
結果
本発明者らは先ず、正常な脳におけるNeu1の発現のパターンを試験し、そして海馬における最高の発現とともに、この酵素は実質組織にわたって広く分布したことを示した（データは示されず）。この発現パターンの線に沿って、Lamp1は過剰シアリル化された状態で蓄積し（データは示されない）、これがKOマウスの他の細胞及び組織における過剰なLEXと関連する性質であった。Lamp1はNeu1-/-海馬の錐体細胞中及び活性化されたミクログリア中に特に豊富であり（データは示されず）、これらの細胞が過剰なLEXを示す可能性が示唆された。本発明者らは、この可能性を、多能性細胞の数を増加させそして細胞の生存性を増強するために、Neu1-/-/ARFマウス及びWT/ARFマウスから単離した主たるミクログリア及びニューロスペアー培養培地における活性なリソソーム酵素のレベルを測定することにより試験した。
両方の遺伝子型からのニューロスペアーは、類似の細胞組成を有していたが、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼ（β−hex）の活性は、Neu1-/-ミクログリア及びNeu1-/-/ARFニューロスペアーの培地においてのみ有意に増加しており（データは示されず）、これらの細胞における過剰なLEXの存在が確認された。明らかに、LEXのレベルは、野生型及びNeu1-/-一次アストロサイトにおいて類似しており（データは示されず）、したがって、本発明者らは、Neu1欠損ニューロスペアーにおいて測定された増強された細胞外放出活性を、これらの培養物の神経細胞集団に帰した。
本発明者らは、Neu1-/-神経細胞及びミクログリアにおけるLEXの増加したレベルは、脳実質の神経細胞及び組成に劇的な影響を与える可能性があることを主張した。事実、Neu1-/-脳の組織病理学的試験は、海馬のCA3亜領域において特に豊富な、多くの異常な好酸性封入体を特定した（データは示されない）。これらは、サイズ及び形状において不均一であり、そしてアミロイドに密接に類似する不定形の球状蛋白質性物質を殆どが含んでいた。これらの封入体は、組織学的マーカーであるチオフラビンＳ及びBielschowsky銀染色の変法について陽性であった（データは示されない）。更に、これらの沈着物のクラスターは、Neu1-/-海馬のCA3において、Methoxy-X04の全身的注射により特異的に検出された。Neu1欠損の下流のアミロイド発生性過程の存在が確認された知見である。
超構造液レベルにおいて、アミロイド沈着物は、異常な形体及び内容物の多くの小胞を含む膨潤した変性神経突起として同定された（データは示されない）。一緒にしたこれらの表現型の変化は、アルツハイマー病（AD）に特徴的な変化を暗示した。ADは、アミロイドβ−ペプチド（Aβ）及び他の断片に異常に処理されたアミロイド前駆体蛋白質（APP）から主としてなる組成を有する蛋白質凝集体の疾患である。
Neu1-/-マウスの脳におけるアミロイドを特徴付けるため、本発明者らは、全長APPと交差反応する抗体を使用し、そしてCA3領域の錐体神経細胞中のこの蛋白質の進行的且つ時間依存的蓄積を見出した（データは示されない）。ユビキチン及び神経線維抗体はまたAPP+変性神経突起の殆どを免疫染色し、これらの構造における強い細胞骨格の異常が示唆された（データは示されない）。APPの蓄積は、Neu1-/サンプル中のこの蛋白質の顕著な増加を示す海馬細胞溶解物のイムノブロットにより確認された（データは示されず）。アルツハイマー病患者及びダウン症候群患者の両方におけるAPPの増加した発現が、疾患の進行の危険因子を代表することはよく確立されているので、本発明者らは、NEU1の機能喪失がアルツハイマー−様表現型の素因を作る可能性があることを推定した。
APPは、グリコシル化されそしてシアリル化されるタイプ−Ｉ膜糖蛋白質であり、そのグリカン構造における変化は、毒性Aβペプチドの増加した産生及び分泌に導く蛋白質の激しいプロセシングとリンクしていた。本発明者らは、APPがNeu1の天然基質であり、もしそうであればNeu1活性の非存在下での過剰シアリル化状態で蓄積するであろうと仮定した。確かに、サンブカス・ニグラ（sambucus nigra）レクチン（SNA）による、Neu1-/-海馬細胞溶解物中のAPPの分析は、蛋白質上のα−2,6結合したシアル酸の過剰量の存在を確認した（データは示されない）。
全てのＮ−及びＮ−グリカンのインビトロでの酵素的除去が、Neu1-/-サンプル及び野生型サンプルにおいてサイズが同じであるコアーAPP蛋白質を放出し、Neu1-/-脳におけるAPPの構造的変化が、そのシアル酸の障害された除去によるものであることが示された（データは示されず）。蓄積されたAPPはまた、Neu1の２つの他の基質であるLamp1及びカテプシンＢと共に、KO海馬から単離された粗リソソーム画分中（CLF）に検出された（データは示されず）。これらの結果は、少なくとも部分的にリソソーム隔室中で開裂されうるNeu1の新規な基質としてAPPを同定する。
APPのアミロイド生成プロセッシングにおける必須の段階は、カルボキシ末端断片（CTF）の生成であり、当該断片は次にβ−アミロイドに開裂される。したがって、本発明者らは、Neu1-/-サンプルにおけるそのレベルを、異常なAβプロセッシングの予測性測定値として評価した。CTFのレベルは、WTサンプルにおけるそれとの比較において、Neu1-/- 海馬サンプル及びCLFの両方において増加した（データは示されず）。更に、β−アミロイドはNeu1-/-CLF中に異常に存在し（データは示されず）、過剰シアリル化されたAPPがリソソーム隔室においてプロセッシングされることが示唆された。これらの観察はまた、Neu1-/-/ARFニューロスペアーの培地及びKO脳脊髄液液の両方におけるアミロイドペプチドAβ42（Aβ）の増加した量の検出により支持された（データは示されない）。このアミロイド生成過程におけるLEXの役割を確認するため、本発明者らは、ヒトTAMRA−接合蛍光Aβ42（T−Aβ）の存在下で、Neu1-/-/ARFニューロスペアー及びNeu1WT/ARFニューロスペアーを培養した。
T−Aβは細胞により容易に摂取され、そして後期エンドソーム／リソソームに別経路で送られた（データは示されず）。内部移行されたペプチドのこの画分は次に、全反射照明顕微鏡を用いるリソトラッカーで標識されたリソソームの生細胞造影により決定される場合、LEXを介してPMに輸送された（データは示されない）。PMの近傍のリソトラッカー＋のオルガネラの数を計数することにより、本発明者らは、Neu1-/-/ARF細胞が、PMに集合したT−Aβを含有するリソソームの有意に大きい数を有した（データは示されず）。更に、両方のニューロスペアー培養物が、ペプチドへの曝露に続きT−Aβ不含培地中で24時間維持された場合、本発明者らは、細胞外の放出されたT−Aβ蛍光を捕捉することができ、そして次に本発明者らは、野生型細胞に比べて、Neu1-/-/ARF細胞培地に細胞外放出されたT−Aβの増加した量を測定した（データは示されず）。したがって、AβはNeu1の不存在下で異常に分泌され、そしてLEXを介して放出される。
これらの結果は一緒になって、Neu1の機能の喪失及びそれに続くLEXの激化が、β−アミロイド生成の素因形成因子であることを示唆する。この仮定を更に証明するため、本発明者らは、本発明者らがNeu1-/-背景へと交配したADのよく特徴づけられたトランスジェニックモデル（5XFAD）を用いて、インビボで、アミロイドβのレベル及びプラークの形成に対するNeu1の除去の効果を分析した。本発明者らは先ず、5XFADマウス系におけるNeu1の発現レベルを、免疫組織化学により試験した。本発明者らは、Lamp1の増加した発現を伴う、海馬において特に顕著な、酵素の顕著な下方制御を観察した（データは示されない）。
本発明者らはまた、5XFAD海馬から単離された一次ニューロスペアーにおける低下したNeu1酵素活性を測定した（データは示されない）。これらの観察に更に加えて、本発明者らは、APPのレベルが、5XFAD/WTにおけるそれに比べて、5XFAD/Neu1-/-から単離された海馬細胞溶解物中で増加したことを示した（データは示されない）。更に、これらのマウスにおけるAPPのプロセッシングは、アミロイド−βの蓄積をもたらした（データは示されない）。これは、5XFADマウスにおけるNeu1の下方制御又は喪失が、脱制御されたLEXを介するのと同様に、β−アミロイド生成過程を促進するというアイデアを支持する発見である。
最後に、Neu1の不足（及び過剰なLEX）がAD−様表現型を復帰させる治療標的を代表することができるか否かを試験するため、本発明者らは5XFADマウスの脳におけるNeu1活性を外的に増加させることを望んだ。後者は、Neu1シャペロンの細胞内発現を増加させることにより達成することができた（保護蛋白質カテプシンＡ）（PPCA）。したがって、本発明者らは、5XFADマウスの海馬領域へのヒトNEU1及びPPCA（AAVNEU1/AAVPPCA）の両方を含むアデノ随伴ウイルスの定位的注射を行なった。このベクターの組合せは、インビトロでの、トランスジーンの持続的発言を指令した（データは示されず）。
注射から４週間後、PPCA及びNEU1の両方の高い発現が、組換えAAVベクターで処理されたマウスの脳切片中に検出された（データは示されない）。顕著に、キャリアー溶液のみを注射した同じ系統に比べて、処理されていない5XFADマウスにおいて見られるアミロイドプラークの豊富な数が、AAVを注射されたマウスにおいて44.3±6.2％減少した（データは示されない）。注射された5XFADマウスからの海馬細胞溶解物のイムノブロットは、APP及びβ−アミロイドの両者のレベルが低下したことを確認した（データは示されない）。
結論
結論として、本発明者らの結果は、リソソーム酵素によるAPPプロセッシングに対する制御の思いもよらないメカニズムを示す。本発明者らは、Neu1の機能喪失の下流のアミロイド生成過程を説明する２ヒットモデルを提案する：異常にプロセッシングされる、過剰にシアリル化されたAPPの蓄積、及びこれに続く、過剰なLEXを介してのAPP最終生成物の放出。このシナリオにおいて、増加したLEXを伴う活性化されたミクログリアは、APPを開裂して毒性のAβペプチドを生成するであろう活性なリソソーム酵素を細胞外に放出することによるフィードフォワード病原カスケードと連携する。アミロイド生成経路におけるNeu1の位置付け、及びLEXの中心的制御因子としてのその役割は、ADにおけるプラークの沈着及びアミロイドの生成を治療し／遅らせる新規な可能性ある療法標的のために開発されるであろう。

Claims (39)

  1. 癌を有する対象のための予後を決定する方法において、
    ａ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
    を含んで成る対象プロファイルであって前記対象からの腫瘍サンプルからのものを提供し；
    ｂ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
    を含んで成る対応する参照プロファイルであって対照サンプルからのものを提供し、
    ここで、前記対象プロファイル及び前記参照プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
    ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、癌を有する前記対象について予後を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性に比べて前記対象の低いリソソームシアリダーゼ活性、高いNEU1基質シアリル化活性、又は高いNEU1レベル活性が、前記対象の浸潤癌（invasive cancer）の予測をもたらす；
    段階を含んで成る方法。
  2. 対象における癌を診断する方法において、
    ａ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むリソソームシアリダーゼ活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
    を含んで成る対象プロファイルであって前記対象からの腫瘍サンプルからのものを提供し；
    ｂ）異なるリソソームシアリダーゼ活性マーカーからの２以上の値を含むNEU1活性プロファイル、NEU1基質シアリル化活性プロファイル、又はNEU1レベル活性プロファイル；
    を含んで成る対応する参照プロファイルであって対照サンプルからのものを提供し、
    ここで、前記対象プロファイル及び前記参照プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
    ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、前記対象について診断を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性、NEU1基質シアリル化活性、又はNEU1レベル活性に比べて前記対象のリソソームシアリダーゼ活性が低い場合、NEU1基質シアリル化活性が高い場合、又はNEU1レベル活性が高い場合、前記対象が癌を有すると診断する；
    を含んで成る方法。
  3. 癌を有する対象におけるリソソーム作用性（lysosomotropic）化学療法剤療法について予後を決定する方法において、
    ａ）前記対象からの腫瘍サンプルからの対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供し；
    ｂ）対照サンプルからの参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを提供し、ここで、前記対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含んで成り；そして
    ｃ）前記対象のリソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを比較して、対象におけるリソソーム作用性化学療法剤療法について予後を決定する、ここで、前記参照のリソソームシアリダーゼ活性に比べて前記対象の低いリソソームシアリダーゼ活性が、前記癌が前記リソソーム作用性化学療法剤に対して耐性であるとの予測をもたらす；
    段階を含んで成る方法。
  4. 前記対照サンプルが、前記対象からの前記腫瘍に隣接する正常組織である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. リソソームシアリダーゼ活性を表わす前記１又は複数の値が、LAMP-1蛋白質のレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1蛋白質のレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  7. リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1シアリル化のレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  8. リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1シアリル化のレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  9. リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1シアリル化のレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  10. リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1のレベル、MUC-1蛋白質のレベル、LAMP-1シアリル化のレベル及びMUC-シアリル化のレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  11. リソソームシアリダーゼ活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1蛋白質のレベルを含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記癌が、横紋筋肉腫、乳癌、結腸癌、膵臓癌、急性リンパ芽球白血病、又はユーイング肉腫（Ewing's sarcoma）である、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
  13. 対象におけるアルツハイマー病に関連する認知症の診断方法において、
    ａ）前記対象からの脳脊髄液のサンプルの対象リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供し；
    ｂ）脳脊髄液の対照サンプルの参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを提供し、ここで、対象リソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルはリソソームエキソサイトーシス活性を表わす１又は複数の値を含んで成り；そして
    ｃ）前記対象のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び前記参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを比較する、ここで、対象が、参照リソソームエキソサイトーシス活性に比べて高いリソソームエキソサイトーシス活性を有する場合、当該対象はアルツハイマー病に関連する認知症を有すると診断される；
    を含んで成る方法。
  14. 前記対象のリソソームエキソサイトーシス活性プロファイル及び前記参照リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルが、
    （ａ）リソソームシアリダーゼ活性プロファイル、ここで前記対象リソソームシアリダーゼ活性プロファイル及び前記対応する参照リソソームシアリダーゼ活性プロファイルは、リソソームシアリダーゼ活性を示す１又は複数の値を含んで成る、又は
    （ｂ）シアリル化活性プロファイル、ここで対象シアリル化活性プロファイル及び対応する参照シアリル化活性プロファイルは、シアリル化活性を示す１又は複数の値を含んで成る、
    を含んで成る、請求項13に記載の方法。
  15. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1シアリル化のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  16. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1シアリル化のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  17. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1シアリル化のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  18. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、アミロイド前駆体蛋白質のシアリル化のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  19. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、トランスチレチン（transthyretin）、β−２ミクログロブリン又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質のシアリル化のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  20. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1蛋白質のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  21. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、MUC-1蛋白質のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  22. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、アミロイド前駆体蛋白質のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  23. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1及びMUC-1蛋白質のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  24. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1蛋白質のレベル、MUC-1蛋白質のレベル、LAMP-1シアリル化のレベル及びMUC-1シアリル化のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  25. リソソームエキソサイトーシス活性を示す前記１又は複数の値が、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、ヘキソスアミニダーゼβ、マンノシダーゼα、トランスチレチン（Transthyretin）、β−２ミクログロブリン又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質のレベルを含んで成る、請求項13に記載の方法。
  26. 癌を有する対象の治療方法において、それを必要とする対象に、療法的有効量の、配列番号：２に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するニューラミニダーゼ−１（Neuraminidase 1）（NEU1）ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
  27. アルツハイマー病に関連する認知症を有する対象の治療方法において、それを必要とする対象に、療法的有効量の、配列番号：２に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するニューラミニダーゼ−１（Neuraminidase 1）（NEU1）ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
  28. 配列番号：４に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、NEU1酵素活性を増強する保護蛋白質／カテプシンＡ（PPCA）ポリペプチドを投与することを更に含んで成る、請求項26又は27のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記NEU1ポリペプチド及びPPCAポリペプチドが別々に又は同時に投与される、請求項28に記載の方法。
  30. 前記NEU1ポリペプチドの投与が、配列番号：１に対して少なくとも85％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るウイルスベクターの投与を含んで成る、請求項29に記載の方法。
  31. リソソームシアリダーゼ活性プロファイルの生成方法において、
    （ａ）対象からの腫瘍からのサンプルを得；そして
    （ｂ）LAMP-1蛋白質のレベル又はLAMP-1シアリル化のレベルについて測定する；
    ことを含んで成る方法。
  32. １又は複数の追加のリソソームシアリダーゼ活性マーカーを測定することを含んで成る、請求項31に記載の方法。
  33. 前記１又は複数の追加のリソソームシアリダーゼ活性マーカーが、NEU1基質を含んで成る、請求項32に記載の方法。
  34. 脳脊髄液からリソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを生成する方法において、
    （ａ）対象から脳脊髄液のサンプルを得；そして
    （ｂ）リソソームエキソサイトーシス活性について測定する；
    ことを含んで成る方法。
  35. 前記リソソームエキソサイトーシス活性についての測定が、LAMP-1蛋白質のレベル又はLAMP-1シアリル化のレベルについての測定を含んで成る、請求項34に記載の方法。
  36. 前記リソソームエキソサイトーシス活性についての測定が、LAMP-1、MUC-1、アミロイド前駆体蛋白質、カテプシンＢ、カテプシンＤ、フィブリノーゲン、ヘキソスアミニダーゼβ、マンノシダーゼα、トランスチレチン（Transthyretin）、β−２ミクログロブリン又は免疫グロブリン重鎖を含む１又は複数の蛋白質についての測定を含んでなる、請求項34に記載の方法。
  37. 得られる活性値の観点で、リソソームシアリダーゼ活性プロファイルを集合することを含んで成る、請求項31〜33のいずれか１項に記載の方法。
  38. 得られる活性値の観点で、リソソームエキソサイトーシス活性プロファイルを集合することを含んで成る、請求項34〜36のいずれか１項に記載の方法。
  39. 対象がヒトである、請求項１〜38のいずれか１項に記載の方法。
JP2014528515A 2011-08-31 2012-08-28 リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法 Active JP6228121B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161529675P 2011-08-31 2011-08-31
US61/529,675 2011-08-31
US201161544855P 2011-10-07 2011-10-07
US61/544,855 2011-10-07
PCT/US2012/052629 WO2013033074A2 (en) 2011-08-31 2012-08-28 Methods and compositions to detect the level of lysosomal exocytosis activity and methods of use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2014526904A true JP2014526904A (ja) 2014-10-09
JP2014526904A5 JP2014526904A5 (ja) 2017-06-29
JP6228121B2 JP6228121B2 (ja) 2017-11-08

Family

ID=46881159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014528515A Active JP6228121B2 (ja) 2011-08-31 2012-08-28 リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法

Country Status (15)

Country Link
US (5) US9399791B2 (ja)
EP (1) EP2751279B1 (ja)
JP (1) JP6228121B2 (ja)
AU (1) AU2012300252B2 (ja)
CA (1) CA2847057C (ja)
CY (1) CY1119689T1 (ja)
DK (1) DK2751279T3 (ja)
ES (1) ES2653918T3 (ja)
HR (1) HRP20171909T1 (ja)
HU (1) HUE037829T2 (ja)
LT (1) LT2751279T (ja)
PL (1) PL2751279T3 (ja)
PT (1) PT2751279T (ja)
SI (1) SI2751279T1 (ja)
WO (1) WO2013033074A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019508044A (ja) * 2016-03-18 2019-03-28 ナントセル，インコーポレイテッド 樹状細胞感染のための多モードベクター
WO2021006202A1 (ja) 2019-07-05 2021-01-14 国立大学法人徳島大学 改変ノイラミニダーゼ

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2011001341A (es) 2008-08-19 2011-03-29 Xenoport Inc Prodrogas de metil hidrogeno fumarato, sus composiciones farmaceuticas, y metodos de uso.
JP2015526476A (ja) 2012-08-22 2015-09-10 ゼノポート，インコーポレイティド メチル水素フマレートの経口剤形およびそのプロドラッグ
US10945984B2 (en) 2012-08-22 2021-03-16 Arbor Pharmaceuticals, Llc Methods of administering monomethyl fumarate and prodrugs thereof having reduced side effects
US10179118B2 (en) 2013-03-24 2019-01-15 Arbor Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of dimethyl fumarate
WO2014197860A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Xenoport, Inc. Method of making monomethyl fumarate
US9421182B2 (en) 2013-06-21 2016-08-23 Xenoport, Inc. Cocrystals of dimethyl fumarate
JP2016534133A (ja) 2013-09-06 2016-11-04 ゼノポート，インコーポレイティド （ｎ，ｎ−ジエチルカルバモイル）メチル メチル（２ｅ）ブト−２−エン−１，４−ジオエートの結晶形態、その合成方法及び使用
US9999672B2 (en) 2014-03-24 2018-06-19 Xenoport, Inc. Pharmaceutical compositions of fumaric acid esters
WO2016179481A1 (en) * 2015-05-07 2016-11-10 Cardelli James Allen Cancer treatment via repositioned tricyclic anti-depressant-like drugs as anti-cancer agents and new combinations of such drugs
WO2017075540A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for the treatment of amyloidosis
US10912011B2 (en) * 2017-01-04 2021-02-02 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Method, base station and user equipment for transceiving system information
WO2023147605A2 (en) * 2022-01-31 2023-08-03 Sens Research Foundation Senescent cell surface markers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998031817A2 (en) * 1997-01-14 1998-07-23 Hopital Sainte-Justine Human lysosomal sialidase and therapeutic uses thereof
WO2006013013A2 (en) * 2004-08-04 2006-02-09 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with protective protein for beta-galactosidase (ppgb)
WO2011049787A1 (en) * 2009-10-19 2011-04-28 Amicus Therapeutics, Inc. Method for treating alzheimer's disease using pharmacological chaperones to increase the activity of gangliosidases

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
EP0545913B1 (en) 1986-08-18 1999-02-24 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
WO1997015588A1 (en) 1995-10-26 1997-05-01 St. Jude Children's Research Hospital Protective protein/cathepsin a and precursor: crystallization, x-ray diffraction, three-dimensional structure determination and rational drug design
EP1292294B1 (en) * 2000-05-01 2009-03-18 Accera, Inc. Use of medium chain triglycerides for the treatment and prevention of alzheimer's disease
US7232670B2 (en) 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
EP1678322A2 (en) 2003-10-24 2006-07-12 Gilead Sciences, Inc. Methods and compositions for identifying therapeutic compounds
WO2008049058A2 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Cornell Research Foundation, Inc. Cln2 treatment of alzheimer's disease
EP2094832B1 (en) 2006-11-15 2015-04-22 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for reducing amyloid beta levels
US7951367B2 (en) 2006-11-15 2011-05-31 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for reducing amyloid beta levels
HUE035779T2 (en) 2007-06-06 2018-05-28 Genzyme Corp Gene therapy for lysosomal storage disorders
WO2013018091A1 (en) 2011-08-04 2013-02-07 Ramot At Tel-Aviv Universitiy Ltd. Particles for the treatment of neurodegenerative diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998031817A2 (en) * 1997-01-14 1998-07-23 Hopital Sainte-Justine Human lysosomal sialidase and therapeutic uses thereof
WO2006013013A2 (en) * 2004-08-04 2006-02-09 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with protective protein for beta-galactosidase (ppgb)
WO2011049787A1 (en) * 2009-10-19 2011-04-28 Amicus Therapeutics, Inc. Method for treating alzheimer's disease using pharmacological chaperones to increase the activity of gangliosidases

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BONTEN, E. J. ET AL.: "Lysosomal neuraminidase. Catalytic activation in insect cells is controlled by the protective prote", J. BIOL. CHEM., vol. Vol. 275, JPN6016043387, 2000, pages pp. 37657-37663 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019508044A (ja) * 2016-03-18 2019-03-28 ナントセル，インコーポレイテッド 樹状細胞感染のための多モードベクター
WO2021006202A1 (ja) 2019-07-05 2021-01-14 国立大学法人徳島大学 改変ノイラミニダーゼ

Also Published As

Publication number Publication date
CY1119689T1 (el) 2018-04-04
WO2013033074A2 (en) 2013-03-07
DK2751279T3 (da) 2017-11-20
US20160304933A1 (en) 2016-10-20
LT2751279T (lt) 2017-12-11
HUE037829T2 (hu) 2018-09-28
JP6228121B2 (ja) 2017-11-08
ES2653918T3 (es) 2018-02-09
EP2751279B1 (en) 2017-10-04
US20200087704A1 (en) 2020-03-19
AU2012300252B2 (en) 2017-10-19
US10533208B2 (en) 2020-01-14
EP2751279A2 (en) 2014-07-09
US20140193392A1 (en) 2014-07-10
US9840727B2 (en) 2017-12-12
CA2847057C (en) 2019-06-11
US20140377245A9 (en) 2014-12-25
SI2751279T1 (en) 2018-01-31
AU2012300252A1 (en) 2014-03-20
US9399791B2 (en) 2016-07-26
WO2013033074A3 (en) 2013-04-25
PT2751279T (pt) 2017-12-29
US20180057854A1 (en) 2018-03-01
US20220406435A1 (en) 2022-12-22
CA2847057A1 (en) 2013-03-07
HRP20171909T1 (hr) 2018-01-26
PL2751279T3 (pl) 2018-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6228121B2 (ja) リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法
Boza-Serrano et al. Galectin-3, a novel endogenous TREM2 ligand, detrimentally regulates inflammatory response in Alzheimer’s disease
JP7098529B2 (ja) Ｇｌａ遺伝子にｇ９３３１ａ変異を有する患者においてファブリー病を処置する方法
KR20130128481A (ko) 리소좀 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이와 관련있는 ｃｎｓ 질환의 치료 방법
Rais et al. FOLH1/GCPII is elevated in IBD patients, and its inhibition ameliorates murine IBD abnormalities
EP3028047B1 (en) Compositions and methods for identifying a risk of cancer in a subject
Ramsay et al. Determination of oligosaccharides and glycolipids in amniotic fluid by electrospray ionisation tandem mass spectrometry: in utero indicators of lysosomal storage diseases
Vieitez et al. Fabry disease in the Spanish population: observational study with detection of 77 patients
US20200397870A1 (en) Recombinant alkaline phosphatase for use in treating sepsis-associated acute kidney injury
WO2018183213A1 (en) Blood biomarkers and diagnostic methods for small vessel diseases
Taylor et al. Amyloid-β (Aβ) immunotherapy induced microhemorrhages are associated with activated perivascular macrophages and peripheral monocyte recruitment in Alzheimer’s disease mice
Zhang et al. Environmentally-induced mdig contributes to the severity of COVID-19 through fostering expression of SARS-CoV-2 receptor NRPs and glycan metabolism
EP2605763B1 (en) Treatment
US20140050740A1 (en) Compositions and methods for the treatment of tissue fibrosis
Santoro et al. Early biochemical effects of velmanase alfa in a 7‐month‐old infant with alpha‐mannosidosis
US11717528B2 (en) Methods and compositions relating to the treatment of fibrosis
Strologo et al. Cystinuria
US20180346988A1 (en) Znf532 for diagnosis and treatment of cancer
US11357780B2 (en) Methods and compositions relating to the inhibition of IP6K1
US8623601B2 (en) Methods of diagnosing cancer
US20190227067A1 (en) Method and kit for determining prognosis, remote recurrence risk and invasion of glioma, and pharmaceutical composition for treating glioma
US9803196B2 (en) Compositions and methods for treating, diagnosing and monitoring disease

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150820

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150820

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160712

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20161007

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161115

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170208

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170515

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20170515

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170912

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20171012

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6228121

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250